Artykuł metodologiczny

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/60288

⸱

8 października 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Neurobiology of Behavior, University of Göttingen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziesięciolecia badań nad wieloma organizmami modelowymi doprowadziły do obecnej koncepcji plastyczności synaptycznej leżącej u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci. Wywołane uczeniem się zmiany w transmisji synaptycznej są często rozmieszczone w wielu neuronach i poziomach przetwarzania w mózgu. Dlatego potrzebne są metody wizualizacji zależnej od uczenia się plastyczności synaptycznej w neuronach. Muszka owocowa Drosophila melanogaster stanowi szczególnie korzystny organizm modelowy do badania obwodów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się. Przedstawiony tu protokół demonstruje sposób, w jaki procesy leżące u podstaw powstawania asocjacyjnych wspomnień węchowych, czyli aktywność synaptyczna i jej zmiany, mogą być monitorowane in vivo. Korzystając z szerokiego wachlarza narzędzi genetycznych dostępnych u Drosophila, możliwa jest specyficzna ekspresja genetycznie kodowanych wskaźników wapnia w określonych populacjach komórek, a nawet w pojedynczych komórkach. Utrwalając muchę w miejscu i otwierając torebkę głowy, można zobrazować dynamikę wapnia w tych komórkach podczas dostarczania bodźców węchowych. Dodatkowo demonstrujemy konfigurację, w której mucha może być jednocześnie poddawana wstrząsom elektrycznym ciała. Zapewnia to system, w którym muchy mogą przechodzić klasyczne warunkowanie węchowe - dzięki któremu wcześniej naiwny zapach uczy się kojarzyć z karą porażenia prądem - w tym samym czasie, gdy reprezentacja tego zapachu (i innych niewyuczonych zapachów) jest obserwowana w mózgu za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Nasze laboratorium wcześniej informowało o generacji synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia, które umożliwiają ograniczenie fluorescencyjnych sygnałów wapniowych do przedziałów pre- lub postsynaptycznych. Mikroskopia dwufotonowa umożliwia przestrzenne rozdzielenie drobnych struktur. Ilustrujemy to, skupiając się na neuronach integrujących informacje z ciała grzyba, centrum wyższego rzędu w mózgu owada. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia metodę badania połączeń synaptycznych między neuronami, których aktywność jest modulowana w wyniku uczenia się węchowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozszyfrowanie, gdzie i jak informacje są zdobywane w mózgu poprzez uczenie się, a następnie przechowywane jako pamięć, stanowi jedno z najtrudniejszych zadań w neurobiologii1. Badania neuronaukowe doprowadziły do koncepcji zmiany w przekaźnictwie synaptycznym jako substracie neuronalnym, który leży u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci2,3. Przypuszcza się, że podczas uczenia się połączenia synaptyczne między zespołami neuronalnymi, które są aktywne podczas percepcji bodźca, ulegają modyfikacji w taki sposób, że ich połączony wzorzec aktywności może zostać odzyskany podczas przywoływania pamięci, instruując w ten sposób przyszłe działania behawioralne4. Te "komórki engramowe" i ich synapsy są często rozmieszczone w różnych regionach mózgu i poziomach przetwarzania, co utrudnia przypisanie obserwowanych zmian w transmisji synaptycznej do uczenia się zadania lub bodźca. Aby zlokalizować i zobrazować te zmiany synaptyczne, które są przyczynowo związane z konkretnym zadaniem uczenia się, potrzebny jest odpowiedni system modelowy, który pozwala na precyzyjne ograniczenie tych synaps.

Dla takiego przedsięwzięcia Drosophila melanogaster jest szczególnie odpowiednia, ponieważ łączy w sobie względną prostotę mózgu, bogactwo behawioralne i dostępność eksperymentalną. Wśród dobrze ugruntowanych organizmów modelowych Drosophila znajduje się pomiędzy nicieniem C. elegans a genetycznie podatnymi ssakami, takimi jak myszy, pod względem złożoności neuronalnej. Stereotypową liczbę neuronów (~300) i ograniczony repertuar behawioralny obserwuje się u C. elegans. Z drugiej strony ssaki mają miliony neuronów i oszałamiającą złożoność behawioralną. Mózg muszki owocowej jest, ze swoimi ~100 000, neuronami znacznie mniejszymi niż mózgi większości kręgowców, a wiele neuronów jest indywidualnie identyfikowalnych5. Jednak Drosophila wykazuje szerokie spektrum złożonych zachowań, w tym zdolność do wykazywania silnego asocjacyjnego uczenia się węchowego i tworzenia pamięci, po raz pierwszy opisaną ponad 40 lat temu6. W trakcie tej klasycznej procedury warunkowania, grupy much są poddawane działaniu zapachu jako bodźca warunkowego (CS+), podczas gdy otrzymują karzący wstrząs elektryczny jako bodziec bezwarunkowy (US). Drugi zapach (CS-) jest wtedy prezentowany bez żadnej kary. W ten sposób zwierzęta uczą się unikać zapachu związanego z karą, który można przetestować w późniejszej sytuacji wyboru między dwoma zapachami, CS+ i CS-. Prace nad analizą substratu neuronalnego leżącego u podstaw tego zachowania u Drosophila zidentyfikowały ciała grzybów (MB) jako główne miejsce "engramu"7,8,9,10 a zatem obwody tego obszaru mózgu były i są przedmiotem intensywnych badań w celu odkrycia logiki, za pomocą której engram pamięci jest pozyskiwany i przechowywany (ostatnio Sprawdzone w11,12).

MB Drosophila składa się z ~2,000 wewnętrznych neuronów (komórek Kenyona) na półkulę, zorganizowanych w równoległe projekcje aksonalne13. Aksony neuronów projekcyjnej węchu są przedłużone do bocznej protocerebry i do kielichów MB, głównego dendrytycznego miejsca wejściowego MB i otrzymują bodźce węchowe z płatów czułkowych. Długie, równoległe wiązki aksonów komórek Kenyona tworzą szypułkę i płaty. Większość komórek Kenyona rozwidla się, tworząc poziome płaty β/β', rozciągając jeden płat poboczny w kierunku linii środkowej mózgu, a pionowe płaty α/α', wydłużając drugie płaty poboczne wystające w kierunku grzbietowo-przednim. Druga grupa komórek Kenyona tworzy poziome γ-płaty 13 MB, gdzie proces uczenia się i następujące po nim tworzenie pamięci krótkotrwałej mogą być zlokalizowane10. Płaty MB odbierają aferentne dane wejściowe i zapewniają odprowadzające wyjście, z których oba są zwykle ograniczone do odrębnych podregionów przedziałowych wzdłuż aksonów komórek Kenyona14,15,16. W szczególności wykazano, że aferentne dopaminergiczne neurony wejściowe MB pośredniczą w efektach opartych na wartościach, np. karnych, wzmacniających w asocjacyjnym uczeniu węchowym15,17. Stereotypowe i indywidualnie identyfikowalne odprowadzające neurony wyjściowe MB z płatów ciała grzyba integrują informacje z dużej liczby komórek Kenyona, celują w różne obszary mózgu i zawierają informacje instruujące o zachowaniu lub awersyjne15. Ta architektura neuronalna doprowadziła do koncepcji organizacji engramu asocjacyjnego. Zapachy są stosunkowo precyzyjnie kodowane przez słabo aktywowane zespoły komórek Kenyona. Zbieżna aktywność tych zespołów komórek Kenyona i uwalnianie dopaminy - wywołane przez karzące bodźce - moduluje transmisję z presynaps komórek Kenyona do neuronów wyjściowych MB w taki sposób, że zwierzęta będą następnie unikać tego konkretnego zapachu10,12. Używamy tego dość precyzyjnie zdefiniowanego i zlokalizowanego engramu jako paradygmatycznego przypadku do zilustrowania, w jaki sposób te zależne od uczenia się zmiany w aktywności synaptycznej mogą być określane i monitorowane.

Wartość Drosophila jako systemu modelowego opiera się w dużej mierze na niezrównanym genetycznym zestawie narzędzi, który pozwala na ekspresję transgenów w celu identyfikacji, monitorowania i kontrolowania pojedynczych neuronów w złożonych obwodach18. Pojawienie się technik monitorowania aktywności neuronalnej - takich jak obrazowanie wapnia, omówione tutaj - pozwoliło na określenie wzorców aktywności neuronów w odpowiedzi na określony bodziec. Łącząc specyficzną ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) sterowaną przez Gal4 ze stymulacją węchową, można zobrazować dynamikę wapnia wywołaną zapachem w interesujących neuronach19. W tym protokole pokazano, że dzięki dalszemu sprzężeniu tej techniki z klasycznym paradygmatem warunkowania, możliwe jest zbadanie tych reakcji węchowych w kontekście uczenia się. Plastyczność wywołana uczeniem się może być dalej analizowana za pomocą GECI, które są nie tylko zlokalizowane w pojedynczym konkretnym neuronie, ale także w określonych podprzedziałach neuronu. Pech et al.20 stworzyli zestaw narzędzi, które pozwalają właśnie na to. Kierując GCaMP321 do pre- lub postsynapsy - poprzez połączenie z kręgowcami Synaptophysin lub dHomer, odpowiednio20 - można rozróżnić modulację różnicową tych miejsc. Ta lokalizacja daje w tym kontekście przewagę nad większością GECI, które są wszechobecne w cytozolu - np. GCaMP22, GCaMP321, lub GCaMP623 - ponieważ oznacza to, że stany przejściowe pre- i postsynaptyczne można odróżnić od ogólnego zintegrowanego napływu wapnia, który następuje w wyniku aktywacji neuronów. Może to dostarczyć wskazówek na temat lokalizacji i rodzajów plastyczności, które występują w wyniku lub powodują uczenie się i tworzenie pamięci. Jako przykład, przedstawiony tutaj protokół pokazuje wartość tego narzędzia w rozszyfrowywaniu modulacji neuronów wyjściowych MB podczas węchowego uczenia się asocjacyjnego poprzez ukierunkowanie ekspresji czujnika wapnia tylko na postsynapsę. Monitorując w obrębie pojedynczej muchy aktywność wywołaną zapachem przed i po kondycjonowaniu węchowym, można dokonać bezpośredniego porównania między naiwną reakcją na zapach a wyuczoną reakcją zapachową. Po umieszczeniu w tej samej komorze obrazowania muchy są narażone na działanie różnych zapachów. Następnie otrzymują protokół awersyjnego warunkowania asocjacyjnego, w którym jeden z tych zapachów jest połączony z porażeniem prądem (stając się CS+), a inny zapach jest prezentowany bez wzmocnienia (stając się CS-). Na koniec muchy są ponownie wystawione na te same zapachy, co w pierwszym kroku. Dynamikę wapnia obserwuje się za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transgeniczne muszki owocowe, Drosophila melanogaster

  1. Krzyżuj samice dziewiczych i samców much (hodowanych w temperaturze 25 °C przy 60% wilgotności względnej w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność) niosących pożądane Gal4 i UAS konstruują odpowiednio klasę<="xref">25, aby uzyskać muchy, w których określone neurony wyrażają genetycznie kodowany wskaźnik wapnia.
  2. Żeńskie potomstwo powyższej krzyżówki należy postarzać do momentu, gdy znajdą się w przedziale 3-6 dni po eklozji. Samice much są preferowane ze względu na ich nieco większy rozmiar.

2. Przygotowanie muszki owocowej do obrazowania wapnia in vivo

  1. Wybierz pojedynczą samicę muchy i znieczulaj ją na lodzie nie dłużej niż 5 minut.
  2. Za pomocą cienkich kleszczyków umieść muchę w komorze obrazowania (pokazano na Rysunek 1c). Upewnij się, że klatka piersiowa i nogi stykają się z przewodami elektrycznymi na dnie komory i że głowa leży płasko. Ustal pozycję rozporka za pomocą przezroczystej taśmy klejącej.
    UWAGA: Ten protokół wymaga specjalnie zbudowanej komory, w której muchy są zamocowane, z kapsułą głowy dostępną do otwarcia, a muchy mogą odbierać zarówno stymulacje zapachowe do czułków, jak i wstrząsy elektryczne do klatki piersiowej i nóg (Rysunek 1).
  3. Za pomocą ostrza skalpela chirurgicznego przymocowanego do rękojeści skalpela (patrz Tabela materiałów), wytnij okienko w taśmie wokół głowy muchy, pozostawiając zakryte czułki i odsłoniętą tylko najbardziej wysuniętą do przodu część klatki piersiowej.
  4. Otocz boki i tył głowy klejem utwardzanym niebieskim światłem, ostrożnie manipulowanym za pomocą szpilki do owadów trzymanej przez wklęsło-wypukłe szczęki. Utrwal klej za pomocą lampy LED emitującej niebieskie światło.
  5. Sprawdź, czy klej jest całkowicie związany i usuń resztki nieutwardzonego kleju z grzbietowej powierzchni głowicy muchy.
  6. Nałóż kroplę roztworu Ringera24 (patrz Tabela Materiałów), aby pokryć odsłonięty naskórek głowy.
  7. Za pomocą noża o bardzo cienkim ostrzu przetnij naskórek. Aby jak najskuteczniej usunąć naskórek, najpierw przetnij tylną część głowy, używając oczek jako punktu wyjścia. Następnie przetnij każdą stronę, przyśrodkowo do oczu, aby utworzyć płat naskórka, który można łatwo oderwać za pomocą kleszczy.
  8. Usuń nadmiar naskórka, który może blokować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania.
  9. Ostrożnie oczyść powierzchnię grzbietową tchawicy za pomocą cienkich kleszczy, unikając uszkodzenia samej tkanki mózgowej. Usuń i odśwież roztwór Ringera24 (patrz Tabela materiałów) zgodnie z wymaganiami, aby oczyścić obszar z resztek tkanki.
  10. Umieść igłę do dostarczania zapachu podskórnego w miejscu, około 1 cm od głowy muchy. Upewnij się, że nic nie utrudnia dostarczania zapachu do anten.
  11. Pod mikroskopem podłączyć komorę obrazowania do systemu dostarczania zapachów za pomocą igły do dostarczania zapachów podskórnych.
  12. Aby mucha mogła w pełni wyzdrowieć po znieczuleniu i operacji oraz dostosować się do przepływu powietrza, na tym etapie należy wprowadzić 10-minutowy okres odpoczynku.

3. Obrazowanie wapnia in vivo

  1. Użyć mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień i obiektyw zanurzeniowy w wodzie (patrz Tabela materiałów), zainstalowanego na stole z izolacją drgań. W celu wizualizacji wskaźników wapnia opartych na GFP należy dostroić laser do długości fali wzbudzenia 920 nm i zainstalować filtr pasmowo-przepustowy GFP.
  2. Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej Z przeskanuj oś Z mózgu i zlokalizuj interesujący Cię obszar mózgu. Użyj funkcji kadrowania, aby ustawić ostrość skanowania tylko na tym obszarze, aby zminimalizować czas skanowania, i obrócić widok skanowania tak, aby przednia część głowy była skierowana w dół.
  3. Dostosuj rozmiar klatki do 512 x 512 px, prędkość skanowania do > 4 Hz i obszar skanowania (w wymiarze Y) tak, aby interesujące Cię neurony były zakryte.

4. Wizualizacja stanów przejściowych wapnia wywołanych zapachem poprzez warunkowanie węchowe

  1. Użyj systemu dostarczania zapachów19,26, który może dostarczyć kilka bodźców zapachowych w czasowo precyzyjny sposób.
    1. Użyj dodatkowego komputera do sterowania urządzeniem i do komunikacji z oprogramowaniem mikroskopu obrazowego, aby skoordynować stymulację zapachu z przechwytywaniem obrazu podczas eksperymentów.
    2. Zainicjuj wstępnie zaprogramowany pakiet makr zdolny do połączenia oprogramowania do akwizycji obrazu i programu dostarczania zapachu (np. pakiet makr VBA zainstalowany w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, patrz Tabela materiałów), który reaguje na zewnętrzny wyzwalacz wejściowy zapewniony przez zainicjowanie protokołu dostarczania zapachu w oddzielnym programie).
  2. Rozpocznij pomiar od monitorowania "przed treningiem"/naiwnych stanów przejściowych wapnia wywołanych zapachem w rozdzielczości 512 x 512 px i częstotliwości odświeżania 4 Hz. Dostarcz 2,5-sekundowy bodziec zapachowy otoczony dodatkową akwizycją obrazu przez 6,25 s poprzedzający początek zapachu (w celu ustalenia wartości bazowej F0) i 12,5 s po przesunięciu zapachu. Powtórz to z drugim środkiem zapachowym, a następnie z trzecim środkiem zapachowym.
  3. Kontynuuj 3 minuty po tym pomiarze z klasycznym kondycjonowaniem ("treningiem") muchy.
    1. Wybierz jeden z zapachów prezentowanych w fazie "przedtreningowej", aby stać się zapachem CS+, a drugi, aby stać się zapachem CS-. Prezentuj zapach CS+ za pomocą sterowanego komputerowo systemu dostarczania zapachów przez 60 sekund wraz z dwunastoma wstrząsami elektrycznymi 90 V.
    2. Po 60 s przerwie prezentuj sam zapach CS przez 60 s. Stosować jako substancje zapachowe 4-metylocykloheksanol i 3-oktanol. Nie należy podawać trzeciego środka zapachowego (np. 1-octen-3-ol) podczas tego treningu, ponieważ jest on stosowany tylko jako kontrola przed (krok 4.2.) i po (krok 4.4) fazie treningu.
  4. Ponownie zmierz stany przejściowe wapnia wywołane zapachem "po treningu", powtarzając protokół stymulacji zapachu "przed treningiem" (krok 4.2.) 3 minuty po zakończeniu fazy treningu (krok 4.3).
    UWAGA: Czas wykonania tego kroku powinien odzwierciedlać interesujący czas po utworzeniu pamięci (np. wykonaj ten krok 3-4 minuty po etapie kondycjonowania, aby zbadać pamięć krótkotrwałą). Zazwyczaj muchy mogą przetrwać kilka godzin w tym preparacie.
  5. Zapisz pliki obrazów w odpowiednim formacie (np. Tiff) do późniejszej analizy obrazu.

5. Analiza obrazu

  1. Aby przeanalizować obrazy, otwórz pliki Tiff (lub podobne) w oprogramowaniu do analizy obrazów, takie jak Fiji27.
  2. Wyrównaj stosy za pomocą algorytmu korekcji ruchu, aby zapewnić minimalny ruch w kierunkach X i Y. Odrzuć wszystkie nagrania, które pokazują silny ruch w osi Z.
  3. Wybierz narzędzie w oprogramowaniu używanym do oznaczania obszaru zainteresowania (ROI) wokół obszaru, który ma być badany. Powinno to być tak precyzyjne, jak to tylko możliwe, aby ograniczyć wpływ fluorescencji tła.
  4. Użyj odpowiedniego narzędzia oprogramowania, aby wyodrębnić czasowe dane o intensywności fluorescencji jako pliki danych z wybranego ROI, tak aby wartość została wygenerowana dla każdej klatki nagrania.
  5. Otwórz dane za pomocą programu do analizy danych, aby obliczyć wartości ΔF/F0 dla każdego śladu zapachu. F0 = średnia fluorescencja w ciągu 2 s przed pojawieniem się zapachu. ΔF = różnica między surową fluorescencją w danej ramce a F0. Na podstawie tych wartości oblicz wartość ΔF/F0 dla każdej klatki, którą można wykreślić w funkcji czasu, aby odzwierciedlić względną fluorescencję przez cały okres bodźca zapachowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykład obrazów uzyskanych za pomocą powyższego protokołu można zobaczyć w Rysunek 2. dHomer-GCaMP3 ulega ekspresji w neuronie wyjściowym MB, którego dendryty unerwiają przedział 1 płata MB γ (neuron jest określany jako MVP228,29) i jest genetycznie ukierunkowany przy użyciu linii split-Gal4 MB112C16. Wykazano również różnicę w subkomórkowej lokalizacji cytozolowego i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza obwodów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się i pamięci jest ważnym celem w dziedzinie neuronauki. Dostępność genetyczna Drosophila oraz zakres i łatwość testów behawioralnych sprawiają, że jest to idealne narzędzie do badania takich zjawisk. W tym miejscu przedstawiono metodę, za pomocą której można uwidocznić u poszczególnych muszek modulację, która zachodzi na poziomie subkomórkowym w wyniku warunkowania węchowego. Przeprowadzając zarówno przedtreningową, jak i potreningową wizualizację dynamiki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych poprzez Wspólne Centrum Badawcze SFB 889 "Mechanizmy przetwarzania sensorycznego" oraz Jednostkę Badawczą FOR 2705 "Rozwarstwienie obwodu mózgu: struktura, plastyczność i funkcja behawioralna ciała grzyba Drosophila".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-Octen-3-olSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAO5284Substancja chemiczna stosowana jako środek nawaniający
3-OctanolSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA218405Substancja chemiczna stosowana jako środek nawaniający
4-metylocykloheksanolSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA153095Substancja chemiczna stosowana jako nawaniacz
Filtr pasmowoprzepustowy do EGFP (525/50 nm)Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Niemcy
Przezroczysta taśma samoprzylepnaTesa SE, Norderstedt, NiemcyStandardowa przezroczysta taśma samoprzylepna
Wklęsło-wypukłe szczękiFine Science Tools, North Vancouver, Kanada10053-09Uchwyty ostrzy z wklęsło-wypukłymi szczękami
Cienkie kleszczeFine Science Tools, North Vancouver, Kanada11412-11Kleszcze z końcówką 0,1 x 0,06 mm
IgłapodskórnaSterican - B. Braun, Melsungenk, Niemcy46651201,20x40mm
Szpilki do owadów MinutienFine Science Tools, North Vancouver, Kanada26002-10Średnica 0,1 mm, końcówka 0,0125 mm
KentoflowKent Express Dental Supplies, Gillingham, Wielka Brytania953683Niebieski klej światłoutwardzalny
Szkiełko mikroskopoweCarl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Niemcy0656.1Obiektyw standardowy szkiełko 76 x 26 mm
Olej mineralnySigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAM8410Stosowany jako rozcieńczalnik do nawaniaczy
Laser Ti-Sapphire z blokadą trybu pracy Chameleon Vision 2Coherent Inc., Santa Clara, CA, USAPrzestrajalny laser femtosekundowy na podczerwień
Mikroskop wielofotonowy LSM 7MP wyposażony w detektory BiGCarl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, NiemcyMikroskop wielofotonowy, wiele firm dostarcza podobne urządzenia.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0) obiektyw zanurzeniowyw wodzie Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Niemcy421452-9900-000Obiektyw W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Roztwór RingeraKCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sacharoza, pH = 7,4
Nóż kłutySharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA72-15515,0 mm Prosta ograniczona głębokość ostrza
Ostrze chirurgiczneSwann-Morton, Sheffield, Wielka Brytania0303Produkt nr 11
Rękojeść chirurgicznaSwann-Morton, Sheffield, Wielka Brytania0907Nr produktu 7S/S
Oprogramowanie Visual Basics of Applicatons (VBA) do odbierania wyzwalacza
z urządzenia dostarczającego zapach oraz urządzenia aplikacyjnego (zasilacza) do porażenia prądem
do interakcji z oprogramowaniem ZEN
firmy Zeiss, które steruje mikroskopem.		Napisane na zamówienie i dostępne na życzeniegdzie indziejniesklasyfikowane.
n.a.n.a.5mM ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poo, M. M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, 40(2016).
  2. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  3. Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).
  4. Josselyn, S. A., Frankland, P. W. Memory Allocation: Mechanisms and Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).
  5. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
  6. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).
  7. Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).
  8. de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1994).
  9. Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).
  10. Fiala, A., Riemensperger, T. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. editors, edition.,R. .M. enzelandJ. .H. .B. yrne, 1, Academic Press. Oxford. 475-482 (2017).
  11. Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).
  12. Hige, T. What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory. Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).
  13. Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers. Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).
  14. Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution. Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).
  15. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, (2014).
  16. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, (2014).
  17. Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).
  18. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
  19. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  20. Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain. Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).
  21. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  22. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  23. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  24. Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).
  25. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  26. Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
  29. Owald, D., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia dwufotonowawarunkowanie w chowegenetycznie kodowane wska niki wapnianeurony cia a grzybowegopodawanie bod c w w chowychwarunkowanie wstrz sem elektrycznymobrazowanie subkom rkowe

Powiązane artykuły