Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60294

⸱

19 grudnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Department of Neurology, Düsseldorf University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego czujnika opartego na FRET ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych przodomózgowia myszy. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać ten czujnik do dynamicznego obrazowania komórkowych poziomów ATP w neuronach i astrocytach.

Streszczenie

Aktywność neuronalna w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) wywołuje wysokie zapotrzebowanie na energię komórkową dostarczaną przez rozkład adenozynotrójfosforanu (ATP). Duża część ATP jest potrzebna do reinstalacji gradientów jonów na błonach plazmatycznych zdegradowanych przez sygnalizację elektryczną neuronów. Istnieją dowody na to, że astrocyty - choć same nie generują szybkich sygnałów elektrycznych - ulegają zwiększonej produkcji ATP w odpowiedzi na aktywność neuronalną i wspierają aktywne neurony, dostarczając im metabolity energetyczne. Niedawny rozwój genetycznie kodowanych czujników dla różnych metabolitów umożliwia teraz badanie takich interakcji metabolicznych między neuronami a astrocytami. W tym miejscu opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji wrażliwego na ATP czujnika transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET-) ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych tkanki hipokampa i kory myszy przy użyciu wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (AAV). Ponadto pokazujemy, w jaki sposób ten czujnik może być wykorzystany do dynamicznego pomiaru zmian w komórkowych poziomach ATP w neuronach i astrocytach po wzroście zewnątrzkomórkowego potasu i po indukcji niedokrwienia chemicznego (tj. Zahamowaniu metabolizmu energii komórkowej).

Wprowadzenie

Pobudzająca aktywność elektryczna neuronów opiera się głównie na przepływie kationów, takich jak sód (Na+) i potas (K+) przez ich błony plazmatyczne. Utrzymanie gradientów elektrochemicznych tych dwóch jonów jest zatem wymagane do sygnalizacji. Osiąga się to za pomocą komórkowej ATPazy Na+/K+ (NKA), wszechobecnej elektrogenicznej pompy transbłonowej, która wytłacza 3 Na+ z komórki w zamian za 2 K+ z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, wymagając zużycia jednej cząsteczki ATP na cykl transportowy1. Oprócz NKA istnieje kilka innych transporterów jonów zużywających ATP, w tym błona plazmatyczna Ca2 + -ATPaza, która jest niezbędna do wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca2 + i jej eksportu po napływie wywołanym aktywnością2. W pęcherzykach presynaptycznych wakuolarna H+-ATPaza (v-ATPaza) tworzy gradient protonów niezbędny do wychwytu neuroprzekaźnika do tego przedziału3.

Chociaż aktywność neuronów wymaga znacznej ilości ATP4, nie wykazują one znaczącej zdolności do magazynowania energii. Zamiast tego wydają się polegać na interakcjach metabolicznych z sąsiednimi astrocytami, głównymi magazynami glikogenu w mózgu5. Sugeruje się, że glikogen astrocytarny rzeczywiście odgrywa ważną rolę we wspieraniu potrzeb energetycznych neuronów; a kluczowym zjawiskiem w proponowanym sprzężeniu neurometabolicznym między tymi dwoma typami komórek jest zdolność astrocytów do zwiększania produkcji ATP w odpowiedzi na aktywność neuronalną6,7,8. Hipoteza ta, znana jako astrocyte-neuron lactatate shuttle (ANLS), jest nadal przedmiotem dyskusji, ponieważ inne prace dostarczyły dowodów na to, że neurony mogą również zwiększać swoje własne tempo glikolizy w odpowiedzi na stymulację9,10, co odzwierciedla konieczność dalszych metod i podejść do badania interakcji neuro-gleju.

Badanie metabolizmu energii komórkowej i poziomów ATP w neuronach i astrocytach w celu wyjaśnienia interakcji metabolicznych neuro-gleju było od dawna utrudnione przez brak odpowiednich sond do wykrywania zmian w stężeniach metabolitów w żywych komórkach w tkance mózgowej. Ostatnia dekada przyniosła jednak gwałtowny rozwój nowych narzędzi i nowych genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych dla różnych metabolitów, w tym czujników ATP, mleczanu, pirogronianu i innych11,12. Korzystając z tych narzędzi, możliwe jest teraz bezpośrednie odniesienie się do pytań związanych z konsumpcją ATP w komórkach i zmianami w poziomach energii komórkowej na poziomie pojedynczej komórki oraz w sposób specyficzny dla typu komórki w nienaruszonej tkance mózgowej13.

W niniejszej pracy opisujemy procedurę wizualizacji cytozolowej dynamiki ATP na neuronach i astrocytach hodowanych organotypowych wycinków mózgu. Pokazujemy, jak wykorzystać wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV) do specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego nanoczujnika ATP ATeam1.03YEMK (14) w neuronach i astrocytach wycinków mózgu myszy, które mogą być utrzymywane w hodowli komórkowej przez kilka tygodni15. Opisano procedurę usuwania blizny glejowej pokrywającej wycinki tkanki hodowlanej, która poprawia dostępność optyczną i obrazowanie komórek w warstwach tkanki organotypowej pod spodem. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób ATeam1.03YEMK może być wykorzystany do wykonywania obrazowania zmian w komórkowych poziomach ATP w tym preparacie na podstawie FRET. Główną zaletą tej metody jest to, że nie wymaga chirurgicznych zabiegów na mózgu, zapewnia wysoki poziom ekspresji czujnika i specyficzności typu komórki w hodowanych wycinkach mózgu, zmniejszając inwazyjność lub stres w komórkach w porównaniu z innymi metodami, takimi jak transfekcja przez elektroporację lub transdukcja z innymi wektorami wirusowymi10,16,17. Ponadto protokół ten może być stosowany do innych nanoczujników opartych na FRET, w tym wariantów ATeam1.03, które zapewniają niższe powinowactwo wiązania do ATP14.

Protokół

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Heinricha Heinego w Düsseldorfie oraz dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej (2010/63/EU). Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem organotypowych kultur plastrów mózgu zostały zgłoszone do Biura Dobrostanu Zwierząt w Zakładzie Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Heinricha Heinego w Düsseldorfie i przez nie zatwierdzone (numer aktu instytucjonalnego: O50/05). Zgodnie z zaleceniami Komisji Europejskiej18, zwierzęta do 10. dnia życia uśmiercano poprzez dekapitację.

1. Przygotowanie organotypowych hodowli plastrów mózgu (OTCs)

  1. Dzień przed lub co najmniej 30 min przed procedurą
    1. Przygotować płytkę Petriego (w warunkach sterylnych). Zdjąć pokrywkę z płytki 6-dołkowej i wlać 80-850 µL pożywki OTC do każdego dołka. Przechowywać płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2/95% O2) do czasu użycia.
    2. Przygotować płytki Petriego do płukania (w warunkach sterylnych). Dodać 3 mL HBSS do każdej płytki Petriego o średnicy 30 mm. Na jedną procedurę wymagane jest łącznie 5 płytek. Umieścić je w inkubatorze (37 °C, 5% CO2/95% O2) na co najmniej 30 min — lub na noc do czasu użycia.
    3. Przygotować ACSF (Tabela 1). Solankę bez glukozy przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego dnia.
Roztwory soli i pożywki – przygotowanie
NazwaSkrótSkładStężenie [mM]Komentarze
Sztuczny roztwór płynu mózgowo-rdzeniowegoACSF (Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy)NaCl125Przeprzepłykiwano mieszaniną z 5% CO2/95% O22, pH 7,4
KCl2.5Zawsze dodawaj glukozę bezpośrednio przed użyciem.
CaCl₂22Nie przechowywać z glukozą przez więcej niż jeden dzień.
MgCl₂21~310 mOsm/L
NaH2PO41.25
NaHCO3326
Glukoza20
Eksperymentalny ACSFE-ACSFNaCl136Przemuślowano 5% CO2/95% O22, pH 7,4
KCl3Zawsze dodawać glukozę bezpośrednio przed użyciem.
CaCl222Nie przechowywać dłużej niż jeden dzień w obecności glukozy.
MgCl221~320 mOsm/L
NaH2PO41.25
NaHCO₃324
Glukoza5
Mleczan1
Roztwór do wywoływania niedokrwienia chemicznegoCISNaCl136Prze KN z 5% CO2/95% O22, pH 7,4
KCl3~318 mOsm/L
CaCl₂22
MgCl221
NaH2PO41.25
NaHCO₃324
2, 2-deoksyglukoza2
Próbka nie jest dostępna (NaN)35
ACSF z dodatkiem 8 mM potasu8 mM K+ Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF)NaCl128Przepuszczono strumień 5% CO2/95% O22, pH 7,4
KCl8~320 mOsm/L
CaCl222
MgCl₂21
NaH2PO41.25
NaHCO₃324
Glukoza5
Mleczan1
ACSF buforowany HepesemH-ACSFNaCl125pH skorygowano do 7,4 za pomocą NaOH
KCl3Zawsze dodawaj glukozę bezpośrednio przed użyciem
CaCl222Nie przechowywać z glukozą przez więcej niż jeden dzień.
MgSO₄42~310 mOsm/L (skorygowano sacharozą)
NaH2PO4125
HEPES25
Glukoza10
Zrównoważony roztwór soli HanksaHBSSSigma (numer katalogowy H9394).
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym DulbeccoDPBSGibco (numer katalogowy 14287-080)
Pożywka do hodowli organotypowychpożywka OTCinaktywowana termicznie surowica konia20%34°C, 5 % CO22, pH 7,4, w warunkach hodowli
MEM79%~320 mOsm/L
L-glutamina1
Insulina0,01 mg/ml
NaCl14.5
MgSO42
CaCl₂21.44
Kwas askorbinowy0.00125 %
D-glukoza13

Tabela 1: Skład roztworów.

  1. W dniu przygotowania dodać glukozę do ACSF, umieścić roztwór w lodu i rozpocząć napowietrzanie mieszanką 95% O2/5% CO2 przez co najmniej 30 min, aby uzyskać pH 7,4.
  2. Disekcja i krojenie
    1. Uśmiercić mysz (BalbC, obie płcie) w 6. do 8. dobie po urodzeniu poprzez szybką dekapitację i umieścić głowę w szklanej czarce Petriego zawierającej lodowaty ACSF.
    2. Odsłonić czaszkę, nacinając skórę od tyłu aż do tylnej krawędzi kości nosowej. Następnie, ostrożnie wyciąć czaszkę od strony otworu wielkiego (foramen magnum) za pomocą nożyczek chirurgicznych i odsłonić mózg.
      UWAGA: Należy upewnić się, że procedura jest zgodna z wytycznymi instytucji.
    3. Wyjąć mózg i umieścić go na membranie filtrującej w lodowatej czarce Petriego wypełnionej ACSF.
    4. Rozdzielić półkule i wykonać cięcie parasagittalne pod kątem 45°. Przymocować jedną półkulę do stolika wibrotomu za pomocą superglue. Natychmiast przenieść blok tkanki do kąpieli wibrotoma zawierającej lodowaty ACSF (napowietrzony 5% CO2/95% O2). Następnie wyrównać położenie tkanki. Drugą półkulę przechowywać w lodowatym ACSF do momentu krojenia.
    5. Ustawić wibrotom tak, aby wycinać plastry o grubości 250-40 µm. Krojenie plastrów o grubości 250 µm pozwoli na uzyskanie około 12 plastrów z jednego zwierzęcia (przy 400 µm: ok. 7 plastrów).
    6. Po wycięciu plastra (Rycina 1A), zidentyfikować formację hipokampa na podstawie jego typowego wyglądu morfologicznego (Rycina 1) i wyizolować go za pomocą igieł hipodermicznych (rozmiar 23 G, 1"), pozostawiając część kory mózgowej przylegającą do hipokampa.
      UWAGA: Zachowanie neocortex podczas hodowli pomaga utrzymać integralność hipokampa. Jeśli jednak jest to wymagane, hipokamp można izolować i hodować bez kory.
    7. Umieścić plaster na siatce w ogrzanym ACSF (34 °C, napowietrzonym 5% CO2/95% O2) do czasu zebrania wszystkich plastrów.
    8. Przenieść plastry do komory z laminarnym przepływem powietrza, aby kontynuować pracę w warunkach sterylnych.

Porównanie skrawków mózgu, anatomia; hodowla ostrą vs organotypowa, oznaczone obszary, schemat, badanie neurobiologiczne.
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy transmisyjne ostrych i organotypowych preparatów skrawków mózgu. Porównanie ostro wyizolowanego skrawka mózgu w płaszczyźnie parasagittalnej (A) oraz parasagittalny organotypowy skrawek mózgu utrzymywany w kulturze przez 12 dni (B) przy użyciu szerokopolowej mikroskopii transmisyjnej. DG = zakręt zębaty; CA1/3 = obszar CA1/CA3 hipokampa; E-CTX = kora entorynalna; CTX = (neokora) kora mózgowa. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Hodowanie plastrów

  1. Szybko i ostrożnie przenieś skrawki z ACSF do jednej z uprzednio ogrzanych szalek Petriego wypełnionych sterylnym roztworem soli Hanksa, używając do tego sterylnej szklanej pipety Pasteura odwróconej końcem dołu.
    UWAGA: Sterylizacja tkanki odbywa się poprzez rozcieńczanie (krok 3.2). Przenieś do szalki Petriego jak najmniejszą ilość ACSF.
  2. Zmień pipetę i przenieś skrawki do drugiej szalki Petriego. Powtórz ten proces łącznie 5 razy. Do kolejnych szalek Petriego przenoś jak najmniejszą ilość HBSS.
  3. Ostrożnie umieść po jednym skrawku na górnej powierzchni insertu hodowlanego. Powtórz tę procedurę dla każdego skrawka. Unikaj tworzenia turbulencji w pipecie i poczekaj, aż skrawkow opadnie na końcówkę pipety Pasteura. Na jednej membranie można umieścić do 4 skrawków.
  4. Uważnie usuń nadmiar roztworu Hanksa z górnej części insertu, używając końcówki o małej średnicy.
  5. Przechowuj hodowle (Rycina 2) w inkubatorze na granicy fazy gazowej (karbogen, 95% O2 /5% CO2) i ciekłej w temperaturze 37 °C aż do dnia przeprowadzenia eksperymentu. Wymieniaj medium co 2-3 dni.

Schemat organotypowej hodowli hipokampa, transdukcja AAV, analiza FRET w obrazowaniu neuronów.
Rycina 2: Zasada obrazowania ATP w oparciu o FRET w hodowlanych organotypowych skrawkach mózgu z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora ATeam1.03YEMK. Schematyczny przedstawienie protokołu zaprezentowanego w niniejszej pracy. W skrócie: parasagitalne skrawki organotypowe, hodowane przez 1–3 dni, są transdukowane wektorem wirusa towarzyszącego adenowirusom zawierającym albo specyficzny dla astrocytów promotor hGFAP, albo specyficzny dla neuronów promotor hSyn oraz sekwencję dla ekspresji ATeam1.03.YEMKRozcieńczone alikwoty tych wektorów (1:2–1:4) nanosi się bezpośrednio na górną powierzchnię skrawka, który utrzymuje się w warunkach hodowlanych przez co najmniej kolejne 6 dni. Zmiany wewnątrzkomórkowych poziomach ATP można następnie wizualizować w komórkach ekspresujących sensor, wzbudzając go przy 434 nm i rejestrując jednocześnie emisję fluorescencji przy 527 (akceptor) i 475 (donor) nm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

3. Ekspresja czujników ATP z użyciem wektora wirusa towarzyszącego adenowirusom (Rycina 2)

UWAGA: Należy upewnić się, że spełnione są wszystkie wymagania dotyczące obchodzenia się z organizmami modyfikowanymi genetycznie!

  1. Aby przygotować wektory wirusowe, należy podzielić wektory wirusowe towarzyszące adenowirusom (AAV2/5) na alikwoty po 1-2 µL aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Alikwoty należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Umieść na sterylnym blacie kolbę zawierającą 10% roztwór wybielacza w celu utylizacji wszystkich zużytych materiałów pozostałych po kontakcie z wektorem.
  3. Do transdukcji przygotować rozcieńczenie 1 µL wektora z 2-3 µL DPBS. Roztwory zapasowe zazwyczaj wykazują miano fizyczne rzędu 1012 kopii genomów wirusowych na ml (vg/ml).
  4. Przenieś insert zawierający hodowany plasterek do komory z laminarnym przepływem powietrza.
  5. Nanieść, nie dotykając tkanki, 0.5 µL rozcieńczonego wektora bezpośrednio na wierzch każdego plasterka.
    UWAGA: Lepszą ekspresję w głębszych warstwach tkanki uzyskuje się poprzez transdukcję hodowanych plastrów w 1. do 3. dniu in vitro (DIV). Transdukcja starszych kultur może skutkować odpowiednio przeważającą ekspresją w komórkach otaczającej blizny glejowej lub niską ekspresją w neuronach.
  6. Na koniec należy umieścić skrawki z powrotem w inkubatorze i utrzymywać je przez co najmniej kolejne 6 dni. Nie należy wymieniać medium w dniu transdukcji.

4. Usuwanie blizny glejowej (Rysunek 3)

  1. Tuż przed rozpoczęciem eksperymentu przenieś insert zawierający hodowane skrawki do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza i umieść go w szalce 30 mm zawierającej 1 mL medium OCT lub MEM.
  2. Umieść szalkę pod stereomikroskopem i ustaw ostrość na powierzchni skrawka.
  3. Użyj dwóch sterylnych igieł hipodermicznych (23 G, 1"), aby wykonać krótkie nacięcie krzyżowe bezpośrednio na wąskich krawędziach wybranego skrawka (Rysunek 3). Procedura ta zwolni napięcie powierzchniowe wytworzone przez bliznę glejową, powodując jej odsuniecie i odsłonięcie leżących poniżej warstw (patrz Rysunek 5).
    UWAGA: Pierwsza warstwa tkanki (blizna glejowa) jest tworzona głównie przez astrocyty reaktywne. W obrazowaniu szerokopolowym ta gęsta warstwa tkanki spowoduje dodatkowe rozproszenie światła, co doprowadzi do rozmycia obrazów. Usunięcie blizny jest zatem korzystne dla uzyskania lepszej widoczności głębszych warstw, które zawierają właściwą tkankę organotypową. Należy zatem pamiętać, aby nacięcie wykonywać wyłącznie na krawędzi i tylko w górnej warstwie preparatu skrawka, tak aby nie uszkodzić tkanki pod spodem. Nie zaobserwowano różnic między danymi uzyskanymi z OTC z blizną glejową a danymi z OTC bez blizny (dane nie przedstawiono).
  4. Wyjmij przygotowany skrawek z insertu. W tym celu użyj sterylnego skalpela i wytnij go, wykonując proste cięcia równoległe do membrany, tworząc kwadrat lub trójkąt ze skrawkiem w centrum, trzymając krawędzie membrany pęsetą. Jeśli insert zawiera dodatkowe skrawki, przenieś go z powrotem na oryginalną płytkę i do inkubatora. Napięcie powierzchniowe medium zapobiegnie jego wyciekowi na powierzchnię membrany.

Technika iniekcji do mózgu z diagramem strzykawki służąca do celowania w konkretne obszary mózgu w badaniach z zakresu neuronauki.
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie mechanicznego usuwania blizny glejowej. Rysunek przedstawia kulturę przekroju hipokampa pokrytą blizną glejową (niebieskawy elipsoid). Poprzez jednorazowe ścięcie końcówek dwóch igieł strzykawkowych w najmniejszym biegunie kultury i na krawędzi blizny glejowej (niebieska przerywana linia), blizna zostanie odchylona na bok. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Obrazowanie ATP oparte na FRET (Rysunek 4)

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować E-ACSF i napowietrzać go mieszaniną 95% O2/5% CO2 przez co najmniej 30 min, aby uzyskać pH 7.4. Włączyć źródło światła fluorescencyjnego (lampę ksenonową) monochromatora (Rycina 4). Perfuzję należy uruchomić bezpośrednio przed wyjęciem skrawka z inkubatora.
    UWAGA: Przez cały czas trwania eksperymentu należy utrzymywać napowietrzanie soli fizjologicznej mieszaniną 95% O2 i 5% CO2.
  2. Przenieść skrawek do komory eksperymentalnej, która jest stale perfundowana świeżym, nasyconym karbogenem E-ACSF przy użyciu pompy perystaltycznej (Rycina 4). Następnie unieruchomić skrawek za pomocą siatki. Umieścić komorę na stole mikroskopu i podłączyć system perfuzyjny. Do perfuzji zaleca się stosowanie gazoszczelnych przewodów laboratoryjnych.
    UWAGA: Eksperymenty można przeprowadzać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze bliskiej fizjologicznej, w zależności od projektu badawczego. Należy sprawdzić stabilność i niezawodność przepływu perfuzyjnego, aby uniknąć zmian ostrości wywołanych ruchem tkanki i/lub zmianami naprężeń ścinających. Standardowe prędkości perfuzji dla pracy ze skrawkami, stosowane przez nas i wiele innych laboratoriów, wynoszą 1.5-2.5 mL/min.

Układ spektroskopowy do obrazowania fluorescencyjnego; schemat i mikroskop, analiza emisji, badanie tkanek.
Rysunek 4: Konfiguracja układu do obrazowania FRET. (ASchematyczny rysunek różnych komponentów i ich rozmieszczenia przestrzennego niezbędnych do konfiguracji obrazowania FRET. Układ składa się z monochromatora z lampą ksenonową jako źródłem światła, mikroskopu z nieruchomym stolikiem w układzie pionowym (1), systemu rozdzielacza obrazu (2), cyfrowej kamery CCD lub CMOS do rejestracji poklatkowej (3) oraz kąpieli eksperymentalnej przystosowanej do stabilnej, stałej perfuzji (4). Perfuzja kąpieli jest realizowana za pomocą pompy perystaltycznej z regulowaną prędkością przepływu.B) Obraz przestrzeni roboczej eksperymentu. Układ obrazowania FRET jest zamontowany na stole wibroizolacyjnym z platformą translacyjną x/y, w której osadzono kąpiel eksperymentalną. Numery: patrz (A). (C) Schematyczny widok drogi światła od monochromatora do kamery cyfrowej. Wskazano położenie poszczególnych filtrów oraz zwierciadła dichroicznego. Numery: patrz (A). Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Ustaw ostrość na hodowany skrawek za pomocą światła przechodzącego. Zidentyfikuj obszar, w którym będą przeprowadzane eksperymenty (przykład: obszar CA1 hipokampa). Przed rozpoczęciem obrazowania odczekaj co najmniej 15 min, aby skrawki zaadaptowały się do warunków solnych. Konfigurację układu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 4.
  2. Włącz kamerę oraz oprogramowanie do obrazowania. Następnie wybierz odpowiedni kostk filtracyjny.
  3. Wzbudź fluorescencyjne białko donora (eCFP) przy 435/17 nm (~435 nm). Ustaw czas ekspozycji w zakresie od 40 do 90 ms.
    UWAGA: Silna ekspozycja skrawków na światło fluorescencyjne może wywołać efekty fototoksyczne.
  4. Wzbudzenie przy 435 nm skutkuje emisją zarówno przy 475 nm (eCFP; donor), jak i przy 527 nm (Venus; akceptor). Rozdziel emisję fluorescencji przy 50 nm za pomocą rozdzielacza obrazu emisji i zastosuj filtry pasmowe 483/32 oraz 542/27, aby dodatkowo odizolować fluorescencję donora i akceptora. Silna ekspresja może prowadzić do nasycenia detektorów. W takim przypadku można zastosować filtr neutralny w celu zmniejszenia intensywności wzbudzenia.
  5. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) pozornie pozbawiony fluorescencji komórkowej w celu odjęcia tła. Następnie utwórz ROI obejmujące ciała komórek.
  6. Ustaw częstotliwość akwizycji obrazów oraz całkowity czas rejestracji. W przypadku długich eksperymentów (>30 min) zaleca się częstotliwość akwizycji 0,2-0,5 Hz, aby zapobiec fototoksyczności.
  7. Rozpocznij rejestrację. Zaleca się rejestrowanie przez co najmniej 5 min w warunkach bazowych, aby zapewnić stabilność preparatu.
    UWAGA: W razie potrzeby koryguj ostrość komórki podczas rejestracji.
  8. Aby wywołać zmiany w poziomie wewnątrzkomórkowego ATP, przenieś rurkę perfuzyjną ze standardowego ACSF do soli zawierającej inhibitory metaboliczne (np. CIS, patrz Tabela 1 i poniżej). Alternatywnie zastosuj sól z podwyższonym stężeniem potasu, aby symulować uwalnianie potasu z aktywnych neuronów.
    UWAGA: Aplikacja poprzez perfuzję kąpielową jest procesem stosunkowo powolnym, który działa globalnie na cały preparat. Zwróć uwagę na czas, w którym nowy roztwór faktycznie zaczął wpływać do kąpieli eksperymentalnej. W zależności od odległości między komorą a rezerwuarem soli, a także od prędkości perfuzji, należy uwzględnić czas opóźnienia.

6. Dokumentacja fluorescencji komórkowej ATeam w wysokiej rozdzielczości

  1. Bezpośrednio po zakończeniu rejestracji przenieś komorę z hodowlą skrawka do konfokalnego mikroskopu skaningowego.
    UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność. Ze względu na ryzyko fotouszkodzeń, krok ten należy wykonać wyłącznie po zakończeniu eksperymentów. W celach dokumentacyjnych można wymienić E-ACSF na H-ACSF. W związku z tym system perfuzyjny nie jest konieczny.
  2. Wykonaj stosy obrazów (z-stacks) przy najwyższej możliwej rozdzielczości w osi z dla danej konfiguracji optycznej.
  3. Zastosuj algorytm dekonwolucji w celu zwiększenia rozdzielczości obrazu.

Wyniki

Wektory AAV stanowią niezawodne narzędzie do selektywnej ekspresji obcych genów w komórkach w obrębie żywej tkanki16. Bezpośrednie zastosowanie AAV zawierających kasetę sekwencyjną ATeam1.03YEMK oraz specyficznego promotora prowadzi do wysokiej ekspresji sensora w wybranym typie komórek. W 14. dobie in vitro (DIV 14, ok. 10 dni po transdukcji), neurony wykazujące ekspresję ATeam pod kontrolą ludzkiego promotora synapsyny występują z wysoką gęstością w neokorze hodowanych skrawków tkanki na głębokości do 50 µm poniżej powierzchni skrawka (Rysunek 5A). Porównywalne wyniki można uzyskać w hipokampie (Rysunek 5B).

Kultury neuronów korowych i hipokampalnych, mikroskopia fluorescencyjna, wizualizacja 3D rozmieszczenia komórek.
Rycina 5: Wizualizacja neuronów wykazujących ekspresję ATeam1.03YEMK w hodowlach organotypowych skrawków mózgu w płaszczyźnie parasagitalnej. Obrazy po lewej stronie odpowiadają projekcjom o rozszerzonym obszarze ostrości z 43 przekrojów optycznych (1.05 µm każda) tkanki korowej (A) i (B) 70 przekrojów optycznych (0.6 µm (każdy) tkanki hipokampa. Obrazy po prawej stronie przedstawiają widok wolumetryczny tej samej projekcji. Komórki są oznaczone kolorami zgodnie z ich głębokością względem powierzchni skrawka, zgodnie ze skalą kolorów po prawej stronie. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W celu pomiaru poziomów ATP w astrocytach, ATeam1.03YEMK jest ekspresowany pod kontrolą ludzkiego promotora kwaśnego białka włókienstwa glia (GFAP). Skutkuje to wydajną transdukcją komórek zarówno w neocortex, jak i w hipokampie hodowanych skrawków tkankowych (Rysunek 6). Warto zauważyć, że można wyróżnić dwa różne fenotypy morfologiczne, w zależności od głębokości względem powierzchni preparatów skrawków. W pierwszej, powierzchownej warstwie, komórki charakteryzują się grubymi wypustkami pierwotnymi, które są rozmieszczone głównie równolegle do powierzchni. Komórki te wykazują silnie nakładające się domeny, tworząc gęstą sieć pozornie reaktywnych astrocytów (Rysunek 6). W głębszych warstwach (30-60 µm od powierzchni), transdukowane astrocyty wykazują cienkie wypustki komórkowe tworzące w dużej mierze sferyczne domeny, a ich morfologia przypomina morfologię astrocytów in situ, jak opisano wcześniej19,20,21 (Rysunek 6). Aby uzyskać lepszą transdukcję astrocytów z głębszych warstw oraz lepszy dostęp optyczny do tych obszarów, można usunąć tkankę blizny glejowej zgodnie z opisem w Kroku 4.

Warstwy astrocytów hipokampa w hodowli; mikroskopia fluorescencyjna; profilowanie głębokości z-stack.
Rycina 6: Wizualizacja astrocytów wykazujących ekspresję ATeam1.03YEMK w hodowanych organotypowych skrawkach mózgu w płaszczyźnie parasagitalnej. Obraz po lewej stronie odpowiada projekcji z rozszerzoną głębią ostrości, obejmującej 191 przekrojów optycznych (0.45 µm (każdy). W celach ilustracyjnych blizna glejowa została wykluczona z projekcji astrocytów. Obrazy po prawej stronie przedstawiają widok objętościowy tej samej projekcji przed i po usunięciu blizny glejowej. Komórki są oznaczone kolorami zgodnie z ich głębokością względem powierzchni skrawka, zgodnie ze skalami kolorów po prawej stronie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Pomyślna ekspresja ATeam1.03YEMK umożliwia dynamiczny pomiar zmian poziomów ATP w neuronach lub astrocytach, w zależności od zastosowanego promotora (patrz wyżej). Eksperymenty przeprowadzono w kąpieli eksperymentalnej stale perfundowanej E-ACSF (napowietrzanym mieszanką 95% O2/5% CO2). W organotypowych skrawkach wykazujących ekspresję ATeam1.03YEMK w neuronach hipokampa, przed rozpoczęciem rejestracji wybrano obszary zainteresowania (ROIs), reprezentujące somata komórek piramidalnych (Ryc. 7A). Ponadto wybrano obszar do odejmowania tła (Ryc. 7A). Następnie rejestrowano emisję fluorescencji Venus oraz eCFP oddzielnie dla każdego z tych ROI, przedstawiając ją jako poziom emisji fluorescencji w czasie (Ryc. 7B). Po rejestracji fluorescencji w warunkach kontrolnych przez kilka minut w celu zapewnienia stabilnej linii bazowej, metabolizm komórkowy zahamowano poprzez wystawienie preparatu skrawka na sól fizjologiczną bez glukozy, do której dodano 5 mM azotku sodu (NaN3) na jedną minutę (Ryc. 7B). Manipulacja ta wywoła przeciwstawne zmiany w intensywności emisji pary FRET (Ryc. 7B, panele lewe), polegające na spadku emisji Venus (527 nm) i wzroście emisji eCFP (475 nm). Obliczenie stosunku FRET poprzez podzielenie emisji fluorescencji Venus przez emisję eCFP (FVenus/FeCFP) pozwoliło uzyskać sygnały odzwierciedlające względne zmiany wewnątrzkomórkowych poziomach ATP, tzw. „stosunek FRET ATeam” (Ryc. 7B, panel prawy). we wszystkich rejestrowanych neuronach (n = 70 komórek w N = 5 skrawkach) NaN3 spowodował odwracalny spadek stosunku FRET ATeam, co wskazuje na odwracalny spadek wewnątrzkomórkowych poziomów ATP po zahamowaniu metabolizmu komórkowego.

Obrazowanie stosunku fluorescencji; analiza FRET neuronów hipokampa obszaru CA1; wykres odpowiedzi fluorescencyjnej.
Rycina 7: Demonstracja obrazowania czasu rzeczywistego stosunku FRET dla ATeam. (A) Górny lewy róg: obraz fluorescencyjny w szerokim polu warstwy piramidowej i stratum radiatum obszaru CA1 hodowanej organotypowej skrawka hipokampa wykazującego ekspresję ATeam1.03YEMK w neuronach. Górny prawy róg: Powiększony widok zaznaczonego ramką obszaru wskazanego po lewej stronie. Białe linie wyznaczają obszary zainteresowania (ROI) 1-3 reprezentujące ciała komórek neuronów piramidowych obszaru CA1 wybranych do analizy w (B). BG oznacza obszar zainteresowania (ROI) wybrany do korekcji tła. Na dole: obrazy w pseudokolorach przedstawiające emisję fluorescencji Venus (zielony), eCFP (fioletowy) oraz stosunek Venus/eCFP. (B) Rejestracja time-lapse w obszarach ROI 1-3, reprezentujących ciała neuronów (patrz A). Ślady po lewej stronie przedstawiają znormalizowaną emisję fluorescencji Venus (zielona) i eCFP (magenta). Ślady po prawej stronie przedstawiają odpowiadający im stosunek FRET dla ATeam. Należy zauważyć, że perfuzja 5 mM NaN3 brak glukozy poza komórką przez 1 minutę (szary słupek) indukuje odwracalny spadek stosunku FRET dla ATeam, co wskazuje na obniżenie wewnątrzkomórkowej koncentracji ATP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby zapewnić stabilność preparatu i czujnika w długoterminowych warunkach eksperymentalnych, skrawki z ekspresją ATeam w neuronach lub astrocytach były poddawane ciągłej perfuzji ACSF przez dłuższe okresy (>50 min; n = 12 komórek na próbę, N = 3 OTC z 3 mózgów). W tych warunkach stosunek FRET dla ATeam nie uległ zmianie (Rysunek 8). Poddanie preparatów działaniu CIS zawierającego inhibitory metaboliczne („ Niedokrwienie chemiczne”, patrz Tabela 1), z kolei, ponownie doprowadziły do oczekiwanego spadku stosunku FRET dla ATeam, co zaobserwowano powyżej.

Odpowiedź neuronalna i astrocytarna na niedokrwienie chemiczne na wykresie stosunku FRET; analiza czasu względem stosunku.
Rycina 8: Eksperymenty bazowe z wykorzystaniem ATeam. Obrazowanie stosunku FRET dla ATeam w długim okresie w 14 różnych komórkach w warunkach bazowych w neuronach (góra) i astrocytach (dół). Dane zostały zebrane w warunkach porównywalnych z innymi danymi eksperymentalnymi. Pod koniec każdego pomiaru wywołano niedokrwienie chemiczne poprzez perfuzję CIS, co zaznaczono strzałką. UWAGA: Bazowe stosunki FRET ATeam są stabilne w czasie w warunkach bazowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Następnie przeanalizowano reakcje neuronów i astrocytów wykazujących ekspresję ATeam1.03YEMK na wzrost stężenia potasu pozakomórkowego. Po ustaleniu stabilnej linii bazowej neurony przepłukiwano roztworem soli fizjologicznej, w którym stężenie potasu zwiększono z 3 do 8 mM przez 3 minuty (Rysunek 9A). Manipulacja ta nie doprowadziła jednak do wykrywalnej zmiany stosunku FRET ATeam (n = 56 komórek w N = 5 skrawkach). Aby upewnić się, że czujnik reaguje na zmianę poziomu ATP, skrawki poddano ponownie długotrwałej niedokrwienności chemicznej wywołanej poprzez zastąpienie E-ACSF przez CIS. Niedokrwienność chemiczna spowodowała szybki spadek stosunku FRET ATeam do nowego, stabilnego poziomu, co wskazywało na nominalne wyczerpanie ATP po 2-3 min (Rysunek 9A).

Analiza FRET w neuronach i astrocytach; stosunki i odpowiedź na niedokrwienie chemiczne, mikroskopia, wyniki graficzne.
Rysunek 9: Reprezentatywne eksperymenty ilustrujące zmiany poziomu ATP w neuronach i astrocytach. (A,B): Obrazy po lewej stronie przedstawiają fluorescencję ATeam z neuronów i astrocytów zlokalizowanych w obszarze CA1 hipokampa w skrawkach organotypowych. Wykresy po prawej stronie przedstawiają zapisy czasowe stosunku FRET ATeam uzyskane z ROI (obszaru zainteresowania) umieszczonego nad pojedynczym ciałem komórki. W obu eksperymentach skrawki poddano najpierw zwiększeniu stężenia potasu pozakomórkowego przez 3 minuty (patrz. pasek), a następnie końcowej ekspozycji na niedokrwienie chemiczne. Należy zauważyć, że podczas gdy neurony nie reagują na podwyższenie poziomu potasu pozakomórkowego (A), astrocyty reagują zwiększeniem poziomu ATP (B). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ten sam protokół eksperymentalny przeprowadzono na skrawkach, w których w astrocytach wykazano ekspresję ATeam1.03YEMK. W przeciwieństwie do obserwacji w neuronach, astrocyty zareagowały na wzrost stężenia potasu zewnątrzkomórkowego odwracalnym wzrostem stosunku FRET dla ATeam, co wskazuje na wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego ATP (n = 70 komórek w N = 5 skrawkach) (Rysunek 9B). Następna ekspozycja na niedokrwienie chemiczne spowodowała, zgodnie z oczekiwaniami, znaczny spadek stosunku FRET dla ATeam, co świadczy o nominalnym wyczerpaniu wewnątrzkomórkowego ATP (Rysunek 9B).

Dyskusja

Tutaj demonstrujemy procedurę specyficznej dla typu komórki ekspresji ATeam1.03YEMK, opartego na FRET, genetycznie kodowanego nanoczujnika14, do pomiaru zmian poziomów ATP w astrocytach lub neuronach w organotypowych kulturach warstw tkanki mózgu myszy15. W przykładowych nagraniach pokazujemy, że wzrost stężenia potasu w zewnątrzkomórkach nie powoduje zmiany stężeń ATP w neuronach, podczas gdy poziomy astrocytarnego ATP rosną w odpowiedzi na tę manipulację. Co więcej, nasze wyniki pokazują, że po zahamowaniu metabolizmu komórkowego stosunek ATeam1.03YEMK FRET gwałtownie spada w obu typach komórek, co wskazuje na szybki spadek wewnątrzkomórkowego ATP.

Ekspresja ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach plastrów wymaga utrzymania tkanki w kulturze w kontrolowanych warunkach przez co najmniej 7-10 dni. Alternatywnie, ATeam1.03YEMK może być również stosowany do pomiaru ATP w ostro izolowanych wycinkach tkanki mózgowej oraz w nerwach wzrokowych myszy13,15. Pomiary w ostro izolowanej tkance wymagają jednak generacji transgenicznych zwierząt lub stereotaktycznego zastosowania wektorów wirusowych do mózgu, co wiąże się z eksperymentami na zwierzętach i ścisłymi protokołami opieki nad zwierzętami. W związku z tym ekspresja ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych tkanek stanowi użyteczną i cenną alternatywę 22,23. Od wielu lat organotypowe kultury warstwowe tkanek służą jako uznany system modelowy do badania właściwości neuronalnych, łączności i rozwoju 24,25,26. Nie tylko utrzymują one ogólną architekturę tkanek i laminację (ryc. 1), ale także posiadają preferencyjne właściwości kultur komórkowych, takie jak doskonała dostępność i bezpośrednia kontrola warunków eksperymentalnych. Organotypowe kultury warstw tkanek są również rutynowo wykorzystywane do ekspresji obcych genów za pomocą wektorów wirusowych27. Doniesiono, że kilka typów wektorów wirusowych dostarcza transgeny do tkanki mózgowej16,28. Wektory adenowirusowe indukują wysoką ekspresję w komórkach glejowych, ale nie w neuronach hipokampa16 i mogą generować reaktywność glejową17. Wektory wirusowe związane z adenowirusami, takie jak stosowane w tym artykule, pojawiają się jako dobra alternatywa15, a ich skuteczność wykazano również in vivo29.

Chociaż są one wykorzystywane głównie do badania właściwości neuronalnych, ostatnie badania wykazały, że organotypowe kultury warstw tkanek mogą być również wykorzystywane do analizy astrocytów. Wyhodowane wycinki są zwykle pokryte warstwą reaktywnych astrocytów19,30 (ryc. 5), ale astrocyty wykazują bardziej natywną, niereaktywną morfologię i cytoarchitekturę w głębszych warstwach19,30 (ryc. 5). W niniejszej pracy opisano procedurę mechanicznego usuwania zewnętrznej blizny glejowej, która skutkuje lepszą dostępnością doświadczalną i optyczną astrocytów natywnych w obrębie właściwych organotypowych warstw tkankowych. Co więcej, jego usunięcie poprawia skuteczność ekspresji w głębszych warstwach plastrów organotypowych; jeśli blizna glejowa nie zostanie usunięta, transdukcja przez AAV może być ograniczona do powierzchownych warstw komórek.

Podczas przeprowadzania eksperymentów na wycinkach tkanek należy wziąć pod uwagę kilka zewnętrznych czynników mechanicznych. Zmiana prędkości perfuzji w kąpieli może indukować ruchy całego preparatu i/lub wywoływać zmiany ostrości, powodując sztuczne przejściowe zmiany sygnału czujnika. Co więcej, doniesiono, że zarówno astrocyty, jak i neurony reagują na deformacje mechaniczne, takie jak narzucone przez wysokie szybkości perfuzji32,33. W naszych rękach zastosowanie niezawodnej pompy perystaltycznej wraz z utrzymywaniem małych i stabilnych objętości soli fizjologicznej między tkanką a obiektywem (łąkotką) skutkuje stabilnym sygnałem FRET w warunkach wyjściowych przy zastosowanej tutaj prędkości perfuzji (1,5-2,5 ml/min; Rysunek 8).

W niniejszym badaniu wykazaliśmy również, że obrazowanie oparte na FRET za pomocą ATeam1.03YEMK może być stosowane do monitorowania poziomów ATP w neuronach i astrocytach. Alternatywnym sposobem wprowadzonym wcześniej do pomiaru komórkowego ATP jest tzw. test lucyferyna-lucyferazy 34,35,36,37. Podejście to opiera się jednak na obrazowaniu bioluminescencji i zapewnia jedynie raczej niską rozdzielczość czasową i przestrzenną, częściowo ze względu na wysoki poziom szumów tła. Inną metodą rutynowo stosowaną w ostatnich latach było obrazowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia magnezu za pomocą wrażliwego na jony fluoroforu magnezu 38,39,40. Podejście to odnosi się do obserwacji, że spożycie ATP powoduje uwolnienie jego kofaktora magnezu. Obrazowanie z użyciem zieleni magnezowej zapewnia zatem jedynie wtórne oszacowanie zmian poziomów ATP. Co więcej, zieleń magnezowa jest również wrażliwa na zmiany wewnątrzkomórkowego wapnia, co wprowadza kolejną trudność przy interpretacji wyników uzyskanych tą metodą.

Niedawny rozwój genetycznie kodowanych nanoczujników do bezpośredniego obrazowania metabolitów komórkowych stanowił zatem duży krok naprzód11,12. Wygenerowano kilka różnych czujników, które można wykorzystać do pomiaru wewnątrzkomórkowego ATP 36,41,42,43. Należą do nich ratiometryczny fluorescencyjny wskaźnik ATP "QUEEN"41, a także PercevalHR, który wykrywa stosunek ATP:ADP42. O ile ta ostatnia sonda jest cennym narzędziem do badania stanu energetycznego komórek, o tyle wymaga jednoczesnego pomiaru zmian pH42.

ATeam to nanosensor, w którym istnieje kilka wariantów, które – między innymi – różnią się powinowactwem do wiązania ATP14. In vitro ATeam1.03YEMK wykazuje Kd 1,2 mM w temperaturze 37 °C, co jest zbliżone do komórkowych poziomów ATP określonych w różnych typach komórek neuronalnych, od podwzgórza i móżdżku34 do hipokampa 37,44,45. W pomiarach kuwetowych obniżenie temperatury o 10 °C spowodowało znaczny spadek powinowactwa wiązania ATeam1.03YEMK do ATP, co sugeruje, że może nie być idealny do obrazowania komórkowego w temperaturze pokojowej14. Nasze wcześniejsze badaniewykazało jednak, że zachowanie i odpowiedź ATeam1.03YEMK wyrażanego w neuronach i astrocytach na różne manipulacje jest podobna w temperaturze zbliżonej do fizjologicznej i pokojowej, co wskazuje, że czujnik umożliwia wiarygodne określenie wewnątrzkomórkowych poziomów ATP w obu warunkach. Ponadto nasze poprzednie eksperymenty dotyczyły wrażliwości na pH ATeam1.03YEMK wyrażanego w komórkach15, wykazując, że jest on niewrażliwy na zmiany wewnątrzkomórkowego pH o około 0,1-0,2 jednostki pH. Jeśli Kd w niskim zakresie mM jest problemem, można zastosować alternatywne warianty ATeam14, w tym warianty ATeam z przesunięciem ku czerwieni ("GO-ATeam")43.

Nasze eksperymenty z użyciem ATeam1.03YEMK pokazują, że wzrost zewnątrzkomórkowego stężenia potasu tylko o kilka mM (od 3 do 8 mM) powoduje przejściowy wzrost stosunku ATeam1,03YEMK w astrocytach w organotypowej kulturze warstwowej. Obserwacja ta potwierdza wcześniejsze badania15,46 i jednoznacznie wskazuje, że astrocyty reagują na uwalnianie potasu przez aktywne neurony wzrostem ich produkcji ATP, najprawdopodobniej w wyniku stymulacji odpowiednio Na+/K+-ATPazy i kotransportera Na+/HCO 3-47,48. W przeciwieństwie do tego, neurony nie wykazały odpowiedzi, co jest zgodne z wcześniejszymi pracami15. Oba typy komórek jednak szybko i silnie zareagowały na hamowanie glikolizy komórkowej i oddychanie mitochondrialne, jak wykazano powyżej15. W warunkach niedokrwienia chemicznego współczynniki ATeam FRET spadły do nowego stabilnego poziomu, co wskazuje na nominalne wyczerpanie komórkowego ATP. Ten ostatni wynik sugeruje, że zarówno neurony, jak i astrocyty wykazują odpowiednie zużycie ATP również w warunkach stanu stacjonarnego, bez dodatkowej stymulacji przez aktywację synaps lub zastosowanie neuroprzekaźników. Podsumowując, dochodzimy do wniosku, że obrazowanie oparte na fret za pomocą genetycznie kodowanych nanoczujników, w tym ATeam1.03YEMK, zapewni cenne podejście do wyjaśnienia procesów komórkowych, które są odpowiedzialne za zmiany wewnątrzkomórkowych poziomów ATP i komórkowego zużycia ATP w różnych warunkach.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów. Autorzy otrzymali wsparcie finansowe umożliwiające publikację w otwartym dostępie od firmy Nikon Microscope Solutions z Düsseldorfu w Niemczech, która produkuje instrumenty wykorzystane w artykule wideo. Firma nie była zaangażowana ani w projektowanie prezentowanych tu eksperymentów, ani w ich wykonywanie, ani w przetwarzanie danych, ani w pisanie manuskryptów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Claudii Roderigo i Simone Durry za fachową pomoc techniczną. Dziękujemy dr Niklasowi J. Gerkau i M.Sc. Joelowi Nelsonowi za pomoc w przygotowaniu organtypowych kultur plastrowych. Badania w laboratorium autora zostały sfinansowane przez Niemieckie Stowarzyszenie Badawcze (DFG; DLA 2795: Ro 2327/13-1 i SPP 1757: Ro 2327/8-2 do CRR; oraz SPP 1757: Finansowanie start-upu Young Glia dla RL).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-deoksyglukozaAlfa AesarL07338Niemetabolizowany analog glukozy
36-IMA-410-019 Laser argonowyMelles Griot488 nm długość fali
argon Kwas askorbinowyCarl Roth3525.1Przeciwutleniacz, witamina C
pasmowe 483/32AHF Analysentechnik AGFiltry pasmowe kompatybilne z rozdzielaczem
542/27AHF Analysentechnik AGFiltr emmisyjny kompatybilny z rozdzielaczem
Beamsplitter T 455 LPAHF Analysentechnik AGWzbudzenie zwierciadło dichroiczne
Beamsplitter T 505 LPXRAHF Analysentechnik AGSplitter dichroiczny
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy C1Nikon Microscope SolutionsModułowy system mikroskopu konfokalnego C1
Przetwarzanie danych Origin Pro 9.0.0 (64-bit)OriginLab corporationOprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy danych
Monohydrat D-glukozyCaelo2580-1kg
DPBSGIBCO/Life14190250Buforowany fosforanem sól fizjologiczna
Eclipse E 600FNDulbecco Mikroskop pionowy Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 pionowy mikroskopNikon Microscope Solutions
Komora eksperymentalnaniestandardowej konstrukcjiKomora perfuzyjna do obrazowania żywych komórek
EZ-C1 Srebrna wersja 3.91Nikon Microscope SolutionsOprogramowanie do obrazowania do mikroskopu konfokalnego
Zrównoważony roztwór soli HanksaSigma-AldrichH9394z czerwienią fenolową do monitorowania pH
HERAcell 150InkubatorCO2 firmy Thermo Scientific HERAcell ® 150 z procedurą dekontaminacji
Narodowy Instytut ZdrowiaPrzetwarzanie obrazów Oprogramowanie dostępne w domenie publicznej
InsulinaSigma-AldrichI6634Insulina z trzustki bydlęcej
Pompa perystaltyczna serii IPIsmatecPrecyzyjna pompa wielokanałowa
Oprogramowanie do układu, Illustrator CS6AdobeEdytor grafiki wektorowej
L-glutaminaGIBCO/Life
Microm HM 650 VThermo ScientificMikrotom wibracyjny. W międzyczasie firma Thermo scientific zaprzestała produkcji urządzenia. Każda inna krajalnica lub rozdrabniacz do tkanek, który można nadawać do krojenia żywej tkanki, również jest w porządku.
Niestandardowa konstrukcjastolika mikroskopu
Microsoft Excel 16Arkuszdo podstawowego przetwarzania danych
Wkładka do hodowli MillicellMerck MilliporePICM0RG50Hydrofilizowany PTFE, wielkość porów 0,4 i mu; m
Minimum Essential Medium EagleSigma-AldrichM7278Syntetyczne podłoże do hodowli komórkowych
Monochromator Polychrome VThermo Scientific/FEIUltra szybko przełączający monochromator
NaN3 (Azek sodu)Sigma-AldrichS-8032Inhibitor mitochondriów (inhibitor kompleksu IV). UWAGA: Azydek jest toksyczny. Należy pamiętać, aby przypadkowo go nie połknąć ani nie wdychać i zapobiec jego wchłanianiu przez skórę.
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0Nikon Microscope SolutionsMikroskop zanurzeniowy w wodzie Obiektyw
NIS Elements 4.50 zaawansowane badaniaNikon Microscope SolutionsOprogramowanie do obrazowania. Ulepszona wersja do obrazowania FRET
ORCA-Flash4.0Hamamatsu PhotonicsCyfrowa kamera CMOS
perfuzyjnaPro Liquid GmbHRurka Tygon, 1,52 x 322 mm (szer.: 0,85)
Photoshop CS 6 wersja 13.0AdobeOprogramowanie do przetwarzania obrazu
L-mleczan soduSigma-Aldrich71718-10G
ssAAV-2/2- hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)ETH Zü bogatyv244Jednoniciowy wektor AAV, który indukuje ekspresję ATeam1.03YEMK< / sup> pod kontrolą ludzkiego fragmentu promotora synapsyny 1 hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)ETH Zü bogatyv307Jednoniciowy wektor AAV, który indukuje ekspresję ATeam1.03YEMK pod kontrolą ludzkiego fragmentu promotora fibrylarnego białka glejowego ABC1D.
WVIEW System optyczny GEMINIHamamatsu PhotonicsEmission Image Splitter
filtry firmy o HERAsafe KS/KSP Szafa bezpieczeństwa Thermo Scientific Surowica dla koni GIBCO/Life 26050088 Inaktywowane termicznie oprogramowanie Huygens Professional SVI Imaging Deconvolution Obraz J 1.52i Wayne'a Rasbana 25030024 kalkulacyjny Microsoft Rurka

Bibliografia

  1. Sweadner, K. J. Isozymes of the Na+/K+-ATPase. Biochimica et Biophysica Acta. 988, 185-220 (1989).
  2. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
  3. Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends in Biochemical Sciences. 40, 611-622 (2015).
  4. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75, 762-777 (2012).
  5. Brown, A. M., Ransom, B. R. Astrocyte glycogen and brain energy metabolism. Glia. 55, 1263-1271 (2007).
  6. Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na+,K+-ATPase and glycogenolysis for K+ homeostasis in mammalian brain. Journal of Neuroscience Research. 93, 1019-1030 (2015).
  7. Allaman, I., Belanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: For better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, 76-87 (2011).
  8. Barros, L. F., Deitmer, J. W. Glucose and lactate supply to the synapse. Brain Research Reviews. 63, 149-159 (2010).
  9. Diaz-Garcia, C. M., et al. Neuronal Stimulation Triggers Neuronal Glycolysis and Not Lactate Uptake. Cell Metabolism. 26, 361-374 (2017).
  10. Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97, 946-960 (2019).
  11. Barros, L. F., et al. Current technical approaches to brain energy metabolism. Glia. 66, 1138-1159 (2018).
  12. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Optogenetic reporters: Fluorescent protein-based genetically encoded indicators of signaling and metabolism in the brain. Progress in Brain Research. 196, 235-263 (2012).
  13. Trevisiol, A., et al. Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts. eLife. 6, e24241(2017).
  14. Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15651-15656 (2009).
  15. Lerchundi, R., et al. FRET-based imaging of intracellular ATP in organotypic brain slices. Journal of Neuroscience Research. , 1-13 (2018).
  16. Ehrengruber, M. U., et al. Gene transfer into neurons from hippocampal slices: comparison of recombinant Semliki Forest Virus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, and measles virus. Molecular and Cellular Neurosciences. 17, 855-871 (2001).
  17. Woo, J., et al. Functional Characterization of Resting and Adenovirus-Induced Reactive Astrocytes in Three-Dimensional Culture. Experimental Neurobiology. 26, 158-167 (2017).
  18. Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Laboratory Animals. 31, 1-32 (1997).
  19. Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141, 41-53 (2005).
  20. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9, 1623(2018).
  21. Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. The Journal of Comparative Neurology. 462, 241-251 (2003).
  22. Frotscher, M., Zafirov, S., Heimrich, B. Development of identified neuronal types and of specific synaptic connections in slice cultures of rat hippocampus. Progress in Neurobiology. 45, vii-xxviii (1995).
  23. Galimberti, I., et al. Long-term rearrangements of hippocampal mossy fiber terminal connectivity in the adult regulated by experience. Neuron. 50, 749-763 (2006).
  24. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  25. Forster, E., Zhao, S., Frotscher, M. Laminating the hippocampus. Nature Reviews. Neuroscience. 7, 259-267 (2006).
  26. Holopainen, I. E. Organotypic Hippocampal Slice Cultures: A Model System to Study Basic Cellular and Molecular Mechanisms of Neuronal Cell Death, Neuroprotection, and Synaptic Plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
  27. Teschemacher, A. G., et al. Targeting specific neuronal populations using adeno- and lentiviral vectors: applications for imaging and studies of cell function. Experimental Physiology. 90, 61-69 (2005).
  28. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  29. Mächler, P., et al. In Vivo Evidence for a Lactate Gradient from Astrocytes to Neurons. Cell Metabolism. 23, 94-102 (2016).
  30. Schreiner, A. E., Berlinger, E., Langer, J., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Lesion-Induced Alterations in Astrocyte Glutamate Transporter Expression and Function in the Hippocampus. ISRN Neurology. 2013, 893605(2013).
  31. Haber, M., Zhou, L., Murai, K. K. Cooperative astrocyte and dendritic spine dynamics at hippocampal excitatory synapses. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 8881-8891 (2006).
  32. Neary, J. T., Kang, Y., Tran, M., Feld, J. Traumatic injury activates protein kinase B/Akt in cultured astrocytes: role of extracellular ATP and P2 purinergic receptors. Journal of Neurotrauma. 22, 491-500 (2005).
  33. Xia, J., et al. Neurons respond directly to mechanical deformation with pannexin-mediated ATP release and autostimulation of P2X7 receptors. The Journal of Physiology. 590, 2285-2304 (2012).
  34. Ainscow, E. K., Mirshamsi, S., Tang, T., Ashford, M. L., Rutter, G. A. Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels. The Journal of Physiology. 544, 429-445 (2002).
  35. Arcuino, G., et al. Intercellular calcium signaling mediated by point-source burst release of ATP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 9840-9845 (2002).
  36. Rajendran, M., Dane, E., Conley, J., Tantama, M. Imaging Adenosine Triphosphate (ATP). The Biological Bulletin. 231, 73-84 (2016).
  37. Rangaraju, V., Calloway, N., Ryan, T. A. Activity-driven local ATP synthesis is required for synaptic function. Cell. 156, 825-835 (2014).
  38. Chatton, J. Y., Pellerin, L., Magistretti, P. J. GABA uptake into astrocytes is not associated with significant metabolic cost: implications for brain imaging of inhibitory transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12456-12461 (2003).
  39. Magistretti, P. J., Chatton, J. Y. Relationship between L-glutamate-regulated intracellular Na+ dynamics and ATP hydrolysis in astrocytes. Journal of Neural Transmission (Vienna). 112, 77-85 (2005).
  40. Langer, J., et al. Rapid sodium signaling couples glutamate uptake to breakdown of ATP in perivascular astrocyte endfeet. Glia. 65, 293-308 (2017).
  41. Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522(2014).
  42. Tantama, M., Martinez-Francois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nature Communications. 4, 2550(2013).
  43. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ Regulation of Mitochondrial ATP Synthesis Visualized at the Single Cell Level. ACS Chemical Biology. 6, 709-715 (2011).
  44. Mollajew, R., Toloe, J., Mironov, S. L. Single KATP channel opening in response to stimulation of AMPA/kainate receptors is mediated by Na+ accumulation and submembrane ATP and ADP changes. The Journal of Physiology. 591, 2593-2609 (2013).
  45. Pathak, D., et al. The Role of Mitochondrially Derived ATP in Synaptic Vesicle Recycling. The Journal of Biological Chemistry. 290, 22325-22336 (2015).
  46. Karus, C., Mondragao, M. A., Ziemens, D., Rose, C. R. Astrocytes restrict discharge duration and neuronal sodium loads during recurrent network activity. Glia. 63, 936-957 (2015).
  47. Larsen, B. R., Stoica, A., MacAulay, N. Managing Brain Extracellular K+ during Neuronal Activity: The Physiological Role of the Na+/K+-ATPase Subunit Isoforms. Frontiers in Physiology. 7, 141(2016).
  48. Ruminot, I., et al. NBCe1 mediates the acute stimulation of astrocytic glycolysis by extracellular K+. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14264-14271 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar ATPsensor FRETplastry organotypowetransdukcja AAVobrazowanie fluorescencyjneniedokrwienie chemicznestymulacja potasemneurony i astrocytyenergia kom rkowa

Powiązane artykuły