Metylacja C w fazie stałej 11, oczyszczanie i formulacja do produkcji znaczników PET

Summary

Informujemy o skutecznej technice radioznakowania węglem-11 w celu wytworzenia klinicznie istotnych znaczników dla pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) przy użyciu wkładów do ekstrakcji do fazy stałej. ¹¹Czynnik metylujący C przepuszcza się przez kartridż, który jest wstępnie załadowany prekursorem, a następująca po nim elucja za pomocą wodnego roztworu etanolu dostarcza chemicznie i radiochemicznie czyste znaczniki PET o wysokiej wydajności radiochemicznej.

Abstract

Rutynowa produkcja radioznaczników używanych w pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) opiera się głównie na mokrej chemii, gdzie radioaktywny synton reaguje z nieradioaktywnym prekursorem w roztworze. Takie podejście wymaga oczyszczenia znacznika za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), a następnie przeformułowania w biokompatybilnym rozpuszczalniku do stosowania u ludzi. Niedawno opracowaliśmy nowatorskie podejście do metylacji ¹¹C do wysoce wydajnej syntezy radiofarmaceutyków PET znakowanych węglem-11, wykorzystując wkłady w fazie stałej jako jednorazowe jednostki "3 w 1" do syntezy, oczyszczania i reformulacji znaczników. Takie podejście eliminuje stosowanie preparatywnej HPLC i zmniejsza straty znacznika w liniach przesyłowych i w wyniku rozpadu promieniotwórczego. Co więcej, technika oparta na kartridżach poprawia niezawodność syntezy, upraszcza proces automatyzacji i ułatwia spełnienie wymagań Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP). Tutaj demonstrujemy tę technikę na przykładzie produkcji znacznika PET Pittsburgh związku B ([¹¹C]PiB), złotego standardu w obrazowaniu in vivo blaszek amyloidowych w ludzkich mózgach.

Introduction

Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) to metoda obrazowania molekularnego, która polega na wykrywaniu rozpadu radioaktywnego izotopu przyłączonego do biologicznie aktywnej cząsteczki, aby umożliwić wizualizację in vivo procesów biochemicznych, sygnałów i przemian. Węgiel-11 (t_1/2 = 20,3 min) jest jednym z najczęściej stosowanych izotopów promieniotwórczych w PET ze względu na jego obfitość w cząsteczkach organicznych i krótki okres półtrwania, co pozwala na wielokrotne podawanie znacznika tego samego dnia temu samemu człowiekowi lub zwierzęciu i zmniejsza obciążenie radiologiczne pacjentów. Wiele znaczników znakowanych tym izotopem jest wykorzystywanych w badaniach klinicznych i podstawowych badaniach zdrowotnych do obrazowania in vivo PET klasycznych i pojawiających się biologicznie istotnych celów - [¹¹C]raklopryd dla receptorów D₂ / D₃, [¹¹C] PiB dla blaszek amyloidowych, [¹¹C] PBR28 dla białka translokatora - by wymienić tylko kilka.

Znaczniki PET znakowane węglem-11 są głównie wytwarzane przez ¹¹C-metylację nieradioaktywnych prekursorów zawierających grupy -OH (alkohol, fenol i kwas karboksylowy), -NH (amina i amid) lub -SH (tiol). Krótko mówiąc, izotop jest wytwarzany w tarczy gazowej cyklotronu w wyniku reakcji jądrowej ¹⁴N(p,α)^11Cw postaci chemicznej [¹¹C]CO₂ . Ten ostatni jest następnie przekształcany w [¹¹C] jodek metylu ([¹¹C]CH₃I) za pomocą mokrej chemii (redukcja do [¹¹C]CH₃OH za pomocą LiAlH₄, a następnie hartowanie za pomocą HI)¹ lub suchej chemii (redukcja katalityczna do [¹¹C]CH₄, po której następuje jodowanie rodnikowe z molekularnym I₂)². [¹¹kategorii]CH₃I można następnie przekształcić w bardziej reaktywny ^{triflat 11}C-metylu ([¹¹C]CH₃OTf), przepuszczając go przez kolumnę triflatu srebra³. Metylacja ¹¹C jest następnie przeprowadzana przez bulgotanie radioaktywnego gazu do roztworu nieradioaktywnego prekursora w rozpuszczalniku organicznym lub za pomocą bardziej eleganckiej metody "pętli" rozpuszczalnika w niewoli^4,5. ¹¹C-tracer jest następnie oczyszczany za pomocą HPLC, przeformułowywany w biokompatybilnym rozpuszczalniku i przepuszczany przez sterylny filtr przed podaniem ludziom. Wszystkie te manipulacje muszą być szybkie i niezawodne, biorąc pod uwagę krótki okres połowicznego rozpadu węgla-11. Jednak zastosowanie systemu HPLC znacznie zwiększa straty znacznika i czas produkcji, często wymaga użycia toksycznych rozpuszczalników, komplikuje automatyzację i czasami prowadzi do nieudanych syntez. Ponadto wymagane czyszczenie reaktorów i kolumny HPLC wydłuża opóźnienia między syntezami kolejnych partii znaczników i zwiększa narażenie personelu na promieniowanie.

Radiochemia fluoru-18 (t_1/2 = 109,7 min), innego powszechnie stosowanego izotopu PET, została ostatnio rozwinięta dzięki rozwojowi zestawów opartych na kasetach, które eliminują potrzebę oczyszczania metodą HPLC. Dzięki zastosowaniu wkładów do ekstrakcji do fazy stałej (SPE), te w pełni jednorazowe zestawy pozwalają na niezawodną rutynową produkcję ¹⁸znaczników F, w tym [¹⁸F]FDG, [¹⁸F]FMISO, [¹⁸F]FMC i innych, przy krótszym czasie syntezy, zmniejszonym zaangażowaniu personelu i minimalnej konserwacji sprzętu. Jednym z powodów, dla których węgiel-11 pozostaje mniej popularnym izotopem w obrazowaniu PET, jest brak podobnych zestawów do rutynowej produkcji ¹¹znaczników C. Ich opracowanie znacznie poprawiłoby niezawodność syntezy, zwiększyłoby wydajność radiochemiczną oraz uprości automatyzację i konserwację prewencyjną modułów produkcyjnych.

Obecnie dostępne zestawy produkcyjne wykorzystują niedrogie, jednorazowe kartridże SPE zamiast kolumn HPLC do oddzielania radioznacznika od nieprzereagowanego radioaktywnego izotopu, prekursora i innych radioaktywnych i nieradioaktywnych produktów ubocznych. Idealnie byłoby, gdyby reakcja znakowania radioaktywnego przebiegała również na tym samym kartridżu; na przykład [¹⁸F]fluorometylacja dimetyloaminoetanolu gazowym [¹⁸F]CH₂BrF w produkcji znacznika PET do obrazowania raka prostaty [¹⁸F]fluorometylocholina zachodzi na kartridżu z żywicą kationowymienną6. Chociaż podobne procedury znakowania radioaktywnego kilku ¹¹znaczników C na wkładach zostały zgłoszone^7,8 i stały się szczególnie skuteczne dla radiosyntezy [¹¹C]choline⁹ i [¹¹C]methionine¹⁰, te przykłady pozostają ograniczone do onkologicznych znaczników PET, w których oddzielenie od prekursora często nie jest wymagane. Niedawno informowaliśmy o opracowaniu "[¹¹C]zestawów" do produkcji [¹¹C]CH₃I¹¹ i późniejszej ¹¹C-metylacji, a także syntezy wspomaganej fazą stałą¹² w naszych wysiłkach na rzecz uproszczenia rutynowej produkcji ¹¹C-tracerów. W tym miejscu chcemy zademonstrować nasz postęp na przykładzie radiosyntezy wspomaganej fazą stałą [¹¹C]PiB, radioznacznika do obrazowania Aβ, który zrewolucjonizował dziedzinę obrazowania choroby Alzheimera (AD), gdy został po raz pierwszy opracowany w 2003 roku (Rysunek 1)^13,14. W tej metodzie lotny [¹¹C]_CH3OTf (bp 100 °C) przepuszcza się przez prekursor 6-OH-BTA-0 osadzony na żywicy jednorazowego wkładu. Znacznik PET [¹¹C]PiB jest następnie oddzielany od prekursora i zanieczyszczeń radioaktywnych przez elucję z wkładu z biokompatybilnym wodnym roztworem etanolu. Ponadto zautomatyzowaliśmy tę metodę radiosyntezy [¹¹C]PiB za pomocą zdalnie sterowanego modułu syntezy radiochemicznej i jednorazowych zestawów kasetowych. W szczególności wdrożyliśmy tę radiosyntezę na 20-zaworowym module radiochemicznym, wyposażonym w napęd strzykawkowy (dozownik), który pasuje do standardowej jednorazowej plastikowej strzykawki o pojemności 20 ml, regulatora przepływu gazu, pompy próżniowej i manometru. Ze względu na prostotę tej metody jesteśmy przekonani, że można ją zmodyfikować do większości dostępnych na rynku syntezatorów automatycznych, zarówno kasetowych, jak i wyposażonych w zawory stacjonarne. Ta technika wspomagana fazą stałą ułatwia produkcję [¹¹C]PiB zgodną z przepisami Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP) i poprawia niezawodność syntezy. Opisana tu technika zmniejsza również ilość prekursora wymaganego do radiosyntezy, wykorzystuje wyłącznie "zielone" biokompatybilne rozpuszczalniki oraz skraca czas pomiędzy kolejnymi partiami produkcyjnymi.

Protocol

1. Przygotowanie i eluentów

1. Rozpuścić 2,72 g trójwodnego octanu sodu w 100 ml wody, aby przygotować 0,2 M roztwór octanu sodu (roztwór A).
2. Rozpuścić 11,4 ml lodowatego kwasu octowego w 1 l wody, aby przygotować 0,2 M roztwór kwasu octowego (roztwór B).
3. Połączyć 50 ml roztworu A z 450 ml roztworu B, aby przygotować bufor octanowy o pH 3,7 (bufor 1) zgodnie z centrum odniesienia buforu¹⁵. Sprawdź pH buforu za pomocą pasków pH lub pH-metru.
4. Połączyć 12,5 ml absolutnego etanolu z 87,5 ml buforu 1, aby uzyskać 12,5% wodny roztwór EtOH (przepłukać 1) w butelce o pojemności 100 ml.
5. Połączyć 15 ml bezwzględnego etanolu z 85 ml buforu 1, aby uzyskać 15% wodny roztwór EtOH (płukanie 2) w butelce o pojemności 100 ml.
6. Połączyć 5 ml absolutnego etanolu z 5 ml buforu 1, aby uzyskać 50% wodny roztwór EtOH (końcowy eluent) i pobrać 2,5 ml tego roztworu do strzykawki o pojemności 10 ml.

2. Zastosowanie prekursora do kartridża

1. Przepuść 10 ml wody, a następnie 5 ml acetonu przez wkład tC18, aby go wstępnie kondycjonować.
2. Osuszyć wkład strumieniem azotu o stężeniu 50 ml/min przez 1 min.
3. Rozpuścić 2 mg prekursora 6-OH-BTA-0 w 1 ml bezwodnego acetonu.
4. Trzymając precyzyjną szklaną strzykawkę Luer-tip o pojemności 250 μl skierowaną w dół, pobrać 100 μl roztworu prekursora i 50 μl poduszki powietrznej na wierzch płynu. Wyjąć igłę i nałożyć roztwór prekursora na wkład tC18 od strony żeńskiej, powoli wciskając tłok do samego dołu. Nie naciskaj na rozwiązanie dalej!

3. Ustawianie rozmaitości do automatycznej syntezy

1. Zamocuj standardowy 5-portowy jednorazowy kolektor na module syntezy i zmontuj go zgodnie z Rysunek 2 i kroki 3.2 - 3.5 poniżej.
   UWAGA: Zalecamy stosowanie kolektorów odpornych na aceton (patrz Tabela materiałów).
2. Port 1 ma dwie pozycje. Podłączyć wlot poziomy do automatycznego dozownika wyposażonego w strzykawkę o pojemności 20 ml. Podłącz pionowy wlot do butelki z myciem 1.
3. Podłącz wyjście modułu, który wytwarza [¹¹C]CH₃OTf do portu 2 kolektora.
4. Zainstaluj kartridż tC18 załadowany prekursorem 6-OH-BTA-0 między portami 3 i 4.
5. Port 5 ma dwie pozycje. Podłącz poziomy wylot do butelki na odpady, która musi pomieścić co najmniej 200 ml. Podłącz pionowy wylot do sterylnej fiolki w celu pobrania znacznika przez sterylny filtr.

4. Radiosynteza [¹¹C]PiB

UWAGA: Wszystkie manipulacje związane z izotopami radioaktywnymi muszą być wykonywane w osłoniętej ołowiem gorącej komórce przez personel odpowiednio przeszkolony do pracy z materiałami radioaktywnymi.
UWAGA: Protokół ten nie obejmuje szczegółów produkcji [¹¹C]CO₂ w cyklotronie i jego konwersji do [¹¹C]_CH3OTf przy użyciu modułu radiochemicznego. Procedury te będą zależały od indywidualnego wyposażenia pracowni radiochemicznej i nie wchodzą w zakres niniejszego protokołu. Nasze centrum PET jest wyposażone w cyklotron IBA, który wytwarza węgiel-11 w postaci chemicznej [¹¹C]CO₂ w reakcji jądrowej ¹⁴N(p,α)¹¹C z mieszaniną gazów N₂/O₂ (99,5:0,5) w tarczy gazowej, oraz dostępny na rynku moduł do produkcji [¹¹C]CH₃I metodą "suchą" (redukcja katalityczna do [¹¹C]CH₄ , po której następuje jodowanie rodnikowe). [¹¹kategorii]_CH3OTf jest wytwarzany przez przepuszczenie [¹¹C]_CH3I przez srebrną kolumnę triflatową podgrzaną do 175 °C przy 20 ml/min.

1. Dostarczyć [¹¹C]CH₃OTf do kolektora przez port 2 i przepuścić go przez załadowany wkład tC18 przy przepływie wyjściowym 20 mL/min regulowanym przez moduł [¹¹C]CH₃OTf, przez porty 3 i 4 oraz do butelki na odpady, jak pokazano na Rysunek 2A.
2. Gdy cała radioaktywność zostanie przeniesiona i uwięziona na kartridżu tC18, zgodnie z monitorem detektora radioaktywności za uchwytem naboju, zatrzymaj przepływ gazu, zamykając port 2. Pozostaw wkład na 2 minuty, aby zakończyć reakcję.
3. Pobrać 19 ml roztworu do płukania 1 (patrz krok 1.4) z butelki o pojemności 100 ml do strzykawki dozującej przez port 1 przy 100 ml / min, jak pokazano na Rysunek 2B.
4. Dozować 18,5 ml roztworu do płukania 1 z dozownika przez wkład tC18 przez porty 3 i 4 i do butelki na odpady z prędkością 50 ml / min, jak pokazano na Rysunek 2C. Upewnij się, że w kolektorze nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one zmniejszyć skuteczność separacji.
5. Powtórzyć kroki 4.3 i 4.4 cztery razy, za każdym razem pobierając i dozując 18,5 ml roztworu do przemywania 1. Całkowita objętość roztworu do przemywania 1 przepuszczonego przez tC18 wynosi 92,5 ml; jednak może się różnić w zakresie 90 - 100 ml w zależności od konkretnego użytego modułu syntezy.
6. Przełącz linię wejściową na porcie 1 z roztworu mycia 1 na roztwór do prania 2 (patrz krok 1.5).
7. Powtórzyć kroki 4.3 i 4.4 trzy razy, pobierając i dozując za każdym razem 18,5 ml roztworu do płukania 2. Całkowita objętość roztworu do płukania 2 przepuszczonego przez tC18 wynosi 55,5 ml. Może się jednak wahać w zakresie 50 - 60 ml w zależności od konkretnego użytego modułu syntezy.
8. Przełącz zawór 5 w kierunku końcowej fiolki, jak pokazano na Rysunek 2D. Odłączyć przewód od dozownika i podłączyć go do strzykawki o pojemności 10 ml zawierającej 2,5 ml końcowego roztworu eluentu (50% wodnego roztworu EtOH, patrz krok 1.6) i 7,5 ml powietrza.
9. Trzymając strzykawkę w dół, ręcznie przepchnąć końcowy roztwór eluentu (2,5 ml), a następnie powietrze (7,5 ml) przez wkład tC18 przez porty 3 i 4 i do sterylnej fiolki w celu pobrania znacznika przez sterylny filtr, jak pokazano na Rysunek 2D.
10. Odłączyć pustą strzykawkę, podłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml zawierającą 10 ml sterylnego buforu fosforanowego (receptura nie jest dołączona, ponieważ może się różnić) i przecisnąć całą objętość przez wkład tC18 do sterylnej fiolki, jak opisano powyżej (Rysunek 2D). Odłączyć strzykawkę i przepłukać przewód 10 ml powietrza za pomocą tej samej strzykawki.
11. Pobrać 0,7 ml końcowego preparatu znacznikowego i pobrać próbki do procedur kontroli jakości (0,1 ml), testu endotoksyn bakteryjnych (0,1 ml) i sterylności (0,5 ml).

5. Procedury kontroli jakości

UWAGA: Każda partia radioznacznika musi zostać poddana odpowiednim procedurom kontroli jakości (QC) przed wydaniem do miejsca obrazowania PET w celu podania ludziom lub zwierzętom. Autorzy tego manuskryptu nie ponoszą odpowiedzialności za zgodność radioznacznika produkowanego w innych ośrodkach z lokalnymi przepisami władz sanitarnych.

1. Przeprowadzić procedury kontroli jakości przed uwolnieniem, które muszą obejmować badania tożsamości radiochemicznej (RCI), czystości radiochemicznej (RCP), czystości chemicznej i aktywności molowej znacznika, a także pozostałej zawartości rozpuszczalnika i pH preparatu.
2. Oznaczyć RCI, RCP, czystość chemiczną i aktywność molową za pomocą analitycznego systemu HPLC wyposażonego w detektory UV (monitorowanie przy 350 nm) i radioaktywności oraz kolumnę z odwróconymi fazami. Określić czasy retencji 6-OH-BTA-0 i 6-OH-BTA-1 i skalibrować przyrząd w celu ilościowego określenia zawartości każdego związku.
3. Oznaczyć zawartość pozostałości rozpuszczalnika za pomocą analitycznego systemu chromatografii gazowej wyposażonego w kolumnę kapilarną. Określić czasy retencji acetonu i etanolu oraz skalibrować przyrząd w celu ilościowego określenia zawartości każdego rozpuszczalnika.
4. Wykonaj test endotoksyn bakteryjnych za pomocą czytnika wkładów wyposażonego w odpowiednie wkłady.
5. Przeprowadzić analizę sterylności próbki co najmniej 14 dni po syntezie, aby upewnić się, że nie ma wzrostu bakterii lub wysłać próbkę sterylności do laboratorium akredytowanego przez lokalny organ ds. zdrowia.

Results

Podsumowując typową radiosyntezę [¹¹C]PiB, gazowy [¹¹C]CH₃OTf jest najpierw przepuszczany przez kartridże tC18 z wstępnie załadowanym roztworem prekursora (Rysunek 1). Oddzielenie mieszaniny reakcyjnej uzyskuje się następnie przez kolejne elucję wodnymi roztworami etanolu w następujący sposób. Najpierw 12,5% EtOH wymywa większość nieprzereagowanych [¹¹C]_CH3OTf i 6-OH-BTA-0, następnie 15% EtOH wypłukuje re...

Discussion

Pomimo niedawnego pojawienia się i zatwierdzenia przez FDA kilku znaczników PET znakowanych ¹⁸znakami F, takich jak florbetapir, florbetaben i flutemetamol, [¹¹C] PiB pozostaje złotym standardem znacznika do obrazowania amyloidu ze względu na szybki wychwyt przez mózg i niskie niespecyficzne wiązanie. Obecnie znacznik ten jest syntetyzowany za pomocą mokrej chemii¹⁶ lub przy użyciu podejścia "suchej pętli" ^4,17

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OH-BTA-0	ABX zaawansowane związki biochemiczne	5101	Nieradioaktywny prekursor [11C]PiB
6-OH-BTA-1	ABX zaawansowane związki biochemiczne	5140	Nieradioaktywny standard [11C]PiB
System HPLC Agilent 1200	Agilent	Agilent 1200	Analityczny system HPLC
Etanol absolutny	Alkohole handlowe	432526
strzykawka Hamilton (końcówka luer, 250 &mikro; L)	Hamilton	HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120	MZ-Analysentechik GmbH	MZ1440-100040	Analityczna kolumna HPLC
System Perkin Elmer Clarus 480 GC	Perkin Elmer	Clarus 480	Chromotograf gazowy
poliwęglanu	Scintomics	ACC-101	Kolektor syntezy
Restek MTX-Wax kolumna (30 m, 0,53 mm)	Restek	70625-273	Analityczna kolumna GC
Scintomics Moduł GRP	Scintomics	Scintomics GRP	Zautomatyzowana jednostka syntezy
Sep-Pak tC18 Plus	Waters	WAT020515	Wkład do ekstrakcji do fazy stałej
kolektor odporny na rozpuszczalniki	Scintomics	ACC-201	Kolektor do syntezy
Igła do rdzenia kręgowego	BD	405181
Sterylny	linia przedłużająca B. Braun	8255059
Sterylny filtr	Millipore	SLLG013SL
Sterylna fiolka (20 ml)	Huayi	SVV-20A
Sterylna woda	Baxter	JF7623
Badania Synthra MeIplus	Synthra	MeIplus Research	[11C]CH3I/[11C]CHModuł 3OTf
Strzykawka (10 mL)	BD	309604
Strzykawka (1mL)	BD	309659
Strzykawka (20 mL)	B. Braun	4617207V	Dozownik strzykawka
Filtr odpowietrzający	Millipore	TEFG02525