Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60233

⸱

18 września 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Loyola University Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Streszczenie

Prawidłowy rozwój układu nerwowego obejmuje tworzenie bariery krew-mózg, bariery dyfuzyjnej, która ściśle reguluje dostęp do układu nerwowego i chroni tkankę nerwową przed toksynami i patogenami. Defekty w tworzeniu tej bariery zostały skorelowane z neuropatiami, a załamanie tej bariery zaobserwowano w wielu chorobach neurodegeneracyjnych. Dlatego tak ważne jest zidentyfikowanie genów, które regulują tworzenie i utrzymywanie bariery krew-mózg, aby zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne. Aby zrozumieć dokładne role, jakie te geny odgrywają w rozwoju neuronalnym, konieczne jest zbadanie wpływu zmienionej ekspresji genów na integralność bariery krew-mózg. Stwierdzono, że wiele cząsteczek, które działają w tworzeniu bariery krew-mózg, jest zachowanych u gatunków eukariotycznych, w tym muszki owocowej, Drosophila melanogaster. Muszki owocowe okazały się doskonałym systemem modelowym do badania mechanizmów molekularnych regulujących rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego. Protokół ten opisuje krok po kroku procedurę oznaczania integralności bariery krew-mózg podczas embrionalnych i larwalnych stadiów rozwoju D. melanogaster.

Wprowadzenie

Podczas rozwoju, komunikacja i interakcje między komórkami są kluczowe dla ustanowienia struktury i funkcji tkanek i organów. W niektórych przypadkach te interakcje komórka-komórka uszczelniają narządy od otaczającego środowiska, aby zapewnić prawidłowe funkcjonowanie narządów. Dotyczy to układu nerwowego, który jest izolowany przez barierę krew-mózg (BBB). Dysfunkcja bariery krew-mózg u ludzi została powiązana z zaburzeniami neurologicznymi, w tym padaczką, a uszkodzenie bariery zaobserwowano w chorobach neurodegeneracyjnych, w tym stwardnieniu rozsianym i stwardnieniu zanikowym bocznym1. U ssaków bariera krew-mózg jest tworzona przez ścisłe połączenia między komórkami śródbłonka2,3. Inne zwierzęta, w tym muszka owocowa, Drosophila melanogaster, mają barierę krew-mózg złożoną z komórek glejowych. Te komórki glejowe tworzą selektywnie przepuszczalną barierę kontrolującą przepływ składników odżywczych, produktów przemiany materii, toksyn i dużych cząsteczek do i z układu nerwowego4. Pozwala to na utrzymanie gradientu elektrochemicznego niezbędnego do wyzwolenia potencjałów czynnościowych, co pozwala na mobilność i koordynację4. U D. melanogaster glej chroni układ nerwowy przed bogatą w potas, podobną do krwi hemolimfą5.

W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i obwodowym układzie nerwowym (PNS) D. melanogaster, dwie zewnętrzne warstwy glejowe, glej podperynkowy i glej okołonerwowy, a także zewnętrzna sieć macierzy zewnątrzkomórkowej, blaszka nerwowa, tworzą barierę hemolimfa-mózg i hemolimfę-nerw6, określaną w tym artykule jako bariera BBB. Podczas rozwoju glej podokołonerwowy staje się poliploidalny i powiększa się, otaczając układ nerwowy5,6,7,8,9,10,11. Glej podokołonerwowy tworzy połączenia przegrodowe, które stanowią główną barierę dyfuzyjną między hemolimfą a układem nerwowym5,6,12. Połączenia te są molekularnie podobne do połączeń przypominających przegrody znajdujących się w parawędach mielinizującego gleju u kręgowców i pełnią tę samą funkcję, co połączenia ścisłe w BBB ssaków13,14,15,16,17. Glej okołonerwowy dzieli, rośnie i owija się wokół gleju podokołonerwowego, aby regulować dyfuzję metabolitów i dużych cząsteczek6,10,18,19. Formowanie BBB jest zakończone po 18,5 h po złożeniu jaj (AEL) w temperaturze 25 °C5,8. Wcześniejsze badania zidentyfikowały geny, które są krytycznymi regulatorami powstawania BBB20,21,22. Aby lepiej zrozumieć dokładną rolę tych genów, ważne jest zbadanie wpływu mutacji tych potencjalnych regulatorów na integralność bariery krew-mózg. Podczas gdy poprzednie badania nakreśliły podejścia do oznaczania integralności BBB w zarodkach i larwach, kompleksowy protokół tego testu nie został jeszcze opisany5,7. Ten protokół krok po kroku opisuje metody oznaczania integralności BBB podczas stadiów embrionalnych i larwalnych w trzecim stadium rozwojowym D. melanogaster.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie próbek

  1. Pobieranie zarodków
    1. W każdej klatce do pobierania zarodków należy użyć co najmniej 50 dziewiczych samic i 20-25 samców do pobrania. Wysiaduj te muchy w butelce z pokarmem z mąki kukurydzianej (Tabela materiałów) przez 1−2 dni przed rozpoczęciem zbiorów23.
      nuta: Można użyć więcej much, ale stosunek samic do samców powinien być utrzymany na poziomie 2:1.
    2. Wstępnie podgrzej talerze agarowe z sokiem jabłkowym (tabela 1) w temperaturze 25 °C przez noc.
      nuta: Jest to wymagane do prawidłowej oceny zarodków. Jeśli płytki szybko wysychają, dodaj miskę z wodą do inkubatora, aby zwiększyć wilgotność w komorze.
    3. Znieczulić muchy z kroku 1.1.1 za pomocą CO2 i przenieść muchy do klatki zbiorczej. Umieść wstępnie podgrzany talerz agarowy z sokiem jabłkowym z niewielką ilością pasty drożdżowej na otwartym końcu i przymocuj do klatki za pomocą czerwonej tulei (Tabela materiałów). W celu usunięcia starszych zarodków należy pozwolić muchom na złożenie zarodków/jaj na płycie z sokiem jabłkowym na płycie z sokiem jabłkowym przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.
    4. Wyjąć klatkę zbiorczą z inkubatora. Odwróć siatkę klatki stroną do dołu i dotknij muchy w dół na dno klatki. Zastąp agar z sokiem jabłkowym nowym, wstępnie podgrzanym talerzem agarowym z sokiem jabłkowym z niewielką ilością pasty drożdżowej. Wyrzuć pierwszą płytkę.
    5. Pozwolić muszkom na złożenie zarodków/jaj na nowej płytce z sokiem jabłkowym na 1 godzinę w temperaturze 25 °C. Po upływie 1 godziny pobierania należy odrzucić tę płytkę i przejść do następnego etapu pobierania zarodków do wstrzykiwań.
    6. W celu zebrania zarodków w późnym stadium 17 (20−21 h AEL), należy pozwolić muszkom o pożądanym genotypie z kroków 1.1.1−1.1.5 położyć się na nowych, wstępnie podgrzanych płytkach agarowych z sokiem jabłkowym z niewielką ilością pasty drożdżowej w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Tabliczka wieku przez 19 godzin w inkubatorze w temperaturze 25 °C, Tak więc zarodki będą miały 20−21 godzin w momencie obrazowania.
      nuta: Ten krok można powtórzyć w razie potrzeby w przypadku wielu rund pobierania próbek, wstrzykiwania i obrazowania.
    7. Zebrać zarodki z płytek do sitka komórkowego z siatką nylonową o grubości 70 μm, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym (PBTx; Tabela 1) pokryć powierzchnię płytki i spulchnić zarodki z powierzchni za pomocą pędzla.
    8. Zarodki dechorionatu zebrane w sitku komórkowym w 50% roztworze wybielacza (Tabela 1) na 100-milimetrowej szalce Petriego przez 5 minut, od czasu do czasu mieszając w temperaturze pokojowej. Opłucz zarodki 3x, obracając sitko komórkowe w PBTx na szalce Petriego, za każdym razem używając świeżego naczynia z PBTx.
    9. Jeśli wszystkie zarodki mają prawidłowy genotyp, należy przejść bezpośrednio do kroku 1.1.10. Jeśli uzyskanie zarodków o prawidłowym genotypie wymaga krzyżówki z muszkami heterozygotycznymi, należy wybrać zarodki o prawidłowym genotypie, wykorzystując obecność lub brak fluorescencyjnie oznaczonych chromosomów równoważących. Do wyboru genotypu należy użyć mikroskopu stereoskopowego z funkcjami fluorescencyjnymi.
      nuta: Chromosomy równoważące oznaczone zdeformowanym żółtym białkiem fluorescencyjnym; Kruppel-Gal4, UAS-zielone białko fluorescencyjne (GFP); i twist-Gal4, UAS-GFP dobrze sprawdzają się w selekcji genotypu w późnej embriogenezie (Tabela 2)24,25,26.
    10. Za pomocą szklanej pipety przenieś zarodki z PBTx do 2% płytki z żelu agarozowego (Tabela 1). Usuń nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej. Wyrównaj ~6−8 zarodków na 2% płycie żelu agarozowego z tylną stroną po prawej i grzbietowej skierowaną do góry (Rysunek 1B).
      nuta: Mikropyle, mały otwór, przez który plemniki dostają się do komórki jajowej, znajduje się na przednim końcu zarodka. Tylny koniec jest bardziej zaokrąglony. Tchawica wydaje się biała i znajduje się grzbietowo w zarodku, co pozwala na rozróżnienie grzbietowej i brzusznej strony zarodka (Ryc. 1B).
    11. Przygotuj szkiełko z jednym kawałkiem taśmy dwustronnej. Mocno dociśnij szkiełko na górze zarodków, aby przenieść je na taśmę dwustronną.
    12. Wysuszyć zarodki przez inkubację w temperaturze pokojowej przez ~25 min (nie stosuje się środka osuszającego). Po wysuszeniu przykryj zarodki olejem halowęglowym.
      nuta: Okresy osuszania mogą się różnić w zależności od temperatury, wilgotności i wentylacji w pomieszczeniu. Okres inkubacji powinien być wykorzystany do ustawienia aparatury do wstrzykiwań i mikroskopu konfokalnego do obrazowania, jak opisano w sekcjach 2 i 3 niniejszego protokołu.
  2. Kolekcja larw
    1. Stwórz krzyżówkę z 5−10 dziewiczymi samicami much o pożądanym genotypie i o połowę mniejszą liczbą samców o pożądanym genotypie w fiolce z pokarmem z mąki kukurydzianej i inkubuj w temperaturze 25 °C23.
    2. Po 5-7 dniach, w zależności od genotypu, delikatnie zebrać wędrujące larwy trzeciego stadium z fiolki za pomocą kleszczy. Opłucz larwy w 1x PBS, aby usunąć pokarm przyklejony do larw. W razie potrzeby przenieść larwy na płytkę z sokiem jabłkowym w celu genotypowania zgodnie z opisem w kroku 1.1.9.
    3. Rozwałkuj larwy na chusteczce za pomocą pędzla, aby je wysuszyć. Przenieś 6−8 larw na szkiełko przygotowane taśmą dwustronną za pomocą kleszczy.

2. Przygotowanie igieł i iniekcji próbki

  1. Pociągnąć igły za ściągacz do mikropipet przed rozpoczęciem stosowania tego protokołu. Zabezpiecz rurki kapilarne w ściągaczu igieł i pociągnij zgodnie ze standardowym kształtem igły i parametrami dla wstrzyknięć D. melanogaster (Tabela 3)27. Igły należy przechowywać na szalce Petriego, zakotwiczając je w glinie do czasu użycia do wstrzykiwań.
  2. Naładować igłę 5 μl dekstranu o stężeniu 10 kDa sprzężonego z chlorkiem kwasu sulforodaminy 101 (tabela materiałów) za pomocą końcówki pipety o pojemności 20 μl w żelu podczas 25-minutowego okresu suszenia zarodków (etap 1.1.12) lub bezpośrednio po przeniesieniu larw na szkiełko (etap 1.2.3).
  3. Załadować igłę do uchwytu na igłę i umieścić w mikromanipulatorze przymocowanym do stalowej podstawy (Tabela materiałów).
    nuta: Igła powinna być prawie równoległa do stopnia mikroskopu w przypadku iniekcji zarodka i lekko pochylona w dół w przypadku wstrzyknięć larw.
  4. Ustaw aparat iniekcyjny (tabela materiałów) na 50 psi, 5−10 ms z zakresem 10.
    nuta: Może być konieczna zmiana tych ustawień dla konkretnego używanego aparatu do wstrzykiwań.
  5. Umieść szkiełko na scenie i dociśnij krawędź igły do krawędzi taśmy dwustronnej pod kątem 45°, aby utworzyć skośną, złamaną końcówkę.
    nuta: W przypadku zarodków konieczne jest jedynie złamanie końcówki na tyle, aby umożliwić przepływ dekstranu o masie 10 kDa. Idealna igła ma lekko pochyloną końcówkę i przy każdym wstrzyknięciu wydostaje się tylko niewielka kropla barwnika. W przypadku larw konieczne jest większe złamanie końcówki, ale z ukośną końcówką, aby przebić ścianę ciała larwy. Wyjdzie większa kropla barwnika.
  6. Pompuj pedał nożny, aż barwnik znajdzie się na końcu igły.
  7. Ustaw igłę tak, aby była równoległa do zarodka lub lekko pochylona w dół w kierunku larwy.
  8. Przesunąć igłę, aby nakłuć tylny koniec próbki i wstrzyknąć próbkę, pompując pedał nożny. Wstrzyknąć ~2 nL barwnika do zarodków i ~220 nL barwnika do larw.
    nuta: Zarodek lub larwa powinna zostać zalana barwnikiem, jeśli wstrzyknięcie się powiedzie.
  9. Zanotuj czas wstrzyknięcia do celów inkubacji. Inkubować zarodki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wysiadywać larwy przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Kontynuuj przesuwanie w dół szkiełka, aby wstrzyknąć dodatkowe próbki, zwracając uwagę na czas wstrzyknięcia dla każdej próbki.
    nuta: W zależności od szybkości, z jaką można wykonać kolejne etapy sekcji i obrazowania, jednorazowo można wstrzyknąć 4-8 próbek.

3. Przygotowanie próbek do obrazowania

  1. Obrazowanie zarodków
    1. Po wstrzyknięciu należy przygotować zarodki do obrazowania. Nałóż wazelinę za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką po prawej i lewej stronie próbek na szkiełku jako przekładkę, aby zapobiec uszkodzeniu zarodków po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego.
    2. Obrazuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego na całej głębokości zarodka za pomocą obiektywu 20x. Obliczyć odsetek wszystkich próbek z barwnikiem zaobserwowanych w brzusznym rdzeniu nerwowym (VNC), stosując następujące równanie: % próbek z upośledzoną barierą krew-mózg = liczba próbek z akumulacją barwnika w VNC/całkowita liczba badanych próbek.
  2. Sekcja i obrazowanie larw
    1. Przygotuj szkiełka z próbkami larw z wyprzedzeniem. Zamontuj dwa szkiełka nakrywkowe w odległości około 0,5 cm od szkiełka z lakierem do paznokci.
      nuta: Szkiełka nakrywkowe pełnią funkcję przekładek dla mózgu, dzięki czemu nie ulega uszkodzeniu podczas procesu montażu.
    2. Po 30-minutowej inkubacji należy wypreparować larwy w 1x PBS bezpośrednio na szkiełku, które zostanie wykorzystane w obrazowaniu. Najpierw użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić larwę w połowie ciała larwy, a drugiej pary kleszczy użyj drugiej pary kleszczy, aby oddzielić przednią i tylną połowę larwy.
    3. Następnie użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić przedni obszar przy haczykach ustnych, a drugiej pary kleszczy odwróć ścianę ciała nad czubkiem kleszczy chwytających haczyki do ust. Mózg i VNC zostaną odsłonięte.
    4. Oddziel mózg i VNC od ściany ciała, przecinając nerwy, a następnie usuń ścianę ciała ze zjeżdżalni (Rysunek 1C,D). W razie potrzeby usuń wyimaginowane dyski.
    5. Przykryj próbkę 10 μl 80% glicerolu i umieść szkiełko nakrywkowe na próbce w celu obrazowania.
    6. Obraz w głąb tkanki układu nerwowego za pomocą obiektywu 20x. Obliczyć procent wszystkich próbek z barwnikiem zaobserwowany w VNC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisane tutaj metody umożliwiają wizualizację integralności BBB w całym OUN w embrionach i larwach D. melanogaster (Rycina 1). Po zakończeniu formowania się BBB w późnej embriogenezie, bariera ta pełni funkcję wykluczania dużych cząsteczek z mózgu i VNC5. Niniejszy protokół wykorzystuje tę funkcję do oceny formowania się BBB. Gdy embriony typu dzikiego (Oregon R) w późnym stadium 17 (wiek 20–21 h) zostały wstrzyknięte dekstranem 10 kDa sprzężonym z fluorescen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zawiera wyczerpujący opis kroków potrzebnych do oznaczenia integralności BBB w późnym stadium embrionalnym i larwalnym trzeciego stadium rozwojowego D. melanogaster. Podobne podejścia zostały opisane w innym miejscu w celu zbadania integralności bariery krew-mózg podczas rozwoju, a także w stadiach dorosłych 5,7,29,30. Jednak opisy procedur w sekcjach dotyczących materiałó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. F. Bryanowi Pickettowi i Dr. Rodneyowi Dale'owi za użycie sprzętu do iniekcji. Praca ta została sfinansowana z funduszy badawczych z Uniwersytetu Loyola w Chicago dla M.D., D.T. i J.J.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 kDa sulforodaminy 101 chlorek kwasowy (Texas Red) DekstranThermoFisher ScientificD1863Dekstran należy rozcieńczyć w autoklawizowanym ddH2O do stężenia 25 mg/ml.
20 μ L Końcówki do pipet żelowychEppendorf22351656
100% etanol (200 dowodów)Pharmco-Aaper11000200
Aktywne suche drożdżeRed
Star AgarFisher ScientificBP1423
AgarozaFisher ScientificBP160-500
Sprężarka powietrzaDeWaltD55140
Sok jabłkowyMott's Naturalny sok
Wybielaczdomowy1-5% Podchloryn
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoŚwiat Precyzyjne instrumenty1B100F-4
Zatyczki do butelekFisher ScientificAS-277
Sitka do komórekBD Falcon352350
Mikroskop konfokalnyOlympusFV1000Próbki zobrazowane za pomocą obiektywu 20x (UPlanSApo 20x/ 0,75)
Aplikator z bawełnianą końcówkąPuritan19-062614
Taśma dwustronna 1/2"Scotch
Dumont Pęseta; Wzór #5; .05 x .01 mm KońcówkaRobozRS-5015
Butelki na muchyFisher ScientificAS-355
Fiolki na muchyFisher ScientificAS-515
Pedał nożnyTreadlite IIT-91-S
Gel CasterBio-Rad1704422
Tacka na żelBio-Rad1704436
Szkło PipetaVWR14673-010
GlycerolFisher ScientificBP229-1
CukierZakupiony w sklepie spożywczym.
Laboratorium oleju halowęglowegoScientific, Inc.FLY-7000
Źródło światłaStojak manipulatora SchottAce I
Światoweinstrumenty precyzyjneM10
MikromanipulatorŚwiat instrumentów precyzyjnychKITE-R
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.P-97
Uchwyt igłyWorld Precision InstrumentsMPH310
Zestawy filtrów NightseaMikroskopia elektronowaNauka SFA-LFS-CYDo wizualizacji systemu pełnego adaptera YFP
Nightsea z głowicą Royal Blue Light HeadMikroskopia elektronowaSFA-RBDo wizualizacji
pędzlaPo prostu Simmons ChiselBlender #6
PipeterFisher Scientific13-683C
Pompa pneumatycznaWorld Precision InstrumentsPV830Jest to również określane jako mikrowtryskiwacz lub regulator ciśnienia. Ponieważ model zastosowany w naszym badaniu nie jest już dostępny, jest to jedna z alternatyw.
Chlorek potasuFisher ScientificBP366-500
Fosforan potasu dwuzasadowyFisher ScientificBP363-500
Małe klatki do pobierania zarodkówGenesee Scientific59-100
Chlorek soduFisher ScientificBP358-212
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyFisher ScientificBP332-500
Stalowa płyta podstawyWorld Precision Instruments5052
Mikroskop stereoskopowyCarl ZeissStemi 2000Służy do preparowania tkanek.
Mikroskop stereoskopowy ze źródłem światła przechodzącegoBaytronixSłuży do iniekcji.
Tegosept (kwas p-hydroksybenzoesowy, ester metylowy)Genesee Scientific20-258
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500Niejonowy środek powierzchniowo czynny
Zatyczki do fiolekFisher ScientificAS-273
jabłkowy granulowany GFP

Bibliografia

  1. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  2. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  3. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
  4. Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414(2014).
  5. Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
  6. Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
  7. Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
  8. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
  9. Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115(2018).
  10. von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
  11. Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
  12. Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
  13. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  14. Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
  15. Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
  16. Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
  17. Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
  18. von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
  19. Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
  20. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365(2014).
  21. Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244(2019).
  22. DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346(2014).
  23. BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
  24. Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
  25. Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
  26. Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
  27. Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
  28. Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161(2018).
  29. Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
  30. Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
  31. Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
  32. Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
  33. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  34. Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038(2018).
  35. Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

pobieranie embrionówiniekcja larwalnakoniugat dekstranumikroskopia konfokalnawysuszanie embrionówsekcja larwalnaekspresja genów
Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.