Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie poklatkowe na żywo komórek jest ważnym narzędziem w biologii komórki, które dostarcza wglądu w procesy komórkowe, które w przeciwnym razie mogłyby zostać przeoczone, źle zrozumiane lub błędnie zinterpretowane przez analizę komórek stałych. Podczas gdy obrazowanie i analiza komórek stałych jest solidna i wystarczająca do obserwacji stanu ustalonego komórki, może być ograniczona w definiowaniu czasowej kolejności zdarzeń na poziomie komórkowym i jest słabo przygotowana do oceny przejściowej natury procesów dynamicznych, w tym progresji mitotycznej. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie żywych komórek jest wymownym narzędziem, które można wykorzystać do obserwacji procesów komórkowych na poziomie pojedynczej komórki w czasie i ma zdolność uchwycenia dynamiki procesów, które w przeciwnym razie byłyby słabo reprezentowane w obrazowaniu komórek stałych. Tutaj opisujemy podejście do generowania komórek przenoszących znakowane fluorescencyjnie markery chromatyny i mikrotubul oraz ich zastosowanie w podejściach do obrazowania żywych komórek w celu monitorowania wyrównania chromosomów metafazy i wyjścia mitotowego. Opisujemy techniki oparte na obrazowaniu do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej, w tym identyfikacji komórek na różnych etapach mitozy, identyfikacji i śledzenia defektów mitotycznych oraz analizy dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po leczeniu inhibitorami mitotycznymi.
Wprowadzenie
Oparta na obrazie analiza stałych komórek jest powszechnie używana do oceny zmian poziomu populacji komórek w odpowiedzi na różne perturbacje. W połączeniu z synchronizacją komórek, a następnie zbieraniem i obrazowaniem szeregowych punktów czasowych, takie podejścia można wykorzystać do zasugerowania komórkowej sekwencji zdarzeń. Niemniej jednak obrazowanie komórek o stałym poziomie jest ograniczone, ponieważ relacje czasowe są implikowane dla populacji i nie są wykazywane na poziomie pojedynczych komórek. W ten sposób, podczas gdy obrazowanie i analiza komórek stacjonarnych są wystarczające do zaobserwowania solidnych fenotypów i zmian w stanie ustalonym, zdolność do wykrywania przejściowych zmian w czasie i zmian, które wpływają tylko na subpopulację komórek, jest niedoskonała. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie żywych komórek jest wymownym narzędziem, które może być używane do obserwacji procesów komórkowych i subkomórkowych w pojedynczej komórce lub populacji komórkowej, w czasie i bez pomocy podejść synchronizacyjnych, które same w sobie mogą wpływać na zachowanie komórek1,2,3,4,5,6.
Utworzenie dwubiegunowego wrzeciona mitotycznego jest niezbędne dla prawidłowej segregacji chromosomów podczas podziału komórki, co skutkuje powstaniem dwóch genetycznie identycznych komórek potomnych. Defekty w strukturze wrzeciona mitotycznego, które zakłócają progresję mitotyczną i zagrażają wierności segregacji chromosomów, mogą powodować katastrofalne podziały komórkowe i zmniejszoną żywotność komórek. Z tego powodu trucizny mitotyczne, które zmieniają tworzenie wrzeciona, są obiecującymi terapiami ograniczającymi szybką proliferację komórek rakowych7,8,9. Niemniej jednak, analiza stałej struktury wrzeciona po dodaniu trucizn mitotycznych ma ograniczoną zdolność do oceny dynamicznego procesu tworzenia wrzeciona i może nie wskazywać, czy obserwowane zmiany w strukturze wrzeciona są trwałe, czy raczej przejściowe i mogą zostać przezwyciężone, aby umożliwić pomyślny podział komórki.
W tym protokole opisujemy podejście do oceny dynamiki mitozy po perturbacjach wrzeciona za pomocą obrazowania żywych komórek. Korzystając z unieśmiertelnionej linii komórkowej RPE-1 hTERT zaprojektowanej do ekspresji histonu 2B oznaczonego RFP w celu wizualizacji chromatyny, wraz z α-tubuliną znakowaną EGFP do wizualizacji mikrotubul, czas wyrównania chromosomów metafazy, początek anafazy i ostatecznie los komórki mitotycznej są oceniane za pomocą wizualnych wskazówek dotyczących ruchu chromosomów, zagęszczenia i morfologii jądrowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Generacja komórek hTERT-RPE-1 stabilnie wyrażających RFP-Histone 2B (RFP-H2B) i α-tubulinę-EGFP (tub-EGFP)
UWAGA: Wszystkie kroki są zgodne z technikami aseptycznymi i odbywają się w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu II+ (BSL2+).
- Wygenerowanie retrowirusa przenoszącego interesujące geny (α-tubulina-EGFP i RFP-H2B) poprzez transfekcję komórek 293T odpowiednimi plazmidami lentiwirusowymi zgodnie z instrukcjami producenta systemu dostarczania transfekcji opartej na lipidach.
- Dzień 1: Użyj jednorazowej szklanej pipety Pasteura, aby odessać pożywkę do hodowli komórkowej z płytki z sub-konfluentnymi komórkami 293T i zmyć pozostałą pożywkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dodając 5 ml PBS. Zamieszać, aby rozprowadzić PBS na dnie płytki, a następnie zassać PBS sterylną jednorazową szklaną pipetą Pasteura.
- Dodać 2 ml 0,05% trypsyny, która została wstępnie podgrzana do 37 °C i umieścić płytkę z powrotem w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 2 do 5 minut, aby umożliwić uwolnienie przylegających komórek z powierzchni szalki do hodowli komórkowej.
- Do płytki zawierającej trypsynę dodać 8 ml świeżej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny.
- Zawiesić krwinki, delikatnie pipetując, a zawiesinę przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umieść stożkową probówkę w zbalansowanej wirówce i wiruj z prędkością 161 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby delikatnie otulić komórki.
- Odessać roztwór pożywki/trypsyny z komórek granulowanych i ponownie zawiesić komórki w 10 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną. Użyj hemocytometru, aby policzyć zawiesinę komórek 293T i płytkę 2 x 106 komórek 293T na dołek płytki 6-dołkowej.
- Hodowle komórek o łącznej objętości 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny i utrzymywane w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Dzień 2: Odpipetować 7 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów i 100 μl zredukowanej pożywki surowicy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut (probówka #1).
- W oddzielnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml odpipetuj 1 μg wektora ekspresyjnego RFP-H2B (lub 1 μg wektora ekspresyjnego α-tubuliny-EGFP) wraz z 5 μl odczynnika wzmacniającego (zgodnie z wymaganiami producenta), 0,5 μg pMD2.G i 1 μg psPAX2 oraz 100 μl zredukowanej pożywki surowicy (probówka #2).
- Połączyć zawartość kroku 1.1.7 i kroku 1.1.8, ostrożnie pipetując probówkę #2 do probówki #1 i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Reakcja może być skalowana w zależności od potrzeb w celu transfekcji komórek w dodatkowych studzienkach. - Pipetować reakcję transfekcji kroplami do żądanej studzienki zawierającej 293T komórki w 2 ml pożywki i umieścić naczynie z powrotem w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
UWAGA: Aby wygenerować komórki wykazujące ekspresję zarówno RFP-H2B, jak i α-tubuliny-EGFP, wygeneruj oddzielnego wirusa dla każdego konstruktu ekspresji (kroki 1.1.7-1.1.9). - Dzień 3: Odessać i zastąpić pożywkę 2 ml świeżego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. Umieścić naczynie z powrotem w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
- Dzień 4: Zbierz pożywkę zawierającą wyrażone cząsteczki wirusa, uważając, aby nie zakłócić lub nie usunąć komórek 293T. Przefiltrować pożywkę zawierającą cząsteczki wirusa, przepuszczając ją przez filtr 0,45 μM podłączony do strzykawki o pojemności 5 ml. Podwielokrotność wirusa do krótkotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C lub długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Uzyskane w ten sposób cząsteczki wirusa będą obecne w zakresie ~1 x 107 do 1 x 108 jednostek transdukcyjnych/ml. Ponieważ zarówno komórki wytwarzające wirusa, jak i komórki, które mają być zakażone, są hodowane w tej samej pożywce, stężenie wirusa w celu zastąpienia pożywki nie jest wymagane, a przefiltrowane cząsteczki wirusa mogą być używane bezpośrednio do infekowania komórek. - Wysiew: 2 x 10 5 komórek hTERT-RPE-1 na studzienkę 6-dołkowego naczynia w ramach przygotowania do infekcji wirusowej. Hodowla komórek w 2 ml DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny i utrzymywana w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Dzień 5: Dodać bromek heksadimetryny (np. polibren) do komórek hTERT-RPE-1 do końcowego stężenia 8 μg/ml. Zakażone komórki mieszaniną 500 μl wirusa rozcieńczonego w 500 μl pożywki do hodowli komórkowych.
UWAGA: Roztwór podstawowy bromku heksadimetryny przygotowuje się w sterylnej wodzie destylowanej, a następnie filtruje przez filtr 0,45 μm. - Dzień 6: Za pomocą jednorazowej szklanej pipety Pasteura odessać pożywkę z dołków zawierających komórki zakażone wirusem. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej 2 ml DMEM zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i odpowiednie stężenia antybiotyku, aby wybrać integrację i ekspresję plazmidu.
UWAGA: Plazmid ekspresji α-tubuliny-EGFP użyty w opisanych eksperymentach przenosi gen oporności na puromycynę, a plazmid ekspresyjny RFP-H2B przenosi gen oporności na blasticydynę. Dlatego 10 μg/ml puromycyny i 2 μg/ml blasticydyny stosuje się do selekcji komórek α-tubuliny-EGFP, RFP-H2B eksprymujących hTERT RPE-1. Stężenia antybiotyku użytego do selekcji mogą się różnić dla różnych użytych linii komórkowych. - Utrzymuj komórki pod selekcją antybiotykową przez 5-7 dni, zastępując pożywkę co 3 dni świeżą pożywką zawierającą odpowiednie odczynniki selekcyjne.
UWAGA: Komórki powinny być utrzymywane w stanie konfluencji podrzędnej podczas selekcji i powinny być rozszerzane w razie potrzeby, zgodnie z opisem w krokach od 1.1.1 do 1.1.4. - Użyj obrazowania immunofluorescencyjnego, aby potwierdzić ekspresję oznakowanych konstruktów.
UWAGA: W razie potrzeby można uzyskać klony pojedynczych komórek, aby uzyskać jednolite poziomy ekspresji w populacji komórek. Po potwierdzeniu stabilnych klonów, komórki mogą być utrzymywane w standardowych warunkach hodowli przy braku selekcji antybiotyków.
2. Przygotowanie komórek do obrazowania żywych komórek po perturbacjach wrzeciona mitotycznego
UWAGA: Stosuj techniki aseptyczne i wykonaj czynności w szafie bezpieczeństwa BSL2.
- Używając sterylnej, jednorazowej szklanej pipety Pasteura, odessać pożywkę z płytki hodowlanej zawierającej linię komórkową, która przenosi konstrukt ekspresyjny (konstrukty) ekspresyjny (od kroku 1.7). Krótko przemyć komórki 10 ml sterylnego PBS. Zamieszaj, aby rozprowadzić PBS na dnie płytki, a następnie odessać PBS sterylną jednorazową szklaną pipetą Pasteura.
- Dodaj 2 ml 0,05% trypsyny do 10 cm płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut lub do momentu, gdy komórki oderwą się od powierzchni płytki.
- Dodaj 8 ml świeżej pożywki do płytki zawierającej trypsynę. Zawiesić krwinki, delikatnie pipetując, a zawiesinę przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umieść stożkową probówkę w zbalansowanej wirówce i wiruj z prędkością 161 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby delikatnie otulić komórki.
- Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml PBS, delikatnie pipetując pipetą serologiczną o pojemności 10 ml. Umieść stożkową probówkę w zbalansowanej wirówce i wiruj z prędkością 161 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby delikatnie otulić komórki.
- Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml świeżej pożywki, delikatnie pipetując pipetą serologiczną o pojemności 10 ml.
- Policz komórki, a następnie oblicz liczbę komórek za pomocą hemacytometru i rozcieńcz do stężenia 1-2 x 105 komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowych. Zasiać 500 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka sterylnej 12-dołkowej płytki dolnej do obrazowania. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych i pozwolić komórkom przylgnąć do powierzchni płytki.
UWAGA: Obrazowanie żywych komórek wymaga, aby komórki były dobrze przylegające, aby pozostały skojarzone z płaszczyzną obrazowania podczas akwizycji obrazu. Czas potrzebny do przylegania komórek po posiewie może się różnić w zależności od linii komórkowej i powinien być zoptymalizowany dla badanej linii komórkowej. - Do 30 minut przed rozpoczęciem obrazowania poklatkowego dodaj odpowiednie stężenie leku mitotycznego do jednego lub więcej studzienek obsianych komórkami. Aby uwzględnić potencjalny wpływ rozpuszczalnika organicznego na zachowanie komórek, dodaj równą objętość rozcieńczalnika inhibitora do komórek jako kontrolę. Na przykład należy upewnić się, że dodanie 100 nM specyficznego inhibitora kinazy mitotycznej Aurora A (np. alisertibu) jest równoległe z równą objętością DMSO, rozcieńczalnika dla tego leku, w studzience kontrolnej komórek.
UWAGA: Analiza porównawcza dynamicznych zmian w progresji mitotycznej wymaga przygotowania studzienek komórek przy braku zakłóceń, aby umożliwić obrazowanie normalnych mitoz równolegle do warunków eksperymentalnych.
3. Mikroskop ustawiony do obrazowania poklatkowego komórek RFP-H2B, α-tubulina-GFP (Rysunek 1, Rysunek 2)
- Umieścić płytkę do hodowli komórkowej zawierającą RFP-H2B, α-tubulinę-GFP eksprymujące komórki hTERT RPE-1 do obrazowania w odpowiedniej wstawce etapowej na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym, który jest wyposażony w kamerę o wysokiej rozdzielczości (rozmiar piksela 0,67 μm przy 20x), komorę środowiskową podgrzaną do 37 °C oraz system dostarczania do nawilżania 5% CO2,
UWAGA: Odpowiednie mogą być zarówno zamknięte komory środowiskowe, jak i wkładki stage z kontrolowaną temperaturą, pod warunkiem, że można dostarczyć nawilżone 5% CO2 i uzyskać stabilną kontrolę temperatury. - Użyj obiektywu pneumatycznego o powiększeniu 20x z aperturą numeryczną 0,5 i przystosowanym do obrazowania fluorescencji i kontrastu fazowego o wysokim kontraście lub jasnego pola. Oglądaj komórki z kontrastem fazowym lub jasnym polem i dostosuj przebieg i precyzyjną ostrość pod mikroskopem, aby ustawić ostrość komórek.
- Zidentyfikuj i ustaw optymalne czasy naświetlania dla akwizycji obrazu w jasnym polu, GFP i RFP, wybierając odpowiednią kostkę filtra o odpowiednim wzbudzeniu i emisji dla fluoroforów, które będą obrazowane. Możesz też kliknąć przycisk automatycznej ekspozycji, aby wprowadzić z góry określony czas ekspozycji. Jeśli sygnał nie jest wystarczająco intensywny, wybierz grupowanie pikseli, aby umożliwić krótsze czasy ekspozycji, klikając kartę kategoryzacji i wybierając opcję łączenia pikseli 2 x 2 piksele z menu rozwijanego.
UWAGA: Fototoksyczność może upośledzać progresję mitotyczną i żywotność komórek. Niepowodzenie komórek mitotycznych w populacjach kontrolnych w ukończeniu normalnych mitoz może wskazywać, że czasy ekspozycji i/lub czas trwania obrazowania wymagają dalszej optymalizacji. - Użyj oprogramowania do akwizycji i analizy, które umożliwia jednoczesne wykonywanie obrazowania wielokierunkowego i wielodołkowego oraz definiowanie parametrów akwizycji obrazu.
- Wybierz i skalibruj stolik mikroskopu do czaszy wielodołkowej, zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj oprogramowania do akwizycji obrazu, aby podświetlić lub w inny sposób wybrać dołki, które zostaną zobrazowane, klikając odpowiednie dołki na schemacie używanego formatu płyty.
- W panelu sterowania GeneratedPoints (Rysunek 2) zdefiniuj współrzędne w każdym dołku, który zostanie zobrazowany, klikając kartę Umieszczanie punktów i wybierając predefiniowane lub losowe rozmieszczenie współrzędnych z menu rozwijanego. Wybierz kartę Obszar roboczy i wybierz opcję Ograniczony z menu rozwijanego, aby ograniczyć obszar wyboru współrzędnych w celu wykluczenia granic studni. Kliknij karty Count (Liczba) i Distribution (Rozkład), aby wybrać odpowiednio liczbę i rozkład punktów do przechwycenia na odwiert.
UWAGA: Liczba współrzędnych, które można zobrazować dla każdego dołka w ciągu 5-minutowego przyrostu punktu czasowego, będzie ograniczona liczbą dołków do zobrazowania, a także czasem ekspozycji dla każdego kanału. Zazwyczaj 5-8 współrzędnych na studzienkę wystarcza, aby zaobserwować, jak co najmniej 50 komórek w każdym stanie przechodzi przez mitozę w ciągu 4 godzin. - Wybierz i wprowadź przedział czasu i czas trwania zbierania obrazów, klikając i wprowadzając wartości w panelu sterowania TimeSequence.
UWAGA: Akwizycja obrazów co 1 do 5 minut jest odpowiednia do monitorowania dynamiki progresji mitotycznej. Całkowity czas trwania obrazowania powinien odzwierciedlać pożądany punkt końcowy i szybkość proliferacji linii komórkowej. Na przykład 4 godziny wystarczą, aby zobaczyć, jak wiele komórek przechodzi przez mitozę, 16 godzin wystarczy, aby zobaczyć, jak większość komórek RPE-1 w populacji asynchronicznej przechodzi przez mitozę.
4. Analiza obrazu poklatkowego w celu określenia czasu metafazy i losu komórki mitotycznej po perturbacjach wrzeciona mitotycznego
UWAGA: Przeprowadź analizę obrazu za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów (Tabela materiałów), ImageJ lub porównywalnego oprogramowania do analizy obrazu.
- Wizualizuj chromatynę oznaczoną znakiem RFP-H2B, wybierając obrazy przechwycone z umieszczoną kostką filtra RFP. Zidentyfikuj komórkę wchodzącą w mitozę, jak wskazuje początkowe zagęszczenie chromatyny (Rysunek 2C, niebieski grot strzałki) i rozpad otoczki jądrowej (gdy α-tubulina-EGFP nie jest już wykluczona przez granicę jądrową).
- Określ mitotyczny czas wyrównania metafazy i początku anafazy w poszczególnych komórkach: Śledź komórkę przez kolejne punkty czasowe w uzyskanym filmie, aby określić liczbę punktów czasowych / minut od wejścia mitotycznego do momentu, gdy chromatyna znakowana RFP-H2B zakończy wyrównanie na równiku komórki podczas metafazy (Rysunek 2C, żółty grot strzałki).
- Aby monitorować czas mitotyczny, wierność mitotyczną i los komórki, kontynuuj śledzenie komórki przez kolejne punkty czasowe, aby zidentyfikować współrzędną czasową, w której segregacja chromosomów anafazy jest widoczna (Rysunek 2C, biały grot strzałki) i/lub gdzie nastąpiła dekompozycja chromatyny i reformacja otoczki jądrowej (na co wskazuje wykluczenie tubuliny z jądra).
UWAGA: Perturbacje w montażu wrzeciona lub progresja mitotyczna mogą być oceniane jako funkcja czasu wymaganego do uzyskania dwubiegunowego wrzeciona mitotycznego i osiągnięcia pełnego wyrównania chromosomów lub do całkowitej segregacji chromosomów anafazy. - Wizualizacja RFP-H2B w celu identyfikacji komórek w każdej populacji, które wykazują defekty mitotyczne, w tym opóźnione chromosomy i mostki chromatyny podczas segregacji chromosomów anafazowych.
UWAGA: Obniżona wierność mitotyczna może również skutkować wielojądrowymi lub mikrojądrowymi komórkami potomnymi i może być wizualizowana w komórkach po wyjściu mitotycznym, jak w Rysunek 3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ocena postępu mitozy w obecności zaburzeń wrzeciona
Regulacja ogniskowania bieguna wrzeciona jest kluczowym etapem prawidłowego tworzenia wrzeciona dwubiegunowego. Zakłócenia w tym procesie poprzez deplecję białek, inhibicję lekową lub zmiany w liczbie centrosomów uszkadzają strukturę wrzeciona i opóźniają lub zatrzymują postęp mitozy10,1,12,13
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rozdzielczość czasowa zapewniana przez obrazowanie poklatkowe pozwala na wizualizację i ocenę sekwencyjnych zdarzeń komórkowych w obrębie pojedynczych komórek. Podejścia, które wykorzystują synchronizację komórkową, a następnie zbieranie i utrwalanie komórek w sekwencyjnych punktach czasowych, są ograniczone, ponieważ ostatecznie dokonuje się porównań między populacjami komórek. W kontekstach, w których odpowiedź komórkowa na perturbacje może być niejednorodna lub gdy wizualizowany proces jest dynamiczny, obrazowanie pok...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
DLM jest obsługiwany przez NSF GRFP. ALM jest wspierany przez fundusze z nagrody Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,05% Trypsyna | Gibo-Life sciences | 25-510 | Proteaza serynowa stosowana do uwalniania przylegających komórek z naczyń hodowlanych |
| 15ml probówki wirówkowe | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor obiektyw | Nikon | Do stosowania w obrazowaniu żywych komórek do wizualizacji zarówno jasnego pola, jak i fluorescencji | |
| Komórki 293T | ATCC | CRL-3216 | Do stosowania w transfekcji retrowirusowej; stosowany w kroku 1.1 |
| a-tubulina-EGFP | Addgene | różne liczby | Wektor ekspresji dla tubuliny alfa połączonej z zielonym znacznikiem białka fluorescencyjnego; do stosowania w wizualizacji tubuliny w obrazowaniu żywych komórek: komercyjnie dostępny za pośrednictwem Addgene i innych dostawców |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Małocząsteczkowy inhibitor kinazy mitotycznej Aurora A. Stężenie podstawowe przygotowuje się w 10 mM w DMSO i stosuje w końcowym stężeniu 100 nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Środek selekcyjny do antybiotyków; stosowany do selekcji komórek eksprymujących a-tub-EGFP |
| C02 | Airgas | Do stosowania w hodowlach komórkowych i obrazowaniu żywych komórek | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Jednozakresowy zestaw filtrów; długość fali wzbudzenia 545nm o szerokości pasma 25nm i emisja przy długości fali 605nm o szerokości pasma 70nm; do wizualizacji H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Zestaw filtrów jednopasmowych; długość fali wzbudzenia 470nm o szerokości pasma 40nm i emisja przy długości fali 525nm o szerokości pasma 50nm; do wizualizacji jednorazowych pipet Pastuer z tubuliny GFP, |
| sterylizowane | Fisher Scientific | 13-678-6A | Do stosowania w komórkach aspiracyjnych |
| Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Pożywka do hodowli komórkowych do wzrostu komórek RPE-1 i 293T |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Suplement pożywki do hodowli komórkowych |
| Lipofectamina 3000 i p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów do transfekcji plazmidów; stosowany w 1.1.4 |
| Naczynia do wielodołkowych kultur tkankowych | Corning | różne | do stosowania w hodowli komórkowych, transfekcji/infekcji i obrazowaniu żywych komórek |
| Mikroskop Ti-E firmy Nikon | Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny firmy Nikon do stosowania w obrazowaniu żywych komórek | ||
| Nikon | wersja 4.51 | Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu; używane w sekcjach 3 i 4 | |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Zredukowana pożywka surowicowa do transfekcji komórek; stosowana w kroku 1.1.3 |
| Penicylina/Streptomycyna | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antybiotyk stosowany w pożywce |
| z roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do hodowli komórkowych (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterylny roztwór soli fizjologicznej do stosowania z hodowlą komórkową |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiwirusowy konstrukt ekspresji otoczki VSV-G; stosowany w kroku 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Polimer kationowy stosowany do zwiększania skuteczności infekcji wirusowych; stosowany w kroku 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | plazmid do pakowania lentiwirusa 2. generacji; stosowany w kroku 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Środek selekcyjny antybiotyku; używany do selekcji komórek eksprymujących RFP-H2B |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | różne liczby | Wektor ekspresji dla histonu 2B znakowanego białkiem czerwonej fluorescencji; do stosowania w wizualizacji chromatyny w obrazowaniu żywych komórek: komercyjnie dostępny przez Addgene i innych dostawców |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów do transfekcji konstruktów siRNA |
| Komórki RPE-1 | ATCC | CRL-4000 | Linia komórkowa nabłonka barwnika ludzkiego |
| Naczynie do hodowli tkankowych 100x20mm | Corning | 353003 | do stosowania w hodowli komórek adherentnych |
| Kamera Zyla sCMOS | Aparat Nikon | dołączony do miroskopu, służący do robienia zdjęć komórek |
Bibliografia
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491(2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131(2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564(2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
