Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Podsumowanie

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) umożliwia szybką i efektywną izolację mRNA translującego specyficznego dla typu komórki. Tutaj demonstrujemy metodę, która łączy hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej w mysim modelu ponownego zasiedlania wątroby i TRAP w celu zbadania profilu ekspresji repopulujących hepatocytów.

Streszczenie

Ponowne zasiedlenie wątroby po urazie jest kluczową cechą ssaków, która zapobiega natychmiastowej niewydolności narządów i śmierci po ekspozycji na toksyny środowiskowe. Głębsze zrozumienie zmian w ekspresji genów, które zachodzą podczas ponownego zasiedlenia, może pomóc w identyfikacji celów terapeutycznych promujących przywrócenie funkcji wątroby w przypadku urazów. Niemniej jednak metody izolowania specyficznie zasiedlających hepatocytów są hamowane przez brak markerów komórkowych, ograniczoną liczbę komórek i kruchość tych komórek. Opracowanie technologii oczyszczania powinowactwa translacyjnego rybosomów (TRAP) w połączeniu z mysim modelem Fah^-/- w celu rekapitulacji populacji w warunkach uszkodzenia wątroby umożliwia profilowanie ekspresji genów w repopulujących hepatocytach. Dzięki TRAP mRNA translujące specyficzne dla typu komórki jest szybko i skutecznie izolowane. Opracowaliśmy metodę, która wykorzystuje TRAP z opartą na powinowactwie izolacją translującego mRNA z hepatocytów, które selektywnie eksprymują białko rybosomalne (RP) znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), GFP: RPL10A. TRAP pozwala uniknąć długiego okresu wymaganego do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, które może zmienić profil ekspresji genów. Ponadto, ponieważ tylko repopulujące hepatocyty wykazują ekspresję białka fuzyjnego GFP:RPL10A, wyizolowane mRNA jest pozbawione zanieczyszczeń pochodzących z otaczających uszkodzonych hepatocytów i innych typów komórek w wątrobie. Oczyszczone z powinowactwa mRNA jest wysokiej jakości i umożliwia dalszą analizę ekspresji genów opartą na PCR lub sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości.

Wprowadzenie

Jako główny organ metaboliczny u kręgowców, wątroba jest odpowiedzialna za homeostazę glukozy, syntezę białek w surowicy, wydzielanie kwasów żółciowych oraz metabolizm ksenobiotyków i detoksykację. Wątroba posiada niezwykłą zdolność do regeneracji uszkodzonego miąższu po ekspozycji na toksyny, aby zapobiec natychmiastowej niewydolności wątroby¹. Jednak niepowodzenie regeneracji może wystąpić w przypadku nadmiernego spożycia paracetamolu lub alkoholu, co może prowadzić do ostrej niewydolności wątroby². Ponadto przewlekłe uszkodzenie wątroby spowodowane wirusowym zapaleniem wątroby, stłuszczeniem wątroby i stłuszczeniowym zapaleniem wątroby może powodować zwłóknienie wątroby, marskość wątroby i raka wątrobowokomórkowego³. Jedynym dostępnym sposobem leczenia schyłkowej niewydolności wątroby jest przeszczep, ale jest on ograniczony przez niedobór narządów, co uniemożliwia skuteczne leczenie u wszystkich pacjentów⁴. Lepsze zrozumienie procesu rekonwalescencji po toksycznym uszkodzeniu wątroby ma zatem kluczowe znaczenie dla opracowania metod leczenia stymulujących regenerację wystarczającą do przywrócenia funkcji chorego narządu.

Najszerzej stosowanym systemem modelowym do badania regeneracji wątroby jest częściowa hepatektomia u gryzoni, w której duża część wątroby jest wycinana w celu stymulowania szybkiej ekspansji hepatocytów⁵. Jednak częściowa hepatektomia nie podsumowuje ekspansji hepatocytów po toksycznym uszkodzeniu wątroby z powodu braku nacieku komórek odpornościowych i martwicy komórek hepatocytów, często obserwowanej w przypadku ostrego uszkodzenia wątroby u ludzi⁶. Bardziej odpowiednim systemem do modelowania tej formy odnowy narządów jest mysz Fah^-/-, która nie ma funkcjonalnej hydrolazy fumaryloacetooctanu (FAH) niezbędnej do prawidłowego metabolizmu tyrozyny i rozwija poważne uszkodzenie wątroby prowadzące do śmierci⁷. Myszy te mogą być utrzymywane w zdrowym stanie przez czas nieokreślony poprzez leczenie lekiem nityzynonem w wodzie pitnej. Alternatywnie, ekspresję FAH można przywrócić przez dostarczenie transgenu do podzbioru hepatocytów, które rozszerzą się, aby ponownie zasiedlić wątrobę po usunięciu nityzynonu⁸.

Aby profilować zmiany ekspresji genów w ponownym zasiedlaniu hepatocytów, potrzebne jest narzędzie do specyficznego izolowania replikujących się hepatocytów u myszy Fah^-/- bez zanieczyszczenia sąsiednimi uszkodzonymi hepatocytami i innymi typami komórek. Niestety, sortowanie komórek wspomagane fluorescencją (FACS) hepatocytów jest trudne, ponieważ (1) kruchość ponownego zasiedlenia hepatocytów prowadzi do słabej regeneracji po perfuzji wątroby, (2) replikujące się hepatocyty mają bardzo zmienną wielkość, co utrudnia izolację czystej populacji przez FACS, oraz (3) czas procedury od perfuzji wątroby do izolacji RNA jest dłuższy niż 2 godziny, W związku z tym profile ekspresji genów mogą ulegać znacznym sztucznym zmianom przed pobraniem próbek⁹.

Alternatywnie, ekspresja rybosomów oznaczonych epitopami, szczególnie w ponownym zasiedleniu hepatocytów, pozwala na szybką izolację aktywnie translującego mRNA związanego przez rybosomy za pomocą oczyszczania powinowactwa natychmiast po pobraniu organów, za pomocą dużych lizatów tkanki wątroby. W tym miejscu opisujemy protokół przeprowadzania oczyszczania powinowactwa translacyjnego rybosomów (TRAP)¹⁰, a następnie sekwencjonowania RNA o wysokiej przepustowości (TRAP-seq), w celu specyficznej izolacji i profilowania mRNA w ponownym zasiedlaniu hepatocytów w klasie Fah^-/- mouse⁹. Koekspresja białka rybosomalnego znakowanego białkiem zielonej fluorescencji (GFP:RPL10A) z FAH umożliwia oczyszczanie powinowactwa translacyjnego mRNA związanego przez polisomy zawierające GFP:RPL10A. Ta metoda pozwala uniknąć wszelkich etapów dysocjacji komórek, takich jak perfuzja wątroby w celu wyizolowania delikatnych, ponownie zasiedlających hepatocytów. Zamiast tego wykorzystuje lizę tkanki całego narządu i przeciwciał do szybkiej ekstrakcji RNA specyficznie z komórek docelowych. Wreszcie, izolacja obfitego, wysokiej jakości mRNA za pomocą TRAP-seq umożliwia dalsze zastosowania, takie jak analiza sekwencjonowania, w celu profilowania dynamicznych zmian ekspresji genów podczas procesu ponownego zasiedlenia.

Protokół

Wszystkie metody wykorzystujące myszy są zgodne z wytycznymi dostarczonymi przez IACUC z Penn Office of Animal Welfare na Uniwersytecie Pensylwanii.

1. Przygotowanie odczynnika

1. Cykloheksymid
   1. Aby uzyskać 500 μl 0,1 g/ml cykloheksymidu, zawiesić 50 mg cykloheksymidu w 500 μl metanolu.
      ostrożność: Cykloheksymid jest niezwykle toksyczny dla środowiska i może powodować wrodzone wady rozwojowe. Wszystkie odpady i zawierające cykloheksymid powinny być zbierane w celu ich prawidłowego usunięcia.
      nuta: Cykloheksymid może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 1 dnia. Cykloheksymid hamuje translację.
2. Ditiotreitol (DTT)
   1. Aby przygotować 1 ml 1 M naziemnej telewizji cyfrowej, zawiesij 0,15 g proszku DTT w wodzie wolnej od RNaz.
      ostrożność: Naziemna telewizja cyfrowa może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych.
      nuta: Naziemna telewizja cyfrowa (DTT) jest detergentem. Naziemna telewizja cyfrowa może być przechowywana w temperaturze -20 °C. Zaleca się przechowywanie 1 M DTT w jednorazowych porcjach po 50 μL.
3. Deoksycholan (DOC)
   1. Aby uzyskać 10% DOC, zawiesić 1 g DOC w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodać wodę wolną od RNaz do 10 ml. Wstrząsaj energicznie, aż proszek się rozpuści.
      nuta: 10% roztwór DOC jest lekko żółty i może być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) przez okres do 1 roku. DOC służy do lizy jądrowej.
4. Przeciwciała przeciwko GFP
   1. Podwielokrotne przeciwciała GFP przy pierwszym użyciu. Zamrażać porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      nuta: Zaleca się przechowywanie 50 μg przeciwciał GFP w jednorazowych podwielokrotnościach.
5. B biotynylowane białko L
   1. Zawiesić biotynylowane białko L w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby uzyskać końcowe stężenie 1 μg/μL.
      nuta: Roztwór do ponownego sporządzenia zawiesiny można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.

2. Przygotowanie bufora

1. Bufor albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
   1. Aby przygotować 50 ml 3% buforu BSA, dodaj 1,5 g proszku BSA wolnego od IgG i proteazy do 40 ml PBS, a następnie wiruj. Po rozpuszczeniu BSA dodać PBS do końcowej objętości 50 ml.
      nuta: Bufor BSA może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.
2. Bufor rozorekcyjny
   1. Aby przygotować 50 ml buforu do rozwarstwiania, połącz 5 ml 10x zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), 125 μl 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1,750 μl 1 M glukozy i 200 μl 1 M NaHCO₃. Dodać wodę wolną od RNaz do końcowej objętości 50 ml.
      nuta: Zapas buforowy do rozbioru może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.
   2. Bezpośrednio przed użyciem dodać 100 μg/ml 0,1 g/ml cykloheksymidu i przechowywać na lodzie.
3. Bufor o wysokiej zawartości soli
   1. Aby przygotować 50 ml bulionu buforowego o wysokiej zawartości soli, dodaj 1 ml 1 M HEPES, 8,75 ml 2 M KCl, 500 μl 1 M MgCl₂ i 500 μl 100% glikolu nonylofenylopolietylenowego (tabela materiałów) do wody wolnej od RNaz.
      nuta: Zapas buforowy o wysokiej zawartości soli może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.
   2. Bezpośrednio przed użyciem dodać 0,5 μl/ml 1 M DTT i 1 μL/ml 0,1 g/ml cykloheksymidu. Świeży bufor o wysokiej zawartości soli należy przechowywać na lodzie.
4. Bufor o niskiej zawartości soli
   1. Aby przygotować 50 ml bulionu buforowego o niskiej zawartości soli, dodaj 1 ml 1 M HEPES, 3,75 ml 2 M KCl, 500 μL 1 M MgCl₂ i 500 μL 100% glikolu polietylenowo-nonylofenylowego do 44,25 ml wody wolnej od RNaz.
      nuta: Zapas buforowy o niskiej zawartości soli może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.
   2. Przed użyciem dodać 0,5 μl/ml 1 M DTT i 1 μl/ml 0,1 g/ml cykloheksymidu. Świeży bufor o niskiej zawartości soli należy przechowywać na lodzie.
5. Bufor do lizy tkanek
   1. Aby uzyskać 50 ml buforu do lizy tkanek, połącz 1 ml 1 M HEPES, 3,75 ml 2 M KCl i 500 μL 1 M MgCl₂. Dodaj wodę wolną od RNaz do końcowej ilości 50 ml.
      nuta: Zapas buforowy do rozbioru może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.
   2. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1 tabletkę/10 ml inhibitora proteazy wolnego od EDTA, 1 μl/ml 0,1 g/ml cykloheksymidu, 10 μl/ml inhibitorów RNazy. Świeży bufor do lizy tkanek należy przechowywać na lodzie.

3. Koniugacja przeciwciał przeciwko kulkom magnetycznym

1. przeciwciała
   1. Obliczyć ilość przeciwciał GFP wymaganą dla wszystkich próbek i przygotować się na jedną dodatkową próbkę.
      nuta: Dla każdej próbki wymagane jest 50 μg każdego przeciwciała GFP.
   2. Rozmrozić przeciwciała GFP na lodzie i wirować z maksymalną prędkością (>13 000 x g) przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatanty do nowej probówki do mikrowirówki.
      >nuta: Etap przygotowania przeciwciał można przeprowadzić przed przygotowaniem kulek, a rozmrożone przeciwciała można przechowywać na lodzie. Alternatywnie, ta część może być wykonana podczas inkubacji kulki magnetycznej i biotynylowanego białka L.
2. Zawieś ponownie koraliki magnetyczne
   1. Zawiesić kulki magnetyczne (tabela materiałów) przez delikatne pipetowanie.
   2. Do każdej próbki użyj 150 μl kulki magnetycznej. Obliczyć objętość kulki magnetycznej wymaganą dla wszystkich próbek i przygotować jedną dodatkową. Przenieś zawieszone kulki magnetyczne do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml lub 2 ml. Jeśli do eksperymentu potrzeba więcej niż 1 ml, podziel całkowitą ilość na równe objętości.
   3. Zbieraj koraliki na stojaku magnetycznym przez >1 min i usuń supernatant. Wyjmij probówkę do mikrowirówki ze stojaka magnetycznego i dodaj 1 ml PBS, a następnie pipetuj w górę iw dół, aby umyć kulki. Zbieraj koraliki na stojaku magnetycznym przez >1 min i usuń PBS.
3. Przygotowanie kulek białkowych powlekanych literą L
   1. Do każdej próbki należy użyć 60 μl biotynylowanego białka L. Jeżeli białko L jest uprzednio zawieszone i przechowywane w temperaturze -20 °C, należy rozmrozić białko L na lodzie. Jeżeli białko L jest ponownie zawieszone przed użyciem, należy pobrać ilość wymaganą dla wszystkich próbek i przygotować jedną dodatkową.
   2. Dodać obliczoną objętość biotynylowanego białka L do zawieszonych i przemytych kulek magnetycznych. Dodaj 1x PBS, aby uzyskać końcową objętość 1 ml w przypadku użycia probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml lub 1,5 ml w przypadku użycia probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Inkubować kulki magnetyczne z biotynylowanym białkiem L przez 35 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze rurowym.
      nuta: Przeciwciała można wytworzyć na tym etapie, podczas gdy kulki inkubują się z biotynylowanym białkiem L.
   3. Zbieraj kulki białkowe pokryte L na stojaku magnetycznym przez >1 min i usuń supernatant. Wyjmij probówkę do mikrowirówki ze stojaka magnetycznego i dodaj 1 ml 3% buforu BSA, a następnie delikatnie pipetuj co najmniej 5 razy, aby umyć kulki pokryte białkiem L.
   4. Zbieraj powlekane kulki na stojaku magnetycznym przez >1 min i usuń supernatant. Powtórz kroki prania z 3% BSA przez kolejne 4 razy (w sumie 5 razy).
4. Wiązanie przeciwciał
   1. Dodać obliczoną ilość przeciwciał GFP do kulek pokrytych białkiem L i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na rotatorze probówkowym.
      nuta: Po inkubacji przeciwciał należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zawirować matrycy powinowactwa.
   2. Podczas inkubacji należy przygotować bufor o niskiej zawartości soli, obliczając całkowitą objętość wymaganą dla wszystkich próbek, a przed użyciem dodać 0,5 μl/ml 1 M DTT i 1 μl/ml 0,1 g/ml cykloheksymidu do zapasu buforowego o niskiej zawartości soli.
      UWAGA: Wymagane są 3 ml buforu o niskiej zawartości soli do przemywania każdej probówki kulek sprzężonych z GFP i 200 μl/próbkę do ponownego zawieszenia kulek sprzężonych z GFP. Świeży bufor o niskiej zawartości soli można przechowywać na lodzie przez kilka godzin.
   3. Zebrać matrycę powinowactwa na stojaku magnetycznym przez >1 min i usunąć supernatant. Dodaj 1 ml buforu o niskiej zawartości soli i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby przemyć matrycę powinowactwa. Zbierz matrycę powinowactwa na stojaku magnetycznym przez >1 min i usuń bufor o niskiej zawartości soli. Powtórz etapy mycia z buforem o niskiej zawartości soli jeszcze 2 razy (w sumie 3 razy).
   4. Zawiesić kulki w buforze o niskiej zawartości soli, tak aby każda próbka miała 200 μl matrycy powinowactwa.
      nuta: Matryca powinowactwa może być przechowywana w 0,02% NaN₃ w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Matrycę powinowactwa należy szybko przemyć 3 razy w buforze o niskiej zawartości soli i delikatnie zawiesić na rotatorze probówkowym w temperaturze 4 °C przez co najmniej 10 minut, jeśli matryca powinowactwa jest przygotowywana w ciągu 1 tygodnia lub przez noc, jeśli matryca powinowactwa jest przechowywana przez ponad 1 tydzień. Protokół można wstrzymać po wykonaniu tego kroku.
      ostrożność: Azydek sodu jest niezwykle toksyczny dla środowiska. W kontakcie z kwasami wytwarzany jest toksyczny gaz. Wszystkie odpady należy zebrać w celu prawidłowej utylizacji.

4. Liza tkanki wątroby

1. Przygotowanie bufora i konfiguracja sprzętu
   1. Oblicz liczbę wymaganych probówek do mikrowirówek, oznacz i schładzaj na lodzie.
      nuta: Zwykle do każdej próbki potrzeba siedmiu probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml: 1 dla pozostałej wypreparowanej wątroby, 4 dla 4 ml homogenizowanego lizatu wątrobowego i 2 dla przenoszenia supernatantów.
   2. Przygotować świeży bufor do rozwarstwiania, obliczając całkowitą objętość wymaganą dla wszystkich próbek i dodać 1 μl/ml 0,1 g/ml cykloheksymidu. Umieść świeży bufor do preparowania na lodzie, aby utrzymać go w chłodzie przez cały czas trwania eksperymentu.
      nuta: Dla każdej próbki wymagane jest 10 ml buforu do rozwarstwiania.
   3. Przygotować świeży bufor do lizy, obliczając całkowitą objętość wymaganą dla wszystkich próbek i dodać 1 tabletkę/10 ml inhibitora proteazy wolnego od EDTA, 1 μl/ml 0,1 g/ml cykloheksymidu i 10 μl/ml inhibitorów RNazy każda. Utrzymuj bufor do lizy na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu.
      nuta: Dla każdej próbki wymagane są 4 ml buforu do lizy.
   4. Ustaw młynek do tkanek (tabela materiałów) tak, aby probówki ze szkła politetrafluoroetylenowego (PTFE) można było umieścić na lodzie podczas homogenizacji kawałków wątroby. Umieścić 4 ml buforu do lizy na zimno w probówkach ze szkła PTFE.
2. Ponowne zasiedlenie wątroby
   1. Poddaj eutanazji 8-12-tygodniową mysz Fah^-/-, której wstrzyknięto wektor TRAP i ponownie zasiedlono przez 1-4 tygodnie ze znieczuleniem i zwichnięciem szyjki macicy zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi eksperymentalnymi na zwierzętach.
   2. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spryskaj brzuch 70% etanolem. Umieść skórę i otrzewną nisko w jamie brzusznej za pomocą kleszczy i użyj nożyczek, aby wykonać poprzeczne nacięcie. Kontynuuj cięcie nożyczkami, aby uzyskać szeroki płat otrzewnej w kształcie litery U, uważając, aby nie przeciąć wnętrzności. Odwróć płat otrzewnej nad mostkiem, aby odsłonić wątrobę.
   3. Ostrożnie usuń wątrobę za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy i szybko umieść tkankę w zimnym buforze do wypreparowania w celu spłukania. Aby homogenizować zamrożone tkanki, należy szybko przenieść żądaną ilość tkanki wątroby do probówek ze szkła PTFE z buforem do lizy na zimno bez rozmrażania tkanki.
      nuta: Wypreparowaną tkankę można błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C po umyciu buforem do preparacji. Po wykonaniu tego kroku protokół można wstrzymać.
   4. Zważ wątrobę na szalce Petriego i wyizoluj 200-500 mg kawałków wątroby i przenieś do probówek ze szkła PTFE. Umieść pozostałą tkankę wątroby we wstępnie schłodzonej probówce mikrowirówkowej i błyskawicznie zamroź.
   5. Homogenizować próbki w homogenizatorze napędzanym silnikiem, zaczynając od 300 obr./min, aby oddzielić hepatocyty od struktury wątroby przez co najmniej 5 uderzeń. Za każdym razem opuszczaj szklaną rurkę, ale uważaj, aby tłuczek nie uniósł się ponad roztwór, aby zapobiec napowietrzaniu, które mogłoby spowodować denaturację białka.
   6. Zwiększ prędkość do 900 obr./min, aby w pełni zhomogenizować tkanki wątroby przez co najmniej 12 pełnych ruchów.
   7. Przenieść lizat do oznakowanych i wstępnie schłodzonych probówek, zawierających nie więcej niż 1 ml lizatu na 1,5 ml probówek do mikrowirówek. Jeśli używane są 4 ml buforu do lizy, zachowaj 1 probówkę i błyskawicznie zamroź pozostałe 3 probówki.
      nuta: Lizaty można przechowywać na lodzie do 1 godziny podczas preparowania następnego zwierzęcia i przygotowywania świeżych lizatów. Homogenizowana wątroba może zostać błyskawicznie zamrożona po etapie lizy i przechowywana w temperaturze -80 °C. Może nastąpić 50% spadek izolowanego RNA, jeśli zostaną użyte mrożone lizaty. Po wykonaniu tego kroku protokół można wstrzymać.
3. Liza jądrowa
   1. Odwirować lizat wątroby przy 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej na lodzie.
   2. Dodać 1/9 objętości sklaratu 10% glikolu polietylenowo-nonylofenylowego, aby uzyskać końcowe stężenie 1% glikolu nonylofenylopolietylenowego i wymieszać, delikatnie odwracając probówki mikrowirówki.
   3. Szybko odwiruj probówki do mikrowirówek i dodaj 1/9 objętości próbki 10% DOC, aby uzyskać końcowe stężenie 1% DOC i wymieszaj, delikatnie odwracając probówki do mikrowirówek. Szybko odwiruj probówki do mikrowirówek i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
   4. Odwirować lizat jądrowy przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej na lodzie.
      nuta: Supernatant zubożony w mitochondria można umieścić na lodzie na kilka godzin, podczas gdy pozostałe próbki są zbierane.

5. Immunoprecypitacja

1. Z każdej probówki należy pobrać 1% całkowitej objętości supernatantu jako kontrolę przed immunoprecypitacją, aby porównać docelowe wzbogacenie po inkubacji z matrycą powinowactwa. Umieścić kontrole przed immunoprecypitacją na rotatorze probówki w temperaturze 4 °C przez noc, w taki sam sposób, w jaki przetwarzane są próbki immunoprecypitowane.
2. Dodać 200 μl matrycy powinowactwa do każdej próbki. Należy zachować szczególną ostrożność przy ponownym wywieszaniu kulek poprzez delikatne pipetowanie przed dodaniem matrycy powinowactwa do każdej próbki. Inkubować lizaty z matrycą powinowactwa w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie mieszając na rotatorze probówkowym.
   nuta: Protokół może zostać wstrzymany na okres do jednego dnia po wykonaniu tego kroku.

6. Izolacja RNA

1. Przygotowanie bufora i konfiguracja sprzętu
   1. Umieść stojak magnetyczny w temperaturze 4 °C na co najmniej 30 minut, aby wstępnie schłodził i utrzymuj stojak na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu.
   2. Obliczyć liczbę wymaganych probówek do mikrowirówek i wstępnie schłodzić na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
      nuta: Zwykle każda próbka wymaga 1 probówki mikrowirówkowej do końcowego oczyszczonego RNA.
   3. Szybko odwiruj probówki z kroku 5.2 i zbierz kulki, umieszczając je na stojaku magnetycznym na co najmniej 1 minutę. Zbierz lub wyrzuć supernatant do dodatkowych probówek do mikrowirówek.
      nuta: Zebrany supernatant, który zawiera frakcję niezwiązaną, może zostać błyskawicznie zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 °C w celu porównania z frakcją związaną w celu wzbogacenia transkryptu po oczyszczeniu. Po wykonaniu tego kroku protokół można wstrzymać.
   4. Przygotować bufor o wysokiej zawartości soli, dodając 0,5 μl/ml 1 M DTT i 1 μl/ml 0,1 g/ml cykloheksymidu do wysokosolnego zapasu buforowego.
      nuta: Na każdą próbkę wymagane jest 5 ml buforu o wysokiej zawartości soli.
2. Izolacja RNA
   1. Do każdej probówki dodać 1 ml świeżego buforu o wysokiej zawartości soli, a następnie delikatnie pipetować co najmniej 5 razy, nie wprowadzając bąbelków.
      nuta: Niewystarczające mycie może wprowadzić tła niezwiązanych transkryptów, podczas gdy wprowadzenie pęcherzyków może przyspieszyć degradację RNA.
   2. Zbieraj koraliki na stojaku magnetycznym przez >1 min i usuń supernatant. Powtórz kroki mycia buforem o wysokiej zawartości soli kolejne 4 razy (w sumie 5 razy).
   3. Usuń pozostały bufor o wysokiej zawartości soli i wyjmij probówki wirówkowe z podstawy magnetycznej i umieść w temperaturze pokojowej na 5 minut, aby się rozgrzały.
   4. Zawiesić kulki w 100 μl buforu do lizy (znajdującego się w zestawie do izolacji RNA) z β-merkaptoetanolem.
      nuta: Każdy zestaw do izolacji i oczyszczania RNA, który zawiera tiocyjanian guanidyny denaturant, może być używany jako bufor do lizy w celu uwolnienia związanego RNA z matrycy powinowactwa. Ekstrakcja RNA powinna być przetwarzana w temperaturze pokojowej, ponieważ tiocyjanian guanidyny może krystalizować w niskich temperaturach.
   5. Wirować kulki i bufor przez co najmniej 5 s z najwyższą prędkością, szybko odwirować, aby zebrać bufor z boku probówki do mikrowirówki i inkubować kulki z buforem w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby uwolnić RNA związane z kulkami do buforu do lizy.
   6. Zbieraj kulki na stojaku magnetycznym przez >1 min i zbieraj supernatant, aby natychmiast przejść do oczyszczania RNA zgodnie z protokołem oczyszczania RNA, jak określono w zestawie (Tabela materiałów).
      >nuta: Supernatant zawierający eluowany RNA w buforze do lizy może być również przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do 1 miesiąca przed oczyszczeniem poprzez podgrzanie do temperatury cieczy po rozmrożeniu.
   7. Aby osiągnąć maksymalną jakość wyizolowanego RNA, należy wykonać wszystkie opcjonalne kroki, w tym trawienie DNazy i wszystkie etapy elucji RNA. Podgrzej bufor elukcyjny dostarczony przez zestaw do izolacji RNA lub wodę wolną od RNaz do 60 °C w celu maksymalnego odzyskania RNA.
      nuta: Wyizolowany RNA może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca lub -80 °C przez kilka lat. Po wykonaniu tego kroku protokół można wstrzymać.

7. Opcjonalna analiza jakości RNA (zalecana)

1. Oceń jakość RNA za pomocą bioanalizatora¹¹ i ilość za pomocą spektrofotometru¹², aby określić, czy powtórzenie procesu immunoprecypitacji jest wymagane w celu uzyskania dużej ilości i wysokiej jakości RNA.
   nuta: Optymalna jakość RNA dla sekwencjonowania o wysokiej przepustowości powinna być zgodna z protokołami określonymi przez zestawy do przygotowywania bibliotek i platformy sekwencjonowania.

8. Aplikacje podrzędne

UWAGA: Całkowite RNA wyizolowane przez protokół TRAP może być używane w wielu standardowych aplikacjach downstream, w tym w sekwencjonowaniu RNA (TRAP-seq). Standardowe protokoły odwrotnej transkrypcji i ilościowego PCR mogą być również stosowane po TRAP.

1. W przypadku TRAP-seq należy przygotować bibliotekę sekwencjonowania RNA zgodnie ze standardowymi metodami¹³.
2. W przypadku sekwencjonowania RNA przygotuj biblioteki sekwencjonowania cDNA przy użyciu komercyjnych zestawów sekwencjonowania RNA z wzbogacaniem poliadenylowanych transkryptów polia(A) na bazie oligo d(T). Alternatywnie, jeśli całkowita jakość RNA jest niższa niż zalecana do wzbogacania poli(A), należy użyć modułów zubożających rRNA. Należy jednak spodziewać się większego wyrównania rRNA po sekwencjonowaniu.

Wyniki

Aby profilować ekspresję genów w repopulacji hepatocytów myszy Fah^-/-, fuzja Gfp:Rpl10a i transgeny Fah są jednocześnie dostarczane w plazmidzie zawierającym transpozon ⁸ (wektor TRAP) do wątroby metodą iniekcji hydrodynamicznej (Rysunek 1A). Usunięcie nityzynonu wywołuje toksyczne uszkodzenie wątroby, które wytwarza ciśnienie selekcyjne dla hepatocytów stabilnie wyrażających FAH w...

Dyskusja

TRAP-seq jest techniką specyficznej dla typu komórki izolacji translacji mRNA za pomocą rybosomów znakowanych epitopami i stanowi alternatywę dla podejść FACS, ponieważ omija ograniczenia, takie jak wymagania czasowe FACS⁹. Zamiast tego TRAP umożliwia szybką i wydajną izolację RNA bezpośrednio z tkanek masowych, pomagając uniknąć jakichkolwiek zmian w ekspresji genów. TRAP-seq szczególnie dobrze nadaje się do stosowania w odbudowie wątroby myszy Fah^-/- , ponieważ ekspansja hepa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 ml Młynek do tkanek, Potter-Elv, powlekany	DWK Life Sciences (Wheaton)	358007
Absolutnie RNA Miniprep Kit	Agilent	400800
Przeciwciała anty-GFP	Memorial Sloan-Kettering Przeciwciała i Rdzeń zasobów biologicznych	GFP Ab #19C8 i GFP Ab #19F7
Albumina surowicy bydlęcej, wolna od IgG, bez proteazy	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
cKompletny, Mini, wolny od EDTA inhibitor proteazy Koktajl	Roche	11836170001
Cykloheksymid	Millipore Sigma	C7698
Kwas dezoksycholowy, DOC	Millipore Sigma	D2510
D-Glukoza, Dekstroza	Fisher Scientific	D16
DL-Ditiothreitol	Millipore Sigma	D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Thermo Fisher Scientific	65602
Fisherbrand Petri Szalki z przezroczystą pokrywką	Fisher Scientific	FB0875712
HBSS (10x), wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej	Thermo Fisher Scientific	14065-056
HEPES, 1 M roztwór, pH 7,3, Klasa biologii molekularnej, Ultrapure, Thermo Scientific	Thermo Fisher Scientific	AAJ16924AE
Chlorek magnezu, MgCl2	Millipore Sigma	M8266
Metanol	Fisher Scientific	A452
NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometr	Thermo Fisher Scientific	VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Moduł izolacji magnetycznej	New England BioLabs	E7490S
NEBNext Ultra Zestaw do przygotowania biblioteki RNA dla Illumina	New England BioLabs	E7530S
Glikol nonylofenylowo-polietylenowy, NP-40. IGEPAL CA-630	Millipore Sigma	I8896
Woda bez nukleaz, bez poddanych działaniu DEPC	Ambion	AM9932
	DWK Life Sciences (Wheaton)	903475
Bufor PBS (10x), pH 7,4	Ambion	AM9625
Białko rekombinowane Pierce L, biotynylowane	Thermo Fisher Scientific	29997
Chlorek potasu, KCl	Millipore Sigma	P4504
RNA 6000 Pico Kit & Odczynniki	Agilent	5067-1513
RNaseZap RNaza Roztwór do dekontaminacji	Invitrogen	AM9780
RNasin Inhibitory rybonukleazy	Promega	N2515
Azydek sodu, NaN3	Millipore Sigma	S2002
Wodorowęglan sodu, NaHCO3	Millipore Sigma	S6297
SUPERaza· W inhibitorze RNazy	Invitrogen	AM2694