Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60230

⸱

28 sierpnia 2019

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Streszczenie

Astrocyty należą do najliczniejszych typów komórek w mózgu dorosłego, gdzie odgrywają kluczowe role w wielu funkcjach. Jako główny gracz w homeostazie mózgu, astrocyty zaopatrują neurony w niezbędne metabolity i buforują wodę zewnątrzkomórkową, jony i glutaminian. Astrocyty, integralny składnik synapsy "trójdzielnej", mają również kluczowe znaczenie w tworzeniu, przycinaniu, utrzymywaniu i modulowaniu synaps. Aby umożliwić te wysoce interaktywne funkcje, astrocyty komunikują się między sobą oraz z innymi komórkami glejowymi, neuronami, naczyniami naczyniowymi mózgu i środowiskiem zewnątrzkomórkowym za pośrednictwem wielu wyspecjalizowanych białek błonowych, które obejmują cząsteczki adhezyjne komórek, akwaporyny, kanały jonowe, transportery neuroprzekaźników i cząsteczki połączeń szczelinowych. Aby wspierać ten dynamiczny przepływ, astrocyty, podobnie jak neurony, polegają na ściśle skoordynowanym i wydajnym transporcie wewnątrzkomórkowym. W przeciwieństwie do neuronów, w przypadku których transport wewnątrzkomórkowy został szeroko opisany, transport oparty na mikrotubulach w astrocytach został mniej zbadany. Niemniej jednak egzo- i endocytarny transport białek błony komórkowej i transport organelli wewnątrzkomórkowych koordynuje normalną biologię astrocytów, a procesy te często są zaburzone w chorobie lub w odpowiedzi na uraz. Tutaj przedstawiamy prosty protokół hodowli wysokiej jakości mysich astrocytów, fluorescencyjnego znakowania interesujących białek i organelli astrocytarnych oraz rejestrowania ich dynamiki transportu wewnątrzkomórkowego za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Pokazujemy również, jak wyodrębnić i określić ilościowo odpowiednie parametry transportu z pozyskanych filmów za pomocą dostępnych wtyczek do analizy obrazu (np. ImageJ/FIJI).

Wprowadzenie

Astrocyty są najliczniejszymi komórkami w dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym, gdzie pełnią unikalne funkcje rozwojowe i homeostatyczne1. Astrocyty modulują rozwój synaps poprzez bezpośredni kontakt z zakończeniami pre- i postsynaptycznymi w ramach synapsy trójdzielnej, która zawiera receptory neuroprzekaźników, transportery i cząsteczki adhezyjne komórek, które ułatwiają tworzenie synaps i komunikację neuron-astrocyty2. Ponadto astrocyty aktywnie kontrolują przekaźnictwo synaptyczne i zapobiegają ekscytotoksyczności neuronów poprzez szybkie usuwanie neuroprzekaźników pobudzających ze szczeliny synaptycznej, recykling neuroprzekaźników i udział w przycinaniu synaptycznym3,4,5,6. Aby umożliwić te wysoce interaktywne funkcje, astrocyty komunikują się między sobą, z innymi komórkami glejowymi i neuronami za pośrednictwem wyspecjalizowanych białek błonowych, w tym cząsteczek adhezyjnych komórek, akwaporyn, kanałów jonowych, transporterów neuroprzekaźników i cząsteczek połączeń szczelinowych. Astrocyty aktywnie zmieniają poziomy powierzchniowe tych białek w odpowiedzi na fluktuacje w ich środowisku wewnątrz- i zewnątrzkomórkowym7. Co więcej, zmiany w poziomach i rozmieszczeniu mitochondriów, kropelek lipidów oraz organelli degradacyjnych i recyklingowych modulują dostarczanie energii, dostępność metabolitów i procesy oczyszczania komórek, które są niezbędne do funkcjonowania i przetrwania astrocytów.

Dynamiczne zmiany w transporcie i pozycjonowaniu białek błonowych i organelli w astrocytach są ułatwione przez skoordynowaną funkcję białek motorycznych i adaptorów, które promują ruchliwość ładunku8,9. Podobnie, poziomy powierzchniowe białek błonowych są modulowane przez zdarzenia internalizacji i recyklingu10. Ładunki te są transportowane przez skomplikowaną sieć aktyny, mikrotubul i możliwie pośrednich ścieżek włókien 8. Badania oparte na barwieniu immunofluorescencyjnym białka wiążącego koniec 1 (EB1), które gromadzi się na rosnących końcach mikrotubul plus, sugerują, że w astrocytach wiązki mikrotubul promieniują z okołojądra i rozciągają swój dodatni koniec w kierunku peryferii11. Nadal jednak brakuje kompleksowego badania organizacji i polaryzacji mikrotubul i innych elementów cytoszkieletu za pomocą obrazowania żywych komórek. Podczas gdy wiele mechanizmów leżących u podstaw dynamiki organelli i białek błonowych zostało szeroko przebadanych w neuronach i innych typach komórek, ruchliwość ładunku w astrocytach jest mniej dobrze poznana. Większość naszej obecnej wiedzy na temat zmian w rozmieszczeniu białek i organelli w astrocytach opiera się na tradycyjnym znakowaniu utrwalonego preparatu opartym na przeciwciałach, co wyklucza precyzyjne przestrzenne i czasowe badanie dynamiki ładunku7,12.

Tutaj opisujemy metodę oznaczania białek błonowych i organelli do obrazowania na żywo w pierwotnych hodowlach astrocytów myszy o wysokiej czystości. Korzystając z tego protokołu, podajemy przykłady, w których śledzimy dynamiczną lokalizację białek błonowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w transfekowanych astrocytach, w tym białka połączenia szczelinowego koneksyny 43 (Cx43-GFP) i pobudzającego transportera aminokwasów 1 (EAAT1-GFP). Opisujemy również zastosowanie fluorescencyjnej sondy acidotropowej do wizualizacji kwaśnych organelli i śledzenia ich dynamiki transportu w żywych astrocytach. Na koniec pokazujemy, jak analizować dane poklatkowe w celu wyodrębnienia i oceny parametrów transportowych dla poszczególnych ładunków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą University of North Carolina w Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Sekcja mózgu i hodowla pierwotnych astrocytów myszy

UWAGA: Poniższy protokół został zaadaptowany z opublikowanych metod, który jest zgodny z oryginalną procedurą opracowaną przez McCarthy'ego i deVellisa13,14,15. Mieszane hodowle komórkowe astrocytów McCarthy'ego / deVellisa (MD) przygotowuje się z kory myszy w 2-4 (P2-P4) po urodzeniu, traktuje czynnikiem antymitotycznym i oczyszcza w celu uzyskania końcowej wzbogaconej kultury astrocytów. Cztery korowe małżówki od młodych myszy obu płci wystarczą do wytworzenia jednej kultury w kolbie tkankowej T75.

  1. Pokryć dno kolb T75 (100% kątowy dostęp do szyjki, 0,22 μm hydrofobowa wentylowana nasadka filtra) poli-D-lizyną (1 mg/ml w 0,1 M buforze Tris, pH 8,5) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny przed rozpoczęciem rozbioru .
  2. Przed rozpoczęciem procedury preparacji należy ogrzać 30 ml pożywki do hodowli astrocytów (zmodyfikowana pożywka Eagle's [DMEM] firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny) w temperaturze 37 °C i rozmrozić 5 ml podwielokrotności 2,5% trypsyny na lodzie. Przygotuj dwie naczynia do preparowania (średnica 60 mm) na lodzie wypełnionym 6 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) bez Ca2+ lub Mg2+.
  3. Zdezynfekuj wszystkie narzędzia chirurgiczne (pęseta z cienką końcówką, nożyczki preparacyjne, proste nożyczki Vannas, kleszcze Graefe z zakrzywionymi końcówkami) w 70% etanolu przed i pomiędzy każdym rozwarstwieniem.
  4. Spryskaj głowę i szyję szczeniąt myszy P2-P4 70% etanolem, a następnie szybko poddaj je eutanazji przez ścięcie nożyczkami chirurgicznymi. Wykonaj nacięcie od tyłu do przodu linii środkowej wzdłuż skóry głowy, aby odsłonić czaszkę. Ostrożnie przeciąć czaszkę od szyi do nosa.
  5. Wykonaj dwa dodatkowe boczne nacięcia nad oczami. Za pomocą pęsety z cienką końcówką delikatnie odwróć klapki czaszki na bok. Usuń mózg i umieść go w pierwszym naczyniu preparacyjnym wypełnionym lodowatym HBSS bez Ca2+ lub Mg2+. Trzymaj naczynie na lodzie i kontynuuj zbieranie reszty mózgów.
    UWAGA: Pozostałą część procedury preparacji należy wykonać w lunecie preparacyjnym.
  6. Usuń opuszki węchowe za pomocą nożyczek Vannas lub cienkiej pęsety (Rysunek 1Ai). Z zakrzywionymi kleszczami końcówkowymi na przecięciu szczelin poprzecznych i międzypółkulowych, delikatnie włóż drugą parę kleszczyków z zakrzywioną końcówką między korą a międzymózgowiem, powoli otwierając kleszcze, aby oddzielić półkule mózgowe od reszty mózgu (Rysunek 1Aii,Aiii). Usuń niechcianą tkankę (Rysunek 1Aiv).
  7. Dla każdej półkuli korowej ostrożnie usuń opony mózgowe pęsetą z cienką końcówką. Opcjonalnie usuń hipokamp z kory mózgowej. Przenieś wypreparowaną korę myszy do drugiego naczynia wypełnionego lodowatym HBSS bez Ca2+ lub Mg2+ i trzymaj je na lodzie podczas preparowania pozostałych mózgów.
    UWAGA: Kolejne kroki należy wykonywać w warunkach aseptycznych w okapie z przepływem laminarnym.
  8. Wypreparowaną korę mózgową pokrój na małe kawałki (około 2−4 mm) za pomocą sterylnych ostrych nożyczek chirurgicznych lub skalpela. Przenieś wypreparowaną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej roztwór enzymu (22,5 ml HBSS bez Ca2+ lub Mg2+, 2,5 ml 2,5% trypsyny). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut z łagodną inwersją co 10 minut.
  9. Zebrać strawioną tkankę przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut i usunąć roztwór enzymu przez dekantację (nie używać aspiratora próżniowego). Dodać 10 ml pożywki do hodowli astrocytów i zdysocjować tkankę na pojedyncze komórki, pipetując roztwór 20−30x za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
  10. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 70 μm, aby zminimalizować grudki komórek i niestrawioną tkankę. Zebrać filtrat w czystej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dostosować całkowitą objętość do 20 ml za pomocą pożywki do hodowli astrocytów. W tym momencie oceń skuteczność dysocjacji korowej, mieszając 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego i licząc komórki za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Jeden preparat z czterech kory myszy P2−P4 daje 10−15 x 106 pojedynczych komórek.
  11. Odessać roztwór powlekający poli-D-lizyną z kolb hodowlanych T75 i przemyć dwukrotnie sterylną wodą. Umieścić zawiesinę komórek o objętości 20 ml i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

2. Oczyszczanie i utrzymanie kultur astrocytów

UWAGA: Wykonaj wszystkie zmiany mediów w warunkach aseptycznych w okapie z przepływem laminarnym, używając sterylnego, przefiltrowanego (0,22 μm membrany filtrującej) pożywki astrocytowej podgrzanej do 37 °C.

  1. Wymień pożywkę komórkową 48 godzin po posiewie (dzień in vitro 2, DIV2).
  2. W DIV5 zastąp pożywkę świeżą pożywką do hodowli astrocytów uzupełnioną 10 μM arabinozydem cytozyny (AraC).
    UWAGA: Ten krok ułatwia usuwanie komórek zanieczyszczających, w tym fibroblastów i innych komórek glejowych. Ważne jest, aby traktować kultury AraC nie dłużej niż 48 godzin, ponieważ dłuższy czas inkubacji zmniejszy żywotność astrocytów.
  3. W DIV7 zmień pożywkę na pożywkę do hodowli astrocytów bez AraC i zacznij codziennie sprawdzać konfluencję hodowli. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, pokryć dwie kolby T75 dla każdej nieoczyszczonej kolby hodowli astrocytów poli-D-lizyną i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 8 godzin do nocy.
  4. Następnego dnia należy rozpocząć oczyszczanie astrocytów od wytrząsania kolb hodowlanych z prędkością 180 obr./min przez 30 minut w inkubatorze do wytrząsania orbitalnego o temperaturze 37 °C. Usuń pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką do hodowli astrocytów. Wytrząsać komórki z prędkością 240 obr./min przez 6 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym o temperaturze 37 °C. Podgrzej 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pożywkę do hodowli astrocytów i 0,25% trypsyny-EDTA do 37 °C 20−30 minut przed końcem okresu wytrząsania.
    UWAGA: Inkubacja CO2 nie jest wymagana podczas etapów wytrząsania. W razie potrzeby pożywki zebrane po 30-minutowym i 6-godzinnym etapie wytrząsania można wykorzystać do hodowli odpowiednio mikrogleju i oligodendrocytów. Traktowanie mieszanej kultury AraC zmniejszy jednak liczebność innych komórek glejowych.
  5. Wyjąć kolby hodowlane z wytrząsarki i natychmiast zastąpić pożywkę 10 ml ciepłego 1x PBS na kolbę. Usunąć PBS i dodać 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA na kolbę. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , sprawdzając co 5 minut, czy nie doszło do oderwania.
  6. Po odłączeniu komórek od kolby należy zatrzymać trypsynizację, dodając 10 ml pożywki do hodowli astrocytów. Przenieść oderwane astrocyty do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i komórek osadu przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 40 ml pożywki do hodowli astrocytów.
  7. Kolby T75 pokryte poli-D-lizyną przemyć dwukrotnie sterylną wodą i rozlać na płytkę 20 ml oczyszczonej zawiesiny astrocytów. Wrócić do inkubatora o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę do hodowli astrocytów co dwa dni przez dodatkowe 10 dni, aż astrocyty dojrzeją.
    UWAGA: Każda kolba T75 oczyszczonych astrocytów powinna wystarczyć do wytworzenia 2 nowych kolb T75 z 3 x 105 komórek każda podczas posiewu.
  8. Powtórz kroki 2,5−2,7 dla kolejnych przejść lub dla płytki astrocytów do mikroskopii.
    UWAGA: Czystość kultur astrocytów po dodaniu AraC i po oczyszczeniu można ocenić jakościowo za pomocą mikroskopii jasnego pola, a dokładniej przez ilościowe określenie procentu komórek dodatnich pod względem białka kwasu fibrylarnego glejowego (GFAP) w polu widzenia na obrazach fluorescencyjnych (Rysunek 1B,C).

3. Transfekcja fluorescencyjnie znakowanych plazmidów

  1. Dzień przed transfekcją lub etykietowaniem wysiewaj astrocyty o pożądanej gęstości do obrazowania 24−48 godzin po transfekcji. Zalecana gęstość dla płytek 24-dołkowych lub studzienek ze szklanym dnem o średnicy 14 mm wynosi 2 x 104 komórek/dołek.
    UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem transfekcji astrocytów posianych na 12-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowych płytkach lub 14-milimetrowych szklanych dołkach dolnych przy użyciu metody opartej na lipofekcji. Odczynniki powinny być skalowane w zależności od wielkości naczynia hodowlanego, w którym rosną astrocyty.
  2. Rozcieńczyć odczynnik do lipofekcji (tabela materiałów) w pożywce o zredukowanej surowicy (tabela materiałów). Aby zoptymalizować stosunek odczynnika do lipofekcji do DNA, należy przetestować szereg odpowiednich rozcieńczeń. Na przykład, jeśli używasz odczynnika zastosowanego w tym protokole (Tabela materiałów), rozcieńczyć 2, 3, 4 i 5 μl odczynnika do lipofekcji w 50 μl pożywki o obniżonej surowicy.
  3. Rozcieńczyć 5 μg DNA o wysokiej czystości w 250 μl pożywki o zredukowanej surowicy. Dodać 5 μl odczynnika wzmacniającego lipofekcję (tabela materiałów). Połączyć probówkę zawierającą odczynnik do lipofekcji z równą objętością mieszaniny wzmacniacza DNA i lipofekcji. Mieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut.
  4. Usuń pożywkę do hodowli astrocytów i dodaj mieszaninę transfekcyjną (krok 3.3) do komórek kroplami. Po 6-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 należy zastąpić kompleks transfekcji odpowiednią ilością pożywki do hodowli astrocytów (2 ml dla naczyń ze szklanym dnem o średnicy 14 mm). Inkubuj przez dodatkowe 24−72 godziny przed przystąpieniem do akwizycji obrazu. Ściśle monitoruj czas trwania etapu inkubacji, aby osiągnąć najlepszą równowagę między ekspresją białka a żywotnością komórek.

4. Znakowanie późnych endosomów/lizosomów za pomocą sond fluorescencyjnych

UWAGA: Niektóre ładunki mogą być oznaczone barwnikami fluorescencyjnymi o wysokim powinowactwie do białek specyficznych dla ładunku. Poniższy przykład pozwala na znakowanie późnych endosomów/lizosomów za pomocą fluorescencyjnej sondy acidotropowej.

  1. Rozcieńczyć sondę znakującą lizosomami (tabela materiałów) w 200 μl pożywki do hodowli astrocytów do stężenia roboczego 1 μM i zastosować do astrocytów z kroku 3.1 o gęstości 2 x 104 komórki/basenik. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Umyj komórki raz ciepłym podłożem do hodowli astrocytów i zastąp je pożywką do obrazowania (tabela materiałów). Natychmiast przejdź do obrazowania na żywo.

5. Akwizycja obrazu za pomocą systemu obrazowania poklatkowego

UWAGA: Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym powinno być wykonywane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w szybką kamerę, określoną ostrość, komorę inkubacyjną i obiektyw olejowy o powiększonej aperturze 40x (np. Plan-Apochromat 1.4NA). Dostępnych jest wiele programów do akwizycji obrazów poklatkowych. Wybór systemu mikroskopowego i oprogramowania do akwizycji powinien opierać się na ich dostępności i przydatności do celów konkretnego badania. Poniżej znajduje się kilka ogólnych wskazówek.

  1. Umieść komorę lub naczynie hodowlane w odpowiednim adapterze na stoliku mikroskopu. Używając światła epifluorescencyjnego, wybierz komórkę (komórki), które wyrażają białka fluorescencyjne lub sondę do nagrania. Dostosuj oświetlenie próbki fluorescencyjnej, aby zobrazować wybrane komórki za pomocą aparatu cyfrowego. Unikaj używania wysokiego oświetlenia, które może powodować fotowybielanie i fototoksyczność. Dostosuj ostrość i powiększenie.
  2. Rejestruj pojedyncze serie poklatkowe ze stosem Z z częstotliwością 1 klatki co 2 s w odstępach czasu od 300 s do 500 s za pomocą funkcji zoomu i określonego ostrości.
    UWAGA: Dynamika transportu (prędkość, częstotliwość ruchu itp.) będzie się różnić w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania, dlatego przebieg akwizycji w czasie może wymagać korekty. Na przykład mitochondria są mniej ruchliwe niż lizosomy i wykazują częste przerwy. W tym przypadku bardziej odpowiednie jest ustawienie parametrów akwizycji na 1 klatkę co 5 s przez 800 s.
  3. Zapisuj obrazy poklatkowe i eksportuj je jako pliki stosu AVI lub TIFF.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Analiza obrazu została przeprowadzona przy użyciu wtyczki KymoToolBox dla ImageJ/Fiji16. Szczegółowe instrukcje krok po kroku są dostępne online17. Poniższe skrócone kroki powinny wystarczyć do stworzenia kimografów i wyodrębnienia parametrów transportu cząstek.

  1. Otwórz sekwencję zdjęć poklatkowych w oprogramowaniu ImageJ/Fiji. Importuj obrazy z menu Plik jako pliki stosu AVI lub TIFF. Przekonwertuj obrazy na 8- lub 16-bitowe, wybierając jeden z tych typów obrazów za pomocą narzędzia Tekst z menu Obraz. W przypadku pracy z plikami RGB podziel kanały za pomocą narzędzia Podziel kanał dostępnego w sekcji Kolor w menu Obraz.
  2. Aby wygenerować kimograf (reprezentacja trajektorii cząstek w pozycji i czasie), narysuj każdą ścieżkę, po której poruszają się cząstki, śledząc linię wzdłuż trajektorii cząstek za pomocą narzędzia do podziału na segmenty. Aby poprawnie przypisać kierunkowość ruchu, narysuj polilinię, używając tej samej żądanej konwencji kierunkowej dla wszystkich filmów, tak aby polaryzacja była spójna we wszystkich badanych komórkach i we wszystkich nich. Na przykład narysuj polilinię od środka komórki w kierunku obrzeża lub odwrotnie. Dostosuj szerokość linii, aby dopasować ją do grubości ścieżki, klikając dwukrotnie narzędzie Linia.
  3. Uruchom makro Draw Kymo wtyczki KymoToolBox, używając linii o szerokości 10. Pojawi się monit z prośbą o kalibrację obrazu w czasie (liczba klatek, liczba klatek na sekundę) i przestrzeni (rozdzielczość x,y). Po kalibracji kimografy są generowane i mogą być zapisywane jako pliki TIFF w celu prezentacji danych lub dalszej analizy cząstek.
  4. Przypisz trajektorie cząstek, ręcznie śledząc każdą cząstkę w kimografie za pomocą narzędzia do segmentacji liniowej przez cały czas trwania akwizycji. Rejestruj trajektorię każdej cząstki jako obszar zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia do zarządzania zwrotem z inwestycji, które znajduje się w menu Analizuj/Narzędzia. Zapisz wszystkie ROI dla każdego filmu poklatkowego do dalszej analizy.
    UWAGA: Bardzo ważne jest przypisanie prawidłowej trajektorii dla poszczególnych cząstek na kimografie, aby uzyskać jak najdokładniejsze obliczenia parametrów transportu.
    1. Uruchom makro Analyze Kymo wtyczki KymoToolBox. Otworzy się okno z prośbą o zdefiniowanie "na zewnątrz" kierunku ruchu cząstek (od lewej do prawej lub odwrotnie) z rozwijanego menu. Wybór ten zależy od położenia zobrazowanych ładunków fluorescencyjnych względem jądra lub obrzeża komórki, jak ustalono w kroku 6.2. Na przykład, jeśli jądro znajduje się na lewo od ładunku, a polilinia w kroku 6.2 została odciągnięta od jądra, zdefiniuj ruch cząstek na zewnątrz jako "od lewej do prawej".
    2. Zdefiniuj prędkość graniczną (minimalną prędkość, przy której ładunek jest uważany za ruchliwy) w oknie Analizuj Kymo. W przypadku ładunków, które poruszają się z dużą prędkością transportu wewnątrzkomórkowego, 0,1 μm/sekundę jest odpowiednim wyborem. Zmodyfikuj tę wartość, aby dostosować czułość oprogramowania do każdego interesującego ładunku. Dostosuj szerokość linii, aby dopasować ją do grubości trajektorii każdej cząstki.
    3. Wybierz opcje Rejestruj wszystkie dane i Rejestruj ekstrapolowane współrzędne w oknie Analizuj kymo. Pozwoli to obliczyć różne parametry transportu ładunku, w tym prędkość średnią, prędkość wewnętrzną, prędkość zewnętrzną, łączną przebytą odległość, odległość przebytą w kierunku wewnętrznym lub zewnętrznym, liczbę przełączników dla każdej cząstki, procent czasu poruszającego się w każdym kierunku lub zatrzymanego itp. Dane obliczone dla poszczególnych ścieżek są następnie łączone według kimografu i zapisywane w plikach tekstowych specyficznych dla każdego obrazu.
      UWAGA: Opcja Pokaż kolorowe Kymo makra Analizuj Kymo generuje oznaczoną kolorami nakładkę ścieżki na oryginalny kimograf. Cząstki poruszające się na zewnątrz są pokolorowane na zielono, do wewnątrz na czerwono, a cząstki stacjonarne na niebiesko. Opcja Współrzędne raportu na oryginalnym stosie makra Analizuj Kymo generuje oznaczoną kolorami nakładkę położenia ekstrapolowanego obiektu na oryginalnym filmie poklatkowym i kimografie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany powyżej protokół izolacji pierwotnych astrocytów z MD myszy powinien pozwolić na uzyskanie powtarzalnych kultur wysokiej jakości. Chociaż kultury początkowo zawierają mieszaninę astrocytów, fibroblastów i innych komórek glejowych, w tym mikrogleju i oligodendrocytów (Rycina 1Bi,Biv; czerwone groty strzałek), dodanie AraC do mieszanej kultury między 5. a 7. dniem in vitro (DIV5-DIV7) minimalizuje proliferację tych komórek zanieczyszczających. Połączenie traktowania Ar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy eksperymentalne podejście do ekspresji, wizualizacji i śledzenia fluorescencyjnie znakowanych organelli i białek błonowych będących przedmiotem zainteresowania za pomocą mikroskopii wideo poklatkowej w pierwotnych astrocytach korowych MD myszy o wysokiej czystości. Przedstawiamy również metodologię pomiaru dynamiki cząstek. Bezpośrednia wizualizacja dynamiki białek i organelli w astrocytach pierwotnych stanowi potężne narzędzie do badania regulacji transportu wewnątrzkomórkowego w tych komórkach i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

DNL był wspierany przez University of North Carolina w Chapel Hill (UNC) School of Medicine jako stypendysta Simmonsa. TWR był wspierany przez UNC PREP Grant R25 GM089569. Prace z wykorzystaniem UNC Neuroscience Center Microscopy Core Facility były częściowo wspierane przez finansowanie z NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 oraz NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center U54 HD079124.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,5% trypsyna (10x)Gibco15090-046
Wirówka stołowaThermo Scientific75-203-637Wirówka Sorvall ST8 Klasa
komórkowych Klasa WaterGen Clone25-511
Mikroskop do hodowli komórkowychZeissWSN-AXIOVERT A1Vert.A1, odwrócony mikroskop do hodowli tkanek z możliwością
fluorescencjiCytozyna ArabinosideSigmaC1768-100MG(AraC) Rozpuść liofilizowany proszek w sterylnej wodzie klasy hodowli komórkowej, aby uzyskać 10 mM bulionu, podwielokrotność i zamrozić do długotrwałego przechowywania
DAPISigmaD9542-5MGRozpuść liofilizowany proszek w wodzie dejonizowanej do maksymalnego stężenia 20 mg / ml, podgrzej lub sonikuj w razie potrzeby. Stosować przy 300 nM do barwienia przeciwstawnego.
Mikroskop preparacyjnyZeissStemi 305
Nożyczki preparacyjneFST14558-09
Zmodyfikowany klon Dulbecco's Eagle MediumGen25-500
Płodowa surowica bydlęcaGemini100-106Inaktywowana termicznie
FIJI (Fidżi to tylko obraz J)NIH Wersja 1.52i
Pęseta z cienką końcówkąFST11254-20Styl #5
Fluorescencyjne źródło światłaExcelitas012-63000X-Cite 120Q
GFAPprzeciwciało Cell Signaling3670SGFAP (GA5) mysie przeciwciało monoklonalne
Naczynia ze szklanym dnemMattek corporationP35G-1.5-14-C35 mm Dish | Nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe | Średnica szkła 14 mm | Niepowlekane
kleszcze GraefeFST11054-10Graefe Kleszcze do tęczówki z zakrzywionymi końcówkami
Zielony barwnik fluorescencyjny, który barwi kwaśne przedziały (późne endosomy i lizosomy)Life TechnologiesL7526LysoTracker Green DND 26. Wstępnie rozpuszczony w DMSOS do roztworu podstawowego o wielkości 1 mM. Rozcieńczyć do końcowego stężenia roboczego w wybranym pożywce wzrostowej lub buforze.
Zbilansowany roztwór soli Hanka (10x)Gibco14065-056Bez magnezu i wapnia
Media obrazoweTechnologie życiaA14291DJRoztwór do obrazowania żywych komórek
Odwrócony mikroskop konfokalnyZeissLSM 780
KymoToolBoxhttps://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Odczynnik wzmacniający lipofekcjonęLife Technologies11514015Plus Odczynnik
Lipofection OdczynnikLife Technologies15338100Odczynnik Lipofectamine LTX
Inkubator z wytrząsaniem orbitalnymNew Brunswick Scientific8261-30-1008Innova 4230, inkubator do wytrząsania orbitalnego z regulacją temperatury i prędkości
100x)Gen Clone25-512
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)Gen Clone25-507x
Bromowodorek poli-D-lizynySigmaP7405Rozpuścić w buforze Tris, pH 8,5, w 1 mg / ml. Zamrażać do długotrwałego przechowywania. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania
Zredukowana pożywka surowicyGibco31985-062OPTI-MEM
Kolby do kultur tkankowychOlympus Plastics25-20975 cm^2. 100% kątowy dostęp do szyjki, hydrofobowa wentylowana nasadka filtra 0,22um
Inkubator do hodowli tkankowychThermo Scientific51030285HERAcell VIOS 160i, inkubator kultur tkankowych z kontrolą
temperatury, wilgotności i CO2Tris-BaseSigmaT15038,402 g rozpuszczony do jednego litra w wodzie z 4,829 g Tris HCl w celu uzyskania 0,1 M buforu Tris, pH 8,5
Tris-HClSigmaT32534,829 g rozpuszczony do jednego litra w wodzie z 8,402 g Tris Base do wytworzenia 0,1 M buforu Tris, pH 8,5
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco25200072
Próżniowe systemy filtracyjneOlympus Plastics25-227500 ml, membrana PES, 0,22 &mikro;
m Nożyczki Vannas prosteRobozRS-5620
hodowli Odwrócony zakres (

Bibliografia

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  2. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
  3. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
  4. Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
  5. Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
  6. Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370(2015).
  7. Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
  8. Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
  9. Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
  10. Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
  11. Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217(2015).
  12. Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
  13. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079(2013).
  14. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  15. Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
  16. Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
  17. Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. , Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

hodowla astrocyt wmikroskopia konfokalnaobrazowanie time lapseanaliza kymograficznaledzenie organelliznakowanie fluorescencyjneanaliza w programie ImageJsondy lizosomalnetransfekcja lipofekcyjna
Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.