Piezo-ICSI dla ludzkich oocytów

Kenichiro Hiraoka; Manami Isuge; Yuko Kamada; Tetsuya Kaji; Takako Suhara; Akira Kuga; Kumi Ohuchi; Masaru Hayashi; Kiyotaka Kawai

doi:10.3791/60224

Artykuł metodologiczny

Piezo-ICSI dla ludzkich oocytów

DOI:

10.3791/60224

⸱

20 kwietnia 2021

Kenichiro Hiraoka¹^,²^,³ , Manami Isuge¹ , Yuko Kamada¹ , Tetsuya Kaji¹ , Takako Suhara¹ , Akira Kuga² , Kumi Ohuchi¹ , Masaru Hayashi¹ , Kiyotaka Kawai¹^,²^,³

¹Kameda Medical Center, ²Kameda IVF Clinic Makuhari, ³Tokyo Medical and Dental University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników do ludzkich oocytów za pomocą mikropipety sterowanej piezo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu doniesień o pierwszych udanych ciążach osiągniętych przez docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI), ICSI stało się podstawową techniką w technologii wspomaganego rozrodu (ART). ICSI wykorzystuje mikropipety z końcówką kolczastą do penetracji osłonki przejrzystej i błony. Następnie cytoplazma jest zwykle zasysana do mikropipety w celu przerwania błony (konwencjonalne ICSI). Wskaźniki przeżycia i zapłodnienia oocytów myszy po konwencjonalnym ICSI wynosiły odpowiednio 16% i 8%. Kimura i Yanagimachi zastosowali piezoelektryczny napęd, rtęć i mikropipetę z płaską końcówką do mysiego ICSI. Zerwanie membrany może być wykonane półautomatycznie poprzez połączenie tego typu urządzeń bez aspiracji cytoplazmatycznej z mikropipetą (piezo-ICSI). Autorzy ci podali znacznie wyższe wskaźniki przeżywalności i zapłodnienia (80% i 78%) w porównaniu z konwencjonalnym ICSI (16% i 8%). Dlatego piezo-ICSI może być skuteczny nie tylko w przypadku oocytów myszy, ale także w przypadku ICSI oocytów ludzkich. Jednak dostępnych jest tylko pięć prac, w których oceniano skuteczność piezo-ICSI w porównaniu z konwencjonalnym ICSI dla ludzkich oocytów. We wszystkich tych pięciu pracach odnotowano znacznie wyższe wskaźniki zapłodnienia w porównaniu z konwencjonalnym ICSI. Celem opisanego tutaj protokołu piezo-ICSI jest poprawa wyników klinicznych ICSI w porównaniu z konwencjonalnym ICSI.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkąd dr Palermo poinformował o pierwszych udanych ciążach uzyskanych dzięki docytoplazmatycznemu wstrzyknięciu plemnika (ICSI)¹, ICSI stało się podstawową techniką w technologii wspomaganego rozrodu (ART). ICSI wykorzystuje mikropipety z końcówką kolczastą do penetracji osłonki przejrzystej i błony. Następnie cytoplazma jest zwykle zasysana do mikropipety w celu przerwania błony (konwencjonalne ICSI). Wskaźniki przeżywalności i zapłodnienia oocytów myszy po konwencjonalnym ICSI wynosiły odpowiednio 16% i 8%². Kimura i Yanagimachi zastosowali napęd piezoelektryczny, rtęć i mikropipetę z płaską końcówką do myszy ICSI². Zerwanie membrany może być wykonane półautomatycznie poprzez połączenie tego typu urządzeń (piezo-ICSI). Autorzy ci podali znacznie wyższe wskaźniki przeżywalności i zapłodnienia (80% i 78%) piezo-ICSI w porównaniu do konwencjonalnych ICSI (16% i 8%)². Jedną z przyczyn lepszych wyników uzyskiwanych w piezo-ICSI może być proces pękania błony. Piezo-ICSI może stabilnie i półautomatycznie rozbijać membranę bez aspiracji cytoplazmatycznej do mikropipety. Wyniki te sugerują, że aspiracja cytoplazmatyczna do mikropipety podczas przerwania błony jest inwazyjna dla oocytów myszy. Dlatego piezo-ICSI może być skuteczny nie tylko w przypadku oocytów myszy, ale także w przypadku ICSI oocytów ludzkich.

Jednak tylko pięć dostępnych prac oceniało skuteczność piezo-ICSI w porównaniu do konwencjonalnego ICSI dla ludzkich oocytów. We wszystkich pięciu tych pracach odnotowano znacznie wyższe wskaźniki nawożenia za pomocą piezo-ICSI w porównaniu ze wskaźnikami nawożenia za pomocą konwencjonalnego ICSI³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷ (Tabela 1). Dlatego piezo-ICSI może poprawić wskaźniki przeżywalności i zapłodnienia w porównaniu z konwencjonalnym ICSI. Celem opisanego tutaj protokołu piezo-ICSI jest poprawa wyników klinicznych ICSI w porównaniu z konwencjonalnym ICSI.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany poniżej protokół piezo-ICSI jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań na ludziach w Centrum Medycznym Kameda.

1. Sprzęt i przygotowanie

Użyj systemu piezo-ICSI składającego się z jednostki napędowej, skrzynki operacyjnej, przełącznika nożnego i sterownika. Używaj dowolnego rodzaju odwróconego mikroskopu lub mikromanipulatora trójosiowego. Przymocuj napęd piezoelektryczny do uchwytu mikropipety i umieść przełącznik nożny na podłodze. Ustaw poziom INTENSYWNOŚĆ na 2, a poziom PRĘDKOŚĆ na 1 w polu operacyjnym.
Użyj dostępnej w handlu mikropipety piezo-ICSI z płaską końcówką. Napełnij mikropipetę płynem operacyjnym (płyn na bazie fluorowęglowodorów) do długości 20 mm. Unikaj mieszania pęcherzyków powietrza z płynem operacyjnym. Zassać wszelkie pęcherzyki powietrza lub nadmiar płynu roboczego w kierunku tylnej części pipety za pomocą urządzenia do napełniania cieczą.
Zamontować mikropipetę w uchwycie mikropipety iniekcyjnej. Jeśli uchwyt do mikropipet iniekcyjnych jest wyposażony w silikonową rurkę, włóż głowicę pipety na około 5 mm do rurki silikonowej. Dokręć nasadkę uchwytu i mocno zamocuj mikropipetę.
Przymocuj jednostkę napędową do manipulatora i mocno zamocuj, aby uniknąć obrotu spowodowanego jej ciężarem.
Umieść mikropipetę w polu mikroskopu. Uruchomić wtryskiwacz i wepchnąć płyn operacyjny do głowicy mikropipety tak, aby powietrze z wnętrza pipety zostało wypchnięte. Upewnij się, że w głowicy pipety nie pozostało powietrze gołym okiem, a nie pod mikroskopem.
Przygotuj naczynie ICSI na naczyniu ze szklanym dnem, jak pokazano na Rysunek 1. Przygotuj dwie mikrokropelki 7% roztworu poliwinylopirolidonu (PVP): mniejsza mikrokropla służy do przygotowania mikropipety (5 μl), a druga do selekcji plemników (10 μl). Przygotować kolejną kroplę wykonaną w środku naczynia ze szklanym dnem z buforowanego podłoża; Ta mikrokropla jest przeznaczona dla oocytu i służy do wstrzykiwania plemników (8 μl).
Włóż głowicę mikropipety do kropli 7% PVP i pokryj wewnętrzną ściankę mikropipety. Energicznie obsługiwać wtryskiwacz, przesuwając go wzdłuż granicy międzyfazowej między cieczą roboczą a PVP. Przepłukać wnętrze mikropipety PVP w odległości około 800 μm od główki pipety.
1. Powtórz tę procedurę (~3 lub 4 razy), aż granica międzyfazowa przesunie się płynnie.

2. Unieruchomienie plemników

Ustaw poziom INTENSYWNOŚĆ na 2, a poziom PRĘDKOŚĆ na 1 w polu operacyjnym. Zastosuj impuls piezoelektryczny z jednostki napędowej podłączonej do uchwytu mikropipety, gdy przełącznik nożny jest włączony. Podczas stosowania impulsu piezoelektrycznego podczas zabiegu, ikona "Impuls piezoelektryczny" pojawia się w prawym górnym rogu filmu.
Zbierz ruchliwe plemniki za pomocą gradientu gęstości i przytrzymaj zebrane ruchliwe plemniki w buforowanym podłożu. Odessać buforowaną pożywkę zawierającą zebrane ruchliwe plemniki o objętości około 2-3 μl za pomocą pipety. Następnie wstrzyknij to podłoże do dolnej części mikrokropli 7% PVP. Wybierz plemniki w powiększeniu 400x.
1. Przymocuj końcówkę mikropipety do ogona wybranego plemnika, a następnie napędzaj napęd piezoelektryczny. Zazwyczaj powtórz jazdę 3 razy na jedno unieruchomienie plemników. Po unieruchomieniu plemników należy je najpierw zassać do ogona mikropipety.

3. Operacja Piezo-ICSI (oocyt z błoną o wysokiej zdolności rozciągania)

Utrzymuj główkę nasienia w pozycji około jednej pełnej długości z tyłu od główki mikropipety. Podczas napędzania napędu piezoelektrycznego (około 5 razy na jeden oocyt) należy przesunąć mikropipetę, aby przeprowadzić nakłucie bez deformacji osłonki przejrzystej. Gdy końcówka mikropipety dotrze do wewnętrznej warstwy osłonki przejrzystej, a następnie wydrążony fragment osłonki przejrzystej zostanie całkowicie zasysany do mikropipety, nakłucie osłonki przejrzystej jest zakończone.
Usunąć wydrążony fragment osłonki przejrzystej znajdujący się wewnątrz mikropipety i jednocześnie przesunąć plemniki do główki mikropipety. Wciśnij mikropipetę i rozciągnij błonę cytoplazmatyczną do około 90% średnicy oocytu.
Gdy jest wystarczająco rozciągnięty, uruchom napęd piezoelektryczny jeden raz, aby rozerwać membranę. Pęknięcie membrany jest zakończone, gdy potwierdzi się, że membrana odbiła się.
Po pęknięciu błony wstrzyknij główkę plemnika do oocytu. Po tym, jak główka plemnika zostanie na pewno wstrzyknięta do cytoplazmy, należy zwrócić uwagę, aby nie dodawać zbędnego płynu.

4. Operacja piezo-ICSI (oocyt z błoną o niskiej zdolności rozciągania)

UWAGA: Wyjaśniamy, jak postępować z oocytem o niskiej zdolności rozciągania, który może spontanicznie pęknąć podczas rozciągania.

Wykonaj tę samą czynność, co oocyt z błoną o wysokiej zdolności rozciągania, aż do momentu rozciągnięcia błony cytoplazmatycznej.
Jeśli błona zostanie samoistnie pęknięta podczas działania, wstrzyknąć główkę plemnika z pozycji mikropipety, nie popychając jej dalej do przodu, aby uniknąć degeneracji oocytów po wstrzyknięciu nasienia.
Po tym, jak główka plemnika zostanie na pewno wstrzyknięta do cytoplazmy, należy zwrócić uwagę, aby nie dodawać zbędnego płynu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane powyżej konwencjonalne ICSI i piezo-ICSI zostały przeprowadzone na 10 488 dojrzałych oocytach (1 744 cykle) przez 4 embriologów. Spośród nich 3 522 oocyty (587 cykli) zostały zapłodnione konwencjonalnym ICSI między styczniem 2013 r. a wrześniem 2016 r., a 6 966 oocytów (1 157 cykli) zostało zapłodnionych za pomocą piezo-ICSI między październikiem 2016 r. a grudniem 2020 r. w Centrum Medycznym Kameda. Tabela 1 przedstawia średni wiek kobiet, wskaźniki zapłodnienia, wskaźniki przeżycia, wskaźniki zwyrodnień, wskaźniki blastocyst w 5 dniu oraz średnią liczbę kriokonserwowanych blastocyst na cykle konwencjonalnych ICSI i piezo-ICSI. Chociaż średni wiek kobiet piezo-ICSI był wyższy w porównaniu z konwencjonalnym ICSI, wskaźniki zapłodnienia, przeżycia i blastocysty oraz średnia liczba kriokonserwowanych blastocyst na cykle piezo-ICSI były znacznie wyższe w porównaniu z konwencjonalnymi ICSI (Tabela 2).

figure-results-1
Rysunek 1: Talerz ICSI używany do piezo-ICSI. Układ mikrokropel jest opisany tutaj. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

studiować	konwencjonalny-ICSI	piezo-ICSI
Yanagida i in. (1999)	66%^w	79%^B
Takeuchi i in. (2001)	83%^A	90%^B
Hiraoka i in. (2015)	68%^w	89%^B
Furuhashi i in. (2019)	64%^w	75%^B
Fujii i in. (2020)	71%^w	84%^mld
^ab<0,05 w tej samej linii

Tabela 1: Porównanie wskaźników nawożenia między konwencjonalnym ICSI a piezo-ICSI. We wszystkich raportach zaobserwowano znacznie wyższe wskaźniki nawożenia w piezo-ICSI w porównaniu z konwencjonalnym ICSI.

SZT. TGL jedynki osób

	konwencjonalny-ICSI	piezo-ICSI	P
Średni wiek kobiet	38,6 ± 0,2	39,2 ± 0,2	<0,05
Liczba cykli	587	1 157	-
Liczba oocytów	3 522	6 966	-
Liczba nawożenia (%)	2 352 (66,8)	5 411 (77,7)	<0.01
Liczba osób przeżyjących (%)	3 303 (93,8)	6 767 (97,1)	<0.01
Liczba zwyrodnień (%)	219 (6,2)	199 (2,9)	<0.01
Liczba blastocyst (%)	915 (38,9)	2 787 (51,5)	<0.01
Średnia liczba kriokonserwowanych blastocyst na cykl	3,8 ± 0,2	5,1 ± 0,2	<0.01

Tabela 2: Wyniki kliniczne Centrum Medycznego Kameda porównujące skuteczność conventional-ICSI and piezo-ICSI. We wszystkich pozycjach porównawczych zaobserwowano znacznie lepsze wyniki w piezo-ICSI w porównaniu z konwencjonalnym ICSI.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki wykazały, że wskaźniki zapłodnienia, wskaźniki przeżycia, wskaźniki blastocyst dnia 5 oraz średnia liczba kriokonserwowanych blastocyst piezo-ICSI były znacznie wyższe w porównaniu z konwencjonalnymi ICSI.

W protokole piezo-ICSI występują 2 krytyczne kroki. Pierwszym krokiem jest mocne przekręcenie nasadki uchwytu na pipety. Drugim krokiem jest utrzymanie zasysanej objętości PVP w mikropipecie na poziomie mniejszym niż 300 mikrometrów. Luźne przekręcenie nasadki uchwytu na mikropipetę i zassanie PVP do mikropipety na głębokość większą niż 300 mikrometrów (jedna pełna długość plemnika to około 60 mikrometrów) powoduje trudności w unieruchomieniu plemników, otwarciu strefy i pęknięciu błony z powodu zmniejszającej się mocy piezoelektrycznej. W szczególności musimy zawsze zwracać uwagę na objętość zasysaną PVP do mikropipety podczas zabiegu. Jest to ograniczenie piezo-ICSI.

Konieczne jest umieszczenie niewielkiej ilości ciężkiej cieczy jako płynu operacyjnego wewnątrz mikropipety, aby uzyskać moc piezoelektryczną. W poprzednich raportach rtęć była używana jako ciecz operacyjna ^2,3,4. Jednak zamiast rtęci można użyć płynu na bazie fluorowęglowodorów, który jest bezpieczny do stosowania^zamiast 5,6,7,8,9,11. Ciecz na bazie fluorowęglowodorów ma ciężar właściwy 1,8 i jest bezbarwna, przezroczysta i nierozpuszczalna w wodzie. Płyn operacyjny ma bezpośredni kontakt z PVP utrzymującym plemniki. Narażenie PVP na płyn operacyjny może mieć pewien negatywny wpływ na plemnik lub oocyt. Jednak wskaźniki zapłodnienia, przeżycia, blastocysty piezo-ICSI w 5 dniu były znacznie wyższe w porównaniu z konwencjonalnymi ICSI w niniejszym badaniu. Uważamy, że ryzyko związane z bezpośrednim kontaktem między cieczą operacyjną a PVP jest dość niskie.

Wcześniej mierzyliśmy czas przygotowania mikropipety za pomocą wtryskiwacza olejowego i wtryskiwacza powietrznego. Średni czas przygotowania mikropipety wtryskiwacza oleju i wtryskiwacza powietrza wynosił odpowiednio 233 i 106 sekund (P < 0,05)⁸. Czas przygotowania mikropipety za pomocą wtryskiwacza powietrza jest krótszy, ponieważ nie zawiera on oleju. Obecność olejku wydłuża czas przygotowania mikropipety ze względu na jej lepkość. Jeśli pęcherzyki powietrza zmieszają się w obszarze oleju wewnątrz mikropipety po włożeniu mikropipety do uchwytu na pipetę, pipetę należy wyrzucić, ponieważ piezo-ICSI nie będzie działać. Policzyliśmy również ilość zmarnowanych mikropipet podczas przygotowywania mikropipet. Średnia liczba zmarnowanych mikropipet na pacjenta w przypadku wtryskiwacza oleju i wtryskiwacza powietrza wynosiła odpowiednio 0,28 ± 0,56 i 0 ± 0 (P < 0,05), odpowiednio⁸. Nie stwierdzono jednak istotnej różnicy między wstrzykiwaczami olejowymi i powietrznymi pod względem przeżywalności (99% i 99%), zapłodnienia (89% i 90%) oraz dobrej jakości zarodków dnia 3 (61% i 61%) po piezo-ICSI⁸. Podczas^badania zmarnowaliśmy dodatkowe 3,2 godziny i 25 mikropipet w grupie z wtryskiwaczem oleju (90 pacjentów) w porównaniu z grupą z wtryskiwaczem powietrza (90 pacjentów). Wyniki wskazują, że użycie wtryskiwacza powietrza zamiast wtryskiwacza olejowego jest dobrą modyfikacją piezo-ICSI.

Piezo-ICSI może półautomatycznie rozbić membranę bez aspiracji cytoplazmatycznej do mikropipety. Ta procedura pękania membrany jest stabilna i łatwa. Piezo-ICSI może również przyczynić się do skrócenia okresu szkolenia ICSI. Wcześniej ocenialiśmy wpływ piezo-ICSI na wskaźniki przeżycia, zapłodnienia, blastocysty dla młodego embriologa. Młody embriolog otrzymał praktykę piezo-ICSI 30 razy przed rozpoczęciem klinicznego leczenia ICSI. Porównaliśmy wskaźniki przeżycia, zapłodnienia, blastocyst młodych i starszych embriologów dla ich 1. 100 oocytów. Wskaźniki przeżycia, zapłodnienia i blastocyst u młodych i starszych embriologów wynosiły odpowiednio 100% i 97%, 87% i 91%, 47% i 57%⁹. Nie stwierdzono istotnej różnicy między młodymi i starszymi embriologami we wszystkich pozycjach porównawczych. Wyniki te wskazują, że piezo-ICSI ma znaczenie w procedurze przerwania błony, która może przyczynić się do skrócenia okresu szkolenia ICSI młodego embriologa.

Niektórzy badacze zgłaszali kliniczną skuteczność docytoplazmatycznego morfologicznie wyselekcjonowanego nasienia (IMSI). Setti i wsp. porównali wyniki kliniczne między ICSI i IMSI w badaniu metaanalitycznym¹⁰. Nie stwierdzono istotnej różnicy we wskaźnikach nawożenia między grupami ICSI i IMSI¹⁰. Jednak odsetek zarodków najwyższej jakości w grupie IMSI był znacznie wyższy w porównaniu z grupą^{ICSI 10}. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, w żadnym badaniu nie analizowano wpływu IMSI w połączeniu z piezo-ICSI na zapłodnienie i rozwój zarodków. Retrospektywnie zbadaliśmy wpływ powiększenia selekcji plemników (400x vs. 1,200x) na zapłodnienie i rozwój zarodka w piezo-ICSI. Wskaźnik zapłodnienia w grupie 1,200x (92%) był znacznie wyższy w porównaniu z grupą 400x (77%) (P = 0,0002)¹¹. Dobrej jakości odsetek zarodków w dniu 3 w grupie 1,200x (64%) był znacznie wyższy w porównaniu z grupą 400x (46%) (P = 0,0021)¹¹. Staraliśmy się wybrać plemniki bez wakuoli w główce plemnika pod powiększeniem 1200x. Procedura ta może wyselekcjonować plemniki o niższym stopniu fragmentacji DNA plemników¹². W związku z tym IMSI może być nowym zastosowaniem piezo-ICSI.

Tutaj opisaliśmy protokół piezo-ICSI, który może poprawić wyniki ICSI bez utraty żywotnych oocytów w ludzkim ART.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy
Wtryskiwacz powietrza	NARISHIGE CORPORATION	IM-12
Jednostka napędowa piezoelektryczna	PRIME TECH Sp. z o.o.	Mikropipeta PMM4GD
	PRIME TECH Sp. z o.o.	PINU06-20FT
Ciecz operacyjna	3M 3M	&handel; Noveck™
PVP 7% Rozwiązanie gotowe do użycia	Cooper Surgical Inc.	ART-4005-A
Podłoże buforowane	Vitrolife	G-MOPS PLUS
Naczynie ze szklanym dnem	NIPRO	87-453
Mikroskop odwrócony	OLYMPUS CORPORATION	IX-73