Artykuł metodologiczny

Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów

18.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60296

⸱

3 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology and Neuropathology, Golgi-Cenci Foundation, 2Laboratory of Neurobiology and Neurogenetic, Golgi-Cenci Foundation, 3Department of Neuropsychology and Social Sciences, Golgi-Cenci Foundation, 4Department of Rehabilitation, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, 5Genomic and Post-Genomic Center, IRCCS Mondino Foundation, 6Department of Brain and Behavioral Sciences, University of Pavia, 7Department of Pathology, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, 8Department of Neurological Science, IRCCS Mondino Foundation, University of Pavia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program dawstwa mózgu i właściwą charakterystykę mózgów. Dawcy mózgu biorą udział w długoterminowym badaniu podłużnym, w tym w seryjnych ocenach wielowymiarowych. Protokół zawiera szczegółowy opis przetwarzania przez mózg i dokładną metodologię diagnostyczną.

Streszczenie

W stale starzejącej się populacji, częstość występowania zaburzeń neurodegeneracyjnych ma wzrosnąć. Zrozumienie mechanizmów choroby jest kluczem do znalezienia środków zapobiegawczych i leczniczych. Najskuteczniejszym sposobem, aby to osiągnąć, jest bezpośrednie badanie chorej i zdrowej tkanki mózgowej. Autorzy przedstawili protokół pozyskiwania, przetwarzania, charakteryzowania i przechowywania dobrej jakości tkanki mózgowej pobranej od osób zarejestrowanych w programie dawstwa mózgu antemortem. Program dawstwa obejmuje bezpośrednie empatyczne podejście do ludzi, zbiór uzupełniających się informacji klinicznych, biologicznych, społecznych i dotyczących stylu życia oraz seryjne wielowymiarowe oceny w czasie w celu śledzenia indywidualnych trajektorii normalnego starzenia się i pogorszenia funkcji poznawczych. Ponieważ wiele chorób neurologicznych jest asymetrycznych, nasz bank mózgów oferuje unikalny protokół krojenia świeżych próbek. Wycinki mózgu obu półkul są na przemian zamrażane (w temperaturze -80 °C) lub utrwalane w formalinie; Stały wycinek na jednej półkuli odpowiada zamrożonemu na drugiej półkuli. Dzięki takiemu podejściu można uzyskać pełną charakterystykę histologiczną całego zamrożonego materiału, a badania omiczne można przeprowadzić na dobrze zdefiniowanych histologicznie tkankach z obu półkul, oferując w ten sposób pełniejszą ocenę mechanizmów choroby neurodegeneracyjnej. Prawidłowe i jednoznaczne rozpoznanie tych chorób można osiągnąć tylko poprzez połączenie zespołu klinicznego z oceną neuropatomorfologiczną, która często dodaje ważnych wskazówek etiologicznych niezbędnych do interpretacji patogenezy. Ta metoda może być czasochłonna, kosztowna i ograniczona, ponieważ obejmuje tylko ograniczony obszar geograficzny. Niezależnie od jego ograniczeń, wysoki stopień charakteryzacji, jaki zapewnia, może być satysfakcjonujący. Naszym ostatecznym celem jest stworzenie pierwszego włoskiego Banku Mózgu, przy jednoczesnym podkreśleniu znaczenia neuropatologicznie zweryfikowanych badań epidemiologicznych.

Wprowadzenie

Według WHO, około 50 milionów ludzi cierpi obecnie na demencję, a liczba ta ma się potroić do 2050 roku. Choroba Alzheimera jest główną przyczyną demencji, a następnie choroby naczyń mózgowych i inne zaburzenia neurodegeneracyjne związane z wiekiem. W 2017 roku WHO opracowała Globalne Obserwatorium Demencji, aby zwiększyć świadomość na temat demencji i zachęcić do globalnego planu działania przeciwko niej1. Każda osoba ma swoją własną trajektorię starzenia się mózgu, dlatego poszukiwanie lekarstwa może być trudne ze względu na złożoność patogenezy chorób neurodegeneracyjnych. Być może każda osoba posiada własną patogenezę zapisaną w tkance mózgowej, wymagającą spersonalizowanego podejścia. Tym samym badanie tkanki mózgowej będzie kluczem do zrozumienia mechanizmów neurodegeneracji.

Patrząc wstecz na historię neuronauki, zdajemy sobie sprawę, że najbardziej imponujące i przełomowe odkrycia nigdy nie mogłyby mieć miejsca bez bezpośredniego zbadania ludzkiego mózgu. Z biegiem czasu źródło tkanki mózgowej, która ma być badana, zmieniło się z prymitywnych sekcji, przypadkowych "przypadkowych spotkań" i, w niektórych przypadkach, nielegalnego handlu, na zorganizowane kolekcje mózgów i strategiczne nowoczesne banki mózgów. Uwzględnienie wielu aspektów etycznych jest jednym z głównych czynników odróżniających współczesne banki mózgów od zbiorów mózgów z przeszłości. Pierwsze prawdziwe nowoczesne banki mózgów (BB) zostały założone w drugiej połowieXX wieku. Nicholasa Cornellisa i Wallace'a Tourtelotte'a można uznać za pionierów nowoczesnego bankowania mózgów. W Wielkiej Brytanii Corsellis zgromadził kolekcję zawierającą ponad 1000 dobrze udokumentowanych mózgów dotkniętych różnymi zaburzeniami psychicznymi i neurologicznymi2. Co więcej, Corsellis pomógł ujawnić potrzebę zachowania świeżej tkanki mózgowej w lodzie na potrzeby badań biochemicznych3. W tym samym czasie w Stanach Zjednoczonych Wallace Tourtelotte wprowadził programy dawstwa mózgu antemortem, aby ułatwić pozyskiwanie potencjalnych dawców mózgu i zapewnić, że pobrane mózgi są opatrzone pełną historią medyczną i neurologiczną4,5. Aby zapoznać się z historycznym przeglądem kolekcji mózgów i współczesnych kulek, zobacz Carlos et al.6.

Więc, dlaczego wciąż potrzebujemy ludzkich mózgów? Ostateczne rozpoznanie chorób mózgu można postawić dopiero po przeprowadzeniu badania neuropatologicznego. Neuropatologia stanowi wyzwanie dla rozpoznania klinicznego i jest kluczem do prawidłowej interpretacji objawów klinicznych oraz do odkrycia histologicznych podstaw nowych wariantów syndromicznych. Rzeczywiście, diagnozę można przedefiniować na podstawie obrazu patologicznego. Niemniej jednak wskaźnik autopsji spadł w ostatnich dziesięcioleciach ze względu na niedawny rozwój innowacyjnych technik neuroobrazowania. Dzięki obrazowaniu mózgu można ocenić in vivo morfologiczne, funkcjonalne i metaboliczne zmiany w mózgu, a także zakres nieprawidłowego fałdowania białek. Jednak neuroobrazowanie in vivo i inne badania biomarkerów mogą dać jedynie "oszacowanie" obrazu patologicznego, ponieważ nie są w stanie wykryć subtelnych zmian komórkowych i molekularnych. Postępy w obrazowaniu molekularnym i odkrycie nowych biomarkerów, cząsteczek docelowych i znaczników7 (np. amyloid, TAU, znaczniki mikrogleju) sprawiają, że ludzki mózg jest jeszcze bardziej niezbędny do interpretacji danych uzyskanych z ocen klinicznych i testów biomarkerów. Co więcej, technologie omiczne (genomika, epigenomika, transkryptomika, metabolomika, proteomika, lipidomika itp.), przeprowadzone na świeżej i zamrożonej tkance mózgowej, otworzyły nowe możliwości zrozumienia mechanizmów choroby i odkrycia genów ryzyka, nowych markerów diagnostycznych i prognostycznych oraz potencjalnych celów leków8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

Dla tych celów, nowoczesne BBs archiwizują dobrze scharakteryzowane, wysokiej jakości tkanki mózgowe, udostępniając je społeczności naukowej3,24. Do mózgów dostarczanych przez kulki powinien być dołączony pełny wywiad kliniczny. Działalność BB obejmuje: (1) Rozpoznawanie i rekrutację osób chorych i zdrowych do programów dawstwa mózgu; Idealnym warunkiem byłoby osiągnięcie multidyscyplinarnej obserwacji dawców przez całe życie w celu uzyskania pełnego wywiadu klinicznego, stylu życia i historii społecznej oraz profili biomarkerów; Rzeczywiście, rezerwa poznawcza i struktura mózgu zależą od stylu życia i czynników społeczno-edukacyjnych25,26, więc te informacje wzbogacają całość dostępnych danych. (2) Pozyskanie mózgu (składającego się z mózgu, móżdżku i pnia mózgu) oraz tkanek pokrewnych (np. rdzenia kręgowego, nerwów czaszkowych i zwojów mózgowych itp.) po śmierci dawcy, przy jednoczesnym przestrzeganiu znormalizowanych przepisów prawnych i etycznych. (3) Odpowiednie przetwarzanie (rozwarstwienie, utrwalenie, zamrożenie) mózgu, zgodnie z definicją zawartą w znormalizowanym protokole operacyjnym, w celu uzyskania wysokiej jakości tkanki i umożliwienia jej wykorzystania w przyszłości w badaniach multidyscyplinarnych. (4) Szczegółowa charakterystyka neuropatologiczna zapewniająca ostateczną ostateczną ostateczną diagnozę. (5) Przechowywanie i dystrybucja materiału tkankowego do społeczności naukowej27,28.

Wszystkie kulki przechowują zarówno zamrożone, jak i zatopione w formalinie tkanki parafinowe. Każda kulka ma swój własny protokół. Z wyjątkiem konkretnych badań, takich jak protokół cięcia dwupółkulowego Instytutu Badań Biomedycznych (New Jersey)29 oraz badanie Deramecourt's patologii naczyń mózgowych30, największe kulki na świecie po prostu przecinają mózg, móżdżek i pień mózgu wzdłuż linii środkowej (płaszczyzny strzałkowej). Jedna połowa jest preparowana na świeżo, a następnie zamrażana do badań biochemicznych, podczas gdy druga jest utrwalana w formalinie w celu oceny histopatologicznej. Tak więc analizy biochemiczne i histopatologiczne przeprowadza się osobno na każdej półkuli. Decyzja o tym, która strona jest nieruchoma, a która zamrożona (lateralizacja), zależy od liczby pojedynczej bank31,32,33,34,35. Ponieważ wiele chorób neurologicznych jest asymetrycznych, nasz BB oferuje unikalny protokół krojenia świeżych mózgów: sąsiednie sekcje pnia mózgu i każda półkula są na przemian unieruchamiane i zamrażane; Stały wycinek na jednej półkuli odpowiada zamrożonemu na drugiej półkuli. Dzięki tej metodzie optymalizuje się wykorzystanie tkanki mózgowej i można uzyskać pełną charakterystykę histologiczną całego zamrożonego materiału z możliwością uzyskania i porównania informacji histologicznych i biochemicznych ze wszystkich obszarów obu półkul.

Ramy naszego projektu banku mózgów to miasto Abbiategrasso. Abbiategrasso to małe miasteczko położone około 22 km na południowy zachód od Mediolanu, w północnych Włoszech. Liczy około 32 600 mieszkańców. Jest siedzibą Fundacji Golgi-Cenci (GC). GC Foundation jest częścią dużego Geriatrycznego Szpitala Rehabilitacyjnego (ASP Golgi-Redaelli) i jest instytutem skupiającym się na badaniach nad starzeniem się i opieką nad osobami starszymi. W szczególności koncentruje się na badaniu starzenia się psychicznego, czynników społecznych i behawioralnych wpływających na nie oraz biologii i patologii leżących u podstaw zależnych od wieku zaburzeń neuropoznawczych (NCD). W 2009 roku Fundacja GC rozpoczęła nowe badanie podłużne z udziałem 1321 uczestników (z 1644 uprawnionych osób: wskaźnik początkowej odpowiedzi 80,3%) urodzonych w latach 1935-1939 (w wieku 70-75 lat), pochodzenia kaukaskiego, mieszkających na tym samym małym obszarze geograficznym. Badanie zostało nazwane InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; w języku angielskim: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) i jest obecnie w toku. Planuje się, że w ramach projektu InveCe.Ab uzyska się kohortę o maksymalnej jednorodności i najmniejszej zmienności w celu oceny występowania, rozpowszechnienia i historii naturalnej demencji, wraz z jej możliwymi czynnikami ryzyka lub czynnikami ochronnymi, w tym zmiennymi behawioralnymi, psychospołecznymi, klinicznymi i biologicznymi36. Charakterystyka kohorty jest pokazana w Rysunek 1 i Tabela 1. Dane epidemiologiczne są zgodne z trendem demencji w populacji europejskiej37,38 i uczestnicy InveCe.Ab mają jednorodne cechy genetyczne i środowiskowe, co stanowi dobry model do badania trajektorii od normalnego starzenia się do zaburzeń neuropoznawczych. Rzeczywiście, jednorodne populacje wymagają mniejszej liczby podmiotów, aby osiągnąć odpowiednią moc statystyczną. Metodologia InveCe.Ab została już opisana w innym miejscu36, ale ważne jest, aby podkreślić jej wielowymiarowe podejście poprzez okresowe kontrole (co 2-3 lata) przy użyciu tego samego zestawu ocen, w tym: pobieranie próbek krwi (panel metaboliczny, homocysteina i witaminy, ekstrakcja DNA w celu profilu apolipoproteiny E (APOE) i innych polimorfizmów genetycznych związanych z funkcjami poznawczymi i starzeniem się), pomiary antropometryczne (waga, wzrost i talia), test mówienia podczas chodzenia (test dwuzadaniowy), wywiad w celu oceny stylu życia (przestrzeganie diety śródziemnomorskiej, poziom aktywności fizycznej i zaangażowanie poznawcze) oraz czynniki społeczne (zaangażowanie społeczne, samotność), ocena neuropsychologiczna i ogólne badanie kliniczne. Porównanie takich danych podłużnych z pośmiertnymi danymi neuropatologicznymi miałoby kluczowe znaczenie dla badań. Dlatego nasz zespół, a w szczególności dr Michela Mangieri, opracował wspomniane powyżej podejście neuropatologiczne. Od 2014 r., podczas drugiej obserwacji, uczestnicy projektu InveCe.Ab byli proszeni o oddanie swoich mózgów, co doprowadziło do powstania Banku Mózgu Abbiategrasso (ABB). Głównymi darczyńcami ABB są uczestnicy InveCe.Ab, ale ABB jest teraz otwarta na innych darczyńców-wolontariuszy. Są to pacjenci z ASP Golgi-Redaelli, gdzie przebywa kilku pacjentów cierpiących na różne choroby neurologiczne lub dorośli ochotnicy, którzy dowiadują się o projekcie ABB i należą do tego samego obszaru geograficznego (Abbiategrasso i okolice). Wszyscy dawcy są poddawani temu samemu protokołowi oceny.

Autorzy proponują metodę śledzenia indywidualnych trajektorii normalnego starzenia się i możliwego postępu do chorób niezakaźnych, a także dokładnego zarządzania, przetwarzania i charakteryzowania mózgów nabytych od takich dawców, śledzonych podłużnie. Ponadto naszym celem jest spotykanie się i angażowanie osób w okresowe oceny neurologiczne, seminaria i działania edukacyjne dotyczące dobrostanu mózgu oraz zwiększanie ich świadomości na temat dawstwa mózgu w celach badawczych.

Protokół

Zgodnie z Komitetem ds. Etyki Badań Naukowych naszej instytucji oraz Kodeksem Postępowania BNE, ABB wykonuje swoje działania zgodnie ze standardami etycznymi39,40. Procedura pobierania próbek mózgu została przedłożona i zatwierdzona przez Komisję Etyki Uniwersytetu w Pawii w kontekście badania InveCe.Ab 36. Procedury badawcze były zgodne z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 r. i późniejszymi zmianami. Formularz zgody jest kompletny i łatwo zrozumiały. Dołączenie do programu darowizn jest osobistą decyzją i potrzebna jest pełna świadomość. W przypadku, gdy dana osoba nie zostanie uznana za kompetentną do podpisania formularza zgody, wymagana jest autoryzacja od opiekuna prawnego lub najbliższej rodziny (NOK). W Tabeli 2 przedstawiono kryteria włączenia i wykluczenia dawstwa mózgu. Badania zostały przeprowadzone pod nadzorem Federazione Alzheimer Italia.

1. Rekrutacja do programu dawstwa mózgu

  1. Zwołaj osoby, które wyraziły zainteresowanie dawstwem mózgu oraz ich NOK i/lub opiekuna prawnego, aby przedstawić projekt (zakres programu dawstwa; proces usuwania, konserwacji, wykorzystywania i dystrybucji mózgu), prawo do wycofania się z programu w dowolnym momencie, ochronę anonimowości oraz strategie działania. Omów możliwość przeprowadzenia dodatkowych badań biomarkerów i testów genetycznych. Zwróć uwagę na życzenia potencjalnego dawcy lub jego NOK, aby być poinformowanym o wynikach.
  2. Wyjaśnij wszystkie aspekty ekonomiczne, w tym brak korzyści finansowych zarówno dla Fundacji, jak i darczyńcy (mózgi są oddawane i dystrybuowane w sposób altruistyczny). Poinformuj ich, że ABB pokrywa koszty transportu ciała, podczas gdy rodzina pokrywa koszty pogrzebu, pochówku lub kremacji.
  3. W przypadku przyjęcia darowizny należy uzyskać podpis zgody na udział w programie darowizn. Nadaj dawcy indywidualny kod numeryczny, aby zagwarantować anonimowość. Zapisz numer identyfikacyjny osób biorących udział w badaniu podłużnym i podaj inny kod dla banku mózgu, aby łatwo oddzielić dwie podgrupy dawców (uczestników lub osoby nieuczestniczące w badaniu podłużnym; zob. tabela 3).
  4. Przekaż dawcy kartę identyfikacyjną, która deklaruje jego status jako dawcy i wyświetla numer telefonu (dostępny 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu), aby powiadomić Bank Mózgu o jego śmierci.

2. Ocena dawców i seryjne działania następcze

UWAGA: Możliwe jest wyrażenie zgody tylko na niektóre, a nie wszystkie, z niżej wymienionych egzaminów. Wszystkie oceny kliniczne są wykonywane przez ten sam zespół, w skład którego wchodzi neurolog, geriatra z doświadczeniem w neurologii i 3 psychologów. Jeśli pojawią się nowe objawy lub pogorszenie funkcji poznawczych postępuje, odstęp czasu między wizytami kontrolnymi może zostać skrócony.

  1. Podobnie jak w przypadku badania InveCe.Ab, należy uzyskać kwestionariusz stylu życia i społeczny, obejmujący stopień autonomii (ADL, IADL), osobiste nawyki, czynniki społeczne i styl życia, które mogą wpływać na funkcje umysłowe. Zbieraj historię rodzinną, medyczną i neurologiczną wraz z informacjami dotyczącymi chorób genetycznych, infekcyjnych, toksycznych, metabolicznych, autoimmunologicznych, sercowo-naczyniowych, pourazowych, zwyrodnieniowych, nowotworowych i neurologicznych. Zbierz poprzednie badania kliniczne i wymień leczenie farmakologiczne.
  2. Przeprowadź obszerną ocenę neuromotoryczną, w tym testy funkcji nerwów czaszkowych, dna oka, pola widzenia, siły i tonu mięśni, wrażliwości, odruchów ścięgnistych, odruchów eksteroceptywnych i prymitywnych, objawów oponowych, postawy, chodu, ruchów, koordynacji, funkcji zwieraczy oraz jakiejkolwiek obecności objawów ogniskowych lub Babińskiego. Oceń język, stan psychiczny i wszelkie zmiany w zachowaniu.
  3. Przeprowadź obszerną ocenę neuropoznawczą, w tym poznanie globalne i pełną ocenę neuropsychologiczną określonych domen poznawczych: pamięci werbalnej i wzrokowej, uwagi, szybkości psychomotorycznej, języka, pamięci semantycznej, funkcji wykonawczych i zdolności wzrokowo-przestrzennych (szczegóły w tabeli 4). Weź pod uwagę obecność depresji (skala CES-D).
  4. Pobrać próbkę krwi, która jest używana zarówno do analizy biochemicznej krwi (Tabela 5), jak i do izolacji i przechowywania DNA, osocza i komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Określenie genotypowania APOE (rs429358 i rs7412) (bardziej obszerne profilowanie genetyczne zostało określone u uczestników InveCe.Ab; patrz Tabela 6). Zarejestruj EKG (zmiany w sercu, migotanie przedsionków) i elektroencefalogram w stanie spoczynku do analizy ilościowej (QEEG).
  5. Rozważ opcjonalne badanie biomarkerów, w tym płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) TAU, fosfo-TAU i β-amyloidu oraz obrazowanie mózgu (MRI w celu wykrycia in vivo zwyrodnienia, niedokrwienia lub stanu zapalnego; FDG-PET do wykrywania niewydolności metabolicznej; PIB-PET do wykrywania amyloidozy mózgu związanej z patofizjologią choroby Alzheimera).
  6. Zaplanuj kolejny program badań kontrolnych dawcy mózgu. Ustaw przedziały czasowe według różnych grup wiekowych (do 64 lat: co 10 lat, 65–74 lata: co 3 lata, od 75 roku życia: co 2 lata).
  7. Przypisz diagnozę kliniczną i/lub diagnozę neurokognitywną zgodnie z DSM-V. Klasyfikuj stopień zaawansowania klinicznej demencji za pomocą wyniku oceny demencji klinicznej (CDR). Zaktualizuj CDR w ostatnim okresie przed śmiercią.
  8. Przygotuj bazę danych graficznie podobną do papierowej. Wstaw wszystkie zebrane dane do bazy danych Brain Bank. Zaplanuj korektę przez innego urzędnika, aby sprawdzić, czy nie ma błędów.

3. Czas śmierci i usunięcia mózgu

UWAGA: Włoskie prawo stanowi, że asystolia musi trwać dłużej niż 20 minut, aby potwierdzić zgon. Rejestracja płaskiego elektrokardiogramu (EKG) przez co najmniej 20 minut (zwana tanatografią) pozwala na przeprowadzenie sekcji zwłok w ciągu 24 godzin od zgonu (DPR 285/90 art. 8 i ustawa nr 578 z 29 grudnia 1993 r.). Czas analizy pośmiertnej wynoszący <24 godziny jest dobrym celem dla zachowania ogólnej jakości tkanek. W przypadku sekcji zwłok trwającej >30 godzin, sekcja zwłok zostaje anulowana (patrz Tabela 2). Zespół przeprowadzający sekcję zwłok składa się z patologa, neurologa i/lub neurobiologa, pielęgniarki, technika sali anatomicznej oraz wszystkich studentów odbywających staż; Dwaj pierwsi członkowie zespołu przeprowadzają również diagnostykę neuropatomorfologiczną. Podczas obchodzenia się ze zwłokami i ich sekcji obowiązkowe jest stosowanie odpowiedniej odzieży (płaszcz, rękawice, okulary i siatka na włosy). W tej sekcji opisujemy główne narzędzia i sprzęt zwykle używany w naszym laboratorium. Czytelnicy mogą wybrać instrumenty, które mają być używane według własnego uznania. Szczegółowy opis wykorzystanych materiałów znajduje się w Tabeli materiałów.

  1. Upewnij się, że wybrana przez rodzinę agencja pogrzebowa przywiezie ciało do placówek ABB. Wykonaj tanatografię, podczas której czynność serca musi być nieobecna. Jeśli tak, podpisz akt zgonu i rozpocznij procedury autopsyjne.
  2. Przewieź zwłoki do sali sekcji zwłok. Zmierz obwód czaszki na poziomie najszerszej części głowy. Zmierz od nasiona do wcięcia, aby uzyskać średnicę przednio-tylną (APD), podczas gdy odległość od jednego ucha do drugiego daje średnicę poprzeczną (TD). Oblicz wskaźnik głowowy (CI) za pomocą wzoru: CI = TD/APD x 100.
  3. Za pomocą ostrego skalpela wykonaj nacięcie skóry głowy w płaszczyźnie koronalnej, od czubka wyrostka sutkowatego po jednej stronie do drugiej, przechodząc przez wierzchołek. Przetnij włosy, skórę i tkankę podskórną i ostrożnie oddziel dwa fałdy skóry głowy od dolnej części czaszki. Wykonuj nacięcie, aż żółty tłuszcz nadoczodołowy stanie się widoczny i odbije skórę głowy do przodu. Pociągnij drugą część do tyłu.
  4. Za pomocą skalpela i kleszczy pobrać małą próbkę mięśnia skroniowego z każdej strony, umieścić jedną w 4% formaldehydzie, a drugą zamrozić (patrz punkt 7).
  5. Przetnij czaszkę za pomocą piły elektrycznej po nacięciu w kształcie litery V po przedniej stronie. Zdejmij jarmułkę i przetnij opony mózgowe. Próbki opony twardej są utrwalane w 4% formaldehydzie i zamrażane (patrz punkt 7).
  6. Uzyskaj około 10 ml płynu mózgowo-rdzeniowego, wprowadzając igłę o wadze 20 g 3,5 cala przez ciało modzelowate, aby dotrzeć do trzeciej komory. Oceń wygląd, kolor i zmętnienie płynu mózgowo-rdzeniowego i zmierz pH. Następnie należy przygotować 10 porcji po około 1 ml każdy i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
  7. Podnieś mózg delikatnie ciągnąc za oba płaty czołowe i przetnij oba nerwy wzrokowe, lejki nerwu wzrokowego, tętnice szyjne wewnętrzne (ICA) oraz trzeci, czwarty, piąty i szósty nerw czaszkowy. Przeciąć tentorium, aby dotrzeć do tylnego dołu i przeciąć tętnice kręgowe i dolne nerwy czaszkowe. Wbij skalpel jak najgłębiej przez otwór wielki, aby przeciąć najbardziej ogonową część rdzenia. W tym momencie delikatnie usuń cały mózg.
  8. Za pomocą skalpela przebij kość nad jaskinią Meckla i zdobądź ganglion Gassera z obu stron. Umocować jeden ganglion w 4% formaldehydzie, a drugi zamrozić (patrz punkt 7). Złam kostny sella turcica za pomocą młotka chirurgicznego i dłuta, aby usunąć przysadkę mózgową, a następnie utrwalić ją w 4% formaldehydzie.
  9. Sprawdź czaszkę i cały mózg pod kątem zmian makroskopowych i zmian naczyniowych. Za pomocą taśmy mierniczej zmierz mózg, uzyskując średnicę poprzeczną i przednio-tylną. Ostrożnie pobrać krąg Willisa i ocenić go makroskopowo (ryc. 2E) pod kątem obecności wariantów anatomicznych, zmian chorobowych lub zwężenia naczynia.
  10. Weź 1-2 kawałki opon mózgowo-rdzeniowych o długości 2-4cm2 z wypukłości i przechowuj je w kompletnej pożywce hodowlanej Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy Eagle (DMEM) w temperaturze 4 °C zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% pen/paciorkowca, 1% glutaminy i 1% aminokwasów endogennych (jak wcześniej opublikowano, z pewnymi modyfikacjami)41.
    1. W celu uzyskania kultur fibroblastów należy umieścić opony mózgowo-rdzeniowe na 10 cm szalce Petriego i dwukrotnie przemyć roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), za każdym razem wyrzucając płyn.
    2. Za pomocą skalpela i końcówki pipety pokrój opony mózgowe na małe kawałki o średnicy około 2 lub 3 mm, wysiew 3-4 kawałki w każdym dołku 6-dołkowej płytki uprzednio pokrytej żelatyną o stężeniu 0,5% i napełnij każdą studzienkę 2 ml kompletnego podłoża uzupełnionego 1% amfoterycyny B (przeprowadzić przetwarzanie w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zagwarantować sterylność hodowli).
    3. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na co najmniej tydzień i zmieniać zużyte podłoże co 3-4 dni. Trypsynizuj komórki sterylną 1x trypsyną, gdy studzienka znajduje się na około 70% konfluencji. Umieść fibroblasty opon mózgowo-rdzeniowych w kolbie T75 i wypełnij ją 12 ml kompletnej pożywki. Po 5 dniach trypsynizuj i zakonserwuj je w 900 μl FBS i 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).
  11. Oddziel i zbadaj mózg, móżdżek i pień mózgu, a następnie zważ je indywidualnie. Zdejmij szyszynkę i utrwal ją w 4% formaldehydzie. Usuń opuszki węchowe i nerwy wzrokowe i zamocuj lub zamroź po jednej z każdej pary, niezależnie od strony. Trzymaj mózg, móżdżek i pień mózgu w lodzie w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2–4 godziny, aż będą gotowe do sekcji, aby zminimalizować rozerwanie tkanek i zmniejszyć miękkość tkanek.
  12. Po zbiorach zwróć odpowiednią uwagę i troskę o zwłoki. Ponownie przymocuj kość za pomocą kleju super adhezyjnego i zszyj skórę głowy za pomocą igły chirurgicznej i niewchłanialnych szwów.
  13. Okaż szacunek i wdzięczność zmarłej osobie, delikatnie traktując zwłoki. Oczyść i ogol twarz oraz umyj i osusz włosy, ponieważ zwłoki zostaną złożone w otwartej trumnie widocznej dla bliskich.
    UWAGA: Rekompozycja zwłok jest wykonywana przez technika. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Protokół sekcji ABB

UWAGA: Ten sam patolog i/lub neurolog tnie pień mózgu, móżdżek i mózg pod dygestoriami. Neurobiolog układa plastry po pokrojeniu. Stażysta, który nie ma do czynienia z wycinkami mózgu, dokumentuje całą procedurę za pomocą zdjęć, które są przesyłane do bazy danych, aby służyć jako przewodnik podczas kolejnych faz przetwarzania tkanek.

  1. Za pomocą noża preparacyjnego przeciąć pień mózgu osiowo i wykonać pierwsze cięcie na poziomie śródmózgowia rostralnego, przez górny wzgórek, aby uzyskać dwa plasterki odsłaniające istotę czarną (SN).
  2. Wykonaj resztę cięć, aby uzyskać 8 mm plastry pnia mózgu, aby uzyskać około 10 sekcji. Należy uważać, aby uwzględnić nacięcia przechodzące przez most rostralny w pobliżu górnych brzegów czwartej komory, aby obserwować miejsce sinawe (LC) i przez rdzeń przedłużony poniżej prążków akustycznych tuż nad dolnym wierzchołkiem czwartej komory, aby mieć przekroje zawierające grzbietowe jądro ruchowe błędnika (DMNV).
  3. Nazwij wszystkie plasterki w sensie rostrocaudalnym jako BS (pień mózgu), a następnie cyfry arabskie, aby zidentyfikować sekcje. Po ostatnim przekroju pnia mózgu użyj oznaczenia SC (rdzeń kręgowy), a następnie cyfr 1–n. Uzyskuje się około 2-4 wycinków SC w zależności od liczby usuniętych metamerów rdzenia (Rysunek 2H–I).
  4. Oznacz wszystkie sekcje, które mają być na przemian naprawione lub zamrożone, i zrób zdjęcie do archiwum zdjęć (Rysunek 2). Następnie napraw i zamroź wszystkie plasterki zgodnie z poniższym opisem (kroki 4.7 i 4.8).
  5. Przetnij móżdżek na płaszczyźnie strzałkowej, aby oddzielić dwie półkule móżdżku na poziomie robaka. Wykonaj cięcie strzałkowe, aby uzyskać 5 plasterków z każdej półkuli (Rysunek 2F–G).
  6. Nazwij wszystkie plastry z robaka jako CBR lub CBL (odpowiednio dla prawego i lewego móżdżku) i użyj liczb arabskich do identyfikacji sekcji. Oznacz wszystkie sekcje, które mają być naprzemiennie naprawione lub zablokowane, i zrób zdjęcie do archiwum (Rysunek 2). Następnie napraw i zamroź wszystkie plasterki, jak opisano poniżej.
  7. Oddziel dwie półkule mózgu przez ciało modzelowate (Ryc. 2A–B) i przekrój je pojedynczo na płaszczyźnie koronalnej. Wykonaj pierwsze cięcie w płaszczyźnie przechodzącej między skrzyżowaniem wzrokowym a ciałami sutkowymi, przez płat czołowy, biegun skroniowy, przedni zakręt obręczy, spoidło przednie, jądro Meynerta i zwoje podstawy.
  8. Wykonaj drugie cięcie około 1 cm z tyłu, przechodząc przez ciała sutkowe i odsłaniając zwoje podstawy, przednie wzgórze, podwzgórze i ciało migdałowate. Kontynuuj krojenie, aby wyciąć przednie i tylne obszary, aby uzyskać 1 cm plasterki, aby uzyskać od 15 do 20 sekcji na każdą półkulę.
  9. Połóż plastry na płaskiej powierzchni. Ułóż je zgodnie z ich pierwotnym położeniem w kierunku przednio-tylnym, od bieguna czołowego do potylicznego, z częścią ciągłą z poprzednim plasterkiem skierowanym do góry.
  10. Porównując sekcje z obu półkul, wybierz naprzemienne sekcje z każdej półkuli, które mają zostać zachowane jako materiał utrwalony lub zamrożony. Rozpoznaj główne sekcje, które mają zostać naprawione i przetworzone do histopatologii, w tym płaty czołowe i skroniowe, obręcz, zwoje podstawy, jądro podstawne Meynerta, ciało migdałowate, wzgórze, hipokamp i kora śródwęchowa, zakręt potyliczno-skroniowy, płaty ciemieniowe i potyliczne.
  11. Nazwij wszystkie plasterki w sensie przednio-tylnym jako L (po lewej) lub R (po prawej), a następnie cyfry arabskie i umieść etykietę wskazującą, czy plasterek ma być utrwalony, czy zamrożony (Rysunek 2A–D). Aby zidentyfikować sekcje, zrób zdjęcie do archiwum zdjęć. Następnie napraw i zamroź wszystkie plasterki zgodnie z opisem w sekcjach 7 i 8.

5. Badanie mózgu i naczyń krwionośnych oraz makroskopowa ocena patologiczna (gołym okiem)

  1. Przeprowadź ogólne badanie makroskopowe z uwzględnieniem zmian opon mózgowo-rdzeniowych, rozlanego lub zlokalizowanego zaniku kory mózgowej, rozlanego lub zlokalizowanego zaniku kory mózgowej, atrofii hipokampa, powiększenia komór, atrofii móżdżku, atrofii pnia mózgu, istoty czarnej, zmian w istocie czarnej (określić rodzaj i lokalizację).
  2. Zbadaj krąg Willisa pod kątem miażdżycy i okluzji. Przypisz wynik = 1 w obecności miażdżycy bez zwężenia większego niż 50%, wynik = 2, jeśli co najmniej jedna tętnica jest zamknięta w 50% lub więcej, wynik = 3, jeśli dwie lub więcej tętnic jest w 50% lub więcej niedrożnych42. Oceń obecność lub brak patologii w innych naczyniach wewnątrzczaszkowych.
  3. Aby wykryć zmiany naczyniowe w miąższu, zbadaj półkule mózgu, móżdżek i pień mózgu. Rozważ zmiany lakunarne (średnica < 10 mm), zawały niedokrwienne lub krwotoczne oraz krwotok (średnica > 10 mm). Jeśli występuje, określ rozmiar w milimetrach, liczbę i lokalizację. Weź również pod uwagę obecność lub brak krwotoku podpajęczynówkowego.

6. Kontrola jakości tkanek

UWAGA: Wynik czynnika agonalnego (AFS) waha się od 0 do 2 i jest ważny w ocenie jakości tkanek. Aby określić AFS, należy wziąć pod uwagę stany kliniczne występujące w czasie śmierci (szczególnie stany determinujące kwasicę mózgu) i czas trwania stanu agonalnego (nagła śmierć lub przedłużająca się agonia). Jeśli AFS > 1, tkanka mózgowa może nie być optymalnej jakości43. Weź również pod uwagę pH mózgu i płynu mózgowo-rdzeniowego; jeśli pH < 6, tkanka mózgowa może nie być optymalnej jakości43,44.

  1. Sprawdź, czy śmierć została spowodowana stanami, które mogą uszkodzić tkankę mózgową, w tym niedotlenieniem, przedłużającą się kwasicą, wentylacją mechaniczną, niewydolnością wielonarządową, wysoką gorączką, ciężkim urazem czaszki, spożyciem substancji neurotoksycznych, ciężkim odwodnieniem, ciężką hipoglikemią, stanem padaczkowym i przedłużoną śpiączką. Jeśli spełniony jest jeden z tych warunków, przypisz 1 punkt.
  2. Sprawdź czas trwania stanu agonalnego (szybki, jeśli śmierć następuje w ciągu 1 godziny, pośredni, jeśli śmierć następuje między 1 a 24 godzinami, powolny, jeśli stan agonalny trwa dłużej niż 1 dzień). Jeśli zdarzy się pośrednia lub powolna śmierć, przypisz 1 punkt.
  3. Oblicz wynik AFS i zmierz pH płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą elektrody, igły pH, a pH tkanek za pomocą pH-metru powierzchniowego na wycinku mózgu z każdego płata i na odcinku móżdżku.

7. Zamrażanie tkanek

  1. Przechowywać wszystkie tkanki do zamrożenia w lodzie w temperaturze 4 °C. Następnie szybko je zamroź. Umieść je na wstępnie zamrożonej aluminiowej tacy. Przykryj zazębiającą się aluminiową płytą, aby utrzymać je płasko. Umieścić je w ciekłym azocie w temperaturze -120 °C na 3 minuty.
  2. Umieść plastry w plastikowej torbie oznaczonej odpowiednim kodem identyfikacyjnym i numerem plasterka. Podziel plastikowe torby na trzy pudełka kriogeniczne (dla prawej półkuli, lewej półkuli i pnia mózgu) i przechowuj w temperaturze -80 °C.

8. Utrwalenie tkanek

  1. Zawiń plastry w gazę jeden po drugim i włóż je do 10% roztworu formaliny buforowanej fosforanem. Po 1 dniu zastąp roztwór formaliny świeżym roztworem. Pozostawić je na około 5 dni w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C.
  2. Zachowaj wszystkie plasterki jako całość i podziel tylko plasterki zawierające hipokamp i ciało migdałowate na dwie części (Rysunek 3). Górna część obu plastrów będzie zawierała płat czołowy (R10a–L9a w Rysunek 3); dolne części będą zawierały odpowiednio: (1) ciało migdałowate, płat skroniowy i zwoje podstawy (L9b w Rysunek 3B) oraz (2) hipokamp i część płata skroniowego (R10b w Rysunek 3A). Ma to na celu utrzymanie relacji między różnymi strukturami.
  3. Umieść wszystkie sekcje w buforze fosforanowym na co najmniej 2 dni, aby wypłukać i usunąć produkty sieciujące.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

9. Odwodnienie, oczyszczanie, zatapianie parafiny i przygotowanie preparatu

  1. Przygotuj rosnące stężenia alkoholu etylowego od 70% do 100%, ksylen i dwa zestawy stopionego wosku parafinowego. Umieść skrawki mózgu w automatycznym procesorze w celu odwodnienia, procedury oczyszczania i infiltracji parafiny (użyj dwóch różnych protokołów przetwarzania tkanek dla makro (plastry mózgu i móżdżku) i mikropróbek (wycinki pnia mózgu i inne małe próbki); Tabela 7). Osadź tkankę w wosku parafinowym na metalowej lub plastikowej formie.
  2. Wybierz sekcje do pokrojenia, aby ocenić wszystkie obszary zainteresowania przy użyciu wskaźnika Montine'a do charakterystyki neuropatologicznej45 (Tabela 8). Następnie pokrój wybrane sekcje na plasterki.
  3. Do makrosekcji należy używać mikrotomu saneczkowego, a do małych przekrojów mikrotomu obrotowego. Wyciąć 5 μm plastry do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz 8 μm do innych barwień i immunohistochemii. Plastry układamy na trzech różnych rodzajach szkiełek histologicznych: 8,5 cm x 11 cm dla największych plastrów, 5 cm x 7,5 cm dla średnich plastrów i klasycznych 2,5 cm x 7,5 cm dla najmniejszych.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

10. Deparafinizacja, barwienie histologiczne i immunohistochemia (IHC)

  1. Przeprowadzić deparafinowanie, aby umożliwić reakcję z wodnymi roztworami barwników. Wykonaj to za pomocą ksylenu i zmniejszającego stężenia alkoholu (5 minut na każdy krok). Nawadniaj przez 5 minut wodą destylowaną.
  2. Do oceny nieprawidłowości architektonicznych i strukturalnych tkanek oraz morfologii komórek należy użyć następujących barwień histologicznych: H&E (dla mikroskopijnych zmian naczyniowych i stanów zapalnych), Fiolet krezylowy (NISSL; dla utraty neuronów), Luxol Fast Blue (LFB; dla demielinizacji), Gallyas (dla blaszek neurytycznych i nici neuropilowych).
  3. Stosować immunohistochemię (IHC) w celu podkreślenia obecności określonych struktur docelowych. Anty-NeuN i anty-GFAP są używane do identyfikacji przedziałów neuronalnych i glejowych; 4G8, AT8, α-SYN i TDP-43 służą do identyfikacji białek, które agregują się w chorobach neurodegeneracyjnych (tabela materiałów).
    1. Wstępnie potraktuj odparafinowane skrawki 3% H2O2 przez 10 minut, a następnie spłucz w PBS. Przeprowadzić zabieg pobierania buforu cytrynianowego 0,01 M pH 6 (podgrzewany w kuchence mikrofalowej szeregowo przez 2, 1 i 2 minuty) dla antygenów 4G8, α-SYN, TDP-43 i NeuN; użyj 70% kwasu mrówkowego dla 4G8 i α-SYN. Wstępnie inkubuj przez 30 minut w 5% normalnej surowicy koziej.
    2. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem pierwszorzędowym. Następnego dnia przepłukać skrawki w PBS przed inkubacją przeciwciałem drugorzędowym (polimer znakowany Envision+ System-HRP) w rozcieńczeniu 1:2 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    3. Przemyć kilkakrotnie w PBS i inkubować w systemie chromogenowym z diaminobenzydyną (Liquid DAB+Substrate Chromogen System), obserwując rozwój reakcji pod mikroskopem (powiększenie 4–10x). Na koniec umyj sekcje w PBS. Przeciwbarwić skrawki w hematoksylinie, odwodnieniu i szkiełku nakrywkowym za pomocą mocowania DPX.
      UWAGA: Tabela 8 podsumowuje standardowy protokół. Wykonaj barwienie H&E na wszystkich sekcjach, podczas gdy specjalne/specyficzne barwienia i reakcje są stosowane na wybranych sekcjach. Wybrane przypadki wymagają dodatkowych obszarów lub reakcji. Tabela materiałów zawiera szczegółowe informacje na temat przeciwciał stosowanych w IHC.

11. Podstawowa charakterystyka neuropatologiczna

UWAGA: Badane są niespecyficzne zmiany w tkance mózgowej, patologia naczyniowa, patologia choroby Alzheimera (AD), TAUopatie niezwiązane z AD, synukleinopatie, patologia białka wiążącego DNA TAR (TDP-43) i zmiany w hipokampie. Mikroskop optyczny podłączony do kamery służy do wykrywania miąższowych zmian mikroskopowych. Ocena histologiczna jest wykonywana przez ten sam zespół przeszkolonego personelu w zakresie neuropatologii, w skład którego wchodzi profesor neurologii, neurolog i patolog. Opiera się na zmodyfikowanym podejściu Montine'a45 (Tabela 8) obejmuje również: (1) Heterogenne TAUopatie niezwiązane z AD, które stanowią patologiczne znamię zwyrodnienia płata czołowo-skroniowego (FTLD) związane ze złożami TAU: choroba Picka, niepłynna pierwotna afazja postępująca (TAU-nfPPA), postępujące porażenie nadjądrowe (PSP)46,47 i zwyrodnienie korowo-podstawne (CBD)48. Ponadto, TAUopatie niezwiązane z AD obejmują stany związane ze starzeniem się i bez określonego znaczenia klinicznego, takie jak Pierwotna TAUopatia związana z wiekiem (CZĘŚĆ)49, Age-Related TAU Astro-Gliopathy (ARTAG)50, argyrofilna choroba zbóż48. (2) Synukleinopatia typu Lewy'ego (LTS), która jest związana z chorobą Parkinsona (PD) i otępieniem z ciałami Lewy'ego (LBD). Aby wyszukać LTS, zastosuj następujące kroki hierarchiczne: najpierw opuszka węchowa, pień mózgu, ciało migdałowate/kora skroniowa; Jeśli poprzednie obszary są pozytywne, dodaj struktury limbiczne (tworzenie hipokampa, kora śródwęchowa, przedni zakręt obręczy), środkowy zakręt czołowy, dolny płat ciemieniowy i kora potyliczna45. Jeśli występują kliniczne cechy korowego LBD (tj. fluktuacje i/lub halucynacje), w pierwszym kroku należy rozważyć struktury limbiczne i izokorę. (3) Depozyty TDP-43, patologiczna cecha charakterystyczna FTLD związana ze złożami TDP-43: behawioralny wariant otępienia czołowo-skroniowego (bvFTD), otępienie semantyczne (SD lub svFTD), TDP-nfPPA i choroba neuronu ruchowego FTD (FTD-MND). IHC dla TDP-43 wykonuje się na następujących odcinkach: ciało migdałowate, hipokamp, kora śródwęchowa i środkowy zakręt czołowy; w przypadkach z podejrzeniem klinicznego FTLD rozważ zbadanie innych sekcji51.

  1. Oceń niespecyficzne zmiany w tkance mózgowej w wybranych sekcjach za pomocą H&E, NISSL, LFB i IHC dla GFAP i NeuN. Weź pod uwagę rozrzedzenie neuronów, neurony balonowate, gąbczastość, glejozę, utratę mieliny, obecność lub brak nacieków zapalnych lub nowotworowych. Określ najczęstszą lokalizację tych zmian.
  2. W celu wykrycia mikroskopijnych zmian naczyniowych należy zbadać szkiełka H&E i LFB zawierające co najmniej dwa makroprzekroje półkuli (pierwszy przechodzi przez ciała sutkowe (cięcie Charcota) z płatami czołowymi i skroniowymi, zwojami podstawy, przednim wzgórzem, ciałem migdałowatym, a drugi przechodzi przez płat potyliczny), odcinek "kolankowaty" formacji hipokampa, jeden przekrój móżdżku, i wszystkie trzy główne odcinki pnia mózgu (poprzez istotę czarną, locus coeruleus i DMNV).
    1. Wykryj chorobę małych naczyń, w tym miażdżycę tętnic, lipohyalinozę, poszerzenie przestrzeni okołonaczyniowej, utratę istoty białej, angiopatię oponowo-rdzeniową i/lub miąższową i/lub kapilarną mózgowo-rdzeniową. Określ nachylenie (0–3) i dominującą lokalizację42,52. Weź pod uwagę obecność lub brak wycieku hemosyderyny, mikrokrwawień i mikrozawałów.
    2. Oceń wpływ uszkodzenia naczyń krwionośnych na upośledzenie funkcji poznawczych za pomocą hierarchicznego schematu Deramecourta (zmiany w ścianach naczyń - choroba małych naczyń - zawały makroskopowe). W tej ocenie należy wziąć pod uwagę przekrój płata czołowego i skroniowego, zwoje podstawy i hipokamp (wynik 0–20)30. Oszacuj również prawdopodobieństwo, że choroba naczyniowa mózgu przyczyniła się do upośledzenia funkcji poznawczych, korzystając z wyniku VCING (niski-pośredni-wysoki), uzyskanego przez uwzględnienie makroskopowych zawałów półkuli i choroby małych naczyń płata potylicznego, w tym umiarkowanego do ciężkiego stwardnienia tętnic i angiopatii amyloidowej53.
  3. Oceń patologię AD za pomocą IHC (4G8) pod kątem rozprzestrzeniania się amyloidu. Zdefiniuj etapy Thala (1–5)54, zagregowana punktacja amyloidu (0–3)45 i morfologia dla każdego miejsca (rozlana, ogniskowa, rdzeniowa).
    1. Oceń patologię AD Tau za pomocą IHC (AT8) i opisz dominującą morfologię dla każdego miejsca (splątki neurofibrylarne, nici neuropilowe, blaszki neurytyczne). Zdefiniuj stadium Braaka (I–VI +; znak dodatni wskazuje na obecność dodatkowych obszarów hiperfosforylowanej patologii Tau, które nie są zgodne z hierarchią Braaka)55 i łączna punktacja (0–3)45.
    2. Oceń blaszki neurytyczne za pomocą barwienia Gallyasa i wyniku CERAD (0–3)56. Następnie zdefiniuj prawdopodobieństwo wystąpienia cech neuropatologicznych odpowiadających zespołowi klinicznemu AD za pomocą wyniku ERAD Amyloid-B raak-C (wynik ABC 0–3): none-low-intermediate-high45.
  4. Użyj AT8 IHC, aby zauważyć obecność lub brak patologii TAU niezwiązanej z AD, określając dominującą lokalizację i osobliwy obraz morfologiczny. Rozważ inkluzje neuronalne, takie jak splątki w kształcie płomienia lub kuliste, inkluzje kulisto-kuliste (tj. ciała Picka)57, nici neuropilowe, dystroficzne neuryty, ziarna argyrofilowe; oraz inkluzje glejowe, takie jak astrocyty kępkowe, astrocyty kolczaste, blaszki astrocytowe, ciała zwinięte, inkluzje kuliste58,59.
  5. Użyj α-syn IHC, aby wykryć LTS (ciała Lewy'ego, blade ciała i neuryty Lewy'ego) na obszarach w powyższej uwadze. W przypadku pozytywnego wyniku należy zastosować klasyfikację McKeitha (0–4), aby ocenić nasilenie zmian 60; następnie użyj etapów Beacha (I–IV) do dystrybucji topograficznej (opuszka węchowa, z przewagą pnia mózgu, z dominacją limbiczną, korą nową)61. Porównaj etapy Beacha i Braaka, aby zdefiniować związek między LBD a patologią AD60,61,62.
  6. Rozważ obecność lub brak inkluzji cytoplazmatycznych gleju (GCI; synukleinopatia glejowa typu innego niż Lewy), które są patologiczną cechą charakterystyczną atrofii wieloukładowej (MSA) i określ ich powszechną lokalizację63.
  7. Użyj TDP-43 IHC, aby wykryć osady TDP-43 w obszarach w powyższej notatce. Zidentyfikuj dominującą morfologię na miejsce: inkluzje cytoplazmatyczne neuronów (NCI), inkluzje neurytów dystroficznych (DN), inkluzje jądrowe (NII). Zdefiniuj wzór: A (dominujące NCI i DN: bvFTD i nfPPA); B (dominujące KIK: FTD-MND); C (dominujące długie DN: svPPA i bvFTD)51,64. Użyj schematu Nelsona, aby zdefiniować obecność TDP-43 w przypadkach AD65,66.
  8. Oceń hipokamp, zaczynając od subiculum i sektora Sommera (CA1). Użyj wyniku Rauramaa (0–4): 1–2 odpowiednio dla mikrozawałów i makrozawałów; 3-4 odpowiadające odpowiednio umiarkowanej i ciężkiej utracie neuronów oraz atrofii hipokampa (stwardnienie hipokampa: HS). Zwróć uwagę na obecność lub brak patologicznych złogów białkowych (w kolejności malejącej częstości: pTAU, TDP-43, α-syn)67.
  9. Zdefiniuj diagnozę neuropatomorfologiczną i wprowadź wszystkie dane patologiczne do bazy danych.
    UWAGA: Pomieszczenia, w których przechowywany jest materiał biologiczny i dane wrażliwe dawców, są zawsze zamknięte i wstęp do nich mają tylko upoważniony personel, w celu zagwarantowania zarówno bezpieczeństwa, jak i prywatności. Zamrożony materiał biologiczny jest przechowywany w zamkniętych zamrażarkach w temperaturze -80 °C, natomiast tkanki zatopione w parafinie utrwalone w formalinie są przechowywane w zamkniętych szafach w temperaturze pokojowej. Stosowane są zamrażarki z podwójnym silnikiem, a także zamrażarka zapasowa. Ponadto, aby zamrażarki zawsze działały, są one wyposażone w system monitorowania 24/7, który uruchamia alarm. Obecny jest również generator awaryjny na wypadek awarii zasilania. Uczestnicy są anonimizowani za pomocą kodu numerycznego, aby zapewnić im prywatność; Nieupoważniony personel nie ma możliwości powrotu do tożsamości dawców i ich wrażliwych danych. Wszystkie informacje są gromadzone w bazie danych chronionej hasłem; Podobnie, papierowa kopia tych danych jest przechowywana w zamkniętych archiwach.

Wyniki

Dawcy mózgów i dane dotyczące pobierania tkanek
W 2014 roku rozpoczęto rekrutację dawców podczas drugiego badania kontrolnego InveCe.Ab, w którym wzięło udział 1010 spośród 1061 kwalifikujących się osób (wskaźnik odpowiedzi: 93%; Rysunek 1). W odniesieniu do podłużnego badania InveCe.Ab, 290 spośród 1010 uczestników (28,7%) zgodziło się zarejestrować jako dawcy (160 było już zarejestrowanych, a 130 wyraziło chęć rejestracji). Poziom wykształcenia jest wyższy u dawców niż u osób niebędących dawcami (66% naszych dawców posiada średnio-wysoki poziom wykształcenia: 8 lub więcej lat nauki), co wskazuje na znaczenie kultury i edukacji. Wiele osób „zdrowych” również wykazało zainteresowanie programem donacji mózgu. Większość naszych „kontroli” przyznaje, że potrafi współczuć chorym i ich bliskim i chce w jakiś sposób przyczynić się do badań prowadzących do lepszego zrozumienia chorób neurologicznych. Osoby bezinteresowne, które za życia regularnie angażują się w programy donacji krwi lub szpiku, są bardziej otwarte na ideę donacji mózgu, podobnie jak osoby, które już wcześniej zgodziły się na oddanie organów po śmierci. Są one świadome faktu, że nawet jeśli nie będzie żyjącego biorcy, ich donacja będzie miała ogromne znaczenie dla nauki. Kolejnym czynnikiem sprzyjającym donacji mózgu jest preferencja kremacji. Obecnie populacja dawców ABB obejmuje łącznie 427 osób (290 uczestników InveCe.Ab + 137 wolontariuszy lub pacjentów ze szpitala geriatrycznego ASP Golgi-Redaelli), z czego 75% ma 70 lat lub więcej. Występuje wyraźna przewaga kobiet (64%) oraz osób starszych bez zaburzeń psychicznych (około 85%). Do tej pory pobrano 27 mózgów z 40 zmarłych dawców (wskaźnik autopsji 67%); 13 osób nie zostało poddanych autopsji z różnych przyczyn, w tym z powodu niezgłoszenia zgonu do ABB, ciężkich obrażeń prowadzących do zniszczenia mózgu, groźnych chorób zakaźnych oraz jednego przypadku CJD; 4 osoby wycofały swoją zgodę. Do chwili obecnej 24 z 27 pobranych mózgów otrzymało pełną charakterystykę neuropatologiczną z ostateczną diagnozą kliniczno-patologiczną, natomiast pozostałe 3 mózgi są wciąż w trakcie badania (Tabela 3). Dodatkowe dane dotyczące pobierania mózgów z ABB obejmują: średni wiek w chwili śmierci (81 lat); średni odstęp postmortem (10,37 h); średnie pH CSF (6,64); średnie pH tkanki (6,07); średnią wagę mózgu (1012,86 gr); w 90% zmarłych osób AFS wynosił 1.

Neurofizjologiczne biomarkery (QEEG)
QEEG jest częścią podejścia wielowymiarowego. Jest to prosta, nieinwazyjna i niedroga metoda, która wykazuje potencjał w wykrywaniu przejścia z łagodnych zaburzeń neuropoznawczych (mild-NCD lub MCI) w ciężkie zaburzenia neuropoznawcze (major-NCD lub otępienie). W ramach naszego podejścia wielowymiarowego wykonywane jest standardowe badanie QEEG i testowana jest jego ewentualna rola jako biomarkera otępienia. Nasze dane z wstępnej serii 36 donatorów mózgów (18 zdrowych osób starszych (NOLD), 11 z łagodnymi NCD i 7 z ciężkimi NCD; z czego 9 z potwierdzoną diagnozą neuropatologiczną) wskazują, że średni procent rytmu alfa był istotnie niższy w grupie major-NCD w porównaniu z grupą mild-NCD (p: 0,002) oraz NOLD (p: 0,033). Odwrotnie, wolniejsze częstotliwości EEG (theta/delta) były istotnie wyższe w grupie major-NCD niż w NOLD/mild-NCD (patrz przypadki przykładowe na Rysunku 4). W naszej serii rozkład rytmów EEG pozwala odróżnić osoby NOLD/mild-NCD od pacjentów z major-NCD niezależnie od diagnozy etiologicznej, co sugeruje, że na rytmy mózgowe wpływa stopień nasilenia zmian degeneracyjnych bez względu na ich typ. Rzeczywiście, 7 z 9 zbadanych mózgów wykazało otępienie wynikające z patologii mieszanych. Specyficzność w odniesieniu do charakteru patologii wydaje się niska, a na elektryczne rytmy mózgowe zdaje się wpływać bardziej stopień nasilenia i topografia zmian niż ich natura molekularna (Poloni, et al. proceedings of AD/PD 2019, Lizbona, dane niepublikowane).

Reprezentatywne przypadki
Protokół ABB może być przydatny i niezbędny w określonych przypadkach oraz warunkach. Przykładem jest obecność patologii asymetrycznej (Rycina 5). Nasz protokół jest bardzo odpowiedni do identyfikacji i właściwej charakterystyki tego typu patologii. Do tej pory zbadaliśmy 4 mózgi z asymetrycznymi zmianami, z których niektóre przedstawiono na Rycini 5. Makroskopowo, w jednym przypadku stwierdzono zanik prawej strony (Rycina 5A) z ciężkim poszerzeniem komór w prawym przekroju wieńcowym (Rycina 5C) w porównaniu z lewą stroną (Rycina 5B). Inny przypadek wykazuje zawał prawej półkuli (Rycina 5D), a kolejny wyraźny zanik prawego ciała mamilarnego (Rycina 5E). Na poziomie mikroskopowym przypadek FTLD wykazuje asymetryczną pozytywność TDP-43, która jest bardziej intensywna po prawej stronie czołowej w porównaniu z lewą (Rycina 5F,G).

Przekroje makroskopowe (Rysunek 6A,C) są wykorzystywane do uzyskania ogólnego przeglądu. Barwienie LFB pomaga zidentyfikować utratę mieliny (Rysunek 6D), a IHC dla 4G8 i AT8 (Rysunek 6B) pozwala na gołym okiem ocenić rozkład immunoreaktywności w półkulach. W serii ABB dostępne są mózgi osób spokrewnionych do celów porównawczych.

W Rycina 7, mikroskopowe obrazy przekrojów mózgów bliźniąt homozygotycznych są zestawione obok siebie w celu ułatwienia porównania (bliźniak 1 (BB137): Rycina 7A,C,E,G,I,K kontra twin 2 (BB138: Rycina 7B,D,F,H,J,L). Podobnie jak w analogicznym wcześniejszym badaniu68oboje bliźniacy zostali poddani porównaniu za pomocą ocen klinicznych i neuropatologicznych. U obojga bliźniąt rozpoznano to samo zaburzenie poznawcze o charakterze otępiennym (major-NCD) o etiologii wieloczynnikowej, jednak zmarli oni w odstępie dwóch lat, odpowiednio w wieku 83 (początek otępienia w wieku 72 lat) i 85 lat (początek otępienia w wieku 76 lat). Ich mózgi wykazują bardzo podobny obraz neuropatologiczny, z nasiloną patologią choroby Alzheimera (AD) powiązaną z angiopatią amyloidową. Immunoreaktywność 4G8 jest rozproszona w całej korze (Rycina 7A, B) i jąder podstawy (Rycina 7C,D) z blaszkami rozproszonymi, gęstymi i z rdzeniem. Jest on również wyraźnie wykrywalny w naczyniach miąższowych i leptomeningealnych kory oraz móżdżku (Rycina 7A,B,G–J). Przy większym powiększeniu wyraźnie widoczna jest struktura capCAA (Rycina 7G,H). Blaszki, sploty i włókna immunopozytywne dla AT8 są rozproszone w korze ciemieniowej obu mózgów (Rycina 7E,F,L). W odniesieniu do obciążenia patologią amyloidu i NFT, bliźniak 1 został zaklasyfikowany do stopnia 3 wg skali Thala (montine A2) i stopnia 5 wg skali Braaka (montine B3), natomiast bliźniak 2 do stopnia 5 wg skali Thala (montine A3) i stopnia 6 wg skali Braaka (montine B3). Oboje posiadali taki sam poziom wykształcenia i prowadzili podobny tryb życia; jednak jedna osoba (BB137) była w związku małżeńskim i krótko potem została wdową, podczas gdy druga (BB138) pozostała stanu wolnego. Wykazali różny stopień zmienności kliniczno-patologicznej przy tym samym początku i przebiegu choroby, lecz w różnych ramach czasowych. Potwierdza to fakt, że choć komponent genetyczny odgrywa kluczową rolę w rozwoju choroby, komponenty epigenetyczne i środowiskowe są fundamentalne w określaniu nieco odmiennych manifestacji.

W niektórych przypadkach obraz kliniczny nie odpowiada cechom neuropatologicznym. Na Rysunku 8 przedstawiono dwa różne przypadki zdefiniowane klinicznie jako przypadki AD; analizy neuropatologiczne wykazują, oprócz pośredniej patologii AD, rozsianą pozytywność na α-syn. W pierwszym przypadku ciężki obraz LTS (Beach IV) wykazuje ciała Lewy rozmieszczone homogenicznie w obrębie gyrus cingoli (Rysunek 8A) oraz w SN jako inkluzje cytoplazmatyczne otoczone neuromelaniną (Rysunek 8B,C). W drugim przypadku ciała Lewy związane z neurytami Lewy są rozproszone w ciele migdałowatym (Rysunek 8D,E) oraz w jądrze Meynerta (Rysunek 8F,G), co sugeruje diagnozę limbicznego LTS. Rzeczywiście, to topografia zmian, a nie ich natura molekularna, warunkuje manifestacje kliniczne.

figure-results-1
Rycina 1: Schemat badania Inve.Ce.Ab. W punkcie wyjściowym ogólna rozpowszechnienie otępienia wynosiło 3%. W trakcie okresów obserwacji wskaźniki rozpowszechnienia wynosiły: 4,4% (1Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.)69, 7.1% (2nd), 10.9% (3Badań i rozwoju). Ośmioletnia częstość występowania wyniosła 15 osób/1000/rok (95% CI: 13–18 osób/1000/rok). Rekrutacja dawców rozpoczęła się w 2014 roku (podczas drugiej obserwacji). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

figure-results-2
Rycina 2: Protokół sekcji mózgowia (A), móżdżku (F) i pnia mózgu (H). Koło tętnicze Willisa oraz pojedyncze półkule przedstawiono w (E) i (B). Przekroje wieńcowe prawej (C) i lewej strony (D) są ponumerowane i naprzemiennie utrwalane („F”) oraz mrożone („C”). Przedstawiono przekroje strzałkowe móżdżku (G) oraz przekroje osiowe pnia mózgu (I). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Przedstawiono przekroje czołowe utrwalonego prawego (A) i lewego (B) płata czołowo-skroniowego.
Na prawym przekroju hipokamp i płat skroniowy (A, R10b) są oddzielone od płata czołowego (A, R10a). Na przeciwległym przekroju ciało migdałowate i jądra podstawy (B, L9b) są oddzielone od płata czołowego (B, L9a). Pasek skali: 1,7 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Względna gęstość widmowa mocy u osób NOLD i osób z głównymi NCD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy patologii asymetrycznych. (A) Pierwszy przypadek: mózg z zanikiem prawostronnym. Przekroje czołowe (B) i (C) wykazują prawostronne poszerzenie komór, szczególnie widoczne w sekcjach 10–12 (C, strzałki). W sekcjach (B) i (C) litera „F” oznacza utrwalony (fixed), a „C” zamrożony (w języku włoskim: congelato). (D) Drugi przypadek: rozległy zawał prawej półkuli. (E) Trzeci przypadek: zanik prawego ciała sutowatego (strzałka). (F, G) Czwarty przypadek: obrazy mikroskopowe wykazują bardziej intensywną immunoreaktywność TDP-43 w prawej korze czołowej (G) w porównaniu z lewą (F) w przypadku otępienia czołowo-skroniowego. Paski skali: 183 µm (F, G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Przekroje makroskopowe. (A, C) Przekroje wieńcowe utrwalonego płata czołowo-skroniowego (A) oraz świeżego płata ciemieniowego (C). (B) Histologiczny przekrój czołowo-skroniowy z immunoznaczeniem przeciwciałem AT8. Immunoreaktywność jest wyraźnie rozłożona w całej korze, jednak bardziej intensywna w płacie skroniowym. (D) Histologiczny przekrój ciemieniowy barwiony LFB. Strzałka wskazuje obszar demielinizacji istoty białej. Pasek skali: 1.55 cm (B, D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rysunek 7: Bliźnięta. Porównanie mózgów dwóch homozygotycznych bliźniąt: BB137 (A, C, E, G, I, K) i BB138 (B, D, F, H, J, L). Obrazy neuropatologiczne są bardzo podobne. (A) i (B) pokazują rozproszoną pozytywność 4G8 w płacie potylicznym z blaszkami amyloidowymi, naczyniami oponowo-miąższowymi (strzałki) i miąższowymi (groty strzałek). Angiopatia amyloidowa naczyń włosowatych (gwiazdki) jest wyraźnie widoczna przy większych powiększeniach (G) i (H). 4G8 jest rozproszone w obrębie jąder podstawy (C, D) oraz wokół naczyń oponowo-miąższowych móżdżku (I, J: strzałki). Immunoreaktywność AT8 identyfikuje sploty neurofibrylarne, włókna i blaszki (strzałki) w korze ciemieniowej (E, F). Barwienie Gallyasa (K) ujawnia blaszki neurytyczne, podobnie jak przeciwciało AT8 (L). Paski skali: 470 µm (A–F; I–J); 90 µm (G–H; K–L). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Diagnoza kliniczna a neuropatologiczna. Na tej rycinie przedstawiono dwa różne przypadki, w których diagnoza neuropatologiczna różni się od diagnozy klinicznej. Immunoreaktywność w odniesieniu do α-syn jest wynikiem nieoczekiwanym. (A–C) Pierwszy przypadek: Gyrus cingoli (A) wykazuje jednorodny rozkład ciał Lewy'ego w SN (strzałki w B). W neuronie SN przedstawiono podwójne ciało Lewy'ego otoczone neuromelaniną (C). (D–G) Drugi przypadek: Rozproszona pozytywność na α-syn jest wykrywalna w ciele migdałowatym (D, E) oraz jądrze Meynerta (F, G). Ciała komórkowe i neuryty Lewy'ego (gwiazdka) są wyraźnie zaznaczone. Paski skali: 154 µm (A, D, F); 37 µm (B, E, G); 20 µm (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-9
Rysunek 9: Wzór umowy o przekazaniu materiałów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

n%
PłećSamce60745.9
Samice71454.1
Kohorta urodzeniowa193523617.8
193621916.6
193726420.0
193830523.1
193929722.5
Stan cywilnyZamężna/Żonaty87266.1
Współmieszkanie131.0
Rozdzielczo/rozwiedzeni292.2
Wdowiec / Wdowa32524.6
Pojedynczy806.1
Główny zawódPracownicy fizyczni66650.6
Pracownicy umysłowi45934.9
Gospodyni domowa19114.5
Lata edukacji≤5 lat75457.2
>5 lat56542.8

Tabela 1: Cechy socjodemograficzne uczestników badania InveCe.Ab.

KRYTERIA WŁĄCZENIAKRYTERIA WYKLUCZENIA
Wszystkie osoby w wieku 18 lat i starszeOsoby jednoznacznie odmawiające donacji
Osoby zamieszkujące obszar AbbiategrassoOsoby mieszkające poza regionem Lombardii
Ochotnicy, którzy wyrażają zgodę samodzielnieRozbieżności między wolą potencjalnego dawcy a życzeniami najbliższych krewnych w kwestii donacji mózgu
Osoby niezdolne do wyrażenia zgody za zgodą najbliższych krewnychSytuacje prowadzące do znacznego naruszenia konsystencji mózgu 
Zgon z przyczyn naturalnychPrzebieg kliniczny <2 lata chyba że możliwość wystąpienia choroby prionowej zostało wykluczone
Śmierć spowodowana zabójstwem lub samobójstwem, wymagająca raportu koronera
Czas od śmierci >30 godzin

Tabela 2: Kryteria przekazania mózgu do badań.

N° płećKOD BBKOD InveCewiekwykształcenie (lata)diagnoza klinicznaCDR   AFSPM (godz.)pH tkankipH roztworudiagnoza neuropatologiczna
1FBB 37875Główne NCD wynikające z AD (BPSD)5229ndndWysoka patologia AD, umiarkowane SVD, TDP43+, LTS kory, HS
2FBB 105945Główne NCD wynikające z AD5155.726.78Zaawansowana patologia AD, łagodne SVD, HS
3FBB 137833Główne NCD o etiologii wieloczynnikowej (AD-VaD)5116ndndWysoka patologia AD, umiarkowane SVD, zawał potyliczny, CAA-capCAA
4MBB 1817113Główne zaburzenia neur认知 (NCD) wynikające z choroby Alzheimera (BPSD)523ndndciężka LTS (Beach IV), umiarkowana patologia AD, łagodne SVD, mCAA
5MBB 115I 6367818Główna choroba niezakaźna (NCD) wynikająca z choroby Alzheimera (AD)516ndndumiarkowana choroba Alzheimera, umiarkowane naczyniowe uszkodzenie mózgu, stan zapalny, ILBD (Beach IIa), HS
6FBB 23I 65793Główne NCD wynikające z chorób naczyniowych5114ndndCiężka i rozległa CAA, umiarkowana patologia AD
7MBB 102I 412798Główne NCD wynikające z chorób naczyniowych318ndndOtępienie naczyniowe, ILBD
8MBB 224I 16803Główne NCD o etiologii wieloczynnikowej5111nd5.99Umiarkowane SVD, niska patologia AD, ILBD (Beach IIa), HS
9FBB 47785Główne NCD w odniesieniu do wielu etiologii (LBD-VaD BPSD)508ndndWysoka patologia AD, patologia BG TAU, ARTAG, łagodne SVD, HS
10FBB 153I 965795Łagodne-NCD (zgon z powodu raka jelita grubego z rozsianymi przerzutami)0.518nd6.73Niska patologia AD, umiarkowane BG-SVD
11MBB 118I 12117913NOLD (zgon z powodu raka wątroby)023nd6.51Umiarkowana SVD
12MBB 236I 521803Główny zespół neur poznawczy (NCD) wynikający z choroby Alzheimera (BPSD)4115nd6.15Wysoka patologia AD, ciężka BG-SVD (liczne mikrokrwawienia), HS
13FBB 138853Główne NCD wynikające z wielu etiologii (AD-VaD BPSD)4015nd6.75Wysoka patologia AD, umiarkowane SVD, CAA, limbic TDP43
14MBB 109I 876798NOLD (śmierć w wyniku guza mózgu – GBL)0116nd6.4Niska patologia choroby Alzheimera, ILBD (Beach IIa), łagodne SVD
15FBB 271848Główne zaburzenia poznawcze (NCD) wynikające z choroby Alzheimera (BPSD)412nd6.7pośrednia choroba Alzheimera, limbiczne LTS, umiarkowane BG-SVD, mCAA, TDP
16FBB 71I 1080798NOLD (zgon z powodu niewydolności serca)006nd6.26umiarkowane BG-SVD, ILBD, amy TDP, niskie AD
17FBB 189I 858805Główne zaburzenia poznawcze (NCD) wynikające z choroby Alzheimera (BPSD)3020nd6.42umiarkowana choroba Alzheimera, CAA-capCAA, TDP43, umiarkowane BG-SVD, HS
18FBB 278I 924805Główne NCD wynikające z LBD (BPSD)3156.027.05pośrednia choroba Alzheimera, limbiczne LTS (Beach IV), limbiczne TDP, stwardnienie hipokampa
19FBB 2471048Główna NCD wynikająca z wielu etiologii (prawdopodobnie patologia mieszana)3066.487.22patologia białka TAU (PART-ARTAG), HS
20MBB 85I 198310Główne NCD wynikające z LBD (BPSD)3196.267.3ciężka LTS układu limbicznego, umiarkowana choroba Alzheimera, umiarkowane SVD, ciężkie CAA-capCAA, HS
21FBB 14I 222828Główne NCD o etiologii wieloczynnikowej (AD-VaD)21115.596.4Patologia AD stopnia pośredniego, umiarkowane SVD
22FBB 282768Główne zaburzenia neuropoznawcze czołowo-skroniowe (nfPPA BPSD)31106.076.39TDP (typ A), ILBD, umiarkowane SVD, niskie AD, HS
23FBB 154I 1079805NOLD (zgon z powodu nowotworu z rozsianymi przerzutami)0156.496.9umiarkowana choroba małych naczyń (SVD), angiopatia amyloidowa mózgu (CAA), niska skala AD, zapalenie układu limbicznego
24FBB 2906513główne zaburzenia neuropsychiatryczne i behawioralne w przebiegu otępienia czołowo-skroniowego (bvFTD BPSD)51125.736.42TDP (typ A)
25FBB 210898Główne NCD wynikające z AD (BPSD)51155.946.4w toku
26MBB 2937518Główne zaburzenia neur poznawcze w obrębie płatów czołowych i skroniowych (BPSD w wariancie behawioralnym FTD)5186.146.83w toku
27FBB 99I 1370799NOLD (zgon w następstwie wstrząsu septycznego)02146.37.12w toku
M/Kśredniaśredniaśredniaśredniaśredniaśredniaśrednia
0.5817.73.21.010.46.16.6

Tabela 3: Diagnoza kliniczna/neuropatologiczna serii ABB. BB: Bank Mózgów (Brain Bank); edu (yrs): lata edukacji; CDR: Kliniczna Skala Oceny Otępienia (0 = brak otępienia; 0,5 = łagodne zaburzenia poznawcze; 1 = łagodne otępienie; 2 = umiarkowane otępienie; 3 = ciężkie otępienie; 4 = bardzo ciężkie otępienie; 5 = otępienie w fazie terminalnej); AFS: Wynik Czynnika Agonalnego (Agonal Factor Score); PM (hrs): godziny po śmierci (Post Mortem); nd: nie wykonano; M/F: mężczyźni/kobiety; BPSD: behawioralne i psychologiczne objawy otępienia; VaD: otępienie naczyniowe; NOLD: zdrowi seniorzy; GBL: glejak wielopostaciowy; nfPPA: niepłynna pierwotna postępująca afazja; bvFTD: wariant behawioralny otępienia czołowo-skroniowego; SVD: choroba małych naczyń; LTS: synukleinopatia typu Lewy; HS: stwardnienie hipokampa; CAA: amyloidowa angiopatia mózgowa; capCAA: naczyniowa CAA w kapilarach; mCAA: oponowa CAA; ILBD: przypadkowa choroba ciał Lewy; BG: jądra podstawy; ARTAG: związana z wiekiem astrogliopatia TAU; PART: pierwotna związana z wiekiem TAUopatia; amy: ciało migdałowate.

DziedzinaNazwa testu 
DepresjaSkala Depresji Center for Epidemiologic Studies (CES-D) [2]
Poznanie globalneMini-Mental State Examination (MMSE) [1]
Pamięć werbalna i wizualnaTest Wybiórczego Przypominania z Podpowiedzią i bez Podpowiedzi [3]
Test Corsi [4]
Złożona Figura Rey-Osterrietha (ROCF)  Przypomnienie [5]
Uwaga/szybkość psychomotorycznaTest rysowania ścieżek A [6]
Macierze uwagi [4]
Językowo-semantyczna pamięćSemantyczna płynność słowna (kolory, zwierzęta, owoce, miasta) [4]
Funkcje wykonawczeTest rysowania ścieżek B [6]
Kolorowe Matryce Ravena [7]
Zdolności wzrokowo-przestrzenneTest Rysowania Zegara (CDT) [8]
Kopiowanie złożonej figury Reya-Osterrietha (ROCF) [5]

Tabela 4: Ocena neuropsychologiczna dla dawców mózgów.

METABOLITY
Morfologia krwi
Cholesterol HDL i LDL
Triglicerydy
Glukoza
Hemoglobina glikowana (HbA1c)
Homocysteina
Kobalamina (witamina B12)
Folat
Albumina
Mocznik
Kreatynina
Transaminazy (ALT i AST)
Gamma-glutamylotransferaza 
Hormon tyreotropowy (TSH)
Witamina D (25-hydroksywitamina D)
Białko C-reaktywne (CRP)
Elektrolity

Tabela 5: Panel metaboliczny dla dawców mózgu.

NAZWA GENUdbSNP
Apolipoproteina E (APOE)rs429358
rs7412
Katalaza (CAT)rs1001179
Dysmutaza ponadtlenkowa 2 (SOD2)rs4880
Angiotensynogen (AGT)rs699
Sirtuina 2 (SIRT2)rs10410544
Translokaza zewnętrznej błony mitochondrialnej 40 (TOMM40)rs2075650
Białko BIN1 (Bridging integrator 1)rs7561528
Katecholo-O-metylotransferaza (COMT)rs4680
reduktaza metylenotetrahydrofolianu (MTHFR)rs1801133
rs1801131
Mózgowy czynnik neurotroficzny (BDNF)rs6265
rodzina transporterów solutowych 6, członek 4 (SLC6A4 lub 5HTT)Region polimorficzny sprzężony z genem transportera hydroksytryptaminy (5-HTTLPR)
rs25531

Tabela 6: SNP przeanalizowane u dawców mózgów InveCe.Ab.

PROCESROZTWÓRCZAS TRWANIA
PRÓBKI MAKROPRÓBKI MIKRO
FIKSACJA10% BUFOROWANA FORMALINA8 dni w 4 °C8 dni w 4 °C
PRANIEBUFOR FASFORANOWY 2-15 dni w temperaturze pokojowej2-15 dni w temperaturze pokojowej
PRANIEPŁUKANIE W H2O 2-3 h, woda z kranu2-3 h, woda z kranu
ODWODNIANIEALKOHOL ETYLOWY 70%24 h8 h
ODWODNIANIEALKOHOL ETYLOWY 80%24 h4 h
ODWODNIANIEALKOHOL ETYLOWY 90%60 h (zazwyczaj przez weekend)4 h
ODWODNIANIEALKOHOL ETYLOWY 95%12 h4 h
ODWODNIANIEALKOHOL ETYLOWY 95%12 h4 h
ODWODNIANIEALKOHOL ETYLOWY 100%6 h4 h
ODWODNIANIEALKOHOL ETYLOWY 100%6 h4 h
PRZEJAŚNIANIEKSYLEN I12 h10 h
PRZEJAŚNIANIEKSYLEN II12 h10 h
INFILTRACJAPARAFINA I12 h11 h
INFILTRACJAPARAFINA II12 h11 h
ZATOPIENIEWOSK PARAFINOWY

Tabela 7: Protokół przygotowania tkanek ABB.

REGIONH&Efiolet krezolowyLFBGALLYAS4G8AT8α-SYNTDP-43NeuNGFAP
PIEŃ MOZGU
Rdzeń przedłużony – jądro grzbietowe nerwu błędnegoProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
Most - miejsce sinawe (Locus Coeruleus)Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
Śródmózgowie - istota czarnaProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst do przetłumaczenia.
MÓŻDZEK
Kora móżdżku i jądro zębateProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.
MÓZG WŁAŚCIWY 
Zakręt czołowy środkowyProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
Jądra podstawne + jądro MeynertaProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.
Przednia część zakrętu obręczyProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.
Ciało migdałowateProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
Wzgórze i jądro podwzgórzoweProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
Górny i środkowy zakręt skroniowyProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.
Hipokamp i kora entorynalnaProszę podać tekst do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst do przetłumaczenia.Proszę podać tekst do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.
Dolny zakręt ciemieniowyProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
Kora potylicznaProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.
Opuszka węchowaProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.

Tabela 8: Oceniare regiony, barwienie i immunohistochemia.

Dyskusja

Krytyczne kroki w protokole
Naszym celem jest pozyskanie, scharakteryzowanie i przechowywanie dobrej jakości tkanek pochodzących od osób o szczegółowej historii wywodzącej się z obserwacji podłużnej. Aby osiągnąć ten cel, należy zająć się następującymi kluczowymi aspektami. Jak opisano powyżej, protokół rozpoczyna się od rekrutacji dawców, co jest pierwszym kluczowym krokiem. Następnie konieczne jest, aby dawcy kontynuowali program obserwacji i utrzymywali przynależność do projektu w czasie, aż do faktycznego oddania mózgu. W chwili śmierci konieczne jest niezwłoczne powiadomienie personelu ABB w celu zwołania zespołu autopsyjnego w ciągu 24 godzin, co jest ważne dla odpowiedniej jakości tkanek. Świeże cięcie półkul mózgowych wymaga pewnej ręki i specjalnego treningu. Aby uniknąć uszkodzeń komórek spowodowanych powolnym zamrażaniem i uzyskać dobrej jakości plastry do kriostatu i omiki, ważne jest, aby zostały one szybko zamrożone. Biorąc pod uwagę szybkość penetracji roztworu formaliny (1 mm/godz.), w celu zachowania antygenowości tkankowej czas namaczania pojedynczego plastra jest utrzymywany na minimalnym poziomie.

Rozwiązywanie problemów z metodą
Aby zająć się krytycznymi krokami wymienionymi powyżej, proponujemy następujące podejście. Rekrutacja dawców i przestrzeganie zaleceń kontrolnych: Istnieje kilka czynników, które utrudniają dawstwo mózgu, w tym obawy przed uszkodzeniem sylwetki, czystości i integralności ciała lub przed możliwością odczuwania bólu po śmierci. Niektórzy obawiają się nawet, że sekcja zwłok może zostać przeprowadzona, gdy jeszcze żyją70,71. Pojawiają się również obawy związane z zakłóceniem organizacji pogrzebu i obciążeniem finansowym72. Co więcej, brak wiedzy personelu medycznego na temat procedur pośmiertnych i niezdolność do rozwiązania problemów potencjalnych dawców lub ich NOK może zniechęcić do rejestracji. Wszystkie te czynniki mogą powodować niski poziom świadomości przy małej liczbie zapisanych uczestników i wysokim prawdopodobieństwie utraty dawców w miarę upływu czasu. Rzeczywiście, program rekrutacji dawców powinien być skuteczny w szerzeniu świadomości, wzbudzaniu zaufania i przekonywaniu ludzi do rejestracji i utrzymywania wysokich wskaźników uczestnictwa w działaniach następczych. Z naszego doświadczenia wynika, że odbywa się to poprzez staranną selekcję potencjalnych dawców i dokładne wyjaśnienie celów BB. Oferujemy działania edukacyjne i empatyczne podejście odpowiadające na lęki i potrzeby zarówno osób zdrowych, jak i dotkniętych chorobami neurodegeneracyjnymi oraz ich rodzin. Okazuje się, że potencjalni dawcy są bardziej skłonni do wyrażenia zgody, gdy kontaktują się z nimi osobiście. Podejście bezpośrednie tworzy relację opartą na wzajemnym zaufaniu i szacunku, co ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia wysokiego odsetka rejestracji na dawstwo mózgu i oceny kontrolne. Wysoko wykwalifikowany personel z silnym poczuciem etyki najpierw zwraca się do potencjalnego dawcy, omawia możliwość oddania mózgu po śmierci, wyjaśnia wartość ludzkiej tkanki mózgowej dla badań neurobiologicznych i wyjaśnia wszelkie wątpliwości dotyczące procedur pośmiertnych. Równie ważna jest przychylna poczta pantoflowa. Po pobraniu mózgu poświęca się odpowiednią uwagę i troskę, aby ponownie skomponować zwłoki. Ważne jest, aby okazywać szacunek i wdzięczność zmarłej osobie poprzez delikatne obchodzenie się ze zwłokami. Kilka miesięcy później planowane jest spotkanie, na którym zostaną przedstawione wyniki analizy neuropatologicznej, gdy tylko poproszą o to członkowie rodziny.

Czas śmierci i pobrania mózgu: Kiedy dana osoba się zgadza, staje się dawcą i otrzymuje kartę identyfikacyjną z numerem, z którym można się kontaktować 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu (numer recepcji Szpitala Geriatrycznego ASP Golgi-Redaelli, który jest z nami połączony). Ponadto krewnym wręczana jest przywieszka samoprzylepna, która może być wykorzystana w przypadku hospitalizacji. Agencje pogrzebowe w okolicy zostały wcześniej poinformowane, aby sprowadzić ciało do obiektów ABB, gdzie wezwano zespół autopsyjny. Zespół autopsyjny składa się z patologa, neurologa i/lub neurobiologa oraz technika anatomicznego, którzy są dostępni codziennie od 6 rano do 23 wieczorem; Niektórzy studenci stażyści są również często obecni, aby pomóc i zrobić zdjęcia.

Precyzja i spójność procedur świeżego rozbioru jest zapewniona dzięki zaangażowaniu tych samych dwóch operatorów (neurologa i patologa), którzy opracowali metodę i mają kilkunastoletnie doświadczenie w neuropatologii. Podczas zamrażania plastrów umieszcza się je na wstępnie zamrożonej aluminiowej tacce i przykrywa zazębiającą się aluminiową płytą, aby były dobrze płaskie. Bezpośrednio po tym umieszcza się je w ciekłym azocie na 3 minuty, a następnie przechowuje w temperaturze -80 °C. Plastry do utrwalenia są pojedynczo zawijane w gazę i moczone w 10% buforowanym fosforanem roztworze formaliny, który podstawia się po jednym dniu. Następnie są przechowywane w formalinie nie dłużej niż 5 dodatkowych dni; Biorąc jednak pod uwagę, że roztwór formaliny wnika z prędkością 1 mm/dzień, chcielibyśmy jeszcze bardziej skrócić czas namaczania.

Ograniczenia metody
Opisana tu metoda badawcza obejmuje jedynie ograniczony obszar geograficzny, a osoby zaangażowane w program dawstwa posiadają cechy, które nie do końca reprezentują populację ogólną. Chociaż jest to więcej niż dopuszczalne, przerwa pośmiertna trwająca do 24 godzin może powodować zmiany w niektórych strukturach białkowych, enzymach i RNA tkanki mózgowej. Oznaczanie AFS i pH może nie być w pełni wystarczające do określenia jakości tkanek73 i opracowujemy inne sposoby uwierzytelniania jakości tkanek w oparciu o integralność RNA.

Jeśli chodzi o procedurę wycinania mikrotomem, chociaż jest ona bardzo przydatna do rekonstrukcji relacji anatomicznych, należy zauważyć, że zastosowanie makrosekcji nie jest proste i wiąże się z pewnymi trudnościami technicznymi. Nasza metoda jest wymagająca i czasochłonna. Koszty są dość wysokie, a finansowanie nie zawsze jest łatwe. Fundusze pochodzą przede wszystkim ze środków publicznych (Szpital Geriatryczny ASP Golgi-Redaelli) i prywatnych (Fundacja Golgi-Cenci), darowizn prywatnych, organizacji non-profit (np. "Federazione Alzheimer Italia") oraz dotacji.

Znaczenie metody ABB w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod
Na początku nasz program dawstwa mózgu był skierowany do osób biorących udział w badaniu podłużnym InveCe.Ab. W związku z tym oddanym mózgom towarzyszą szczegółowe informacje kliniczne, biologiczne i społeczne gromadzone przez lata. Siła ABB wynika właśnie z tego charakterystycznego pochodzenia. Rzeczywiście, badanie grupy osób spokrewnionych społecznie i genetycznie, które mają wspólne cechy biologiczne i ekspozycje środowiskowe, poprawia analizę statystyczną. Ponadto badanie obejmuje następujące korzyści: 1) Dbanie o potrzeby społeczności i zaspokajanie jej potrzeb (akt "dawania przed prośbą"): ludzie otrzymują bezpłatne okresowe badania kontrolne, o których informuje się lekarza pierwszego kontaktu, podaje się numer telefonu do naszej sekretarki na konsultacje, a osoby o znacznym stopniu niepełnosprawności są odwiedzane w domu; 2) Angażowanie uczestników, osób pełniących funkcje publiczne i lekarzy rodzinnych w działania edukacyjne poprzez organizację cyklicznych seminariów (związanych ze zdrowiem mózgu, dawstwem mózgu i ogólnym stanem zdrowia) oraz planowanie kursów tematycznych (np. korzystanie z urządzeń informatycznych dla osób starszych); 3) Poznawanie ludzi i przyjmowanie podejścia twarzą w twarz. Wszystkie te elementy stanowią o sile projektu ABB. Ponadto projekt zwiększa możliwości kliniczne zaangażowanego personelu medycznego, ponieważ zdobywa on doświadczenie zarówno w ocenach antemortem, jak i pośmiertnych ocenach neuropatologicznych. W związku z tym chcielibyśmy wspomnieć o bardzo osobliwym doświadczeniu związanym z "badaniem starzenia się mniejszości". Badanie to obejmowało ograniczoną i wyselekcjonowaną liczbę Afroamerykanów mieszkających w rejonie Chicago (784 z 1357 uprawnionych osób: wskaźnik odpowiedzi 57%). Uczestnicy byli odwiedzani co roku w domach i proszeni byli o dołączenie do programu dawstwa mózgu. Badanie to opiera się na nietypowym podejściu, z pewnymi podobieństwami do naszego, uzyskując wysoki odsetek pozytywnych odpowiedzi na program dawstwa mózgu (352 dawców z 784 uczestników zostało włączonych: 44%), chociaż wskaźnik autopsji nie był do końca zadowalający (53%)74. Podobnie jak w "The minority aging research study", oferujemy działania edukacyjne i empatyczne podejście, osiągając doskonałe rezultaty. W szczególności nasz wskaźnik odpowiedzi wynosi 93%, odsetek zapisów wynosi 28,7%, a wskaźnik autopsji w tej chwili wynosi 67%. Wskaźniki te pokazują, że projekty bezpośrednio angażujące ludzi mają większy odsetek darowizn. Inne programy dawstwa mózgu, w których mniej uwagi poświęca się budowaniu relacji z potencjalnymi dawcami, mają na ogół niski odsetek zapisów, wynoszący około 10-15% lub mniej73,75.

Istnieje kilka wcześniejszych badań kohortowych zakończonych analizą neuropatologiczną. Co więcej, większość banków i repozytoriów mózgów jest skoncentrowana na chorobie i występuje niedobór "kontrolnych" mózgów od zdrowych dawców w porównaniu z liczbą "chorych" mózgów. Tylko ograniczona liczba BB opiera się na badaniach populacyjnych obejmujących zarówno osoby chore, jak i normalne, w celu zbadania trajektorii starzeniasię 73,74,76,77,78,79,80. Niektóre badania, takie jak "The minority aging research study" w USA74 i "The Vantaa 85+ study" w Finlandii76 są podobne do naszych, ale zwykle kończą się wraz z zakończeniem kohorty. Zamiast tego przewiduje się, że program dawstwa ABB będzie kontynuowany przez długi czas w przyszłości, pozyskując potencjalnych dawców i planując działania następcze nawet po zakończeniu badania podłużnego InveCe.Ab. Takie podejście sprawia, że nasza metoda rekrutacji jest podobna do tej z programu dawstwa mózgu "Sun Health Research Institute (SHRI)", który jest skierowany do społeczności emerytów73. Protokół SHRI dla dawstwa mózgu jest bardzo skuteczny z najkrótszym średnim odstępem między pośmiertnymi czasami na świecie (3,92 godziny). Podobnie jak w przypadku największych kulek BB na świecie, protokół SHRI po prostu przecina mózg, móżdżek i pień mózgu w linii środkowej (płaszczyzna strzałkowa), następnie jedna połowa jest preparowana na świeżo i zamrażana do badań biochemicznych, podczas gdy druga jest utrwalana w formalinie w celu oceny histopatologicznej. Jednak jedną z mocnych stron protokołu preparacji SHRI jest utrwalenie pojedynczych wycinków, a nie całej półkuli. Rzeczywiście, utrwalenie półkuli jako całości nie jest optymalne ze względu na różne gradienty fiksacji między powierzchnią a rdzeniem. Co więcej, długotrwała ekspozycja na roztwór formaliny może mieć wpływ na białka korowe. Stąd powód, dla którego zdecydowaliśmy się naprawić poszczególne plasterki.

Decyzja o tym, która strona jest ustalona, a która zamrożona, zależy od pojedynczego banku (zawsze tego samego, losowo przypisanego lub przypisanego w zależności od tego, czy dzień sekcji jest parzysty czy nieparzysty)31,32,33,34,35. Tak więc analiza biochemiczna i histopatologiczna są przeprowadzane osobno na każdej półkuli. Ponieważ wiele chorób neurologicznych jest asymetrycznych, nasz BB oferuje unikalny protokół krojenia świeżych próbek: naprzemienne sekcje z pnia mózgu i z każdej półkuli móżdżku i mózgu są zachowywane jako materiał stały lub zamrożony; Stały wycinek na jednej półkuli odpowiada zamrożonemu na drugiej półkuli. Nasza metoda daje możliwość uzyskania pełnej charakterystyki histologicznej całego zamrożonego materiału oraz porównania wyników ze wszystkich obszarów obu stron. Jak wspomniano we wstępie, opisana metoda pozwala nam uzyskać jak najwięcej informacji z tkanki mózgowej. Co więcej, metoda ABB pozwala na podstawową, ale kompletną charakterystykę neuropatologiczną, obejmującą prawie wszystkie znane proteinopatie mózgu i patologię naczyniową. Ze względu na kontrowersyjną rolę urazów naczyniowych w określaniu zaburzeń poznawczych, zdecydowaliśmy się na zastosowanie podwójnej punktacji dla obciążenia naczyniowego30,53.

Jak wyjaśniono w protokole, stosujemy podejście multidyscyplinarne. Chociaż jest to metoda czasochłonna i pracochłonna, uważamy, że zapewnia kilka korzyści dla badań. Na przykład w poprzedniej pracy wykazaliśmy, że wysoki tHcy per se, czyli MTHFR C677T TT związany z allelem APOE-ε4, może być związany z dysfunkcjami wykonawczymi, a nie utratą pamięci81. Dlatego interesująca może być ocena osób z tym konkretnym profilem genetycznym na poziomie neuropatologicznym. Jest to przykład tego, jak takie pogłębione działania następcze są przydatne w tworzeniu nowych hipotez badawczych, które można zweryfikować poprzez badanie materiału biologicznego zgromadzonego w naszym banku. Kolejnym dowodem na to, że nasze podejście ma zalety, jest włączenie QEEG do rutynowych ocen, ze względu na jego oryginalność i względną łatwość użycia. Rzeczywiście, EEG wykrywa aktywność synaptyczną kory mózgowej poprzez rejestrowanie potencjałów elektrycznych dendrytów należących do korowych neuronów piramidowych82. QEEG można uznać za biomarker do szacowania aktywności synaptycznej kory mózgowej, która jest związana z funkcjami poznawczymi83. W szczególności spadek rytmów alfa w tylnej części mózgu przy ogólnym wzroście niższych częstotliwości (rytmy theta i delta) jest związany z rozpadem połączeń korowych. Należy wziąć pod uwagę, że większość badań korelacji diagnostycznych opierała się na diagnozie klinicznej, która jest jedynie prawdopodobną, a nie ostateczną diagnozą 84,85,86,87. Tylko w bardzo niewielu badaniach celowanych porównano dane dotyczące QEEG z obrazem neuropatologicznym w celu zbadania korelacji między wariantami QEEG i LTS88,89 oraz rozróżnienia między FTLD a AD83. Kończąc nasze badanie definicją diagnozy neuropatologicznej, możliwe jest prawidłowe zinterpretowanie poczynionych obserwacji dotyczących aktywności elektrycznej mózgu. Co więcej, wykonując seryjne QEEG u każdego badanego możemy śledzić wewnątrzosobniczą trajektorię fal EEG i ich korelacje z obrazem neuropatologicznym. Śledzenie indywidualnych modyfikacji aktywności elektrycznej kory mózgowej w czasie może prowadzić do lepszego zrozumienia jej znaczenia jako biomarkera rozpoczynającej się demencji.

Przyszłe zastosowania i kierunek metody
Wdrożenie dystrybucji tkanek jest jednym z naszych głównych celów perspektywicznych. W tym celu właśnie powołaliśmy komisję naukową, w skład której wchodzi dyrektor Fundacji GC (geriatra), pracownik naukowy neurologii z Uniwersytetu w Pawii, neurolog i patolog zarówno z Fundacji GC, jak i Szpitala Geriatrycznego ASP Golgi-Redaelli. Podczas dystrybucji tkanki mózgowej, szkiełek histologicznych i innych próbek biologicznych należy pamiętać, że dawcy wyrazili zgodę na dawstwo ze względu na potrzeby badań. Dystrybucja materiału powinna zatem odbywać się w sposób rozważny, zgodnie z opisem zawartym w Kodeksie postępowania BNE40. Każda ze stron składających wniosek o udostępnienie materiału powinna wskazać rodzaj i ilość potrzebnej próbki, przedstawić opis projektu badawczego oraz sposób wykorzystania próbek, a także, w miarę możliwości, przedstawić dowody potwierdzające wcześniejsze publikacje (w odniesieniu do umowy o przeniesieniu zob . rys. 9). Bank mózgów nie działa dla korzyści finansowych. W związku z tym opłaty uiszczane przez badaczy powinny pokrywać jedynie wydatki związane z pozyskiwaniem, przetwarzaniem, przechowywaniem i dystrybucją tkanek.

W planach jest rozpoczęcie analizy przypadków za pomocą sekwencjonowania egzomu i technik omicznych, takich jak proteomika i transkryptomika. Nasza alternatywna metodologia pobierania próbek pozwoli na przeprowadzenie badań omicznych na dobrze zdefiniowanych histologicznie tkankach z obu półkul. Dzięki takiemu podejściu możliwe będzie porównanie wzorca aktywacji genów w różnych obszarach mózgu tej samej półkuli i w odpowiadających im obszarach drugiej półkuli, a także będzie możliwe skorelowanie aktywacji genów z histopatologią. W tej dziedzinie dużym zainteresowaniem cieszyłyby się zastosowania uczenia głębokiego, w tym komputerowa analiza preparatów histologicznych oraz najnowocześniejsza korelacja danych klinicznych, histologicznych i omicznych. Można zidentyfikować inne korelacje między wieloma różnymi zmiennymi, a także inne możliwe zastosowania technologiczne. Dostępność zamrożonego materiału z obu półkul pozwoli na dokładne określenie topografii aktywacji genów i dystrybucji białek. Będzie to szczególnie interesujące nawet u osób zdrowych, biorąc pod uwagę, że zarówno funkcje mózgu, jak i niektóre choroby są asymetryczne.

Co więcej, możemy uzyskać kultury komórkowe od dobrze scharakteryzowanych dawców mózgu. Rzeczywiście, hodowle komórkowe z opon mózgowo-rdzeniowych pobranych mózgów dostarczają żywych komórek, które można wykorzystać do dalszych badań nad chorobami lub mechanizmami starzenia, za pomocą technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), która polega na przeprogramowaniu fibroblastów opon mózgowo-rdzeniowych i różnicowaniu ich w komórki nerwowe w zaawansowanych modelach90.

Wraz ze starzeniem się mózgu mogą zachodzić różne profile zmian na poziomie molekularnym, komórkowym i tkankowym. Każdy mózg jest wyjątkowy. Każdy z nich ma swój własny sposób reagowania na wewnętrzne i zewnętrzne czynniki stresogenne; Niektóre opierają się, podczas gdy inne ulegają i wykazują wyraźne patologie. Często występują rozbieżności między obrazem klinicznym a obrazem neuropatologicznym, ponieważ o obrazie klinicznym decyduje topografia zmian, a nie ich charakter molekularny. Prawidłowa i jednoznaczna diagnoza może być osiągnięta tylko poprzez połączenie zespołu klinicznego z objawami neuropatologicznymi, które często dostarczają ważnych wskazówek etiologicznych niezbędnych do rozwikłania patogenezy chorób. W Europie podejmowane są wysiłki na rzecz stworzenia standardowego podejścia do diagnostyki neuropatologicznej. Nasz protokół diagnostyczny jest prawie całkowicie zgodny z niedawno opublikowanymi wytycznymi dotyczącymi diagnozy neuropatologicznej dla bankowania mózgu91. Pozwoli nam to na gromadzenie i udostępnianie dobrze udokumentowanej tkanki mózgowej, a jej potencjalnym celem jest utworzenie pierwszego włoskiego banku mózgu. Rzeczywiście, we Włoszech istnieją repozytoria mózgu, ale nie ma banków mózgów opartych na badaniach kohortowych. Naszym celem jest opracowanie metody pobierania tkanki mózgowej, która może być wdrożona na szeroką skalę we Włoszech, aby stworzyć sieć, która wykorzystuje wspólny protokół i udostępnia porównywalny materiał. W tym celu zaangażowanie innych ośrodków badawczych oraz stworzenie specjalnej strony internetowej są jednymi z głównych celów na przyszłość.

Innowacyjne technologie są stale wykorzystywane do analizy molekularnego charakteru chorób neurodegeneracyjnych oraz do identyfikacji biomarkerów. W tym kontekście będzie rosło zapotrzebowanie na mózgi, którym będą towarzyszyć informacje o trajektoriach poznawczych i starzenia się uzyskane w badaniach podłużnych, podkreślając znaczenie neuropatologicznie zweryfikowanego podejścia epidemiologicznego92.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Pragniemy zadedykować tę pracę dr Micheli Mangieri. Zanim zmarła przedwcześnie, poczęła i rozpoczęła projekt Abbiategrasso Brain Bank Project.

Jesteśmy wdzięczni naszym dawcom mózgu, którzy hojnie wspierają badania, przekazując najszlachetniejszy organ swojego ciała; bez nich te badania nie byłyby możliwe.

Jesteśmy wdzięczni Valerii Marzagalli za jej cenną pracę w projekcie ABB.

Autorzy dziękują Prof. Johannesowi Attemsowi, Dr. Paolo Focianiemu i Dr. Giorgio Giaccone za ich cenne wskazówki i mądre rady.

Chcielibyśmy podziękować dr Alice Cirrincione i Pani Giulii Bortone za ich cenną pomoc podczas całego projektu.
Serdeczne podziękowania dla Pani Tere Cassani za wsparcie oraz dla "Federazione Alzheimer Italia" za współpracę.
Autorzy są wdzięczni dr Matteo Morettiemu i prof. Antonio Marco Marii Osculati z Wydziału Zdrowia Publicznego, Medycyny Doświadczalnej i Sądowej Uniwersytetu w Pawii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
50ml probówka stożkowa polipropylenowa 30x115mmBD405253
poliklonalne anty-GFAPDakoZ0334(anty-królik); rozcieńczenie = 1:1000
monoklonalne anty-NeuN (A60)ChemiconMAB377(anty-mysie); rozcieńczenie = 1:1000
Anty-fosfo TAU (AT8)TermoScientificMN1020( anty-mysz); rozcieńczenie = 1:200
Anty-fosfo TDP-43 (pS409/410-2)CosmoBioTIP-PTD-P02poliklonalne przeciwciało pierwszorzędowe (anty-królik) ; rozcieńczenie = 1:4000; obróbka wstępna: Trzyetapowe w kuchence mikrofalowej przez 2 min-1 min-2 min z buforem cytrynianowym 0,01M pH 6
Anty-&alfa;-SYN (KM51)NovocastraNCL-L-ASYNpierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne (anty-mysie); rozcieńczenie = 1:500; obróbka wstępna: 1) Trzyetapowe w kuchence mikrofalowej przez 2 min-1 min-2 min z buforem cytrynianowym 0,01 M pH 6; 2) 70% kwas mrówkowy w H2O przez 10 min
Anty-β amyloid (4G8)BioLegend800703monoklonalne przeciwciało pierwszorzędowe (anty-mysie); rozcieńczenie = 1:1000; obróbka wstępna: 70% kwas mrówkowy w H2O przez 10 min
Deska do krojeniaBD352070
DMEM High GlucoseCarlo ErbaFA30WL0101500medium
Piła elektryczna z ostrzem 5dCEA06.06.14/06.00.16
Elektroda pH mierzy powierzchnię 12mmCEA70064.250 Elektroda HHH
Igła pHFisher Scientific11796338
EnVision+System-HRPPrzeciwciałoK4001(przeciw myszy); rozcieńczenie 1:2
EnVision+System-HRPPrzeciwciałoK4003(anty-królik); rozcieńczenie 1:2
Eter etylowySMI8401530
Bezpieczne przycinanie piór ostrze noża 14cmFisher Scientific11749798
Płodowa surowica bydlęcaCarlo ErbaFA30WS1810500średni suplement; rozcieńczenie = 20%
Kleszcze 15cm chirurgiczne lub anatomiczneRękawice Uvex500XG
CEA01.28.14
KlejArcobaleno2624000800002
Podparcie głowyLacor60456
L-Glutamina (100X)Carlo ErbaFA30WX0550100średni suplement; rozcieńczenie = 1%
Miara zwijanaCEABISCEATA34
Nieadsorbowalny monofilament poliamidUHU Bostik8000053131470
Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Life Technologies11140050średni suplement; rozcieńczenie = 1%
Wstrzykiwacz/roztwór Strept (100X)Carlo ErbaFA30WL0022100średni suplement; rozcieńczenie = 1%
Igła rdzeniowa punkt końcówki quincke 20GA 3,50 CALA 0,9x90mmCEA03.06.16
Sterylny skalpel z n° 21 ostrzy
Miska chirurgicznaOlcelli FarmaceuticaA930857255
Młotek chirurgiczny i cisel chirurgicznyCEA79.68.88
Nożyczki chirurgiczneCEA27.08.45/79.68.64
PióroM130RC
Przeciwciało pierwszorzędowePierwszorzędowe przeciwciało Pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne drugorzędowe Dako drugorzędowe Dako

Bibliografia

  1. The Global Dementia Observatory Reference Guide World Health Organization. , at http://apps.who.int/bookorders (2018).
  2. Kasper, B. S., et al. Neuropathology of epilepsy and psychosis: the contributions of J.A.N. Corsellis. Brain: a journal of neurology. 133, Pt 12 3795-3805 (2010).
  3. Overy, C., Tansey, E. M. The development of brain banks in the UK. c.1970-c.2010. , Available from: www.histmodbiomed.org (2013).
  4. Tourtellotte, W. W., Itabashi, H. H., Rosario, I., Berman, K. The National Neurological Research Bank. A collection of cryopreserved human neurological specimens for neuroscientists. Annals of the New York Academy of Sciences. 436, 513-516 (1984).
  5. Tourtellotte, W. W., Rosario, I. P., Conrad, A., Syndulko, K. Human neuro-specimen banking 1961-1992. The National Neurological Research Specimen Bank (a donor program of pre- and post-mortem tissues and cerebrospinal fluid/blood; and a collection of cryopreserved human neurological specimens for neuroscientists). Journal of neural transmission. 39, Supplementum 5-15 (1993).
  6. Carlos, A. F., Poloni, T. E., Medici, V., Chikhladze, M., Guaita, A., Ceroni, M. From brain collections to modern brain banks: A historical perspective. Alzheimer's & dementia. 5, New York, N.Y. 52-60 (2019).
  7. Szymański, P., Markowicz, M., Janik, A., Ciesielski, M., Mikiciuk-Olasik, E. Neuroimaging diagnosis in neurodegenerative diseases. Nuclear medicine review. Central & Eastern Europe. 13 (1), 23-31 (2010).
  8. Nowak, D., Hofmann, W. K., Koeffler, H. P. Genome-Wide Mapping Of Copy Number Variations using SNP Arrays. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 36 (4), 246-251 (2009).
  9. Bush, W. S., Moore, J. H. Chapter 11: Genome-wide association studies. PLoS computational biology. 8 (12), 1002822(2012).
  10. Dirks, R. A. M., Stunnenberg, H. G., Marks, H. Genome-wide epigenomic profiling for biomarker discovery. Clinical epigenetics. 8 (1), 122(2016).
  11. Felsenfeld, G. A Brief History of Epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 018200(2014).
  12. Cogswell, J. P., et al. Identification of miRNA Changes in Alzheimer's Disease Brain and CSF Yields Putative Biomarkers and Insights into Disease Pathways. Journal of Alzheimer's Disease. 14 (1), 27-41 (2008).
  13. Lau, P., et al. Alteration of the microRNA network during the progression of Alzheimer's disease. EMBO molecular medicine. 5 (10), 1613-1634 (2013).
  14. Lowe, R., Shirley, N., Bleackley, M., Dolan, S., Shafee, T. Transcriptomics technologies. PLoS computational biology. 13 (5), 1005457(2017).
  15. Simpson, J. E., et al. Microarray analysis of the astrocyte transcriptome in the aging brain: relationship to Alzheimer’s pathology and APOE genotype. Neurobiology of aging. 32 (10), 1795-1807 (2011).
  16. Shevchenko, G., Konzer, A., Musunuri, S., Bergquist, J. Neuroproteomics tools in clinical practice. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 705-717 (2015).
  17. Patterson, S. D. Proteomics: evolution of the technology. BioTechniques. 35 (3), 440-444 (2003).
  18. Paraizo Leite, R. E., Tenenholz Grinberg, L. Closing the gap between brain banks and proteomics to advance the study of neurodegenerative diseases. Proteomics. Clinical applications. 9 (9-10), 832-837 (2015).
  19. Giacomelli, C., Daniele, S., Martini, C. Potential biomarkers and novel pharmacological targets in protein aggregation-related neurodegenerative diseases. Biochemical Pharmacology. 131, 1-15 (2017).
  20. Faghihi, M. A., Mottagui-Tabar, S., Wahlestedt, C. Genetics of neurological disorders. Expert review of molecular diagnostics. 4 (3), 317-332 (2004).
  21. Toft, M. Advances in genetic diagnosis of neurological disorders. Acta Neurologica Scandinavica. 129, 20-25 (2014).
  22. Kumar, D., Weatherall, D. J. Genomics and clinical medicine. , 651(2008).
  23. Han, G., Sun, J., Wang, J., Bai, Z., Song, F., Lei, H. Genomics in Neurological Disorders. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 12 (4), 156-163 (2014).
  24. Gere, C. A Brief History of Brain Archiving. Journal of the History of the Neurosciences. 12 (4), 396-410 (2003).
  25. Fratiglioni, L., Paillard-Borg, S., Winblad, B. An active and socially integrated lifestyle in late life might protect against dementia. Lancet neurology. 3 (6), 343-353 (2004).
  26. Spartano, N. L., et al. Association of Accelerometer-Measured Light-Intensity Physical Activity With Brain Volume. JAMA Network Open. 2 (4), 192745(2019).
  27. Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta neuropathologica. 115 (5), 497-507 (2008).
  28. Ravid, R., Park, Y. mok Brain banking in the twenty-first century: creative solutions and ongoing challenges. Journal of Biorepository Science for Applied Medicine. 2, 17(2014).
  29. Iacono, D., Geraci-Erck, M., Peng, H., Bouffard, J. P. Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), (2016).
  30. Deramecourt, V., et al. Staging and natural history of cerebrovascular pathology in dementia. Neurology. 78 (14), 1043-1050 (2012).
  31. Netherlands Brain Bank Information for tissue applicants. , Available from: https://www.brainbank.nl/media/uploads/file/Information for tissue applicants_2019.pdf (2019).
  32. UK Brain Bank Network Process used by the banks for tissue processing and storage. The UK Brain Bank Network protocol. , Available from: https://mrc.ukri.org/documents/pdf/process-used-by-the-banks-for-tissue-processing-and-storage/ (2019).
  33. Vonsattel, J. P. G., Del Amaya, M. P., Keller, C. E. Twenty-first century brain banking. Processing brains for research: the Columbia University methods. Acta neuropathologica. 115 (5), 509-532 (2008).
  34. A Tour Of The Brain Bank. Brain Bank. , Available from: https://hbtrc.mclean.harvard.edu/pdf/about/HBTRC-Tour-2013.2.pdf (2019).
  35. Sheedy, D., et al. An Australian Brain Bank: a critical investment with a high return! Cell and tissue banking. 9 (3), 205-216 (2008).
  36. Guaita, A., et al. Brain aging and dementia during the transition from late adulthood to old age: design and methodology of the "Invece.Ab" population-based study. BMC Geriatr. 13, 98(2013).
  37. Lobo, A., et al. Prevalence of dementia and major subtypes in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 4-9 (2000).
  38. Hofman, A., et al. The prevalence of dementia in Europe: a collaborative study of 1980-1990 findings. Eurodem Prevalence Research Group. Int J Epidemiol. 20 (3), 736-748 (1991).
  39. BrainNet Europe - Code of Conduct. , Available from: https://www.brainnet-europe.org/indexe151.html?_option=com_content_view=article_id=89_Itemid=89 (2008).
  40. Klioueva, N. M., Rademaker, M. C., Huitinga, I. Design of a European code of conduct for brain banking. Handbook of Clinical Neurology. 150, Elsevier B.V. (2018).
  41. Lee, K., Saetern, O. C., Nguyen, A., Rodriguez, L., Schüle, B. Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors. Journal of visualized experiments: JoVE. (119), (2017).
  42. Esiri, M. M., Wilcock, G. K., Morris, J. H. Neuropathological assessment of the lesions of significance in vascular dementia. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 63 (6), 749-753 (1997).
  43. Tomita, H., et al. Effect of agonal and postmortem factors on gene expression profile: quality control in microarray analyses of postmortem human brain. Biological psychiatry. 55 (4), 346-352 (2004).
  44. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: what quality markers matter. Brain research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  45. Montine, T. J., et al. National Institute on Aging-Alzheimer's Association guidelines for the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease: a practical approach. Acta Neuropathologica. 123 (1), 1-11 (2012).
  46. Boxer, A. L., Yu, J. T., Golbe, L. I., Litvan, I., Lang, A. E., Höglinger, G. U. Advances in progressive supranuclear palsy: new diagnostic criteria, biomarkers, and therapeutic approaches. The Lancet Neurology. 16 (7), 552-563 (2017).
  47. Dickson, D. W., Ahmed, Z., Algom, A. A., Tsuboi, Y., Josephs, K. A. Neuropathology of variants of progressive supranuclear palsy. Current opinion in neurology. 23 (4), 394-400 (2010).
  48. Dickson, D. Neurodegeneration: the molecular pathology of dementia and movement disorders. , Wiley-Blackwell. (2011).
  49. Crary, J. F., et al. Primary age-related tauopathy (PART): a common pathology associated with human aging. Acta neuropathologica. 128 (6), 755-766 (2014).
  50. Kovacs, G. G., et al. Aging-related tau astrogliopathy (ARTAG): harmonized evaluation strategy. Acta neuropathologica. 131 (1), 87-102 (2016).
  51. Alafuzoff, I., et al. Neuropathological assessments of the pathology in frontotemporal lobar degeneration with TDP43-positive inclusions: an inter-laboratory study by the BrainNet Europe consortium. Journal of neural transmission. 122 (7), Vienna, Austria. 957-972 (2015).
  52. Love, S., et al. Development, appraisal, validation and implementation of a consensus protocol for the assessment of cerebral amyloid angiopathy in post-mortem brain tissue. American journal of neurodegenerative disease. 3 (1), 19-32 (2014).
  53. Skrobot, O. A., et al. Vascular cognitive impairment neuropathology guidelines (VCING): the contribution of cerebrovascular pathology to cognitive impairment. Brain. 139 (11), 2957-2969 (2016).
  54. Thal, D. R., Rüb, U., Orantes, M., Braak, H. Phases of A beta-deposition in the human brain and its relevance for the development of AD. Neurology. 58 (12), 1791-1800 (2002).
  55. Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112 (4), 389-404 (2006).
  56. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD): Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-479 (1991).
  57. Finger, E. C. Frontotemporal Dementias. CONTINUUM: Lifelong Learning in Neurology. 22, 2, Dementia 464-489 (2016).
  58. Kovacs, G. G. Neuropathology of Neurodegenerative Diseases. , Cambridge University Press. Cambridge. (2014).
  59. Kovacs, G. G., et al. Neuropathology of the hippocampus in FTLD-Tau with Pick bodies: a study of the BrainNet Europe Consortium. Neuropathology and applied neurobiology. 39 (2), 166-178 (2013).
  60. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB Consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
  61. Beach, T. G., et al. Unified staging system for Lewy body disorders: correlation with nigrostriatal degeneration, cognitive impairment and motor dysfunction. Acta neuropathologica. 117 (6), 613-634 (2009).
  62. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies. Neurology. 89 (1), 88-100 (2017).
  63. Trojanowski, J. Q., Revesz, T. Neuropathology Working Group on MSA Proposed neuropathological criteria for the post mortem diagnosis of multiple system atrophy. Neuropathology and applied neurobiology. 33 (6), 615-620 (2007).
  64. Mackenzie, I. R. A., et al. A harmonized classification system for FTLD-TDP pathology. Acta neuropathologica. 122 (1), 111-113 (2011).
  65. Nelson, P. T., et al. Limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy (LATE): consensus working group report. Brain. 142 (6), 1503-1527 (2019).
  66. Josephs, K. A., et al. Staging TDP-43 pathology in Alzheimer's disease. Acta neuropathologica. 127 (3), 441-450 (2014).
  67. Rauramaa, T., et al. Consensus recommendations on pathologic changes in the hippocampus: a postmortem multicenter inter-rater study. Journal of neuropathology and experimental neurology. 72 (6), 452-461 (2013).
  68. Iacono, D., et al. Same Ages, Same Genes: Same Brains, Same Pathologies?: Dementia Timings, Co-Occurring Brain Pathologies, ApoE Genotypes in Identical and Fraternal Age-matched Twins at Autopsy. Alzheimer Disease & Associated Disorders. 30 (2), 178-182 (2016).
  69. Guaita, A., et al. Influence of socio-demographic features and apolipoprotein E epsilon 4 expression on the prevalence of dementia and cognitive impairment in a population of 70-74-year olds: The InveCe.Ab study. Archives of Gerontology and Geriatrics. 60 (2), 334-343 (2015).
  70. Stevens, M. Factors influencing decisions about donation of the brain for research purposes. Age and ageing. 27 (5), 623-629 (1998).
  71. Le Bouc, R., et al. Limiting Factors of Brain Donation in Neurodegenerative Diseases: The Example of French Memory Clinics. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 49 (4), 1075-1083 (2016).
  72. Samarasekera, N., et al. Brain banking for neurological disorders. The Lancet. Neurology. 12 (11), 1096-1105 (2013).
  73. Beach, T. G., et al. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: description and experience, 1987-2007. Cell and tissue banking. 9 (3), 229-245 (2008).
  74. Barnes, L. L., Shah, R. C., Aggarwal, N. T., Bennett, D. A., Schneider, J. A. The Minority Aging Research Study: ongoing efforts to obtain brain donation in African Americans without dementia. Current Alzheimer research. 9 (6), 734-745 (2012).
  75. de Lange, G. M., Rademaker, M., Boks, M. P., Palmen, S. J. M. C. Brain donation in psychiatry: results of a Dutch prospective donor program among psychiatric cohort participants. BMC psychiatry. 17 (1), 347(2017).
  76. Peuralinna, T., et al. APOE and AβPP Gene Variation in Cortical and Cerebrovascular Amyloid-β Pathology and Alzheimer's Disease: A Population-Based Analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (2), 377-385 (2011).
  77. Kawas, C. H. The oldest old and the 90+ Study. Alzheimer's & dementia: the journal of the Alzheimer's Association. 4, Suppl 1 56-59 (2008).
  78. Bennett, D. A., Schneider, J. A., Arvanitakis, Z., Wilson, R. S. Overview and findings from the religious orders study. Current Alzheimer research. 9 (6), 628-645 (2012).
  79. O'Brien, R. J., et al. Neuropathologic studies of the Baltimore Longitudinal Study of Aging (BLSA). Journal of Alzheimer's disease: JAD. 18 (3), 665-675 (2009).
  80. Jonkman, L. E., et al. Normal Aging Brain Collection Amsterdam (NABCA): A comprehensive collection of postmortem high-field imaging, neuropathological and morphometric datasets of non-neurological controls. NeuroImage: Clinical. 22, 101698(2019).
  81. Polito, L., et al. High homocysteine and epistasis between MTHFR and APOE: association with cognitive performance in the elderly. Experimental gerontology. 76, 9-16 (2016).
  82. Amzica, F., Lopes Silva, F. Cellular substrates of brain rhythms. Niedermeyer's Electroencephalography is now in its thoroughly updated sixth edition. , 33-63 (2009).
  83. Vecchio, F., et al. Resting state cortical EEG rhythms in Alzheimer's disease: toward EEG markers for clinical applications: a review. Supplements to Clinical neurophysiology. 62, 223-236 (2013).
  84. Gouw, A. A., et al. EEG spectral analysis as a putative early prognostic biomarker in nondemented, amyloid positive subjects. Neurobiology of Aging. 57, 133-142 (2017).
  85. Babiloni, C., et al. Abnormalities of cortical neural synchronization mechanisms in patients with dementia due to Alzheimer's and Lewy body diseases: an EEG study. Neurobiology of Aging. 55, 143-158 (2017).
  86. Bonanni, L., et al. Quantitative electroencephalogram utility in predicting conversion of mild cognitive impairment to dementia with Lewy bodies. Neurobiology of Aging. 36 (1), 434-445 (2015).
  87. Engedal, K., et al. Quantitative EEG Applying the Statistical Recognition Pattern Method: A Useful Tool in Dementia Diagnostic Workup. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 40 (1-2), 1-12 (2015).
  88. Caviness, J. N., Beach, T. G., Hentz, J. G., Shill, H. A., Driver-Dunckley, E. D., Adler, C. H. Association Between Pathology and Electroencephalographic Activity in Parkinson's Disease. Clinical EEG and Neuroscience. 49 (5), 321-327 (2018).
  89. Goossens, J., et al. EEG Dominant Frequency Peak Differentiates Between Alzheimer's Disease and Frontotemporal Lobar Degeneration. Journal of Alzheimer's Disease. 55 (1), 53-58 (2016).
  90. Bordoni, M., et al. From Neuronal Differentiation of iPSCs to 3D Neuro-Organoids: Modelling and Therapy of Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3972(2018).
  91. Alafuzoff, I. Minimal neuropathologic diagnosis for brain banking in the normal middle-aged and aged brain and in neurodegenerative disorders. Handbook of clinical neurology. 150, 131-141 (2018).
  92. Wharton, S. B., et al. Epidemiological Neuropathology: The MRC Cognitive Function and Aging Study Experience. Journal of Alzheimer's Disease. 25 (2), 359-372 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pobieranie tkanki m zgowejcharakterystyka neuropatologicznaprocedura sekcji m zgumetoda utrwalania tkanekprotok mro enia tkanekanaliza p ynu m zgowo rdzeniowegokrojenie p kul m zguocena histologicznabadania omiczne
Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.