Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.
Artykuł metodologiczny
Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby scharakteryzować każdy etap spermatogenezy, badacze muszą oddzielić różne subpopulacje komórek rozrodczych od jąder. Jednak wyizolowanie dyskretnych populacji jest trudne, ponieważ dorosłe jądro zawiera złożoną mieszankę komórek rozrodczych ze wszystkich etapów spermatogenezy wraz z pewnymi populacjami komórek somatycznych. W ciągu ostatnich kilku dekad różne techniki, takie jak elutriacja odśrodkowa, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i STA-PUT zostały z powodzeniem zastosowane do izolacji komórek rozrodczych. Wadą jest to, że wszystkie wymagają dedykowanych urządzeń i specjalistycznego szkolenia. Kierując się zasadami leżącymi u podstaw metody STA-PUT, opracowano prosty protokół izolacji spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużających się spermatyd z jąder myszy. Po przygotowaniu zawiesiny pojedynczej komórki jąder, określone populacje komórek są wzbogacane przez sedymentację grawitacyjną poprzez nieciągły gradient gęstości albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Frakcje komórkowe są następnie ręcznie pobierane i analizowane pod mikroskopem. Ten zmodyfikowany gradient gęstości dla okrągłych spermatydów (MDR) protokół sedymentacji może być szeroko stosowany, ponieważ wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego. Co więcej, protokół wymaga minimalnej ilości materiałów wyjściowych, co zmniejsza jego koszt i wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych.
Wprowadzenie
Wiele jest nadal niewiadomych na temat molekularnych i biologicznych wydarzeń zachodzących podczas spermatogenezy ssaków, złożonego procesu, w którym spermatogonialne komórki macierzyste przekształcają się w wysoce wyspecjalizowane plemniki1,2. Spermatogeneza zachodzi wewnątrz kanalików nasiennych jądra. Kanaliki zawierają mieszaninę komórek rozrodczych z każdego etapu różnicowania, w tym spermatogonialne komórki macierzyste, mitotycznie dzielące się spermatogonie, spermatocyty mejotyczne i plemniki postmejotyczne (które ulegają haploidalnemu różnicowaniu od plemników okrągłych do wydłużających się plemników, a na końcu do dojrzałych plemników). Komórki somatyczne jądra obejmują komórki Sertoliego, które są zmieszane z komórkami rozrodczymi wewnątrz kanalików nasiennych, okołokanalikowe komórki mięśniowe, które tworzą ściany kanalików, oraz komórki Leydiga wytwarzające testosteron w przestrzeni śródmiąższowej między kanalikami.
Badanie procesów molekularnych i biochemicznych podczas spermatogenezy często wymaga oddzielenia odrębnych populacji komórek rozrodczych od złożonej mieszaniny komórek jąder. Opracowano wiele różnych strategii wzbogacania komórek. Najbardziej udanymi metodami są: sedymentacja prędkości STA-PUT za pomocą jednostki grawitacji3,4,5,6, elutriacja odśrodkowa oparta na wirowaniu przeciwprądowym7,8, oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), które oddziela komórki według zawartości DNA i/lub określonych markerów. Metody te są powszechnie stosowane wśród badaczy spermatogenezy i pozwalają na skuteczne wzbogacanie określonych typów komórek rozrodczych. Jednak ograniczeniem tych technik jest to, że wymagają one specjalistycznego, drogiego sprzętu, który wymaga specjalistycznej wiedzy.
Prezentowany tutaj jest prosty i tani protokół do izolowania wzbogaconych populacji trzech najliczniejszych populacji komórek jąder myszy: okrągłych spermatydów, spermatocytów pachytenowych i emerydy. Protokół ten jest określany jako zmodyfikowany gradient gęstości dla okrągłych spermatyd (MDR), ponieważ działa szczególnie dobrze w przypadku wzbogacania okrągłych spermatyd. Metoda MDR opiera się na tych samych zasadach, co sedymentacja szybkościowa STA-PUT, ale wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego. Żywe komórki mogą się osadzać przez ręcznie przygotowany nieciągły gradient gęstości albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w standardowej probówce o pojemności 50 ml pod polem grawitacyjnym Ziemi. Większe komórki poruszają się szybciej w gradiencie, który oddziela różne populacje komórek rozrodczych. Po sedymentacji wzbogacone frakcje trzech typów komórek są zbierane ręcznie. Czystość tych wzbogaconych populacji komórek jest porównywalna z czystością uzyskaną przez STA-PUT i elutriację odśrodkową.
Oprócz omówienia budowy i wykorzystania gradientu BSA do sedymentacji prędkości, protokół opisuje również metodę trawienia w celu uwolnienia komórek jąder z kanalików nasiennych. Protokół został zmodyfikowany w stosunku do tego opracowanego przez Romrell et al.9 i obejmuje sekwencyjne trawienie z kolagenazą IV i trypsyną. Wykazano, że sekwencyjne trawienie w połączeniu z użyciem buforu wodorowęglanowego (tj. roztworu Krebsa) znacznie zwiększa separację i żywotność komórek rozrodczych9.
Podczas wzbogacania MDR, komórki spędzają razem około 4 godzin poza środowiskiem kanalików nasiennych i nie są poddawane naprężającym siłom mechanicznym, co pozwala na zbieranie wysoce żywotnych frakcji komórkowych do dalszej analizy. Ponadto, podobnie jak w przypadku elutriacji odśrodkowej i STA-PUT, protokół MDR nie wymaga żadnej obróbki chemicznej ani znakowania komórek, co również pomaga utrzymać ich żywotność. Co ważne, do izolacji MDR wystarczą zaledwie dwa dorosłe jądra myszy, a zatem jedna dorosła mysz dostarcza wystarczającą ilość wzbogaconych komórek zarówno do analizy RNA, jak i białka. Standardowy protokół STA-PUT zaleca użycie do izolacji komórek aż 12 dorosłych myszy6; Chociaż na podstawie wcześniejszych doświadczeń wiadomo, że udaną izolację można przeprowadzić od trzech do czterech dorosłych myszy. Najniższa ilość materiału wyjściowego, która została uznana za wystarczającą do elutriacji odśrodkowej, to sześć jąder myszy (trzy myszy)8. W związku z tym, oprócz wyeliminowania konieczności posiadania drogiego specjalistycznego sprzętu, protokół MDR zmniejsza liczbę wymaganych zwierząt laboratoryjnych.
Protokół
Utrzymanie myszy laboratoryjnych i wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Konfiguracja sprzętu i odczynników
- Ustawić łaźnię wodną na 37 °C.
- Ustawić inkubator do hodowli komórkowych na 34 °C, 5% CO2, 95% wilgotności. Umieść rotator rurkowy w inkubatorze.
nuta: Inkubatory wymagają długiego czasu na zmianę temperatury wewnętrznej. Jeżeli inkubator stale ustawiony na temperaturę 34 °C nie jest dostępny, należy go ustawić na 1 dzień przed doświadczeniem. - Przygotuj i oznacz odpowiednią ilość szkiełek mikroskopowych. Narysuj pierścień o średnicy ~1 cm za pomocą pisaka do smaru i pozwól smarowi wyschnąć.
- Przygotuj 1x bufor Krebsa, pH 7,8 (Tabela 1). Umieść dwie stożkowe probówki z 50 ml 1x Krebs w temperaturze 34 °C, aby wstępnie się rozgrzały dla kroków 2,5−2,8. Resztę 1x Krebs przechowuj w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
- Przygotuj rozwiązania BSA. Najpierw przygotuj 25 ml 10% (w/v) roztworu BSA w Krebs, rozpuszczając 2,5 g BSA w 1x buforze Krebsa do końcowej objętości 25 ml. Rozcieńczyć 10% roztwór BSA 1x buforem Krebsa, aby uzyskać różne stężenia BSA (Tabela 2). Wszystkie roztwory BSA należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
nuta: Przygotować roztwory tego samego dnia, w którym wykonano zabieg, i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. - Przygotuj enzymy wytrawiające poprzez zważenie odpowiedniej ilości trypsyny i kolagenazy do stożkowych probówek o pojemności 50 ml (Tabela 3).
2. Sekcja zwierząt i przygotowanie zawiesiny komórek rozrodczych
UWAGA: To zajmuje około 1 godziny.
- Uśmierc dorosłego samca myszy (w wieku 7 tygodni lub starszego, jądro o wadze 80-120 mg w zależności od szczepu i wieku) poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenieCO2 .
- Spryskaj brzuszny brzuch myszy 70% etanolem. Otwórz jamę brzuszno-miedniczną za pomocą nożyczek, tworząc otwór w kształcie litery V.
- Ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową najądrza kleszczami, zlokalizuj jądra i usuń je nożyczkami. Unikaj przeszkadzania tunica albuginea. Umieść jądra na 6 cm szalce Petriego zawierającej 1x Krebsa.
- Zdecapsuluj jądra i wyrzuć osłonkę białawą. Lekko rozproszyj kanaliki nasienne, delikatnie oddzielając je kleszczami.
- Za pomocą kleszczy przenieś kanaliki nasienne do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 2 ml świeżo przygotowanego roztworu kolagenazy (Tabela 3).
- Inkubować kanaliki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Delikatnie mieszać, kołysząc rurką.
nuta: Swobodnie unoszące się kanaliki powinny pojawić się w ciągu 3 minut ze względu na usunięcie komórek śródmiąższowych. Temperatura fizjologiczna komórek jąder wynosi 34 °C; Dlatego w tej temperaturze zwykle odbywa się długie trawienie. Jednak krótkie, 3-minutowe trawienie można przeprowadzić w temperaturze 37 °C (zalecana przez producenta). Należy pamiętać, że w przypadku stosowania temperatury 34 °C czas trawienia powinien zostać ponownie zoptymalizowany. - Dodaj co najmniej 40 ml ciepłego 1x Krebs i pozwól kanalikom osiąść (~1 min) w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć supernatant i powtórzyć 1x.
- Dodać 25 ml świeżo przygotowanego roztworu trypsyny (Tabela 3), umieścić probówkę na rotatorze probówek wewnątrz inkubatora o temperaturze 34 °C i inkubować przez 15-20 minut (~15 obr./min). Sporadycznie sprawdzaj stan kanalików. Gdy roztwór stanie się mętny i pozostaną tylko małe kawałki kanalików, umieść probówkę na lodzie i natychmiast przejdź do następnego kroku.
nuta: Aby uniknąć nadmiernego trawienia i lizy komórek, szybko przejdź do następujących etapów mycia. Niektóre protokoły obejmują dezaktywację trypsyny przez płodową surowicę bydlęcą (FBS). W tym protokole pominięto leczenie FBS, a zamiast tego trypsyna jest usuwana przez natychmiastowe odwirowanie, a następnie przemycie zimnym 1x Krebsem. - Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 40 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml na lodzie.
- Wirować 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
nuta: Wirowanie ze zbyt dużą siłą może uszkodzić komórki. - Usunąć supernatant, ostrożnie go wylewając.
- Dotknij granulki ogniwa, aby ponownie zawiesić komórki w pozostałej części 1x Krebs.
- Dodaj co najmniej 40 ml zimnego 1x Krebsa do zawieszonych komórek.
- Powtórz kroki 2.10 i 2.11.
- Postukaj w probówkę z osadem komórkowym, aby ponownie zawiesić ogniwa. Dodaj 1 ml 0,5% BSA do 1x Krebs i za pomocą odciętej końcówki pipety ponownie zawieś komórki, pipetując roztwór w górę iw dół. Unikaj robienia bąbelków.
- Na koniec dodaj 1−3 ml 0,5% BSA w 1x Krebs, tak aby końcowa objętość wynosiła ~ 3 ml. Przefiltrować zawiesinę komórek rozrodczych przez sitko do komórek o wielkości 40 μm i natychmiast przystąpić do ładowania komórek na gradient BSA.
3. Separacja komórek rozrodczych poprzez nieciągły gradient BSA
UWAGA: Ukończenie tej sekcji zajmuje około 2 godzin. Rozpocznij przygotowanie nieciągłego gradientu BSA podczas etapów mycia (kroki 2.10−2.14), aby załadować ogniwa, gdy tylko obróbka wstępna będzie gotowa.
- Umieść probówkę o pojemności 50 ml pionowo na lodzie, tak aby można było zobaczyć jedną stronę probówki. Alternatywnie, uruchom protokół w chłodni w temperaturze 4 °C, w którym to przypadku lód nie jest potrzebny.
- Odetnij końcówkę pipety serologicznej o pojemności 10 ml około 5−10 mm od końcówki, aby uzyskać większy otwór (Rysunek 1A) i zamontuj ją na kontrolerze pipety (Rysunek 1C).
nuta: Zmniejszy to prędkość podczas pipetowania, co ułatwi układanie różnych roztworów BSA w stosy. Alternatywnie, użyj pipety mechanicznej o pojemności 1 ml z gładkim tłokiem i odetnij końcówki pipet z otworem o średnicy około 3 mm (Rysunek 1B). - Zacznij od odpipetowania 5 ml 5% roztworu BSA na dno probówki o pojemności 50 ml.
- Powoli odpipetować 5 ml 4% roztworu BSA na 5% roztwór. Zacznij od delikatnego dotknięcia powierzchni 5% roztworu odciętą końcówką pipety i nakładaj warstwy na oba roztwory, ostrożnie utrzymując kontakt z powierzchnią, uważając, aby nie dopuścić do zanurzenia końcówki pipety.
nuta: Na końcu tego kroku powinna być widoczna wyraźna linia między dwiema warstwami. - Powtórz krok 3.4 z innymi roztworami BSA, aby uzyskać nieciągły gradient od 5% do 1% (Rysunek 1D).
- Ostrożnie załaduj jednokomórkową zawiesinę na górę gradientu, nie przeszkadzając. Pozostawić komórki do osadzania się w nachyleniu przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
4. Zbiór wzbogaconych frakcji komórek rozrodczych
UWAGA: Ukończenie tej sekcji zajmuje około 30 minut.
- Zamontuj końcówkę do pipety o pojemności 1 ml na pipecie mechanicznej o pojemności 1 ml i przytnij końcówkę tak, aby otwór miał średnicę ~3 mm (Rysunek 1B).
- Ostrożnie zbierz frakcje ~1 ml w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml, zaczynając od góry gradientu BSA, i przechowuj je na lodzie. Ponumeruj probówki w tej samej kolejności, w jakiej zostaną zebrane frakcje.
nuta: W tym momencie powinna pojawić się seria ~28 probówek zawierających zawiesiny komórek. Użyj pipety mechanicznej o pojemności 1 ml z gładkim tłokiem i odetnij końcówki pipet, aby zminimalizować ryzyko zakłócenia gradientu BSA. - Odwirować frakcje komórek rozrodczych w temperaturze 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Uważając, aby nie naruszyć osadu, wyrzuć większość supernatantu i ponownie zawieś osad komórkowy, przesuwając rurkę. Dodaj 1 ml lodowatego buforu 1x Krebs do każdej probówki i powtórz wirowanie.
nuta: Powtórz etap mycia, jeśli BSA zakłóca dalszą analizę. - Wyrzuć większość supernatantu, ale pozostaw ~100 μl po ostatnim praniu. Ostrożnie zawiesić osad komórkowy.
nuta: Staranne ponowne zawieszenie komórek zapewnia, że próbka pobrana z tego roztworu reprezentuje wszystkie komórki danej frakcji. Utrzymuj zawiesiny komórek na lodzie podczas przygotowywania szkiełek.
5. Analiza frakcji komórek
UWAGA: Analiza trwa 2 godziny.
- Pojedynczo odmierzaj pipetę 20 μl 4% paraformaldehydu (PFA) do każdego pierścienia smarowego na numerowanym szkiełku mikroskopowym.
- Natychmiast dodać 2 μl zawiesiny zawieszonych komórek z odpowiedniej frakcji. Powtórz dla każdej frakcji.
nuta: Przygotowując szkiełka, utrzymuj wszystkie zawiesiny komórkowe na lodzie. - Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę do nocy (O/N).
nuta: Na tym etapie, po pobraniu próbki z każdej frakcji, komórki mogą być przetwarzane w celu dalszych analiz lub przechowywania (sekcja 6). - Przepłukać szkiełka raz za pomocą 1x PBS i zamontować za pomocą podłoża montażowego z 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI) (tabela materiałów).
- Przeanalizuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby oszacować, który konkretny typ komórek rozrodczych jest wzbogacony w każdą frakcję.
nuta: Różne typy komórek można rozpoznać po ich charakterystycznej morfologii jądrowej uwidocznionej przez barwienie DAPI. Rysunek 2A pokazuje reprezentatywne frakcje wzbogacone o wydłużone spermatydy, okrągłe spermatydy i pachytenowe spermatocyty. Okrągłe jądro spermatydu jest małe (6−7 μm średnicy) i okrągłe (Ryc. 2A). Okrągłe jądra plemników myszy charakteryzują się również pojedynczą, okrągłą strukturą heterochromatyny zwaną chromocentrum. Jądra wydłużających się spermatyd mają typowy wydłużony kształt i zmniejszony rozmiar jądra z powodu kondensacji chromatyny (Rysunek 2A). Jądra spermatocytów pachytenu są znacznie większe (średnica ponad 10 μm) i mają bardziej nieregularny kształt, z obszarami gęsto upakowanej chromatyny rozmieszczonymi w całym (Rysunek 2A). - W razie potrzeby oprócz barwienia DAPI należy wykonać barwienie immunologiczne, aby ułatwić rozpoznawanie różnych typów komórek.
- W takim przypadku rozprowadź 2 μl zawiesiny komórkowej z 20 μl roztworu utrwalającego (4% PFA i 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS) wewnątrz smarowego pierścienia pisaka. Po wysuszeniu szkiełek należy utrwalić komórki 4% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Płukać PBS, a następnie przepuszczać 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS przez 5 min. Płukać PBS i dezaktywować pozostały PFA poprzez inkubację szkiełek w 100 mM NH4Cl przez 5 min.
- Przepłukać PBS i przejść do standardowego protokołu immunofluorescencji składającego się z blokowania i inkubacji ze specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi i przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluorochromem. Zamontuj prowadnice za pomocą uchwytu zapobiegającego blaknięciu z DAPI (Tabela Materiałów) i pozwól im ustawić się na 24 godziny
nuta: Przykłady użytecznych markerów do inkubacji przeciwciał pierwotnych obejmują aglutyninę orzeszków ziemnych (PNA; 1:2,000 w roztworze blokującym), która barwi akrosom w okrągłych i wydłużonych spermatydach, przeciwciało anty-DDX4 (1:200 w roztworze blokującym), które znakuje pojedynczą ziarnistość cytoplazmatyczną w okrągłych spermatydach oraz przeciwciało anty-γH2AX (1:100 w roztworze blokującym), które rozpoznaje ciała płciowe w spermatocytach pachytenowych. Zobacz reprezentatywne wyniki i Rysunek 2C,D dla przykładów analizy immunofluorescencyjnej frakcji.
6. Przetwarzanie pozostałych próbek do przechowywania
UWAGA: Ukończenie sekcji 6 zajmuje około 20 minut.
- Po pobraniu próbki z każdej frakcji na szkiełko mikroskopowe, dodaj 1 ml lodowatego 1x Krebsa do każdej frakcji i odwiruj komórki w temperaturze 600−13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
nuta: Wirowanie z niską prędkością powoduje powstanie luźnego osadu, co utrudnia całkowite usunięcie 1x Krebsa, podczas gdy wirowanie z dużą prędkością może uszkodzić komórki. Wybierz prędkość wirowania zgodnie z określonymi wymaganiami protokołu końcowego. - Usunąć i wyrzucić supernatant i kontynuować preferowaną analizę dalszą.
nuta: W tym momencie komórki można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -70 °C. Po zapoznaniu się z tą techniką możliwe jest bezpośrednie kontynuowanie preferowanego protokołu dalszego obrotu, ale zawsze zaleca się pobranie próbki i zapewnienie czystości każdej frakcji. Całkowite RNA można ekstrahować, oznaczać ilościowo i analizować za pomocą takich metod, jak reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (PCR) i sekwencjonowanie RNA. Można również przygotować całkowite ekstrakty białkowe, z których można przeprowadzić analizę immunoprecypitacji lub western blot (Rysunek 3).
Wyniki
Za wystarczające wzbogacenie konkretnego typu komórek zarodkowych uznaje się zazwyczaj poziom powyżej 80%6. Protokół MDR sprawdza się szczególnie dobrze w wzbogacaniu okrągłych spermatyd. Dzięki tej technice rutynowo można uzyskać wysoką liczbę okrągłych spermatyd o czystości >90%. Optymalne frakcje spermatocytów pachytenowych i wydłużających się spermatyd są wzbogacane odpowiednio do ~75% i ~80%. Wydłużające się spermatydy mają tendencję do pozostawania na górze gradientu i są zbierane z pierwszą frakcją. W przedstawionym przykładzie frakcja 1 zawierała ~80% wydłużających się spermatyd (Ryc. 2B). Większość wydłużających się spermatyd uzyskanych tą techniką posiada kondensowane jądra, podczas gdy wczesne, niewykondensowane spermatydy wydłużające się występują rzadko (Ryc. 2A). Kolejne frakcje zawierają wzbogacone okrągłe spermatydy. W tym przykładzie wzbogacenie okrągłych spermatyd przekroczyło 90% w frakcjach 2, 3 i 4, a wzbogacenie powyżej 80% zaobserwowano łącznie w siedmiu frakcjach (2–8) (Ryc. 2B). Ze względu na swój duży rozmiar, spermatocyty pachytenowe sedymentują szybciej i są zbierane na końcu. W przykładzie oczyszczania wzbogacenie wyniosło około 75% w frakcjach 14 i 15 (Ryc. 2B).
Choć morfologia jądra, wizualizowana za pomocą barwienia DAPI, zazwyczaj wystarcza do rozpoznania komórek, w celu wsparcia analizy można przeprowadzić analizę immunofluorescencyjną. PNA barwi rozwijające się akrosomy spermatyd okrągłych i wydłużających się, a wygląd akrosomu może zostać wykorzystany do dalszej kategoryzacji spermatyd okrągłych na etapy 1–8 różnicowania10. Rozróżnienie PNA-barwionych spermatyd wydłużających się i okrągłych opiera się na różnicach w kształcie ich jąder (Rysunek 2C, lewy panel). Przeciwciało anty-DDX4 jest użytecznym markerem dla frakcji spermatyd okrągłych, ponieważ wizualizuje ono pojedynczą, dodatnią dla DDX4 granulę perinuklearną – ciałko chromatoidalne (CB) – w cytoplazmie każdej spermatydy okrągłej. To specyficzne barwienie CB jest łatwe do odróżnienia od bardziej rozproszonego barwienia cytoplazmatycznego w spermatocytach (Rysunek 2C, środkowy panel). Spermatocyty w stadium pachytennym można rozpoznać za pomocą przeciwciała anty-γH2AX, które znakuje jądrowe ciałko płciowe pojawiające się specyficznie w fazie pachyteny pierwszego podziału mejozy (Rysunek 2C, prawy panel). W niniejszej puryfikacji barwienie PNA wykazało, że frakcje spermatyd okrągłych wzbogacone przez MDR zawierały mieszaninę spermatyd okrągłych na różnych etapach różnicowania, z których wszystkie posiadały swoją charakterystyczną strukturę – dodatnie dla DDX4 CB (Rysunek 2D, frakcja RS). Barwienie anty-γH2AX dodatkowo potwierdziło wzbogacenie spermatocytów pachytennych we frakcji 16 (Rysunek 2D, frakcja PSpc).
Liczenie komórek wykazało, że liczba komórek w frakcjach okrągłych spermatyd i spermatocytów w stadium pachytenu jest wystarczająca do przeprowadzenia różnych dalszych analiz. Każda z frakcji okrągłych spermatyd (5−8) zawierała około 2,5 x 106 komórek. Zatem poprzez połączenie tych frakcji możliwe jest uzyskanie ponad 10 milionów komórek. Frakcje spermatocytów w stadium pachytenu (14 i 15) zazwyczaj zawierały nieco mniej komórek. W tej izolacji w każdej frakcji policzono około 1,5−2,0 x 106 komórek. Pierwsza frakcja zawierała 0,75 x 106 spermatyd w fazie elongacji.
Jak pokazano na Rysunku 3A, całkowita ilość RNA uzyskana z większości frakcji mieściła się w przedziale 0,5−2,5 µg, co jest wystarczające do dalszych analiz RNA, takich jak PCR z odwrotną transkrypcją, sekwencjonowanie RNA lub wizualizacja RNA na żelu. Ilość białka uzyskana z każdej frakcji zazwyczaj mieści się w przedziale 20−140 µg (Rysunek 3B), co wystarcza do przeprowadzenia kilku analiz western blot. Z zebranych frakcji przygotowano lizaty całych komórek, a analizę western blot przeprowadzono z użyciem przeciwciał wykrywających DDX4, PIWIL1 i PIWIL2, które są silnie ekspresjonowane w spermatocytach w stadium pachiteny i okrągłych spermatydach, a także powszechnie ekspresjonowaną dehydrogenazę gliceraldo-3-fosforanową (GAPDH).
W niniejszym protokole 10% lizatów białkowych pochodzących z pojedynczych frakcji było wystarczające do wyraźnego wykrycia wszystkich tych białek w standardowych warunkach western blot (Rycina 3C). Wykazano również, że ilość białka w jednej frakcji była wystarczająca do przeprowadzenia immunoprecypitacji z użyciem przeciwciała przeciwko PIWIL1, a także do wykrycia współimmunoprecypitowanego PIWIL2 (Rycina 3D). Ponadto protokół ten został z powodzeniem zastosowany do uzyskania wzbogaconych frakcji spermatocytów pachytenowych i okrągłych spermatyd z myszy kontrolnych oraz genetycznie zmodyfikowanych do dalszych zastosowań, takich jak ilościowa reakcja polimerazy w łańcuchu z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR)11 oraz wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA12.
Rycina 1: Przygotowanie nieciągłego gradientu BSA. (A) Końcówka pipety serologicznej 5 mL do przygotowania gradientu. (B) Końcówka pipety 1 mL do przygotowania gradientu i pobierania frakcji komórek zarodkowych po sedymentacji. (C) Sprzęt niezbędny do przygotowania gradientu. (D) Widok boczny nieciągłego gradientu gęstości BSA od roztworu BSA 5% (dół) do 1% (góra); roztwory BSA 2% i 4% mają niebieski kolor w celu lepszej wizualizacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy zebranych frakcji komórkowych i analiza wzbogacenia. (A) Komórki jądra barwione DAPI. Górny rząd przedstawia komórki jądra w nienaruszonym nabłonku kanalików nasiennych w przekroju jądra utrwalonego w PFA i zatopionego w parafinie (lewo) lub w zawiesinie (prawo). Dolny rząd przedstawia frakcje wzbogacone w elongujące spermatydy (ES), okrągłe spermatydy (RS) lub spermatocyty pachytenowe (PSpc). Paski skali = 20 µm dla górnego rzędu i 10 µm dla powiększeń w dolnym rzędzie. (B) Względna kwantyfikacja różnych typów komórek płciowych w każdej frakcji. Komórki policzono ręcznie przy użyciu oprogramowania ImageJ i sklasyfikowano jako RS, ES, PSpc, komórki Sertolego oraz inne komórki. Numery frakcji i odpowiadające im wartości procentowe BSA w gradiencie są zaznaczone na osi x. (C) Analiza immunofluorescencyjna komórek jądra. Panel lewy: PNA znakowane rhodaminą barwi akrosom zarówno w ES (żółta strzałka), jak i w RS (biała strzałka). Panel środkowy: przeciwciało DDX4 barwi pojedynczy granulek okojądrowy w RS, który jest łatwy do odróżnienia od bardziej rozproszonego sygnału cytoplazmatycznego w spermatocytach (niebieska strzałka). W ES nie wykryto sygnału DDX4 (pomarańczowa strzałka). Panel prawy: przeciwciało γH2AX rozpoznaje charakterystyczne jądrowe ciałko płci występujące tylko w spermatocytach pachytenowych (komórki γH2AX-ujemne zaznaczono białym asteryskiem). Paski skali = 10 µm. (D) Frakcje komórkowe wzbogacone metodą MDR zostały znakowane PNA (frakcja RS), przeciwciałem anty-DDX4 (frakcja RS) i przeciwciałem anty-γH2AX (frakcja PSpc) w celu dalszej walidacji wzbogacenia komórek w każdej frakcji. Paski skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Analizy następcze po wzbogaceniu komórek MDR. (A) RNA wyekstrahowano z każdej frakcji po reprezentatywnym wzbogaceniu komórek MDR, a następnie poddano kwantyfikacji. Numery frakcji oraz odpowiadające im procentowe stężenia BSA w gradiencie zaznaczono na osi x. (B) Białka wyekstrahowano z każdej frakcji poprzez lizę osadu komórkowego w buforze do testu immunoprecypitacji radiologicznej (RIPA), a następnie poddano kwantyfikacji. (C) Przygotowano ekstrakty białek całkowitych z komórek i przeanalizowano je metodą western blottingu przy użyciu przeciwciał przeciwko DDX4, PIWIL1, PIWIL2 i GAPDH. Z każdej wskazanej frakcji naniesiono 10% lizatu. (D) Przeprowadzono immunoprecypitację ze wskazanych frakcji przy użyciu przeciwciał anty-PIWIL1, a następnie wykonano western blotting z przeciwciałami anty-PIWIL1 i anty-PIWIL2. Próbka wejściowa (input) zawiera mieszaninę lizatów białkowych z różnych frakcji; kontrolną immunoprecypitację (IP) z użyciem króliczego IgG przeprowadzono również z mieszanego lizatu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Schematyczny przedstawienie protokołu MDR oraz czasu wymaganego do ukończenia każdego etapu. Materiał wyjściowy składa się z dwóch jąder z dorosłej myszy. Podano średnią liczbę komórek oraz ilość RNA i białka otrzymanych z jednej frakcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Bufor | Odczynniki | Przygotowanie | Przechowywanie |
| bufor Krebsa (10x) | 3,26 g KH2PO4 | Dopełnić do 2 L wodą destylowaną2O, filtr 0.22 µm oraz autoklaw. | Można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy |
| 139,5 g NaCl | |||
| 5,89 g MgSO44•7H2O | |||
| 50 g dekstrozy | |||
| 3,78 g CaCl22•2H2O | |||
| 7,12 g KCl | |||
| bufor Krebsa (1x) | 4,24 g NaHCO33 | Rozpuścić NaHCO₃3 do 100 ml H2O, dodać 200 ml buforu Krebsa 10x i dopełnić do 2 l wodą H2O2O. | Należy przygotować bezpośrednio przed użyciem |
| 200 ml 10x buforu Krebsa |
Tabela 1: Przygotowanie buforu Krebsa.
| stężenie BSA (m/v) | roztwór 10% BSA | bufor Krebsa 1x |
| 0.50% | 0,5 ml | 9,5 ml |
| 1% | 1 ml | 9 ml |
| 2% | 2 ml | 8 ml |
| 3% | 3 ml | 7 ml |
| 4% | 4 ml | 6 ml |
| 5% | 5 ml | 5 ml |
Tabela 2: Przygotowanie roztworów BSA.
| Roztwór do trawienia | Stężenie robocze | Odczynniki | Przygotowanie |
| Kolagenaza | 1 mg/ml | Kolagenaza IV | Odważyć 2 mg kolagenazy IV do probówki stożkowej o pojemności 50 mL i dodać 2 mL podgrzanego 1x buforu Krebsa bezpośrednio przed trawieniem (krok 2.3). |
| Trypsyna | 0,6 mg/ml | Trypsyna | Odważ 15 mg trypsyny do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, dodaj 25 ml podgrzanego 1x buforu KREBS i 40 µL DNazy I bezpośrednio przed trawieniem (krok 2.6). |
| >3,2 ku/ml | DNaza I |
Tabela 3: Przygotowanie enzymów trawiennych.
Dyskusja
Przedstawiono tutaj prosty i niedrogi protokół izolowania wzbogaconych populacji okrągłych spermatydów, spermatocytów pachytenowych i wydłużających się spermatydów przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego (przegląd protokołu pokazanego na rycinie 4). Chociaż nie jest wymagana żadna specjalistyczna wiedza ani drogie maszyny, istnieją pewne krytyczne kroki, które należy wziąć pod uwagę podczas trawienia tkanek, budowy gradientu i ładowania zawiesiny komórek na gradient.
Komórki rozrodcze są uwalniane z kanalików nasiennych w wyniku dwóch kolejnych trawień enzymatycznych. Pierwsze trawienie kolagenazą IV oddziela kanaliki nasienne poprzez usunięcie komórek śródmiąższowych. Wydłużony czas trawienia może uszkodzić kanaliki i doprowadzić do utraty spermatydów, ponieważ (jeśli zostaną uwolnione z kanalików na tym etapie) zostaną one odrzucone w kolejnych krokach. Drugi etap trawienia trypsyną uwalnia komórki rozrodcze z kanalików nasiennych. Sporadycznie może dochodzić do lizy komórek i zazwyczaj niektóre grudki tworzą się z powodu uwolnionego genomowego DNA. Nie zaleca się przekraczania sugerowanego czasu trwania lub temperatury trawienia, ponieważ może to prowadzić do gorszej żywotności, zwiększonej lizy komórek i zlepiania się. Jeśli wystąpi łagodne zbrylanie, grudki można zignorować. Jednak w przypadku znacznego zbrylania się i utraty komórek należy skrócić czas trawienia trypsyny lub jej stężenie. Należy również zauważyć, że aktywność enzymatyczna trypsyny może się różnić w zależności od partii i podczas długotrwałego przechowywania. Ilość DNazy I podczas trawienia trypsyny można również zwiększyć, aby usunąć nadmiar grudek, ale należy to uznać za rozwiązanie wtórne. Ważne jest, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową pod koniec obróbki wstępnej, ponieważ zbite komórki będą szybciej osadzać się, zanieczyszczając frakcje i zaburzając gradient.
Budowanie gradientu może wymagać pewnej wprawy. W przypadku dyskomfortu podczas używania końcówki do pipety o pojemności 5 ml z kontrolerem do pipet, zaleca się użycie zwykłej pipety mechanicznej o pojemności 1 ml z gładkim tłokiem, a następnie przycięcie końcówek pipet do otworu o średnicy ~3 mm (rysunek 1B). Szerszy otwór i płynne ładowanie roztworów BSA zmniejszy ryzyko pomieszania gradientu. Przy odpowiednim przygotowaniu możliwe jest dostrzeżenie granic między sąsiadującymi roztworami BSA ze względu na ich różne współczynniki załamania światła. Gradient powinien być wykonany bezpośrednio przed użyciem. Należy również zauważyć, że wszelkie niewielkie wstrząsy lub wibracje mogą zakłócić gradient, dlatego gradient należy ustawić w środowisku, w którym nie zostanie zakłócony.
Ładowanie zawiesiny ogniw na gradient musi być wykonane bardzo ostrożnie. Po załadowaniu zawiesina komórek powinna pozostać na szczycie gradientu, z którego komórki powoli zaczną osadzać się przez pierwszą warstwę. Jeśli zaobserwuje się duże grupy komórek poruszające się szybko w gradiencie, prawdopodobnie komórki nie zostały ostrożnie zawieszone lub występuje nadmierne zlepianie. Jeśli komórki nie pozostają na szczycie nieciągłego gradientu BSA po załadowaniu, ale natychmiast opadają między warstwami 1% i 2% BSA (krok 3.6), zawiesina komórek jest prawdopodobnie zbyt gęsta. Protokół ten został zoptymalizowany przy użyciu dwóch jąder dorosłej myszy (80-120 mg / jądro) jako materiału wyjściowego; Chociaż przeprowadzono udane izolacje przy użyciu zmniejszonych ilości materiału wyjściowego. Aby zwiększyć skalę protokołu i uzyskać bardziej wzbogacone komórki rozrodcze z większej liczby jąder, należy wprowadzić więcej probówek o pojemności 50 ml z gradientem.
Protokół został początkowo opracowany i zoptymalizowany w celu wzbogacenia haploidalnych okrągłych spermatyd z jąder dorosłych myszy, a czystość okrągłych frakcji spermatyd ma wynosić ponad 90%. Oprócz wysoce czystych okrągłych frakcji spermatyd uzyskano zadowalające wyniki w zakresie wzbogacania spermatocytów pachytenowych i wydłużających się spermatydów. Należy zauważyć, że erytrocyty mogą zanieczyszczać wydłużające się frakcje spermatydów i należy podjąć dalsze kroki w celu ich wyeliminowania, jeśli oczekuje się, że ich obecność będzie zakłócać dalsze analizy. Nie byliśmy w stanie wzbogacić innych typów komórek, takich jak komórki premejotyczne lub wczesne komórki mejotyczne (przed fazą pachytenu) od dorosłych myszy za pomocą protokołu MDR.
Dodatkowo sedymentacja STA-PUT jest z powodzeniem stosowana do uzyskiwania wzbogaconych frakcji spermatogonii lub spermatocytów preleptotenu, leptotenu i zygotenu przy użyciu młodzieńczych jąder pobranych w określonych punktach czasowych po urodzeniu13. Podejście to wykorzystuje pojawienie się tych typów komórek podczas pierwszej fali spermatogenezy. To samo podejście można prawdopodobnie zastosować do wzbogacania MDR, ale nie zostało ono jeszcze przetestowane w praktyce. Inną metodą, która jest dobrą opcją do oczyszczania komórek premejotycznych i mejotycznych na określonych etapach różnicowania, jest FACS, która ma tę ważną zaletę, że umożliwia izolację określonych typów komórek w oparciu o markery specyficzne dla obecności 14,15,16,17.
Ogólnie rzecz biorąc, sedymentacja prędkości MDR służy jako użyteczna metoda wzbogacania komórek rozrodczych. Chociaż metoda ta nie jest lepsza od innych dobrze znanych metod pod względem czystości lub ilości wzbogaconych komórek, jej niewątpliwymi zaletami są prostota i niskie koszty konfiguracji. To, wraz z niewielką ilością wymaganych materiałów wyjściowych, sprawia, że protokół ten jest doskonałą opcją dla badaczy w dziedzinie spermatogenezy i tych z innych dziedzin, którzy mogą nie chcieć inwestować w specjalistyczny sprzęt lub duże grupy zwierząt.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium Kotaja za ich wkład podczas rozwoju protokołu oraz aktywne wykorzystanie i testowanie protokołu w swoich projektach badawczych. Szczególnie doceniamy wkład Jana Lindströma za pomoc w optymalizacji protokołu. Badanie to było wspierane przez Akademię Fińską, Fundację Sigrid Jusélius i Doktorancki Program Medycyny Molekularnej w Turku.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyd | Preferencja badacza | ||
| AlexaFluor488 osioł anty-królik IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| AlexaFluor647 osioł anty-mysie IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma | A9647 | |
| CaCl2· 2H2O | Preferencja badacza | ||
| Kolagenaza IV | Sigma | C5138 | |
| Kompletny koktajl inhibitorów proteazy | Roche | 11836145001 | |
| Przeciwciało DDX4 | Abcam | ab13840 | |
| Dekstroza | Preferencja badacza | ||
| DNaza I | Worthington | LS006355 | |
| GAPDH | HyTest | 5G4 | |
| IgG przeciw-mysie IgG sprzężone z HRP | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
| Anty-królicze IgG sprzężone z HRP | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
| KCl | Preferencja badacza | ||
| KH2PO4 | Preferencja badacza | ||
| MgSO4· 7H2O | Preferencja badacza | ||
| NaCl | Preferencja badacza | ||
| NaHCO3 | Preferencja badacza | ||
| NH4Cl | Preferencja badacza | ||
| Pierce Zestaw do oznaczania białek BCA | Life Technologies | 23227 | |
| PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
| PIWIL2, klon 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
| Prolong Diamond Antidafe Mountant z DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | do barwienia immunologicznego Alexa Fluor |
| Neomarkery | IgG królika | NC-100-P | |
| Aglutynina z orzeszków ziemnych (PNA) znakowana rodaminąVector | Laboratories | RL-1072 | |
| Bufor | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1% NP-40, 0,5% w/v deoksycholan sodu, 0,05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x koktajl inhibitorów proteazy, 0,2 mM PMSF i 1 mM DTT | ||
| TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
| Triton X-100 | Preferencja badacza | niejonowy środek powierzchniowo czynny | |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium z DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | do standardowej analizy DAPI frakcji komórkowych |
| i gamma; Przeciwciało H2AX | Millipore | 05-636 | |
| 0,22 i mikro; m filtr | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | lub odpowiednik |
| 1 ml pipeta mechaniczna | Preferencja badacza | ||
| Probówki 1,5 ml lub 2 ml | Preferencja badacza | ||
| 40 &mikro; m sita komórkowe do probówek 50 ml | Greiner Bio-One | 542040 | lub równoważny sitko do komórek |
| Pipety serologiczne 5 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | lub równoważne |
| 50 ml probówki stożkowe | Preferencja badacza | ||
| Szalki Petriego 6 cm | Preferencja badacza | ||
| Inkubator kultur komórkowych | Preferencja badacza | ||
| Wirówka do probówek 50 ml | Preferencje badacza | ||
| Smarownik do szkiełek mikroskopowych | Preferencje badacza | ||
| HulaMixer Mieszalnik próbek | Thermo Fisher Scientific | 15920D | lub równoważny rotator komórkowy |
| Mikrodysekcja forcepty | Preferencja badacza | ||
| Nożyczki do mikrodysekcji | Preferencja badacza Szkiełka | ||
| podstawowe i nakrywkowe do mikroskopii | Preferencje badacza | ||
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | lub równoważny kontroler pipet |
| Wirówka z chłodzeniem do probówek 1,5 ml | Preferencje badacza | ||
| Końcówki do pipety mechanicznej 1 ml | Preferencje badacza Kąpiel | ||
| wodna | Preferencje badacza | ||
| Mikroskop fluorescencyjny szerokokątny | Preferencje badacza |
Bibliografia
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Advances in Experimental Medicine and Biology. 636, 1-15 (2008).
- Lehtiniemi, T., Kotaja, N. Germ granule-mediated RNA regulation in male germ cells. Reproduction. 155 (2), R77-R91 (2018).
- Lam, D. M., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 65 (1), 192-199 (1970).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Experimental Cell Research. 79 (1), 213-227 (1973).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 279-297 (2009).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648(2013).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. Journal of Cellular Physiology. 86 (1), 177-189 (1975).
- Barchi, M., Geremia, R., Magliozzi, R., Bianchi, E. Isolation and analyses of enriched populations of male mouse germ cells by sedimentation velocity: the centrifugal elutriation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 299-321 (2009).
- Romrell, L. J., Bellvé, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Developmental Biology. 49 (1), 119-131 (1976).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).
- Da Ros, M., et al. FYCO1 and autophagy control the integrity of the haploid male germ cell-specific RNP granules. Autophagy. 13 (2), 302-321 (2017).
- Bellvé, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. The Journal of Cell Biology. 74 (1), 68-85 (1977).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biology of Reproduction. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Suter, L., Koch, E., Bechter, R., Bobadilla, M. Three-parameter flow cytometric analysis of rat spermatogenesis. Cytometry. 27 (2), 161-168 (1997).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biology of Reproduction. 95 (4), 85-85 (2016).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 65 (1), 40-49 (2005).
Przedruki i uprawnienia
