Artykuł metodologiczny

Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą jonoforezy Lucyfera Yellow

DOI:

10.3791/60225

⸱

14 września 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocyty to morfologicznie złożone komórki, czego przykładem są ich liczne procesy i krzaczaste terytoria. Aby przeanalizować ich skomplikowaną morfologię, przedstawiamy niezawodny protokół wykonywania wewnątrzkomórkowej żółtej jonoforezy Lucyfera w lekko utrwalonej tkance.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocyty są niezbędnymi składnikami obwodów neuronalnych. Obejmują one cały ośrodkowy układ nerwowy (OUN) i są zaangażowane w różne funkcje, w tym usuwanie neuroprzekaźników, regulację jonów, modulację synaptyczną, wsparcie metaboliczne neuronów i regulację przepływu krwi. Astrocyty to złożone komórki, które mają somę, kilka głównych gałęzi i liczne drobne procesy, które kontaktują się z różnymi elementami komórkowymi w neuropilu. Aby ocenić morfologię astrocytów, konieczne jest posiadanie wiarygodnej i powtarzalnej metody wizualizacji ich struktury. Przedstawiamy niezawodny protokół wykonywania wewnątrzkomórkowej jonoforezy astrocytów przy użyciu fluorescencyjnego żółtego barwnika Lucyfera (LY) w lekko utrwalonej tkance mózgowej dorosłych myszy. Ta metoda ma kilka cech, które są przydatne do scharakteryzowania morfologii astrocytów. Pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję poszczególnych astrocytów, co jest przydatne do wykonywania analiz morfologicznych dotyczących różnych aspektów ich budowy. Immunohistochemia wraz z jonoforezą LY może być również wykorzystana do zrozumienia interakcji astrocytów z różnymi składnikami układu nerwowego oraz do oceny ekspresji białek w znakowanych astrocytach. Protokół ten można wdrożyć w różnych mysich modelach zaburzeń OUN w celu rygorystycznego zbadania morfologii astrocytów za pomocą mikroskopii świetlnej. Jonoforeza LY zapewnia eksperymentalne podejście do oceny struktury astrocytów, zwłaszcza w kontekście urazu lub choroby, w której proponuje się, aby komórki te uległy znaczącym zmianom morfologicznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocyty to najliczniejsze komórki glejowe w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Odgrywają rolę w homeostazie jonów, regulacji przepływu krwi, tworzeniu synaps, a także eliminacji i wychwytywaniu neuroprzekaźników1. Szeroki zakres funkcji astrocytów znajduje odzwierciedlenie w ich złożonej strukturze morfologicznej2,3. Astrocyty zawierają kilka pierwotnych i wtórnych gałęzi, które dzielą się na tysiące drobniejszych rozgałęzień i listków, które bezpośrednio oddziałują z synapsami, dendrytami, aksonami, naczyniami krwionośnymi i innymi komórkami glejowymi. Morfologia astrocytów różni się w różnych regionach mózgu, co może wskazywać na ich zdolność do wykonywania swoich funkcji w różny sposób w obwodach neuronalnych4. Co więcej, wiadomo, że astrocyty zmieniają swoją morfologię podczas rozwoju, w warunkach fizjologicznych i w wielu stanach chorobowych3,5,6.

Spójna, powtarzalna metoda jest potrzebna, aby dokładnie określić złożoność morfologii astrocytów. Tradycyjnie, immunohistochemia była wykorzystywana do wizualizacji astrocytów za pomocą markerów białkowych specyficznych dla astrocytów lub wzbogaconych w astrocyty. Jednak metody te ujawniają wzorzec ekspresji białek, a nie strukturę astrocytów. Powszechnie stosowane markery, takie jak kwaśne białko fibrylarne glejowe (GFAP) i β białko wiążące wapń S100 (S100β), nie ulegają ekspresji w całej objętości komórki, a tym samym nie rozwiązują pełnej morfologii7. Genetyczne podejścia do ekspresji białek fluorescencyjnych wszechobecnych w astrocytach (zastrzyki wirusowe lub transgeniczne linie reporterowe myszy) mogą zidentyfikować drobniejsze gałęzie i ogólne terytorium. Jednak trudno jest rozróżnić poszczególne astrocyty, a analizy mogą być stronnicze ze względu na populację astrocytów, do której dąży konkretny promotor8. Mikroskopia elektronowa o przekroju szeregowym została wykorzystana do ujawnienia szczegółowego obrazu interakcji procesów astrocytów z synapsami. Ze względu na to, że tysiące procesów astrocytów kontaktuje się z synapsami, obecnie nie jest możliwe zrekonstruowanie całej komórki za pomocą tej techniki9, chociaż oczekuje się, że zmieni się to dzięki zastosowaniu podejść uczenia maszynowego do analizy danych.

W tym raporcie skupiamy się na procedurze charakteryzowania astrocytów myszy za pomocą wewnątrzkomórkowej jonoforezy z żółtym barwnikiem Lucyfera (LY), używając jako przykładu warstwy promieniowej CA1. Metoda opiera się na pionierskich wcześniejszych pracach Erica Bushonga i Marka Ellismana10,11. Astrocyty z lekko utrwalonych wycinków mózgu są identyfikowane po ich charakterystycznym kształcie somy i wypełnione LY. Komórki są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pokazujemy, w jaki sposób jonoforeza LY może być wykorzystana do rekonstrukcji pojedynczych astrocytów i wykonywania szczegółowych analiz morfologicznych ich procesów i terytorium. Metoda ta może być również stosowana w połączeniu z immunohistochemią w celu identyfikacji relacji przestrzennych i interakcji między astrocytami a neuronami, innymi komórkami glejowymi i naczyniami krwionośnymi mózgu. Uważamy, że jonoforeza LY jest bardzo odpowiednim narzędziem do analizy morfologii w różnych regionach mózgu i mysich modelach zdrowych lub chorobowych stanów7,12,13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Kanclerza Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles. We wszystkich eksperymentach wykorzystano dorosłe myszy (w wieku 6-8 tygodni) różnej płci.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Roztwór sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)
    1. Przygotuj świeży roztwór ACSF (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mM NaHCO3, 11 mM D-glukozy, 1,25 mM Na2HPO4 i 2 mM CaCl2) przed każdym eksperymentem. Dodaj MgCl2 i CaCl2 w ostatnim kroku. Rozpuść składniki w wysokiej jakości wodzie dejonizowanej.
    2. Inkubować roztwór ACSF w temperaturze 35 °C w łaźni wodnej i bańkować 95%O2/5% CO2 przez co najmniej 30 minut przed doświadczeniem.
    3. Dodać 2% chlorowodorku lidokainy, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,02% w ACSF (w 100 ml).
  2. Roztwór utrwalający
    1. Użyj 10% fosforanu buforowanego formaliną.
  3. Roztwór barwnika LY
    1. Przygotować 1,5% roztwór barwnika LY, rozpuszczając sól dilitową LY CH lub sól dipotasową LY CH w 5 mM KCl. Dokładnie odwirować. Objętość 1 ml wystarcza na kilka eksperymentów.
    2. Wirować przez 10 minut przy 16 800 x g. Następnie przefiltrować supernatant za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm do nowej probówki. Podwielokrotności można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
      nuta: Bardzo ważne jest, aby odwirować i przefiltrować roztwór barwnika, aby zapobiec agregacji cząstek barwnika, które mogą zatkać elektrodę.

2. Perfuzja przezsercowa myszy i rozwarstwienie mózgu

  1. Przygotowanie sprzętu i myszy do perfuzji przezsercowej
    UWAGA:     Można używać myszy C57 / BL6 dowolnej płci. Empirycznie zaobserwowano, że aby metoda działała niezawodnie, ważne jest, aby myszy nie były starsze niż 3 miesiące (idealne jest 6-8 tygodni). Protokół perfuzji jest opisany poniżej. Aby uzyskać więcej informacji, znajduje się dodatkowe odniesienie14.
    1. Wyczyść rurkę perfuzyjną z roztworem ACSF, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza w linii. Ustaw narzędzia chirurgiczne w kolejności użycia (pęseta, zakrzywione, nożyczki, nożyczki do tęczówki).
    2. Głęboko znieczulij mysz, umieszczając ją w komorze indukcyjnej izofluranu, po dodaniu 2-3 ml izofluranu do komory. Odczekaj 1-2 minuty, aby znieczulenie zaczęło działać. Upewnij się, że oddychanie nie ustaje.
    3. Test na odruch szczypania palców u stóp. Kontynuuj, gdy mysz nie reaguje na bodziec bólowy i odruch jest nieobecny. Zabezpiecz zwierzę w pozycji leżącej z głową umieszczoną w stożku oddechowym z zapasem 5% izofluranu w tlenie, a kończyny i ogon zaklejone taśmą pod wyciągiem chemicznym.
  2. Perfuzja przezsercowa
    1. Za pomocą pęsety podnieś skórę pod klatką piersiową. Wykonaj nacięcie o długości 5-6 cm zakrzywionymi, nożyczkami przez skórę, aby odsłonić jamę brzuszną. Przeciąć w górę przez ścianę brzucha, aż wątroba i przepona będą widoczne.
    2. Delikatnie odsuń wątrobę od schematu. Nożyczkami do tęczówki wykonaj boczne nacięcie 3−4 cm w przeponie.
    3. Przeciąć klatkę piersiową po obu stronach ciała, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Uważaj, aby nie uszkodzić serca i unikać płuc. Podnieś mostek do góry, aby odsłonić serce.
    4. Gdy serce będzie widoczne, wstrzyknij 0,05 ml roztworu heparyny sodowej (1,000 USP na ml) do lewej komory jako antykoagulant. Następnie ostrożnie wprowadzić igłę perfuzyjną do lewej komory. Upewnij się, że igła pozostaje w komorze i nie przebija się do innych komór serca. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku nożyczkami do tęczówki.
    5. Ukrwić roztworem ACSF z szybkością około 10 ml/min, aż płyn znajdujący się w organizmie zostanie oczyszczony z krwi (1-2 min).
    6. Zamień roztwór ACSF na roztwór utrwalający bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Perfuzja z roztworem utrwalającym przez 10 minut przy 10−20 ml/min.
      ostrożność: Uważaj, aby z nosa nie spływał roztwór utrwalający. Oznacza to, że igła dotarła do prawej komory, a utrwalacz przemieszcza się do płuc, a nie przez obwód ogólnoustrojowy do reszty ciała.
  3. Preparacja mózgu
    1. Usuń głowę myszy nożyczkami i ostrożnie wypreparuj mózg myszy z czaszki. Umieścić w roztworze utrwalającym na 1,5 godziny w temperaturze pokojowej przez krótki okres po utrwaleniu.
      nuta: Dobra perfuzja jest niezbędna do udanej jonoforezy LY. Mózg powinien być koloru białego i nie powinien mieć krwi w naczyniach krwionośnych mózgu. Ciało i kończyny powinny wydawać się sztywne.

3. Przygotowanie plastra

  1. Przygotowanie plastrów hipokampa
    1. Myć mózg 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie osusz mózg bibułą filtracyjną i usuń opuszkę węchową i móżdżek za pomocą ostrej żyletki.
    2. Zamontuj mózg na tacy wibratomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego i napełnij tacę PBS w temperaturze pokojowej. Wyciąć przekroje koronalne hipokampa o grubości 110 μm.
      nuta: Dostosuj ustawienie wibratomu, aby upewnić się, że plastry mają tę samą grubość i równą powierzchnię. W tym eksperymencie użyto ustawienia prędkości 4,5 i ustawienia częstotliwości 8, które są arbitralnymi ustawieniami instrumentu (Tabela materiałów). Użytkownicy mogą być zmuszeni do eksperymentowania z ustawieniami na innych urządzeniach.
    3. Zbierz kawałki z tacki i umieść w naczyniu z PBS na lodzie.

4. Przygotowanie elektrody

  1. Przygotuj ostrą elektrodę o odpowiedniej rezystancji.
    1. Użyj elektrody jednocylindrowej ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem (średnica zewnętrzna 1.0 mm, średnica wewnętrzna 0.58 mm). Pociągnij elektrodę na ściągaczu do mikropipet (tabela materiałów). Idealne elektrody wypełnione 1,5% LY w 5 mM KCl powinny mieć rezystancję 200 MΩ po umieszczeniu w kąpieli PBS.
      nuta: Ustawienie ściągacza różni się w zależności od urządzenia (rodzaj używanej maszyny i filamentu ściągacza). Wyższe ustawienie ciepła zwykle daje dłuższe i drobniejsze końcówki. Dla ściągacza do mikropipet użytego w tym eksperymencie ustawienia były następujące: ciepło: 317, ciągnięcie: 90, prędkość: 70 i opóźnienie: 70. Zastosowano filament typu korytowego.
    2. Przechowuj elektrody w zamkniętym pojemniku, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu do końcówki. Trzymaj elektrody podniesione od dna pudełka, aby zapobiec pęknięciu końcówki.
  2. Napełnij elektrodę roztworem barwnika LY.
    1. Umieść elektrodę w pozycji pionowej z końcówką skierowaną w dół. Odpipetować 1−2 μl roztworu LY do tylnej części elektrody i odczekać 5−10 minut, aż roztwór przesunie się do końcówki poprzez działanie kapilarne.
    2. Delikatnie zabezpiecz napełnioną elektrodę w uchwycie elektrody podłączonym do manipulatora.
      nuta: Srebrny drut uchwytu elektrody musi stykać się z LY wewnątrz elektrody. W razie potrzeby dostosuj objętość roztworu LY, w zależności od długości przewodu.

5. Napełnianie astrocytów jonoforezą

  1. Przetestuj elektrodę.
    1. Delikatnie umieść plasterek mózgu w naczyniu ze szklanym dnem wypełnionym 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej. Przytrzymaj plasterek na miejscu za pomocą platynowej harfy z nylonowymi strunami.
    2. Upewnij się, że elektroda jest podłączona do źródła napięcia i umieść elektrodę uziemiającą w kąpieli zawierającej wycinek mózgu.
    3. Przenieś cel do obszaru mózgu, który Cię interesuje.
    4. Opuść elektrodę do roztworu. Pod jasnym polem przesuń go na środek pola view i dokładnie zbadaj go za pomocą 40-krotnej soczewki zanurzonej w wodzie, aby upewnić się, że jest czysty i bez zanieczyszczeń i pęcherzyków. Jeśli coś zatka końcówkę elektrody, wymień ją na nową.
      nuta: Zatkanie jest problemem dla elektrody 200 MΩ. Przy odwirowaniu i filtracji roztworu barwnika przed każdym eksperymentem nie powinno to być częstym problemem. Ponieważ jednak końcówka elektrody jest mała, tkanka może czasami utknąć w otworze. Autorzy nie znaleźli sposobu, aby temu zapobiec, ale można sobie z tym łatwo poradzić, po prostu używając nowej elektrody.
    5. Obserwować końcówkę elektrody pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym z laserem o długości fali 488 nm. Następnie przetestuj wyrzut barwnika, włączając stymulator przy napięciu 12 V. Zwróć uwagę na dużą chmurę barwnika fluorescencyjnego wokół końcówki elektrody, gdy stymulator jest włączony. Jeśli po stymulacji objętościowej nie zostanie wyrzucony żaden barwnik lub jego niewielka ilość wymiotuje, wymień elektrodę.
    6. Pod jasnym polem powoli opuść elektrodę w kierunku warstwy, zatrzymując się tuż nad powierzchnią.
  2. Wypełnij astrocyt jonoforezą.
    1. Zidentyfikuj astrocyty 40−50 μm poniżej powierzchni wycinka za pomocą kontrastu różnicowego interferencji w podczerwieni (IR-DIC). Szukaj komórek z wydłużonymi, owalnymi somatami o średnicy około 10 μm. Po wybraniu astrocytu przesuń go na środek pola widzenia.
      nuta: Dobra komórka do jonoforezy ma wokół siebie wyraźne, wyraźne granice. Nie wybieraj komórek zbyt blisko powierzchni plasterka, ponieważ nie można ich całkowicie wypełnić. Potrzeba trochę praktyki w ciągu kilku dni, aby móc rutynowo identyfikować astrocyty do wypełnienia barwnikiem. W zależności od obszaru mózgu użytego w eksperymencie, liczba astrocytów może się różnić. Może to wpłynąć na czas potrzebny do zidentyfikowania astrocytu przed wypełnieniem.
    2. Powoli opuść końcówkę elektrody do wycinka, poruszając się po tkance, aż znajdzie się na tej samej płaszczyźnie co korpus komórki.
      nuta: Przesuwaj elektrodę powoli, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
    3. Gdy ciało komórki astrocytu jest wyraźnie widoczne i zarysowane, powoli i delikatnie przesuwaj elektrodę do przodu. Przesuwaj elektrodę, aż końcówka przebije somę ogniwa. Powoli przesuwaj ostrość obiektywu w górę i w dół, aby zauważyć, czy elektroda znajduje się wewnątrz somy.
      nuta: Końcówka elektrody musi znajdować się wewnątrz korpusu komórki i należy obserwować małe wgłębienie na somie. Nie przesuwaj elektrody dalej, aby uniknąć przechodzenia końcówki przez ogniwo.
    4. Gdy końcówka elektrody znajdzie się wewnątrz ogniwa, włącz stymulator przy napięciu ~0,5−1 V i w sposób ciągły wyrzucaj prąd do ogniwa. Za pomocą mikroskopu konfokalnego obserwuj, jak komórka się wypełnia. Zwiększ zoom cyfrowy, aby zobaczyć szczegóły ogniwa i upewnij się, że końcówka elektrody jest widoczna wewnątrz ogniwa.
      nuta: Obniż napięcie, jeśli wydaje się, że barwnik wycieka z ogniwa lub wypełnia inne ogniwa w pobliżu. Jeśli wydaje się, że barwnik nadal wycieka z ogniwa, powoli wyciągnij elektrodę i znajdź inne ogniwo. Ważne jest, aby barwnik nie przeciekał, aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do tła na końcowym obrazie.
    5. Odczekaj około 15 minut, aż drobniejsze gałęzie i procesy pojawią się zdefiniowane, wyłącz napięcie i delikatnie wyjmij końcówkę elektrody z ogniwa.
  3. Obrazowanie wypełnionej komórki.
    UWAGA:     Obrazowanie można wykonać bezpośrednio po wypełnieniu lub po barwieniu immunohistochemicznym. Obiektyw z większą aperturą numeryczną (NA) zapewnia lepszą rozdzielczość.
    1. Poczekaj, aż komórka powróci do pierwotnej postaci przed obrazowaniem (15-20 min) za pomocą obiektywu 40x. Aby zobrazować komórkę, dostosuj ustawienie konfokalnej, aby upewnić się, że drobniejsze gałęzie i procesy wydają się zdefiniowane.
    2. Skonfiguruj stos z krokiem o rozmiarze 0,3 μm. Podczas obrazowania przesuwaj obiektyw, aż nie będzie sygnału z komórki i ustaw go jako górę. Następnie przesuń obiektyw w dół (skupiając się przez komórkę), aż nie będzie sygnału, ustaw go jako dół.
    3. Po zakończeniu obrazowania sprawdź, czy elektroda nie została wyrzucona. Jeśli pojawi się duża chmura barwnika, można ją użyć do następnego plasterka. W przeciwnym razie wymień go na nową elektrodę.
      nuta: Barwienie pojedynczego astrocytu i obrazowanie trwa od około 45 minut do 1 godziny. W tym konkretnym eksperymencie udało się uzyskać około 3-6 komórek na mysz. W razie potrzeby wiele komórek można oznaczyć etykietami na tym samym wycinku. Jednak, aby rozróżnić poszczególne astrocyty, należy zachować odległość około 200 μm między komórkami.

6. Barwienie za pomocą immunohistochemii (opcjonalnie)

  1. Po zakończeniu obrazowania natychmiast umieść plasterek w 10% formalinie na lodzie, aby zachować do celów immunohistochemicznych. Plastry mózgu należy przechowywać w ciemności i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Myj skrawki mózgu 3x w 0,1 M PBS 0,5% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym (tj. Triton X 100) przez 5 minut każda. Następnie inkubować w roztworze blokującym 0,1 M PBS z 0,5% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym i 10% normalną surowicą kozią (NGS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  3. Inkubować skrawki z mieszaniem w pierwszorzędowych przeciwciałach rozcieńczonych w 0,1 M PBS z 0,5% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym i 5% NGS przez 2 dni w temperaturze 4 °C.
    nuta: Ze względu na grubość wycinków mózgu, okres inkubacji przeciwciał pierwotnych musi zostać wydłużony w celu lepszej penetracji, a stężenie przeciwciał może zostać zwiększone. W tym eksperymencie zastosowano rozcieńczenie 1:500 dla przeciwciała anty GFAP i rozcieńczenie 1:500 dla przeciwciała anty akwaporyny-4.
  4. Przemyć skrawki 3x w 0,1 M PBS 0,5% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym przez 10 minut każda, a następnie inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w 0,1 M PBS z 0,5% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym i 10% NGS przez 6 godzin w temperaturze pokojowej.
    nuta: Nie wybieraj przeciwciała wtórnego wzbudzonego przez 488 nm, która jest długością fali używaną do wizualizacji barwnika LY. W tym eksperymencie zastosowano rozcieńczenie 1:1,000 dla koziej anty-kurzej IgG Alexa Fluor 546 (H+L) i Alexa Fluor 647 koziej anty-króliczej IgG (H+L).
  5. Przepłukać sekcje 3x po 0,1 M PBS przez 10 min każda. Następnie zamontuj sekcje na szklanych szkiełkach mikroskopowych w mediach montażowych odpowiednich do fluorescencji. Uszczelki zasuwane. Komórki obrazu o rozmiarze kroku 0,3 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane przedstawione w tym badaniu pochodzą z 7−12 komórek od 4 myszy w każdym eksperymencie. W stosownych przypadkach średnie dane są podawane w panelach rysunkowych.

Aby ocenić morfologię astrocytów, przeprowadziliśmy wewnątrzkomórkową jonoforezę przy użyciu barwnika LY do wypełnienia astrocytów w warstwie radiatum CA1, co jest podsumowane w Rysunek 1. Rycina 2 przedstawia reprezentatywny astrocyt i jego skomplikowaną strukturę morfologiczną. Komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda opisana w tym artykule opisuje sposób wizualizacji morfologii astrocytów za pomocą wewnątrzkomórkowej jonoforezy barwnika LY w lekko utrwalonych wycinkach mózgu. W protokole tym podkreślono kilka krytycznych czynników, które przyczyniają się do udanej jonoforezy LY i morfologicznej rekonstrukcji komórek. Jednym z czynników jest jakość i powtarzalność obrazów, która zależy w dużej mierze od wieku myszy i wyniku perfuzji. W tym badaniu użyliśmy myszy C57 / BL6N w wieku 6-8 tygodni. Udana perfuzja (w dużym stopniu za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Pani Soto, Dr. Yu i Dr. Octeau za wskazówki, jak również komentarze do tekstu. Prace te są wspierane przez NS060677.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% buforowany fosforan formalinyFisherSF 100-20Identyczną alternatywą można zastosować
filtry strzykawkowe Acrodisc z membraną SuporPall4692Identyczną alternatywą można zastosować
Ag/AgCl mielonygranulat WPIEP2Podobną alternatywę można zastosować
Alexa Fluor 546 koza anty-kurczak IgG (H+L)Thermo ScientificA-11040Podobną alternatywę można zastosować
Alexa Fluor 647 kozia anty-królicza IgG (H+L)Thermo ScientificA27040Podobną alternatywę można zastosować
Przeciwciało anty Aquaporin-4Novus BiologicalsNBP1-87679Podobną alternatywę można zastosować
Przeciwciało anty GFAPAbcamab4674Podobną alternatywę można zastosować
Pipety ze szkła borokrzemianowego z żarnikiemŚwiatowe instrumenty precyzyjne1B150F-4
C57BL/6NTac myszyTaconic StockB6Podobną alternatywę można zastosować
Chlorek wapniaSigma21108Identyczną alternatywę można zastosować
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyOlympusFV1000MPEPodobną alternatywę można zastosować
D-glukozaSigmaG7528Identyczny alternatywa może być użyta
Fosforan disodowySigma255793Identyczną alternatywę można zastosować
Ściągacz elektrod - Model P-97SutterP-97Podobną alternatywę można zastosować
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Identyczną alternatywę można zastosować
Heparyna sodowa do wstrzykiwań (1,000 USP na ml)Sagent Pharmaceuticals400-10Identyczną alternatywą może być użyte
oprogramowanie Imaris (wersja 7.6.5)Bitplane Inc.Podobną alternatywę można zastosować
IzofluoranHenry Schein Zdrowie zwierząt29404Identyczną alternatywę można zastosować
Chlorowodorek lidokainy do wstrzykiwań (2%)Maszynka do strzyżenia1050035Identyczną alternatywę można zastosować
Lucyfer Żółty CH sól dilithiumSigmaL0259
Lucyfer Żółty CH sól dipotasowaSigmaL0144
Chlorek magnezuSigmaM8266Można zastosować identyczną alternatywę
Szkło osłonowe mikroskopuThermo Scientific24X60-1Można zastosować identyczną alternatywę
Szkiełka mikroskopoweFisher12-544-2Można zastosować identyczną alternatywę
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS-1000Można zastosować identyczną alternatywę
Soczewka obiektywu (40x)OlympusLUMPLFLN 40XWMożna zastosować podobną alternatywę
Soczewka obiektywu (60x)OlympusPlanAPO 60XPodobną alternatywą można zastosować
tabletki PBS, 100 mlVWRVWRVE404Identyczną alternatywą można zastosować
Mikromanipulator pipetowy - Model ROE-200SutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200Podobną alternatywą może być używany
Chlorek potasuSigmaP3911Można zastosować identyczną alternatywę
Wodorowęglan soduSigmaS5761Można zastosować identyczną alternatywę
Chlorek soduSigmaS5886Można zastosować identyczną alternatywę
Stymulator - Model Omnical 2010Światowe instrumenty precyzyjneOmnical 2010Można zastosować podobną alternatywę
Triton X 100SigmaT8787Można zastosować identyczną alternatywę
Vibratome- Model #3000Pelco100-SMożna zastosować podobną alternatywę

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261(2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143(2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096(2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnawstrzykiwanie barwnika fluorescencyjnegoskrawki tkanki m zgowejprzygotowanie elektrodrekonstrukcja tr jwymiarowaglia kwa ny bia kowy GFAPastrocyty hipokampaanaliza morfologiczna

Powiązane artykuły