Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Streszczenie

Aby scharakteryzować każdy etap spermatogenezy, badacze muszą oddzielić różne subpopulacje komórek rozrodczych od jąder. Jednak wyizolowanie dyskretnych populacji jest trudne, ponieważ dorosłe jądro zawiera złożoną mieszankę komórek rozrodczych ze wszystkich etapów spermatogenezy wraz z pewnymi populacjami komórek somatycznych. W ciągu ostatnich kilku dekad różne techniki, takie jak elutriacja odśrodkowa, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i STA-PUT zostały z powodzeniem zastosowane do izolacji komórek rozrodczych. Wadą jest to, że wszystkie wymagają dedykowanych urządzeń i specjalistycznego szkolenia. Kierując się zasadami leżącymi u podstaw metody STA-PUT, opracowano prosty protokół izolacji spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużających się spermatyd z jąder myszy. Po przygotowaniu zawiesiny pojedynczej komórki jąder, określone populacje komórek są wzbogacane przez sedymentację grawitacyjną poprzez nieciągły gradient gęstości albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Frakcje komórkowe są następnie ręcznie pobierane i analizowane pod mikroskopem. Ten zmodyfikowany gradient gęstości dla okrągłych spermatydów (MDR) protokół sedymentacji może być szeroko stosowany, ponieważ wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego. Co więcej, protokół wymaga minimalnej ilości materiałów wyjściowych, co zmniejsza jego koszt i wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych.

Wprowadzenie

Wiele jest nadal niewiadomych na temat molekularnych i biologicznych wydarzeń zachodzących podczas spermatogenezy ssaków, złożonego procesu, w którym spermatogonialne komórki macierzyste przekształcają się w wysoce wyspecjalizowane plemniki1^,2. Spermatogeneza zachodzi wewnątrz kanalików nasiennych jądra. Kanaliki zawierają mieszaninę komórek rozrodczych z każdego etapu różnicowania, w tym spermatogonialne komórki macierzyste, mitotycznie dzielące się spermatogonie, spermatocyty mejotyczne i plemniki postmejotyczne (które ulegają haploidalnemu różnicowaniu od plemników okrągłych do wydłużających się plemników, a na końcu do dojrzałych plemników). Komórki somatyczne jądra obejmują komórki Sertoliego, które są zmieszane z komórkami rozrodczymi wewnątrz kanalików nasiennych, okołokanalikowe komórki mięśniowe, które tworzą ściany kanalików, oraz komórki Leydiga wytwarzające testosteron w przestrzeni śródmiąższowej między kanalikami.

Badanie procesów molekularnych i biochemicznych podczas spermatogenezy często wymaga oddzielenia odrębnych populacji komórek rozrodczych od złożonej mieszaniny komórek jąder. Opracowano wiele różnych strategii wzbogacania komórek. Najbardziej udanymi metodami są: sedymentacja prędkości STA-PUT za pomocą jednostki grawitacji^3,4,5,6, elutriacja odśrodkowa oparta na wirowaniu przeciwprądowym^7,8, oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), które oddziela komórki według zawartości DNA i/lub określonych markerów. Metody te są powszechnie stosowane wśród badaczy spermatogenezy i pozwalają na skuteczne wzbogacanie określonych typów komórek rozrodczych. Jednak ograniczeniem tych technik jest to, że wymagają one specjalistycznego, drogiego sprzętu, który wymaga specjalistycznej wiedzy.

Prezentowany tutaj jest prosty i tani protokół do izolowania wzbogaconych populacji trzech najliczniejszych populacji komórek jąder myszy: okrągłych spermatydów, spermatocytów pachytenowych i emerydy. Protokół ten jest określany jako zmodyfikowany gradient gęstości dla okrągłych spermatyd (MDR), ponieważ działa szczególnie dobrze w przypadku wzbogacania okrągłych spermatyd. Metoda MDR opiera się na tych samych zasadach, co sedymentacja szybkościowa STA-PUT, ale wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego. Żywe komórki mogą się osadzać przez ręcznie przygotowany nieciągły gradient gęstości albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w standardowej probówce o pojemności 50 ml pod polem grawitacyjnym Ziemi. Większe komórki poruszają się szybciej w gradiencie, który oddziela różne populacje komórek rozrodczych. Po sedymentacji wzbogacone frakcje trzech typów komórek są zbierane ręcznie. Czystość tych wzbogaconych populacji komórek jest porównywalna z czystością uzyskaną przez STA-PUT i elutriację odśrodkową.

Oprócz omówienia budowy i wykorzystania gradientu BSA do sedymentacji prędkości, protokół opisuje również metodę trawienia w celu uwolnienia komórek jąder z kanalików nasiennych. Protokół został zmodyfikowany w stosunku do tego opracowanego przez Romrell et al.⁹ i obejmuje sekwencyjne trawienie z kolagenazą IV i trypsyną. Wykazano, że sekwencyjne trawienie w połączeniu z użyciem buforu wodorowęglanowego (tj. roztworu Krebsa) znacznie zwiększa separację i żywotność komórek rozrodczych⁹.

Podczas wzbogacania MDR, komórki spędzają razem około 4 godzin poza środowiskiem kanalików nasiennych i nie są poddawane naprężającym siłom mechanicznym, co pozwala na zbieranie wysoce żywotnych frakcji komórkowych do dalszej analizy. Ponadto, podobnie jak w przypadku elutriacji odśrodkowej i STA-PUT, protokół MDR nie wymaga żadnej obróbki chemicznej ani znakowania komórek, co również pomaga utrzymać ich żywotność. Co ważne, do izolacji MDR wystarczą zaledwie dwa dorosłe jądra myszy, a zatem jedna dorosła mysz dostarcza wystarczającą ilość wzbogaconych komórek zarówno do analizy RNA, jak i białka. Standardowy protokół STA-PUT zaleca użycie do izolacji komórek aż 12 dorosłych myszy⁶; Chociaż na podstawie wcześniejszych doświadczeń wiadomo, że udaną izolację można przeprowadzić od trzech do czterech dorosłych myszy. Najniższa ilość materiału wyjściowego, która została uznana za wystarczającą do elutriacji odśrodkowej, to sześć jąder myszy (trzy myszy)⁸. W związku z tym, oprócz wyeliminowania konieczności posiadania drogiego specjalistycznego sprzętu, protokół MDR zmniejsza liczbę wymaganych zwierząt laboratoryjnych.

Protokół

Utrzymanie myszy laboratoryjnych i wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Konfiguracja sprzętu i odczynników

1. Ustawić łaźnię wodną na 37 °C.
2. Ustawić inkubator do hodowli komórkowych na 34 °C, 5% CO₂, 95% wilgotności. Umieść rotator rurkowy w inkubatorze.
   nuta: Inkubatory wymagają długiego czasu na zmianę temperatury wewnętrznej. Jeżeli inkubator stale ustawiony na temperaturę 34 °C nie jest dostępny, należy go ustawić na 1 dzień przed doświadczeniem.
3. Przygotuj i oznacz odpowiednią ilość szkiełek mikroskopowych. Narysuj pierścień o średnicy ~1 cm za pomocą pisaka do smaru i pozwól smarowi wyschnąć.
4. Przygotuj 1x bufor Krebsa, pH 7,8 (Tabela 1). Umieść dwie stożkowe probówki z 50 ml 1x Krebs w temperaturze 34 °C, aby wstępnie się rozgrzały dla kroków 2,5−2,8. Resztę 1x Krebs przechowuj w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
5. Przygotuj rozwiązania BSA. Najpierw przygotuj 25 ml 10% (w/v) roztworu BSA w Krebs, rozpuszczając 2,5 g BSA w 1x buforze Krebsa do końcowej objętości 25 ml. Rozcieńczyć 10% roztwór BSA 1x buforem Krebsa, aby uzyskać różne stężenia BSA (Tabela 2). Wszystkie roztwory BSA należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
   nuta: Przygotować roztwory tego samego dnia, w którym wykonano zabieg, i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
6. Przygotuj enzymy wytrawiające poprzez zważenie odpowiedniej ilości trypsyny i kolagenazy do stożkowych probówek o pojemności 50 ml (Tabela 3).

2. Sekcja zwierząt i przygotowanie zawiesiny komórek rozrodczych

UWAGA: To zajmuje około 1 godziny.

1. Uśmierc dorosłego samca myszy (w wieku 7 tygodni lub starszego, jądro o wadze 80-120 mg w zależności od szczepu i wieku) poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenie_CO2
.
2. Spryskaj brzuszny brzuch myszy 70% etanolem. Otwórz jamę brzuszno-miedniczną za pomocą nożyczek, tworząc otwór w kształcie litery V.
3. Ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową najądrza kleszczami, zlokalizuj jądra i usuń je nożyczkami. Unikaj przeszkadzania tunica albuginea. Umieść jądra na 6 cm szalce Petriego zawierającej 1x Krebsa.
4. Zdecapsuluj jądra i wyrzuć osłonkę białawą. Lekko rozproszyj kanaliki nasienne, delikatnie oddzielając je kleszczami.
5. Za pomocą kleszczy przenieś kanaliki nasienne do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 2 ml świeżo przygotowanego roztworu kolagenazy (Tabela 3).
6. Inkubować kanaliki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Delikatnie mieszać, kołysząc rurką.
   nuta: Swobodnie unoszące się kanaliki powinny pojawić się w ciągu 3 minut ze względu na usunięcie komórek śródmiąższowych. Temperatura fizjologiczna komórek jąder wynosi 34 °C; Dlatego w tej temperaturze zwykle odbywa się długie trawienie. Jednak krótkie, 3-minutowe trawienie można przeprowadzić w temperaturze 37 °C (zalecana przez producenta). Należy pamiętać, że w przypadku stosowania temperatury 34 °C czas trawienia powinien zostać ponownie zoptymalizowany.
7. Dodaj co najmniej 40 ml ciepłego 1x Krebs i pozwól kanalikom osiąść (~1 min) w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć supernatant i powtórzyć 1x.
8. Dodać 25 ml świeżo przygotowanego roztworu trypsyny (Tabela 3), umieścić probówkę na rotatorze probówek wewnątrz inkubatora o temperaturze 34 °C i inkubować przez 15-20 minut (~15 obr./min). Sporadycznie sprawdzaj stan kanalików. Gdy roztwór stanie się mętny i pozostaną tylko małe kawałki kanalików, umieść probówkę na lodzie i natychmiast przejdź do następnego kroku.
   nuta: Aby uniknąć nadmiernego trawienia i lizy komórek, szybko przejdź do następujących etapów mycia. Niektóre protokoły obejmują dezaktywację trypsyny przez płodową surowicę bydlęcą (FBS). W tym protokole pominięto leczenie FBS, a zamiast tego trypsyna jest usuwana przez natychmiastowe odwirowanie, a następnie przemycie zimnym 1x Krebsem.
9. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 40 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml na lodzie.
10. Wirować 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
    nuta: Wirowanie ze zbyt dużą siłą może uszkodzić komórki.
11. Usunąć supernatant, ostrożnie go wylewając.
12. Dotknij granulki ogniwa, aby ponownie zawiesić komórki w pozostałej części 1x Krebs.
13. Dodaj co najmniej 40 ml zimnego 1x Krebsa do zawieszonych komórek.
14. Powtórz kroki 2.10 i 2.11.
15. Postukaj w probówkę z osadem komórkowym, aby ponownie zawiesić ogniwa. Dodaj 1 ml 0,5% BSA do 1x Krebs i za pomocą odciętej końcówki pipety ponownie zawieś komórki, pipetując roztwór w górę iw dół. Unikaj robienia bąbelków.
16. Na koniec dodaj 1−3 ml 0,5% BSA w 1x Krebs, tak aby końcowa objętość wynosiła ~ 3 ml. Przefiltrować zawiesinę komórek rozrodczych przez sitko do komórek o wielkości 40 μm i natychmiast przystąpić do ładowania komórek na gradient BSA.

3. Separacja komórek rozrodczych poprzez nieciągły gradient BSA

UWAGA: Ukończenie tej sekcji zajmuje około 2 godzin. Rozpocznij przygotowanie nieciągłego gradientu BSA podczas etapów mycia (kroki 2.10−2.14), aby załadować ogniwa, gdy tylko obróbka wstępna będzie gotowa.

1. Umieść probówkę o pojemności 50 ml pionowo na lodzie, tak aby można było zobaczyć jedną stronę probówki. Alternatywnie, uruchom protokół w chłodni w temperaturze 4 °C, w którym to przypadku lód nie jest potrzebny.
2. Odetnij końcówkę pipety serologicznej o pojemności 10 ml około 5−10 mm od końcówki, aby uzyskać większy otwór (Rysunek 1A) i zamontuj ją na kontrolerze pipety (Rysunek 1C).
   nuta: Zmniejszy to prędkość podczas pipetowania, co ułatwi układanie różnych roztworów BSA w stosy. Alternatywnie, użyj pipety mechanicznej o pojemności 1 ml z gładkim tłokiem i odetnij końcówki pipet z otworem o średnicy około 3 mm (Rysunek 1B).
3. Zacznij od odpipetowania 5 ml 5% roztworu BSA na dno probówki o pojemności 50 ml.
4. Powoli odpipetować 5 ml 4% roztworu BSA na 5% roztwór. Zacznij od delikatnego dotknięcia powierzchni 5% roztworu odciętą końcówką pipety i nakładaj warstwy na oba roztwory, ostrożnie utrzymując kontakt z powierzchnią, uważając, aby nie dopuścić do zanurzenia końcówki pipety.
   nuta: Na końcu tego kroku powinna być widoczna wyraźna linia między dwiema warstwami.
5. Powtórz krok 3.4 z innymi roztworami BSA, aby uzyskać nieciągły gradient od 5% do 1% (Rysunek 1D).
6. Ostrożnie załaduj jednokomórkową zawiesinę na górę gradientu, nie przeszkadzając. Pozostawić komórki do osadzania się w nachyleniu przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C lub na lodzie.

4. Zbiór wzbogaconych frakcji komórek rozrodczych

UWAGA: Ukończenie tej sekcji zajmuje około 30 minut.

1. Zamontuj końcówkę do pipety o pojemności 1 ml na pipecie mechanicznej o pojemności 1 ml i przytnij końcówkę tak, aby otwór miał średnicę ~3 mm (Rysunek 1B).
2. Ostrożnie zbierz frakcje ~1 ml w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml, zaczynając od góry gradientu BSA, i przechowuj je na lodzie. Ponumeruj probówki w tej samej kolejności, w jakiej zostaną zebrane frakcje.
   nuta: W tym momencie powinna pojawić się seria ~28 probówek zawierających zawiesiny komórek. Użyj pipety mechanicznej o pojemności 1 ml z gładkim tłokiem i odetnij końcówki pipet, aby zminimalizować ryzyko zakłócenia gradientu BSA.
3. Odwirować frakcje komórek rozrodczych w temperaturze 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Uważając, aby nie naruszyć osadu, wyrzuć większość supernatantu i ponownie zawieś osad komórkowy, przesuwając rurkę. Dodaj 1 ml lodowatego buforu 1x Krebs do każdej probówki i powtórz wirowanie.
   nuta: Powtórz etap mycia, jeśli BSA zakłóca dalszą analizę.
5. Wyrzuć większość supernatantu, ale pozostaw ~100 μl po ostatnim praniu. Ostrożnie zawiesić osad komórkowy.
   nuta: Staranne ponowne zawieszenie komórek zapewnia, że próbka pobrana z tego roztworu reprezentuje wszystkie komórki danej frakcji. Utrzymuj zawiesiny komórek na lodzie podczas przygotowywania szkiełek.

5. Analiza frakcji komórek

UWAGA: Analiza trwa 2 godziny.

1. Pojedynczo odmierzaj pipetę 20 μl 4% paraformaldehydu (PFA) do każdego pierścienia smarowego na numerowanym szkiełku mikroskopowym.
2. Natychmiast dodać 2 μl zawiesiny zawieszonych komórek z odpowiedniej frakcji. Powtórz dla każdej frakcji.
   nuta: Przygotowując szkiełka, utrzymuj wszystkie zawiesiny komórkowe na lodzie.
3. Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę do nocy (O/N).
   nuta: Na tym etapie, po pobraniu próbki z każdej frakcji, komórki mogą być przetwarzane w celu dalszych analiz lub przechowywania (sekcja 6).
4. Przepłukać szkiełka raz za pomocą 1x PBS i zamontować za pomocą podłoża montażowego z 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI) (tabela materiałów).
5. Przeanalizuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby oszacować, który konkretny typ komórek rozrodczych jest wzbogacony w każdą frakcję.
   nuta: Różne typy komórek można rozpoznać po ich charakterystycznej morfologii jądrowej uwidocznionej przez barwienie DAPI. Rysunek 2A pokazuje reprezentatywne frakcje wzbogacone o wydłużone spermatydy, okrągłe spermatydy i pachytenowe spermatocyty. Okrągłe jądro spermatydu jest małe (6−7 μm średnicy) i okrągłe (Ryc. 2A). Okrągłe jądra plemników myszy charakteryzują się również pojedynczą, okrągłą strukturą heterochromatyny zwaną chromocentrum. Jądra wydłużających się spermatyd mają typowy wydłużony kształt i zmniejszony rozmiar jądra z powodu kondensacji chromatyny (Rysunek 2A). Jądra spermatocytów pachytenu są znacznie większe (średnica ponad 10 μm) i mają bardziej nieregularny kształt, z obszarami gęsto upakowanej chromatyny rozmieszczonymi w całym (Rysunek 2A).
6. W razie potrzeby oprócz barwienia DAPI należy wykonać barwienie immunologiczne, aby ułatwić rozpoznawanie różnych typów komórek.
   1. W takim przypadku rozprowadź 2 μl zawiesiny komórkowej z 20 μl roztworu utrwalającego (4% PFA i 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS) wewnątrz smarowego pierścienia pisaka. Po wysuszeniu szkiełek należy utrwalić komórki 4% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Płukać PBS, a następnie przepuszczać 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS przez 5 min. Płukać PBS i dezaktywować pozostały PFA poprzez inkubację szkiełek w 100 mM NH₄Cl przez 5 min.
   3. Przepłukać PBS i przejść do standardowego protokołu immunofluorescencji składającego się z blokowania i inkubacji ze specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi i przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluorochromem. Zamontuj prowadnice za pomocą uchwytu zapobiegającego blaknięciu z DAPI (Tabela Materiałów) i pozwól im ustawić się na 24 godziny
      nuta: Przykłady użytecznych markerów do inkubacji przeciwciał pierwotnych obejmują aglutyninę orzeszków ziemnych (PNA; 1:2,000 w roztworze blokującym), która barwi akrosom w okrągłych i wydłużonych spermatydach, przeciwciało anty-DDX4 (1:200 w roztworze blokującym), które znakuje pojedynczą ziarnistość cytoplazmatyczną w okrągłych spermatydach oraz przeciwciało anty-γH2AX (1:100 w roztworze blokującym), które rozpoznaje ciała płciowe w spermatocytach pachytenowych. Zobacz reprezentatywne wyniki i Rysunek 2C,D dla przykładów analizy immunofluorescencyjnej frakcji.

6. Przetwarzanie pozostałych próbek do przechowywania

UWAGA: Ukończenie sekcji 6 zajmuje około 20 minut.

1. Po pobraniu próbki z każdej frakcji na szkiełko mikroskopowe, dodaj 1 ml lodowatego 1x Krebsa do każdej frakcji i odwiruj komórki w temperaturze 600−13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   nuta: Wirowanie z niską prędkością powoduje powstanie luźnego osadu, co utrudnia całkowite usunięcie 1x Krebsa, podczas gdy wirowanie z dużą prędkością może uszkodzić komórki. Wybierz prędkość wirowania zgodnie z określonymi wymaganiami protokołu końcowego.
2. Usunąć i wyrzucić supernatant i kontynuować preferowaną analizę dalszą.
   nuta: W tym momencie komórki można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -70 °C. Po zapoznaniu się z tą techniką możliwe jest bezpośrednie kontynuowanie preferowanego protokołu dalszego obrotu, ale zawsze zaleca się pobranie próbki i zapewnienie czystości każdej frakcji. Całkowite RNA można ekstrahować, oznaczać ilościowo i analizować za pomocą takich metod, jak reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (PCR) i sekwencjonowanie RNA. Można również przygotować całkowite ekstrakty białkowe, z których można przeprowadzić analizę immunoprecypitacji lub western blot (Rysunek 3).

Wyniki

Wystarczające wzbogacenie typu komórki rozrodczej jest zwykle uważane za powyżej 80%⁶. Protokół MDR sprawdza się szczególnie dobrze w przypadku wzbogacania okrągłych spermatyd. Za pomocą tej techniki można rutynowo uzyskać dużą liczbę >90% czystych okrągłych spermatyd. Optymalne frakcje spermatocytów pachytenowych i wydłużających się spermatyd są wzbogacone odpowiednio do ~75% i ~80%. Wydłużające się plemniki mają tendencję do pozostawania na szczycie gradientu i są zbierane wraz z pierwszą frakcją. W pokazanym przykładzie frakcja 1 zawierała ~80% wydłużających się spermatydów (Rysunek 2B). Większość wydłużających się plemników uzyskanych tą techniką ma skondensowane jądra, podczas gdy nieskondensowane wczesne wydłużające się plemniki są rzadkie (Rysunek 2A). Kolejne frakcje zawierają wzbogacone okrągłe spermatydy. W tym przykładzie wzbogacenie okrągłych spermatyd wynosiło ponad 90% we frakcjach 2, 3 i 4, a wzbogacenie powyżej 80% zaobserwowano łącznie w siedmiu frakcjach (2−8) (Rysunek 2B). Ze względu na duże rozmiary spermatocyty pachytenowe szybciej się osadzają i są zbierane jako ostatnie. W przykładzie z oczyszczaniem wzbogacenie wynosiło około 75% we frakcjach 14 i 15 (Rysunek 2B).

Podczas gdy morfologia jądrowa, wizualizowana przez barwienie DAPI, zwykle wystarcza do rozpoznania komórek, analiza immunofluorescencyjna może być przeprowadzona w celu wsparcia analizy. PNA barwi rozwijające się akrosomy okrągłych i wydłużonych spermatydów, a wygląd akrosomalny może być wykorzystany do dalszej kategoryzacji okrągłych spermatyd na etapy 1−8 różnicowania¹⁰. Rozróżnianie zabarwionych PNA, wydłużonych i okrągłych spermatyd opiera się na różnicach w ich kształcie jądrowym (Rysunek 2C, lewy panel). Przeciwciało anty-DDX4 jest użytecznym markerem dla okrągłych frakcji spermatydów, ponieważ wizualizuje jedną pojedynczą ziarnistość okołojądrową DDX4-dodatnią, ciało chromatoidalne (CB), w cytoplazmie każdego okrągłego spermatydu. To specyficzne dla CB barwienie jest łatwe do odróżnienia od szerzej rozpowszechnionego barwienia cytoplazmatycznego w spermatocytach (Rysunek 2C, środkowy panel). Spermatocyty pachytenowe można rozpoznać po przeciwciałie anty-γH2AX, które znakuje jądrowe ciało płciowe specyficznie pojawiające się w fazie pachytenu pierwszego podziału mejotycznego (Rysunek 2C, prawy panel). W tym oczyszczeniu barwienie PNA ujawniło, że wzbogacone MDR okrągłe frakcje spermatydów zawierały mieszaninę okrągłych spermatyd na różnych etapach różnicowania, z których wszystkie zawierały swoją charakterystyczną strukturę, DDX4-dodatnią CB (Rysunek 2D, frakcja RS). Anty-γH2AX dodatkowo zweryfikował wzbogacające spermatocyty pachytenowe we frakcji 16 (Rysunek 2D, frakcja PSpc).

Liczenie komórek wykazało, że liczba komórek w okrągłych frakcjach spermatydów i pachytenów spermatydów jest wystarczająca do różnych dalszych analiz. Okrągłe frakcje spermatydów (5−8) zawierały około 2,5 x 10⁶ komórek. Dlatego łącząc te frakcje, można uzyskać ponad 10 milionów komórek. Frakcje spermatocytów pachytenu (14 i 15) zawierały zwykle nieco mniej komórek. W tej izolacji policzono około 1,5−2,0 x 10⁶ komórek na frakcję. Pierwsza frakcja zawierała 0,75 x 10⁶ wydłużających się spermatydów.

Jak pokazano w Rysunek 3A, całkowita ilość RNA uzyskana z większości frakcji wahała się od 0,5 do 2,5 μg, co jest wystarczające do dalszych analiz RNA, takich jak PCR z odwrotną transkrypcją, sekwencjonowanie RNA lub wizualizacja RNA na żelu. Ilość białka uzyskanego z każdej frakcji zwykle waha się od 20−140 μg (Rysunek 3B), co jest wystarczające dla kilku zachodnich plam. Z pobranych frakcji przygotowano lizaty całych komórek, a analizę western blot przeprowadzono przy użyciu przeciwciał wykrywających DDX4, PIWIL1 i PIWIL2, które ulegają silnej ekspresji w spermatocytach pachytenowych i okrągłych spermatydach, a także we wszechobecnej dehydrogenazie 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego (GAPDH).

W tym protokole, 10% lizatów białkowych pochodzących z pojedynczych frakcji było wystarczające do wyraźnego wykrycia wszystkich tych białek na standardowym ustawieniu western blot (Rysunek 3C). Wykazano również, że ilość białka w jednej frakcji jest wystarczająca do immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciała przeciwko PIWIL1, a także do wykrywania koimmunoprecypitowanego PIWIL2 (Figura 3D). Co więcej, protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do uzyskania wzbogaconych frakcji spermatocytów pachytenowych i okrągłych spermatyd od myszy kontrolnych i genetycznie modyfikowanych do dalszych zastosowań, takich jak ilościowe sekwencjonowanie odwrotnej transkrypcji PCR¹¹ i sekwencjonowanie RNA o wysokiej przepustowości¹².

Rysunek 1: Przygotowanie nieciągłego gradientu BSA. (A) Końcówka do pipety serologicznej o pojemności 5 ml do przygotowania gradientu. (B) Końcówka do pipety o pojemności 1 ml do przygotowania gradientu i zebrania frakcji komórek rozrodczych po sedymentacji. C) Sprzęt potrzebny do przygotowania spadku. (D) Widok z boku nieciągłego gradientu gęstości BSA od 5% (na dole) do 1% (na górze) roztworu BSA; roztwory 2% i 4% BSA są koloru niebieskiego dla lepszej wizualizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy zebranych frakcji komórkowych i analiza wzbogacenia. (A) Komórki jąder barwione DAPI. Górny rząd pokazuje komórki jąder w nienaruszonym nabłonku nasiennym utrwalonego przez PFA, zatopionego w parafinie przekroju jądra (po lewej) lub w zawiesinie (po prawej). Dolny rząd pokazuje frakcje wzbogaconych wydłużających się spermatydów (ES), okrągłych spermatydów (RS) lub spermatocytów pachytenowych (PSpc). Podziałka = 20 μm dla górnego rzędu i 10 μm dla wstawek dolnego rzędu. (B) Względna kwantyfikacja różnych typów komórek rozrodczych w każdej frakcji. Komórki zostały ręcznie zliczone za pomocą oprogramowania ImageJ i sklasyfikowane jako RS, ES, PSpc, komórki Sertoliego i inne komórki. Liczby ułamkowe i odpowiednie procenty BSA w gradiencie są wskazane na osi x. (C) Analiza immunofluorescencyjna komórek jąder. Lewy panel: PNA znakowany rodaminą barwi akrosom zarówno w ES (żółta strzałka), jak i RS (biała strzałka). Panel środkowy: Przeciwciało DDX4 barwi pojedynczą granulkę okołojądrową w RS, którą łatwo odróżnić od bardziej rozproszonego sygnału cytoplazmatycznego w spermatocytach (niebieska strzałka). W ES nie wykryto sygnału DDX4 (pomarańczowa strzałka). Prawy panel: Przeciwciało γH2AX rozpoznaje charakterystyczne jądrowe ciało płciowe obecne tylko w spermatocytach pachytenowych (komórki γH2AX-ujemne oznaczone białą gwiazdką). Podziałki skali = 10 μm. (D) Frakcje komórek wzbogacone w MDR oznaczono PNA (frakcja RS), anty-DDX4 (frakcja RS) i anty-γH2AX (frakcja PSpc) w celu dalszej walidacji wzbogacenia komórek w każdej frakcji. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Dalsze analizy po wzbogaceniu komórek MDR. (A) RNA wyekstrahowano z każdej frakcji po reprezentatywnym wzbogaceniu komórek MDR i określono ilościowo. Liczby ułamkowe i odpowiednie procenty BSA w gradiencie są wskazane na osi x. (B) Białka wyekstrahowano z każdej frakcji poprzez lizę osadu komórkowego w buforze testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA), a następnie określono ilościowo. (C) Ekstrakty białek z całych komórek przygotowano i przeanalizowano metodą western blot przy użyciu przeciwciał przeciwko DDX4, PIWIL1, PIWIL2 i GAPDH. 10% lizatu zostało załadowane z każdej wskazanej frakcji. (D) Immunoprecypitację przeprowadzono ze wskazanych frakcji przy użyciu przeciwciał anty-PIWIL1, a następnie western blot przeciwciałami anty-PIWIL1 i anty-PIWIL2. Próbka wejściowa zawiera mieszaninę lizatów białkowych z różnych frakcji, a kontrolne immunoprecypitacja (IP) z użyciem króliczej IgG również przeprowadzono z mieszanego lizatu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Schematyczne przedstawienie protokołu MDR i czasu wymaganego do wykonania każdego kroku. Materiał wyjściowy składa się z dwóch jąder od dorosłej myszy. Wskazana jest średnia liczba komórek oraz ilość RNA i białka uzyskanego z jednej frakcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

bufor	Odczynniki	preparat	składowanie
Bufor Krebsa (10x)	3,26 g KH2PO4	Doprowadzić do 2 L za pomocą H2O, przefiltrować 0,22 μm i przelać w autoklawie.	Może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy
	139,5 g NaCl
	5,89 gMgSO4•7H2O
	50 g dekstrozy
	3.78 g CaCl2•2H2O
	7,12 g KCl
Bufor Krebsa (1x)	4,24 g NaHCO3	Rozpuść NaHCO od3 do 100 mlH2O, dodaj 200 ml buforu 10x Krebs i doprowadź do 2 l za pomocą H2O.	Do przygotowania na świeżo
	200 ml 10x bufor Krebsa

Tabela 1: Przygotowanie bufora Krebsa.

. . . .

Stężenie BSA (w/v)	10% roztwór BSA	1x bufor Krebs
0,50%	0,5 ml	9,5 ml
1 proc	1 ml	9 ml
2 proc	2 ml	8 ml
3 proc	3 ml	7 ml
4 proc	4 ml	6 ml
5 proc.	5 ml	5 ml

Tabela 2: Przygotowanie rozwiązań BSA.

Roztwór do wytrawiania	Koncentracja robocza	Odczynniki	preparat
Kolagenaza	1 mg/ml	Kolagenaza IV	Odważyć 2 mg kolagenazy dożylnej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 2 ml ciepłego buforu Krebsa bezpośrednio przed trawieniem (krok 2.3).
trypsyna	0,6 mg/ml	trypsyna	Zważ 15 mg trypsyny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 25 ml ciepłego buforu 1x KREBS i 40 μL DNazy I tuż przed mineralizacją (krok 2.6).
	>3,2 ku/ml	DNaza I

Tabela 3: Przygotowanie enzymów trawiennych.

Dyskusja

Przedstawiono tutaj prosty i niedrogi protokół izolowania wzbogaconych populacji okrągłych spermatydów, spermatocytów pachytenowych i wydłużających się spermatydów przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego (przegląd protokołu pokazanego na rycinie 4). Chociaż nie jest wymagana żadna specjalistyczna wiedza ani drogie maszyny, istnieją pewne krytyczne kroki, które należy wziąć pod uwagę podczas trawienia tkanek, budowy gradientu i ładowania zawiesiny komórek na gradient.

Komórki rozrodcze są uwalniane z kanalików nasiennych w wyniku dwóch kolejnych trawień enzymatycznych. Pierwsze trawienie kolagenazą IV oddziela kanaliki nasienne poprzez usunięcie komórek śródmiąższowych. Wydłużony czas trawienia może uszkodzić kanaliki i doprowadzić do utraty spermatydów, ponieważ (jeśli zostaną uwolnione z kanalików na tym etapie) zostaną one odrzucone w kolejnych krokach. Drugi etap trawienia trypsyną uwalnia komórki rozrodcze z kanalików nasiennych. Sporadycznie może dochodzić do lizy komórek i zazwyczaj niektóre grudki tworzą się z powodu uwolnionego genomowego DNA. Nie zaleca się przekraczania sugerowanego czasu trwania lub temperatury trawienia, ponieważ może to prowadzić do gorszej żywotności, zwiększonej lizy komórek i zlepiania się. Jeśli wystąpi łagodne zbrylanie, grudki można zignorować. Jednak w przypadku znacznego zbrylania się i utraty komórek należy skrócić czas trawienia trypsyny lub jej stężenie. Należy również zauważyć, że aktywność enzymatyczna trypsyny może się różnić w zależności od partii i podczas długotrwałego przechowywania. Ilość DNazy I podczas trawienia trypsyny można również zwiększyć, aby usunąć nadmiar grudek, ale należy to uznać za rozwiązanie wtórne. Ważne jest, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową pod koniec obróbki wstępnej, ponieważ zbite komórki będą szybciej osadzać się, zanieczyszczając frakcje i zaburzając gradient.

Budowanie gradientu może wymagać pewnej wprawy. W przypadku dyskomfortu podczas używania końcówki do pipety o pojemności 5 ml z kontrolerem do pipet, zaleca się użycie zwykłej pipety mechanicznej o pojemności 1 ml z gładkim tłokiem, a następnie przycięcie końcówek pipet do otworu o średnicy ~3 mm (rysunek 1B). Szerszy otwór i płynne ładowanie roztworów BSA zmniejszy ryzyko pomieszania gradientu. Przy odpowiednim przygotowaniu możliwe jest dostrzeżenie granic między sąsiadującymi roztworami BSA ze względu na ich różne współczynniki załamania światła. Gradient powinien być wykonany bezpośrednio przed użyciem. Należy również zauważyć, że wszelkie niewielkie wstrząsy lub wibracje mogą zakłócić gradient, dlatego gradient należy ustawić w środowisku, w którym nie zostanie zakłócony.

Ładowanie zawiesiny ogniw na gradient musi być wykonane bardzo ostrożnie. Po załadowaniu zawiesina komórek powinna pozostać na szczycie gradientu, z którego komórki powoli zaczną osadzać się przez pierwszą warstwę. Jeśli zaobserwuje się duże grupy komórek poruszające się szybko w gradiencie, prawdopodobnie komórki nie zostały ostrożnie zawieszone lub występuje nadmierne zlepianie. Jeśli komórki nie pozostają na szczycie nieciągłego gradientu BSA po załadowaniu, ale natychmiast opadają między warstwami 1% i 2% BSA (krok 3.6), zawiesina komórek jest prawdopodobnie zbyt gęsta. Protokół ten został zoptymalizowany przy użyciu dwóch jąder dorosłej myszy (80-120 mg / jądro) jako materiału wyjściowego; Chociaż przeprowadzono udane izolacje przy użyciu zmniejszonych ilości materiału wyjściowego. Aby zwiększyć skalę protokołu i uzyskać bardziej wzbogacone komórki rozrodcze z większej liczby jąder, należy wprowadzić więcej probówek o pojemności 50 ml z gradientem.

Protokół został początkowo opracowany i zoptymalizowany w celu wzbogacenia haploidalnych okrągłych spermatyd z jąder dorosłych myszy, a czystość okrągłych frakcji spermatyd ma wynosić ponad 90%. Oprócz wysoce czystych okrągłych frakcji spermatyd uzyskano zadowalające wyniki w zakresie wzbogacania spermatocytów pachytenowych i wydłużających się spermatydów. Należy zauważyć, że erytrocyty mogą zanieczyszczać wydłużające się frakcje spermatydów i należy podjąć dalsze kroki w celu ich wyeliminowania, jeśli oczekuje się, że ich obecność będzie zakłócać dalsze analizy. Nie byliśmy w stanie wzbogacić innych typów komórek, takich jak komórki premejotyczne lub wczesne komórki mejotyczne (przed fazą pachytenu) od dorosłych myszy za pomocą protokołu MDR.

Dodatkowo sedymentacja STA-PUT jest z powodzeniem stosowana do uzyskiwania wzbogaconych frakcji spermatogonii lub spermatocytów preleptotenu, leptotenu i zygotenu przy użyciu młodzieńczych jąder pobranych w określonych punktach czasowych po urodzeniu¹³. Podejście to wykorzystuje pojawienie się tych typów komórek podczas pierwszej fali spermatogenezy. To samo podejście można prawdopodobnie zastosować do wzbogacania MDR, ale nie zostało ono jeszcze przetestowane w praktyce. Inną metodą, która jest dobrą opcją do oczyszczania komórek premejotycznych i mejotycznych na określonych etapach różnicowania, jest FACS, która ma tę ważną zaletę, że umożliwia izolację określonych typów komórek w oparciu o markery specyficzne dla obecności 14,15,16,17.

Ogólnie rzecz biorąc, sedymentacja prędkości MDR służy jako użyteczna metoda wzbogacania komórek rozrodczych. Chociaż metoda ta nie jest lepsza od innych dobrze znanych metod pod względem czystości lub ilości wzbogaconych komórek, jej niewątpliwymi zaletami są prostota i niskie koszty konfiguracji. To, wraz z niewielką ilością wymaganych materiałów wyjściowych, sprawia, że protokół ten jest doskonałą opcją dla badaczy w dziedzinie spermatogenezy i tych z innych dziedzin, którzy mogą nie chcieć inwestować w specjalistyczny sprzęt lub duże grupy zwierząt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4% Paraformaldehyd	Preferencja badacza
AlexaFluor488 osioł anty-królik IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
AlexaFluor647 osioł anty-mysie IgG	Thermo Fisher Scientific	A-31571
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A9647
CaCl2· 2H2O	Preferencja badacza
Kolagenaza IV	Sigma	C5138
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11836145001
Przeciwciało DDX4	Abcam	ab13840
Dekstroza	Preferencja badacza
DNaza I	Worthington	LS006355
GAPDH	HyTest	5G4
IgG przeciw-mysie IgG sprzężone z HRP	GE Healthcare Life Sciences	NA931
Anty-królicze IgG sprzężone z HRP	GE Healthcare Life Sciences	NA934
KCl	Preferencja badacza
KH2PO4	Preferencja badacza
MgSO4· 7H2O	Preferencja badacza
NaCl	Preferencja badacza
NaHCO3	Preferencja badacza
NH4Cl	Preferencja badacza
Pierce Zestaw do oznaczania białek BCA	Life Technologies	23227
PIWIL1	Cell Signaling Technology	G82
PIWIL2, klon 13E-3	Millipore	MABE363
Prolong Diamond Antidafe Mountant z DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36962	do barwienia immunologicznego Alexa Fluor
Neomarkery	IgG królika	NC-100-P
Aglutynina z orzeszków ziemnych (PNA) znakowana rodaminąVector	Laboratories	RL-1072
Bufor			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1% NP-40, 0,5% w/v deoksycholan sodu, 0,05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x koktajl inhibitorów proteazy, 0,2 mM PMSF i 1 mM DTT
TRIsure	Bioline	BIO-38033
Triton X-100	Preferencja badacza		niejonowy środek powierzchniowo czynny
Trypsin	Worthington	LS003703
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium z DAPI	Vector Laboratories	H-1200	do standardowej analizy DAPI frakcji komórkowych
i gamma; Przeciwciało H2AX	Millipore	05-636
0,22 i mikro; m filtr	Sartorius	Sartolab BT 180C6	lub odpowiednik
1 ml pipeta mechaniczna	Preferencja badacza
Probówki 1,5 ml lub 2 ml	Preferencja badacza
40 &mikro; m sita komórkowe do probówek 50 ml	Greiner Bio-One	542040	lub równoważny sitko do komórek
Pipety serologiczne 5 ml	Sarstedt	86.1254.001	lub równoważne
50 ml probówki stożkowe	Preferencja badacza
Szalki Petriego 6 cm	Preferencja badacza
Inkubator kultur komórkowych	Preferencja badacza
Wirówka do probówek 50 ml	Preferencje badacza
Smarownik do szkiełek mikroskopowych	Preferencje badacza
HulaMixer Mieszalnik próbek	Thermo Fisher Scientific	15920D	lub równoważny rotator komórkowy
Mikrodysekcja forcepty	Preferencja badacza
Nożyczki do mikrodysekcji	Preferencja badacza Szkiełka
podstawowe i nakrywkowe do mikroskopii	Preferencje badacza
Nanodrop 1000	Thermo Scientific
Pipetboy Acu 2	Integra	155 000	lub równoważny kontroler pipet
Wirówka z chłodzeniem do probówek 1,5 ml	Preferencje badacza
Końcówki do pipety mechanicznej 1 ml	Preferencje badacza Kąpiel
wodna	Preferencje badacza
Mikroskop fluorescencyjny szerokokątny	Preferencje badacza