Kwantyfikacja samoodnowy w mysich kulturach mammosfery

Podsumowanie

Tutaj opisujemy implementację i interpretację wyników ilościowego testu samoodnawiania mammosfery in vitro.

Streszczenie

Gruczoł sutkowy charakteryzuje się rozległą zdolnością do regeneracji, ponieważ przechodzi ogromne zmiany hormonalne przez cały cykl życia samicy. Rola komórek macierzystych sutka (MaSC) jest szeroko badana zarówno w kontekście fizjologicznym/rozwojowym, jak i w odniesieniu do kancerogenezy piersi. W tym aspekcie bardzo poszukiwane są badania ex vivo skoncentrowane na właściwościach MaSC. Kultury mammosfery stanowią substytut tworzenia się narządów i stały się cennym narzędziem zarówno w badaniach podstawowych, jak i translacyjnych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania mysich pierwotnych kultur mammosfery oraz ilościowe określenie właściwości wzrostu MaSC. Protokół obejmuje pobieranie i trawienie gruczołu sutkowego, izolację pierwotnych komórek nabłonka sutka (MEC), ustanowienie pierwotnych kultur mammosfery, seryjne pasażowanie, ilościowe określenie parametrów wzrostu mammosfery i interpretację wyników. Jako przykład przedstawiamy wpływ niskopoziomowej konstytutywnej ekspresji Myc na normalne MEC, co prowadzi do zwiększonej samoodnowy i proliferacji.

Wprowadzenie

Izolacja i hodowla in vitro komórek macierzystych i progenitorowych nabłonka sutka stały się niezbędne do zrozumienia ich właściwości w biologii komórek sutkowych. Eleganckie śledzenie linii i testy seryjnych przeszczepów umożliwiły badanie komórek macierzystych (SC) i innych podzbiorów tkanek w kontekście ich niszy in vivo. Jednak takie podejście jest czasochłonne i wymaga generowania modeli myszy reporterskich^1,2,3,4,5. W związku z tym hodowla in vitro i namnażanie komórek macierzystych sutka (MaSC) przy jednoczesnym zachowaniu kluczowych cech macierzystych, a mianowicie zdolności do samoodnawiania się i różnicowania, jest jednym z największych wyzwań w tej dziedzinie. W ostatnich latach test mammosfery był szeroko stosowany do modelowania zarówno prawidłowej tkanki sutka, jak i wzrostu raka piersi, do ilościowego określania normalnych lub nowotworowych SC (CSC) i oceny ich zdolności do samoodnawiania się jako zastępczego reportera ich aktywności w odpowiednim kontekście in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

Test mammosfery jest efektywnym i opłacalnym podejściem, w którym świeżo izolowane komórki nabłonka sutka (MEC) są hodowane w warunkach nieprzylegających, z założeniem, że tylko MaSC przetrwają i utworzą kule w zawiesinie, podczas gdy wszystkie inne typy komórek umrą z powodu anoikis. Co więcej, zdolność do formowania kilku generacji mammosfer w szeregowych nieprzylegających przejściach jest związana ze zdolnością do samoodnawiania się MaSCs^6,9,11. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół ilościowego testu mammosfery, który został pierwotnie opracowany przez Dontu i współpracowników⁷ jako modyfikacja pionierskiego testu neurosfery¹², umożliwiający wzrost przypuszczalnych SC w nieprzylegających, wolnych od surowicy warunkach z dodatkiem odpowiednich czynników wzrostu^7,12.

Protokół

Procedury in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą UE 2010/63 i po zatwierdzeniu przez naszą instytucjonalną komisję etyki (Organizm dla Dobrostanu Zwierząt - OPBA) oraz włoskie Ministerstwo Zdrowia (numery IACUC 762/2015 i 537/2017).

1. Pobieranie i trawienie mysiego gruczołu sutkowego

1. W typowym eksperymencie należy złożyć w ofierze 8-10 tygodniowe dziewicze samice myszy przez wdychanie CO₂ . W zależności od celów eksperymentu użyj 5-30 myszy. Umieść myszy na deskach sekcyjnych pod maską. Użyj igieł, aby rozciągnąć kończyny przednie i zmyć sierść zwierzęcia etanolem.
2. Podnieś skórę kleszczami i wykonaj pionowe nacięcie, zaczynając od poziomu obszaru miednicy i przesuwając się aż do szyjki macicy, pozostawiając nienaruszoną otrzewną. Aby uniknąć pęknięcia skóry lub otrzewnej, użyj nożyczek o zaokrąglonych krawędziach.
3. Ostrożnie oderwij skórę od ciała delikatnymi ruchami nożyczek po bocznej osi ciała.
4. Gdy skóra zostanie całkowicie oderwana od klatki piersiowej i brzucha, wykonaj cztery nacięcia w poprzek czterech kończyn zwierzęcia i przygwoźdź skórę igłami. Użyj nożyczek i kleszczy, aby całkowicie oderwać ciało zwierzęcia od przedłużonej skóry.
5. Użyj kleszczy, aby delikatnie podnieść poduszeczki tłuszczowe sutka, które są teraz całkowicie odsłonięte, i ostrożnie oderwij je od skóry za pomocą nożyczek. Zbierz dolną część klatki piersiowej i jamę brzuszną gruczołów sutkowych każdej myszy i zanurz je w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zbierz do 20 gruczołów na probówkę. Chusteczki higieniczne należy trzymać na lodzie.
   nuta: W razie potrzeby gruczoły mogą pozostać na lodzie przez noc. Jest to bezpieczny punkt postoju. Poniższe czynności należy wykonywać w sterylnych warunkach.
6. Przygotuj i przefiltruj pożywkę wytrawiającą: zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnioną 2 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 200 U/ml kolagenazy i 100 μg/ml hialuronidazy (patrz tabela materiałów).
7. Przenieś do 20 gruczołów na szalkę Petriego o średnicy 100 mm i zmiel tkankę za pomocą skalpela lub zakrzywionych nożyczek. Unikaj przenoszenia dużych ilości DPBS do naczynia.
8. Dodać 10 ml pożywki wytrawiającej do każdej płytki Petriego i przenieść zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml.
9. Uszczelnij rurki parafilmem i umieść je na rotatorze. Ustawić rotator na niską prędkość (0,03 x g) i inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ .
10. Sprawdź wzrokowo zawieszenie przed przejściem do kolejnych kroków. Jeżeli duże kawałki tkanki pozostają niestrawione, należy przedłużyć inkubację w temperaturze 37 °C o kolejne 30 minut.
    nuta: Alternatywnie, trawienie można przeprowadzić przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ , przy użyciu delikatnej mieszanki kolagenazy i enzymu hialuronidazy¹³.

2. Izolacja pierwotnych mysich MEC

1. Zatrzymaj rotator i wyjmij rurki z inkubatora. Wyreguluj końcówkę P1000 przy otworze pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Jeśli zawieszenie przechodzi przez końcówkę P1000, przejdź do kolejnych kroków. W przeciwnym razie przedłużyć inkubację w temperaturze 37 °C o kolejne 30 minut.
2. Wirować przy 100 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad z każdej probówki w 3 ml DPBS.
   nuta: Niska prędkość wirowania pozwala na usunięcie limfocytów i komórek tkanki tłuszczowej. Wymagana jest delikatna manipulacja, aby uniknąć przemieszczenia się granulki na tym etapie.
3. Przefiltrować zawiesinę komórek w każdej probówce oddzielnie, używając filtrów siatkowych o średnicy 100, 70 i 40 μm. Na każdym etapie filtrowania umyj sitka 2 ml DPBS przed zebraniem przepustu.
   nuta: Od tego momentu zawiesiny komórek mogą być łączone i przetwarzane razem.
4. Wirować przy 300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości DPBS.
5. Przystąpić do lizy krwinek czerwonych (RBC), dodając równą objętość buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) (patrz tabela materiałów). Mieszać pipetując i inkubować na lodzie do 5 minut.
6. Dodać 10 ml DPBS i odwirować przy 300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant i dokonać oględzin osadu. Jeśli granulka jest biała, przejdź do następnego kroku. W przeciwnym razie powtórzyć etap lizy RBC (krok 2.5).
7. Zawiesić osad komórkowy w 1-5 ml pożywki mammosfery: pożywka do wzrostu komórek nabłonka sutka (MEBM), uzupełniona 2 mM glutaminą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 5 μg/ml insuliny, 0,5 μg/ml hydrokortyzonu, 2% B27, 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 20 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 0,4 IU/ml heparyny (patrz tabela materiałów).

3. Ponowne powlekanie seryjnej mammosfery

1. W celu założenia kultur mammosfery, umieść komórki na 6-dołkowych płytkach poddanych działaniu kultur nietkankowych (o bardzo niskiej adhezji) o gęstości 200 000 żywych komórek/ml w pożywce mammosfery. Inkubować komórki przez 7-10 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
2. Przygotować i przefiltrować 1% roztwór poli-HEMA w 95% etanolu (patrz Tabela materiałów). Pokryj 6-dołkowe płytki o bardzo niskiej przyczepności dla następujących przejść, dodając 400 μl 1% roztworu poli-HEMA na dołek i pozwalając etanolowi całkowicie wyschnąć. Aby uzyskać lepsze rezultaty, powtórz powlekanie dwukrotnie.
   nuta: Zastosowanie niepowlekanych płytek podczas pierwszego pasażu pozwala na selektywne usuwanie fibroblastów z hodowli.
3. Pod koniec 7-10 dni hodowli zebrać pierwotne mammosfery ze wszystkich studzienek i odwirować w temperaturze 300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
4. Ostrożnie zdekantować supernatant i przystąpić do mechanicznej dysocjacji mammosfer za pomocą pipety P200 z filtrowanymi końcówkami. Odpipetować około 100 razy i wizualnie sprawdzić zawiesinę pod kątem obecności dużych sferoidów.
   nuta: Krótka inkubacja (2-5 min) kuli w małej objętości (0,2-0,5 ml) trypsyny lub Accutazy w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ może być zastosowana w celu ułatwienia dysocjacji mechanicznej. Przygotować świeżą pożywkę mammosfery (krok 2.7) do posiewu każdego przejścia.
5. Zawiesić w 1-5 ml świeżej pożywki mammosfery i policzyć żywe komórki. W stosownych przypadkach należy podzielić komórki na grupy poddane działaniu substancji lub w warunkach hodowli.
6. Umieść 20 000 żywotnych komórek/ml na 6-dołkowych płytkach o bardzo niskiej przyczepności pokrytych poli-HEMA i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
   nuta: Mammosfery osiągają maksymalny rozmiar w ciągu 5-7 dni po posiewie komórek. Jeśli to możliwe, należy rozmieścić komórki każdej próbki lub stanu do wielu studzienek, aby uzyskać kontrpróby techniczne. Gęstość posiewu powinna być utrzymywana na niskim poziomie, aby uniknąć agregacji komórek. Zaleca się maksymalnie 20 000 komórek/ml dla płytek 6-dołkowych i 5 000 komórek/ml dla płytek 24-dołkowych.
7. Po 5-7 dniach policz liczbę kulek w studzience. Można to zrobić ręcznie, za pomocą mikroskopu wyposażonego w soczewkę o 10-krotnym powiększeniu lub za pomocą cyfrowej analizy obrazu (patrz krok 4).
8. Zebrać mammosfery z każdej studzienki oddzielnie i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
9. Ostrożnie zdekantować supernatant i przystąpić do mechanicznej dysocjacji mammosfer za pomocą pipety P200 z filtrowanymi końcówkami. Odpipetować około 100 razy i wizualnie sprawdzić zawiesinę pod kątem obecności dużych sferoid.
10. Zawiesić ponownie w 1 ml świeżej pożywki mammosfery i policzyć żywe komórki. Połączyć komórki każdej próbki lub warunku i powtórzyć kroki 3.6-3.10. Zapisać liczbę posianych komórek oraz liczbę kulek i komórek zliczonych w każdym dołku dla każdego przejścia. Przejdź do kroku 5 w celu obliczenia skumulowanego wzrostu.

4. Wyliczanie sfer za pomocą cyfrowej analizy obrazu (DIA)

1. Na końcu każdego przejścia zeskanuj całą powierzchnię wszystkich studni i uzyskaj obrazy kul za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na stereoskopie. Zapisz obrazy jako pliki .tif.
2. Zaimportuj obrazy stereoskopowe jako sekwencję obrazów za pomocą klasy ImageJ14. Ustaw skalę i typ obrazu na 8-bitowy.
3. Zduplikuj stos obrazów i wybierz opcję Odejmij tło z zakładki Proces na pasku menu. Zaznacz opcje Jasne tło i Paraboloida przesuwna i kliknij przycisk OK. Przetwórz wszystkie obrazy stosu.
4. Wybierz Dostosuj, a następnie Próg z zakładki Obraz paska menu. Klikając Zastosuj, pojawi się okno dialogowe zatytułowane Konwertuj stos na binarny. Wybierz opcję Domyślne jako metodę i Światło jako tło. Zaznacz pole Oblicz próg dla każdego obrazu i kliknij przycisk OK.
5. Wybierz kolejno polecenia Zlewnia, Otwórz i Erozja z listy binarnej na karcie Proces paska menu. Przetwarzaj wszystkie obrazy stosu, klikając przycisk Tak w wyświetlonym oknie dialogowym.
   nuta: Procesy te pozwalają na wizualną segmentację obiektów, które się stykają, wygładzanie obiektów i usuwanie pikseli z krawędzi obiektów.
6. Wybierz funkcję Analizuj cząstki z menu Analizuj. Ustaw minimalny próg rozmiaru na 10 000 μm² i okrągłość w zakresie od 0,50 do 1,00. Wybierz opcję Wielokropek z menu rozwijanego Pokaż. Zaznacz opcję Sumuj, Wyklucz na krawędziach i Pokaż na miejscu i kliknij przycisk OK. Przetwarzaj wszystkie obrazy stosu.
7. Sprawdź wzrokowo zgodność elipsy ze sferami i, jeśli to konieczne, odpowiednio skoryguj liczbę cząstek. Zsumuj liczby ze wszystkich ramek każdej studzienki, aby uzyskać całkowitą liczbę mammosfer na studzienkę.

5. Obliczanie skumulowanej krzywej wzrostu

UWAGA: Liczba mammosfer zliczonych w każdym dołku na końcu każdego przejścia (P_N) odzwierciedla liczbę komórek inicjujących mammosferę zasianych na początku P_N.

1. Dla każdego przejścia (P_N) zarejestruj liczbę posianych komórek oraz liczbę komórek i kulek zliczonych na studzienkę. Oblicz rozmiar kuli na końcu każdego przejścia:
   rozmiar kuli P_N (komórki / kula) = komórki liczone P_N / kule liczone P_N
   nuta: Rozmiar kuli w_{P N} jest miarą potencjału proliferacyjnego każdej komórki inicjującej mammosferę zasianej w P_N.
2. Wywnioskuj liczbę platerowanych kulek, dzieląc liczbę komórek posianych dla_{P N} przez rozmiar kuli obliczony na końcu poprzedniego przejścia (P_N-1):
   kule platerowane P_N = komórki platerowane_{P N} / rozmiar kuli P_N-1
   nuta: Zgodnie z konwencją, przyjmuje się, że rozmiar kuli jest stabilny podczas pierwszego przejścia kultury (tj. rozmiar kuli P₀ = rozmiar kuli P₁). Jeśli jako kontrpróby techniczne używa się wielu odwiertów, jako mianownik należy użyć średniej wielkości kuli w P_N-1.
3. Oblicz skumulowaną liczbę komórek i kul dla każdej studzienki na przejście:
   liczba skumulowana P_N = (liczba P_N / platerowana P_N) X liczba skumulowana P_N-1,
   nuta: Zgodnie z konwencją, łączna liczba P₀ = platerowana P₁. Jeżeli jako kontrpróby techniczne wykorzystuje się wiele studzienek, należy obliczyć średnią łączną liczbę odwiertów na próbkę lub warunek dla każdego przejścia.
4. Wykreśl punkty danych w skali półlogarytmicznej. Wyświetla numer przejścia (od_{P 0} do P_N) na osi x (skala liniowa) oraz skumulowany numer komórki lub sfery na osi y (skala logarytmiczna).
5. Dopasuj wykładniczą linię trendu do punktów danych i oblicz współczynnik determinacji (R²), aby zmierzyć dobroć dopasowania.
   nuta: Linia trendu dopasowana do punktów danych powinna być zbliżona do krzywej wykładniczej, zgodnie z oczekiwaniami dla populacji komórek, która rośnie lub umiera ze stałą szybkością. R² przyjmuje wartości z zakresu od 0 do 1, przy czym wartości najbliższe 1 wskazują na lepsze dopasowanie.
6. Przedstaw równanie linii trendu jako naturalną funkcję wykładniczą, aby wywnioskować tempo wzrostu (GR) kultury:
   y = y₀ e^(GR)x, gdzie y₀ jest wartością y, gdy x = 0.

Wyniki

Nadekspresja Myc w prawidłowych MEC prowadzi do zwiększenia częstotliwości występowania komórek inicjujących tworzenie mammosfer. Jest to osiągane poprzez podwójny mechanizm: Myc zwiększa tempo symetrycznych podziałów MaSC oraz częstotliwość przeprogramowania komórek progenitorowych w nowe MaSC¹. Aby przetestować efekt niskiej konstytutywnej ekspresji Myc, zastosowaliśmy transgeniczny model myszy Rosa26-MycER, w którym aktywność Myc może być indukowana przez 4-hydroksytamoksifen (4-OHT)¹⁵. Najpierw wysialiśmy MEC na płytkach 6-dołkowych o ultra-niskim stopniu adhezji w celu usunięcia fibroblastów, bez dodatku 4-OHT. Po pierwszym pasażu podzieliliśmy kulturę na dwie części: dwie dołki pozostały nieleczone (kontrola), a w dwóch dołkach zastosowano 20 nM 4-OHT (MycER). Przeliczono liczbę sfer i komórek w 5 kolejnych pasażach dla trzech niezależnych eksperymentów (Tabela 1). Skumulowana liczba komórek i sfer na pasaż przedstawiona jest w Tabeli 2. Indukcja za pomocą 4-OHT prowadzi do zwiększenia tempa wzrostu sfer i komórek, co pokazano na Rysunku 1.

Rycina 1: Reprezentatywne wyniki. Sfera kumulacyjna (A) oraz komórka (B) krzywe wzrostu mammosfer kontrolnych i MycER. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe z 3 niezależnych eksperymentów. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

		Pierwsze wysianie			drugie wysiewanie			3. posiew			4. wysiewanie na podłoża			5. pasażowanie
		Posiane komórki	Liczenie komórek	Liczenie sfer	Liczba wysianych komórek	Liczenie komórek	Liczba sfer	Liczba wysianych komórek	Liczenie komórek	Liczenie sfer	Liczba wysianych komórek	Liczenie komórek	Liczenie sfer	Liczba wysianych komórek	Liczenie komórek	Zliczanie sfer
Eksperyment 1	Kontrola	77,000	50,000	31	65,000	58,500	41	57,000	30,000	32	30,000	22,000	5	22,000	0	0
		77,000	81,000	41	65,000	55,000	23
	MycER	77,000	31,0000	193	80,000	375,000	323	80,000	380,000	217	80,000	220,000	223	80,000	170,000	155
		77,000	110,000	142	80,000	505,000	396	80,000	270,000	149	80,000	290,000	194	80,000	250,000	160
Exp2	Kontrola	75,000	75,000	71	60,000	17,000	34	28,000	45,000	29	45,000	13,000	2	13,000	0	0
		75,000	47,000	45	60,000	11,000	47
	MycER	75,000	200,000	188	80,000	225,000	277	80,000	230,000	155	80,000	210,000	211	80,000	100,000	95
		75,000	250,000	192	80,000	202,500	283	80,000	305,000	185	80,000	160,000	237	80,000	100,000	133
Eksperyment 3	Kontrola	82,500	130,000	121	80,000	45,000	105	80,000	110,000	86	80,000	58,500	75	58,500	58,500	78
		82,500	125,000	177	80,000	71,250	42
	MycER	82,500	325,000	457	80,000	610,000	327	80,000	367,000	309	80,000	500,000	260	80,000	115,000	146
		82,500	475,000	463	80,000	455,000	392	80,000	415,000	204	80,000	470,000	295	80,000	185,000	161

Tabela 1: Liczba przeliczonych sfer oraz liczba wysianych i przeliczonych komórek w każdym pasażu.

Tabela 2: Obliczanie liczby wysianych sfer oraz skumulowanej liczby sfer i komórek. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

W tym miejscu opisano protokół ilościowego opisu właściwości wzrostu MaSC in vitro. Jako przykład przedstawiamy wpływ niskopoziomowej konstytutywnej ekspresji Myc na normalne mysie MaSC. Podejście to można jednak w równym stopniu zastosować do różnych kontekstów. Ludzkie lub mysie komórki pierwotne, a także ustalone linie komórkowe, mogą być hodowane w warunkach niezależnych od zakotwiczenia w celu stworzenia kultur mammosfery, które mogą być szeregowo pasażowane. Nadekspresję genów i interferencję RNA można łatwo wprowadzić do protokołu poprzez dodanie etapu transdukcji wirusa na końcu pierwszego pasażu (po kroku 3.5). Alternatywnie, komórki mogą być infekowane adhezją, a następnie powlekane jako mammosfery.

Krytycznym aspektem przedstawionego tutaj testu jest gęstość komórek wysiewu, która powinna być na tyle niska, aby uniknąć generowania agregatów zakłócających interpretację wyników^16,17. Morfologia mammosfer może być pouczająca w rozwiązywaniu tej niejasności. Tylko zwarte, okrągłe kule powinny być wyliczone na końcu każdego przejścia. Należy wziąć pod uwagę zarówno okrągłość sferoid, jak i rozmiar. Korzystając ze zautomatyzowanego procesu DIA, etap ten jest zapewniony za pomocą odpowiednich progów w sposób obiektywny i bezwzględny. Często przodkowie tworzą struktury groniaste lub mniejsze skupiska komórek, które powinny być wykluczone z liczby mammosfery. Z reguły stosujemy próg o średnicy 100 μm. Na koniec należy zachować ostrożność, aby uniknąć przenoszenia nienaruszonych lub nie w pełni zdysocjowanych mamopferów z jednego kanału do drugiego. Z drugiej strony, nadmierne pipetowanie prowadzi do zwiększonej śmierci komórek. Tak więc, jeśli napotkasz takie trudności, zalecamy zastosowanie łagodnej trypsynizacji lub leczenia Accutase i przepuszczenie zdysocjowanych kulek przez sitko 40 μm, aby zapewnić wytworzenie zawiesin jednokomórkowych.

Efektywność formowania kul (SFE) była stosowana alternatywnie, jako substytut kwantyfikacji SC lub CSC ex vivo w kulturach mammosfery. SFE jest rzeczywiście miarą komórek macierzystych podobnych do komórek w danej populacji komórek. Reprezentuje jednak mniej sumienne podejście, ponieważ dostarcza informacji tylko w różnych punktach czasowych. Obliczanie skumulowanych liczb kul i generowanie skumulowanych krzywych wzrostu umożliwia natomiast wnioskowanie o tempie wzrostu kultury od początkowego etapu wysiewu komórek do wyczerpania kultury lub, w przypadku kultur unieśmiertelnionych, dla pożądanej liczby pasaży. Ocena właściwości wzrostu pozwala na ocenę odchylenia od wykładniczego wzrostu za pomocą współczynnika R² oraz, w drugim etapie, ocenę samej wartości GR.

Co ważne, skumulowane krzywe wzrostu mammosfery mogą być wykorzystane do selektywnej oceny wpływu inhibitorów małocząsteczkowych lub innych leków chemioterapeutycznych na poziomie CSC ^6,11. W przeciwieństwie do normalnych mammosfer pierwotnych, które funkcjonalnie wyczerpują się w 5-7 przejściach, mammosfery nowotworowe mają tendencję do rozszerzania się w nieskończoność. Ta funkcja jest powiązana z nieograniczoną możliwością samoodnawiania CSC. Wpływ na proliferację i samoodnawianie CSC można rozłączyć poprzez generowanie odpowiednio krzywych wzrostu komórek nowotworowych i mammosfery. Oczekuje się, że efekt specyficzny dla CSC spowoduje zmniejszenie skumulowanego tempa wzrostu mammosfery, z lub bez wpływu na skumulowane tempo wzrostu komórek ^6,11.

Wreszcie, kolejnym obszarem zainteresowań jest przeprogramowanie SC tkanek dorosłych. W pełni rozwinięte mamosfery składają się z fenotypowo heterogenicznej populacji komórek, w której tylko niewielka część zachowuje cechy podobne do łodygi, w tym zdolność inicjowania mammosfery i regenerację gruczołu sutkowego po przeszczepie in vivo 6,9,11,18,19. Progenitorzy sutka mogą być zatem izolowani albo za pomocą testów in vitro^{zachowujących} znaczniki ^6,9,11, albo, ex vivo, przy użyciu ustalonych markerów powierzchniowych ^2,3. Warto zauważyć, że przodkowie sutka nie przeżywają anoikis i nie są w stanie tworzyć mammosfer. Wykazano, że wymuszona ekspresja Myc nadaje potencjał inicjacji mammosfery przodkom sutka izolowanym jako PKHneg¹¹, co skutkuje generowaniem kultury, która może być pasażowana w nieskończoność. Podobnie, interferencja negatywnych regulatorów fizjologicznego przeprogramowania może być testowana przy użyciu tego samego testu. W tym kontekście częstym problemem, który może się pojawić, jest ograniczona liczba komórek wejściowych. Jeśli wejście komórek jest mniejsze niż 10 000 komórek, zalecamy wysiew na płytkach 24-dołkowych (maksymalnie 5 000 żywych komórek/ml). Niemniej jednak może się okazać, że warunki hodowli niezależne od zakotwiczenia są zbyt surowe dla przeprogramowania punktacji, zwłaszcza w przypadkach, gdy efekt przeprogramowania nie jest natychmiastowy. W takich przypadkach bardziej odpowiednie może być zastosowanie matrycy nośnej i trójwymiarowych kultur organoidowych²⁰.

Ogólnie rzecz biorąc, test mammosfery jest opłacalną opcją, którą można łatwo zastosować do oceny właściwości podobnych do łodygi w normalnych i nowotworowych populacjach MEC. Podejście ilościowe przyjęte w tym protokole ułatwia porównania między kulturami prowadzonymi w różnych warunkach lub narażonymi na różne bodźce. Przy rygorystycznym przestrzeganiu, zapewnia stosunkowo prosty system modeli ex vivo, który pozwala na rozprzęganie wielu czynników, które definiują właściwości łodygi in vivo, oferując możliwość bardziej szczegółowych badań mechanistycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do lizy ACK	Lonza	10-548E	Bufer do lizy chlorku amonu i potasu, 100 mL.
B27	Invitrogen	17504-044	B27 suplement 50X (10 mL). Stężenie końcowe 2% v/v.
bFGF	Peprotech	100-18B	Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów - zasadowy, 50 μg. Roztwór podstawowy 100 μ g/μ L w Tris 5 mM pH 7,6. Rozcieńczenie końcowe 0,02% v/v.
Kolagenaza	Sigma	C2674	Kolagenaza z Clostridium histolyticum. Typ I-A, proszek liofilizowany, 1 g. Zapas 20 000 U/ml w DMEM. Rozcieńczenie końcowe 1% v/v.
DMEM	Lonza	12-614F	Zmodyfikowane podłoże Eagle's Eagle's
	Microgem	firmy Dulbecco S17859L0615	buforowana fosforanem sól fizjologiczna
EGF	Tebu-Bio	AF-100-15	Rekombinowany ludzki nabłonkowy czynnik wzrostu. Roztwór podstawowy 100 μ g/ml w sterylnym dH2O. Końcowe rozcieńczenie 0,02% v/v.
Glutamina	Lonza	17-605E	L-glutamina, 200 mM. Rozcieńczenie końcowe 1% v/v.
Heparin	PharmaTex	34692032	Stężenie magazynowe 5 000 j.m./ml. Rozcieńczenie końcowe 0,008% v/v.
Hialuronidaza	Sigma	H4272	Typ IV-S, proszek, 750-3,000 U/mg w postaci stałej, 30 mg. Roztwór podstawowy 10 mg/ml w sterylnym dH2O. Końcowe rozcieńczenie 1% v/v.
Hydrokortyzon	Sigma	H0888	Stężenie zapasowe 100 μ g/ml. Rozcieńczenie końcowe 0,5% v/v.
Insulina	SAFCBiosciences	91077C	Insulina rekombinowana ludzka, suchy proszek, 250 mg. Stężenie podstawowe 1 mg/mL. Rozcieńczenie końcowe 0,5% v/v.
Płytki 6-dołkowe o niskim nasadce	Corning	351146	Sterylne 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych bez obróbki z przezroczystym płaskim dnem i pokrywką.
MEBM	Lonza	CC-3151	Wzrost komórek nabłonka sutka podłoże podstawowe
Mieszanina Penicllin-Streptomycyna	Lonza	17-602F	Zawiera 10 000 U penicyliny potasowej i 10 000 &mikro; g siarczan streptomycyny na ml w 0,85% soli fizjologicznej. Rozcieńczenie końcowe 1% v/v.
Poly-HEMA	Sigma	P3932	Rozpuścić w 95% EtOH przez noc w temperaturze 55 & st. C. Stężenie podstawowe 12% w/v. Końcowe rozcieńczenie 1% v/v w 95% EtOH. Filtr (0,22 μ m) przed użyciem.