Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

Podsumowanie

Testy interakcji międzykulturowych przedstawione w tym protokole są niedrogie, mają wysoką przepustowość i są proste. Testy te można wykorzystać do obserwacji interakcji mikrobiologicznych w kokulturze, identyfikacji wzorców interakcji i scharakteryzowania potencjału hamującego badanego szczepu drobnoustrojów przeciwko patogenom ludzkim i środowiskowym.

Streszczenie

Badanie interakcji między mikroorganizmami doprowadziło do licznych odkryć, od nowych środków przeciwdrobnoustrojowych po wgląd w ekologię mikroorganizmów. Wiele podejść stosowanych do badania interakcji mikrobiologicznych wymaga specjalistycznego sprzętu, jest kosztownych i czasochłonnych. W artykule przedstawiono protokół testów interakcji między kulturami, które są niedrogie, skalowalne do dużej liczby próbek i łatwe do dostosowania do wielu projektów eksperymentalnych. Mikroorganizmy są hodowane razem, przy czym każdy studzienka reprezentuje jedną parzystą kombinację mikroorganizmów. Badany organizm jest hodowany po jednej stronie każdej studzienki i najpierw inkubowany w monokulturze. Następnie organizmy docelowe są jednocześnie inokulowane po przeciwnej stronie każdej studzienki za pomocą wydrukowanego w 3D stempla inokulacyjnego. Po wspólnej hodowli zakończone testy są oceniane pod kątem fenotypów wizualnych, takich jak wzrost lub zahamowanie. Testy te mogą być wykorzystane do potwierdzenia fenotypów lub identyfikacji wzorców wśród interesujących izolatów. Korzystając z tej prostej i skutecznej metody, użytkownicy mogą szybko i wydajnie analizować kombinacje mikroorganizmów. To podejście oparte na współhodowli ma zastosowanie zarówno do odkrywania antybiotyków, jak i badań nad mikrobiomem w oparciu o hodowle i zostało już z powodzeniem zastosowane w obu zastosowaniach.

Wprowadzenie

W naturze mikroorganizmy rzadko występują w izolacji; w związku z tym nieustannie wchodzą w interakcje z innymi organizmami. Dlatego badanie, w jaki sposób mikroorganizmy oddziałują ze sobą, jest niezbędne do zrozumienia wielu zachowań mikroorganizmów¹. Interakcje mikrobiologiczne mogą być wzajemne, komensalne lub antagonistyczne. Te z kolei mogą wpływać nie tylko na same mikroorganizmy, ale także na środowisko i gospodarzy, których mikroorganizmy kolonizują^1,2.

Wielu naukowców bada interakcje mikrobiologiczne w celu zidentyfikowania nowych cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych. Jedna z pierwszych klinicznie ważnych cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych została odkryta dzięki badaniom interakcji mikrobiologicznych. Sir Alexander Fleming zaobserwował zanieczyszczający izolat Penicillium spp., który hamował wzrost szczepu Staphylococcus, co doprowadziło do odkrycia powszechnie stosowanego antybiotyku penicyliny³. Charakterystyka mechanizmów, które mikroorganizmy wykorzystują do antagonizowania swoich konkurentów, pozostaje owocnym źródłem dla odkrycia cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych. Na przykład niedawno wykazano, że Streptomyces sp. szczep Mg1 wytwarza antybiotyk linearmycins, który ma działanie lityczne i degradujące przeciwko Bacillus subtilis⁴.

Ponadto, niedawno odkryto nierybosomalny peptyd o nazwie lugdunin po obserwacji, że komensal nosowy Staphylococcus lugdunensis hamuje Staphylococcus aureus⁵. Badania wykazały również, że wzajemne interakcje między mikroorganizmami są równie silne jak interakcje antagonistyczne w odkrywaniu cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych. Na przykład, wiele mrówek hodujących grzyby w plemieniu Attini ma symbiotyczne bakterie zwane Pseudonocardia na swoim egzoszkielecie, które wytwarzają cząsteczki przeciwgrzybicze, aby zahamować obowiązkowy patogen ich uprawy grzybów⁶. Ponieważ badania nad interakcjami mikrobiologicznymi przyniosły korzyści w odkrywaniu cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych, zastosowanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych może doprowadzić do odkrycia nowych cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych.

Jeśli chodzi o koszt i łatwość wykonania, metodologie używane do badania interakcji mikrobiologicznych wahają się od prostych do złożonych. Na przykład test z korkiem agarowym jest niedrogą i prostą metodą, którą można wykorzystać do zbadania antagonizmu między wieloma mikroorganizmami⁷. Jednak test z zatyczką agarową nie jest wydajną procedurą i może być pracochłonny w przypadku wielu kombinacji parami. Aby ocenić wpływ produktów wytwarzanych przez drobnoustroje na docelowe izolaty będące przedmiotem zainteresowania w sposób wysokoprzepustowy, wiele laboratoriów stosuje testy dyfuzji krążkowej⁸. Testy te są łatwe i niedrogie oraz można je skalować do większej liczby próbek⁷. Jednak test ten wymaga wytworzenia ekstraktów mikrobiologicznych i może dać mylące wyniki dla niektórych kombinacji organizmów docelowych i antybiotyków, takich jak Salmonella i cefalosporyny⁹.

Poprzednie podejścia polegają na wyizolowanych komponentach w celu wywołania odpowiedzi w organizmie docelowym, zamiast pozwalać mikroorganizmom na wzajemne interakcje. Jest to godne uwagi, ponieważ interakcje między drobnoustrojami mogą wywoływać produkcję "tajemniczych" cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych, które nie są wytwarzane w monokulturze. Na przykład niedawno wykazano, że przeciwdrobnoustrojowa keyycyna jest wytwarzana przez Micromonospora sp. tylko wtedy, gdy jest hodowana wspólnie z Rhodococcus sp., która jest izolowana z tego samego mikrobiomu gąbki¹⁰. Bardziej złożone metodologie interakcji pozwalają obejść tę potencjalną przeszkodę związaną z monokulturą. Na przykład iChip jest przydatny do izolowania rzadkich i trudnych do wyhodowania bakterii z próbek środowiskowych i pozwala na obserwację interakcji mikrobiologicznych poprzez wzrost in situ¹¹. Do szczegółowego zbadania interakcji można zastosować spektrometrię mas z obrazowaniem czasu przelotu wspomaganą matrycą laserową (MALDI-TOF-IMS). Takie podejście dostarcza szczegółowych informacji na temat składu i dystrybucji małych cząsteczek i peptydów wytwarzanych przez oddziałujące kolonie drobnoustrojów z wysoką rozdzielczością przestrzenną. MALDI-TOF-IMS został również wykorzystany w wielu badaniach interakcji bakteryjnych w celu scharakteryzowania mechanizmów konkurencji^12,13,14,15. Jednak MALDI-TOF-IMS często wymaga pracochłonnego przygotowania próbek, specjalistycznej wiedzy specjalistycznej do obsługi sprzętu oraz drogich i specjalistycznych spektrometrów masowych. Z tych powodów jest to technika trudna do wykorzystania w badaniach o wysokiej przepustowości. W związku z tym korzystny byłby prosty, skalowalny i wysokoprzepustowy test kokulturowy dla interakcji mikrobiologicznych, który przezwycięża wiele ograniczeń powyższych podejść.

Tutaj przedstawiono protokół dla wysokoprzepustowej kohodowli mikrobiologicznej. Ten test jest prosty i łatwy do włączenia do istniejących wcześniej badań interakcji mikrobiologicznych. W przeciwieństwie do wielu powszechnie stosowanych metod badania interakcji mikrobiologicznych, nasza metoda jest prosta, niedroga i nadaje się do badania dużej liczby interakcji. Testy te są nie tylko łatwe do wykonania, ale materiały są powszechnie dostępne u większości dostawców laboratoryjnych lub w zasobach publicznych (np. bibliotekach i przestrzeniach twórczych). W związku z tym test ten jest korzystny jako pierwsza linia badań w celu identyfikacji i przeanalizowania interesujących wzorców wśród wielu par kombinacji mikroorganizmów, co może być szczególnie przydatne w badaniu ekologii drobnoustrojów.

Protokół

Uzyskano świadomą zgodę od rodziców dawcy, a Komitet ds. Badań Ludzkich na Uniwersytecie Wisconsin-Madison zatwierdził badanie (numer zatwierdzenia Institutional Review Board [IRB] H-2013-1044).

1. Przykładowa kultura

UWAGA: Ta procedura jest tutaj używana do badania interakcji między izolatami bakterii z ludzkiej jamy nosowej. Zasadniczo poniższe metody mają zastosowanie do każdego stanu hodowli. Rosół z naparu mózgowo-sercowego (BHI) służy do ogólnego rozmnażania bakterii w nosie. Wszystkie płytki są zestalane przy użyciu 1,5% agaru. Do tego badania próbki pobiera się z roztworu soli fizjologicznej spłukiwanego do nosa dawcy (płukanie nosa), przenosi do probówek mikrowirówek i zamraża w temperaturze -80 °C.

1. Użyć standardowych technik hodowli, aby umieścić 100 μl każdej z rozmrożonych próbek popłuczyn na płytkach BHI.
2. Inkubować płytki w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 1 tydzień.
3. Po inkubacji wybrać ≥2 kolonie każdego odrębnego morfotypu na płytkę i przeprowadzić izolaty tlenowo na płytkach BHI, rozprowadzając kolonię z płytki początkowej na nową płytkę BHI i inkubując płytkę w temperaturze 37 °C. Powtarzać, aż kultury bakterii będą czyste.
   nuta: Izolaty bakteryjne można zidentyfikować za pomocą morfologii kolonii, barwienia metodą Grama, sekwencjonowania genu 16S rRNA lub innej metody. Jednak znajomość tożsamości izolatu nie jest konieczna do kontynuowania protokołu.
4. Kriokonserwować wszystkie izolaty bakteryjne w temperaturze -80 °C po połączeniu 1 ml 50% glicerolu z 1 ml nocnej hodowli bakteryjnej (patrz punkt 3) w krioprobówkach.

2. 3D Drukowanie znaczków

UWAGA: Poliwęglan został wybrany jako materiał do tłoczenia ze względu na jego wysoką temperaturę zeszklenia (147 °C), która przekracza standardowe temperatury autoklawu (121 °C), co minimalizuje możliwość deformacji po wielokrotnym użyciu.

1. Załaduj do drukarki 3D filament poliwęglanowy.
2. Nałóż biały klej szkolny (polioctan winylu) na stół roboczy, aby poprawić przyczepność i zminimalizować wypaczanie stempla inokulacyjnego podczas drukowania.
3. Załaduj plik . Plik modelu STL (Plik danych uzupełniających) dla stempla inokulacji (Rysunek 1) do oprogramowania drukarki 3D.
4. Wydrukuj stempel inokulacji przy temperaturze dyszy 290 °C, temperaturze stołu 60 °C i wysokości warstwy 0,38 mm.
5. Zawiń stempel w folię aluminiową i sterylizuj w autoklawie przez 1,5 godziny w cyklu grawitacyjnym z 15 minutami suszenia.
   nuta: Chociaż poliwęglan jest higroskopijny, stemple zachowują tylko około 0,5% masy wody po autoklawowaniu.

3. Przygotowanie kultur nocnych

1. Za pomocą pipety serologicznej odpipetować 3 ml sterylnego bulionu BHI do 14 ml probówek hodowlanych.
2. Używając sterylnej pętli zaszczepiającej o pojemności 1 μl, zaszczepij kolonię bakteryjną w bulionie. Zakręć pętlą, aby grudka rozproszyła się w bulionie. Krótko przed inkubacją wymieszać probówki hodowlane.
3. Inkubować probówki hodowlane w temperaturze 37 °C przez noc (~16 h) na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min.
4. Wirować, aby rozbić grudki komórek, gdy kultury bakteryjne osiągną wystarczające zmętnienie (OD₆₀₀ ≥ 1).

4. Przygotowanie płytek do testów biologicznych

UWAGA: Płytki do testów biologicznych są przygotowywane w kapturze z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność.

1. Przygotuj pożywkę BHI z 1,5% agarem i sterylizuj w autoklawie zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Po sterylizacji w autoklawie schłodzić pożywkę BHI do temperatury 55 °C w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze.
3. Za pomocą pipety serologicznej odpipetuj 3 ml stopionego podłoża BHI do każdego z 12 dołków na 12-dołkowej płytce. Upewnij się, że studzienki są tak dokładne i równe, jak to możliwe. Jeden litr pożywki da ~ 27 płytek do testów biologicznych.
4. Pozostaw agar na noc do zastygnięcia.

5. Inokulacja płytek do testów biologicznych organizmem testowym

UWAGA: Organizm testowy odnosi się do organizmu, dla którego produkcja aktywności hamującej (np. produkcja antybiotyku) jest określana za pomocą testu interakcji z kulturą współistniejącą. W tym eksperymencie organizmami testowymi są promieniowce wyizolowane z próbek z płukanek nosowych.

1. Zaszczepić badany organizm na płytce do testu biologicznego, wkładając sterylną pętlę inokulacyjną o pojemności 10 μl do nocnej kultury i rozprowadzając kroplę kultury nad lewą trzecią częścią płytki.
   nuta: Zaleca się pokrycie smug tylko jednej trzeciej dołka, ponieważ przerost studzienki uniemożliwia późniejsze zaszczepienie organizmów docelowych.
2. Powtarzać tę czynność, aż wszystkie 12 studzienek na płytce zostanie zaszczepionych badanym organizmem.
3. Inkubować płytki do góry nogami w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni. W wyższych temperaturach (≥37 °C) lub w bardziej suchym klimacie należy przechowywać płytki w wilgotnym pojemniku, aby zapobiec ich wysychaniu.

6. Przygotowanie organizmów docelowych

UWAGA: Organizm docelowy odnosi się do organizmu, którego status zahamowania jest określany za pomocą testu interakcji z kulturą współistniejącą. W tym eksperymencie organizmami docelowymi są Staphylococcus spp. wyizolowane z próbek z płukania nosa.

1. Po inkubacji na płytkach do testów biologicznych przez 6 dni należy przygotować przez noc kultury określonych organizmów docelowych, jak to opisano powyżej (patrz sekcja 3).

7. Inokulacja organizmu docelowego

UWAGA: Po całonocnej inkubacji upewnij się, że kultury są mętne (OD₆₀₀ ≥ 1). Niektóre kultury bakteryjne mogą flokulować na dnie probówki hodowlanej. Wirować probówki hodowlane, aby rozproszyć grudki i ocenić zmętnienie kultury.

1. Przygotować płytkę docelową, wypełniając każdą studzienkę pustej płytki 12-dołkowej 1,8 ml BHI i 200 μl docelowej kultury przez noc
.
2. Rozpakować i umieścić sterylny stempel inokulacyjny na płytce docelowej. Delikatnie obracaj kultury w studzienkach, uważając, aby kultury nie zanieczyściły sąsiednich studni.
3. Podnieś stempel zaszczepiający i upewnij się, że na każdej końcówce stempla znajduje się kropla rozcieńczonej kultury docelowej.
4. Przygotuj płytkę kontrolną monokultury, umieszczając stempel inokulacyjny na nieinokulowanej płytce do testu biologicznego i delikatnie kołysz stempelem, tak aby kropla kultury zaszczepiła każdą studzienkę. Po usunięciu stempla inokulacji, kropla kultury powinna być widoczna w dołkach płytki do testu biologicznego.
   1. Jeśli jakiekolwiek studzienki nie zostaną zaszczepione pieczęcią inokulacyjną z powodu nierównomiernego poziomu pożywki, należy nanieść 3 μl rozcieńczonej kultury przez noc po prawej stronie studzienek za pomocą pipety.
5. Zaszczepić płytki testu biologicznego, jak to zrobiono powyżej (patrz krok 7.4.1), ale wyrównaj stempel tak, aby końcówki zrównały się z prawą stroną płytki 12-dołkowej. Upewnij się, że stempel nie styka się z istniejącą kolonią bakteryjną podczas zaszczepiania studzienek.
6. Ostrożnie usuń stempel i umieść go z powrotem w tabliczce docelowej.
7. Powtarzać inokulację dla każdej płytki do testu biologicznego, aż wszystkie płytki zostaną zaszczepione.
8. Inkubować płytki do testów biologicznych do góry nogami w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni.

8. Punktacja

1. Po wspólnej hodowli organizmów testowych i docelowych przez 1 tydzień, oceń interakcje na podstawie następującej oceny wizualnej:
   1. Oceń studzienki ze wzrostem organizmu docelowego, który wykazuje wzrost nie do odróżnienia od kontroli monokultury jako "0" (brak zahamowania) (Rysunek 2A,B).
   2. Oceń studzienki z organizmem docelowym, który wykazuje zmniejszony wzrost w porównaniu z kontrolą, jako "1" (słabe hamowanie) (Rysunek 2C).
   3. Oceń dołki, w których organizm docelowy nie rósł, jako "2" (silne hamowanie) (Rysunek 2D).

Wyniki

Testy interakcji w kokulturze mogą być wykorzystywane do zrozumienia interakcji mikrobiologicznych, identyfikacji interesujących wzorców oraz wykrywania izolatów mikrobiologicznych o intrygującej aktywności. W tych testach organizm testowy jest hodowany w monokulturze po jednej stronie 12-dołkowej płytki agarowej i inkubowany przez 7 dni. Następnie obok organizmu testowego nanosi się organizm docelowy, a oba mikroorganizmy są hodowane wspólnie przez 7 dni przed oceną fenotypu wzrostu orga...

Dyskusja

Antybiotyki i inne metabolity wtórne, które pośredniczą w interakcjach mikrobiologicznych, są przydatne w wielu zastosowaniach, w tym w odkrywaniu leków. W niniejszym artykule przedstawiono protokół testów kokulturowych w celu oceny dużej liczby interakcji mikrobiologicznych. Te testy interakcji z kokulturami są prostym, niedrogim, skalowalnym i wysokowydajnym sposobem do badania wielu par kombinacji mikroorganizmów w tandemie. Organizmy docelowe są wykrywane obok organizmów badanych w studzience na płytce 12-dołkowej za...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 μ L jednorazowe polistyrenowe pętelki do zaszczepiania, niebieskie	VWR	12000-806
10 μ L jednorazowe polistyrenowe pętle do zaszczepiania, żółte	VWR	12000-810
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, sterylna z pokrywką	Greiner bio-one	665 180
14 mL polistyrenowa probówka z okrągłym dnem, 17 x 100 mm 2style, niepirogenna, sterylna	Falcon	352057
2.0 samostojące probówki z nakrętkami, sterylne	USA scientific	1420-9710
Pipeta serologiczna 25 ml	Cell Treat	229225B
Agar, bakteriologiczny	VWR	J637
Brain Heart Infusion Broth Dot	Scientific	DSB11000-5000
Filament poliwęglanowy, biały, średnica 3 mm	Keene Village Plastics	12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R
Klej szkolny	Elmer's	EPIE304
Drukarka 3D Taz 6	Lulzbot