Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów

Summary

Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program dawstwa mózgu i właściwą charakterystykę mózgów. Dawcy mózgu biorą udział w długoterminowym badaniu podłużnym, w tym w seryjnych ocenach wielowymiarowych. Protokół zawiera szczegółowy opis przetwarzania przez mózg i dokładną metodologię diagnostyczną.

Abstract

W stale starzejącej się populacji, częstość występowania zaburzeń neurodegeneracyjnych ma wzrosnąć. Zrozumienie mechanizmów choroby jest kluczem do znalezienia środków zapobiegawczych i leczniczych. Najskuteczniejszym sposobem, aby to osiągnąć, jest bezpośrednie badanie chorej i zdrowej tkanki mózgowej. Autorzy przedstawili protokół pozyskiwania, przetwarzania, charakteryzowania i przechowywania dobrej jakości tkanki mózgowej pobranej od osób zarejestrowanych w programie dawstwa mózgu antemortem. Program dawstwa obejmuje bezpośrednie empatyczne podejście do ludzi, zbiór uzupełniających się informacji klinicznych, biologicznych, społecznych i dotyczących stylu życia oraz seryjne wielowymiarowe oceny w czasie w celu śledzenia indywidualnych trajektorii normalnego starzenia się i pogorszenia funkcji poznawczych. Ponieważ wiele chorób neurologicznych jest asymetrycznych, nasz bank mózgów oferuje unikalny protokół krojenia świeżych próbek. Wycinki mózgu obu półkul są na przemian zamrażane (w temperaturze -80 °C) lub utrwalane w formalinie; Stały wycinek na jednej półkuli odpowiada zamrożonemu na drugiej półkuli. Dzięki takiemu podejściu można uzyskać pełną charakterystykę histologiczną całego zamrożonego materiału, a badania omiczne można przeprowadzić na dobrze zdefiniowanych histologicznie tkankach z obu półkul, oferując w ten sposób pełniejszą ocenę mechanizmów choroby neurodegeneracyjnej. Prawidłowe i jednoznaczne rozpoznanie tych chorób można osiągnąć tylko poprzez połączenie zespołu klinicznego z oceną neuropatomorfologiczną, która często dodaje ważnych wskazówek etiologicznych niezbędnych do interpretacji patogenezy. Ta metoda może być czasochłonna, kosztowna i ograniczona, ponieważ obejmuje tylko ograniczony obszar geograficzny. Niezależnie od jego ograniczeń, wysoki stopień charakteryzacji, jaki zapewnia, może być satysfakcjonujący. Naszym ostatecznym celem jest stworzenie pierwszego włoskiego Banku Mózgu, przy jednoczesnym podkreśleniu znaczenia neuropatologicznie zweryfikowanych badań epidemiologicznych.

Introduction

Według WHO, około 50 milionów ludzi cierpi obecnie na demencję, a liczba ta ma się potroić do 2050 roku. Choroba Alzheimera jest główną przyczyną demencji, a następnie choroby naczyń mózgowych i inne zaburzenia neurodegeneracyjne związane z wiekiem. W 2017 roku WHO opracowała Globalne Obserwatorium Demencji, aby zwiększyć świadomość na temat demencji i zachęcić do globalnego planu działania przeciwko niej¹. Każda osoba ma swoją własną trajektorię starzenia się mózgu, dlatego poszukiwanie lekarstwa może być trudne ze względu na złożoność patogenezy chorób neurodegeneracyjnych. Być może każda osoba posiada własną patogenezę zapisaną w tkance mózgowej, wymagającą spersonalizowanego podejścia. Tym samym badanie tkanki mózgowej będzie kluczem do zrozumienia mechanizmów neurodegeneracji.

Patrząc wstecz na historię neuronauki, zdajemy sobie sprawę, że najbardziej imponujące i przełomowe odkrycia nigdy nie mogłyby mieć miejsca bez bezpośredniego zbadania ludzkiego mózgu. Z biegiem czasu źródło tkanki mózgowej, która ma być badana, zmieniło się z prymitywnych sekcji, przypadkowych "przypadkowych spotkań" i, w niektórych przypadkach, nielegalnego handlu, na zorganizowane kolekcje mózgów i strategiczne nowoczesne banki mózgów. Uwzględnienie wielu aspektów etycznych jest jednym z głównych czynników odróżniających współczesne banki mózgów od zbiorów mózgów z przeszłości. Pierwsze prawdziwe nowoczesne banki mózgów (BB) zostały założone w drugiej połowie^{XX wieku.} Nicholasa Cornellisa i Wallace'a Tourtelotte'a można uznać za pionierów nowoczesnego bankowania mózgów. W Wielkiej Brytanii Corsellis zgromadził kolekcję zawierającą ponad 1000 dobrze udokumentowanych mózgów dotkniętych różnymi zaburzeniami psychicznymi i neurologicznymi². Co więcej, Corsellis pomógł ujawnić potrzebę zachowania świeżej tkanki mózgowej w lodzie na potrzeby badań biochemicznych³. W tym samym czasie w Stanach Zjednoczonych Wallace Tourtelotte wprowadził programy dawstwa mózgu antemortem, aby ułatwić pozyskiwanie potencjalnych dawców mózgu i zapewnić, że pobrane mózgi są opatrzone pełną historią medyczną i neurologiczną^4,5. Aby zapoznać się z historycznym przeglądem kolekcji mózgów i współczesnych kulek, zobacz Carlos et al.⁶.

Więc, dlaczego wciąż potrzebujemy ludzkich mózgów? Ostateczne rozpoznanie chorób mózgu można postawić dopiero po przeprowadzeniu badania neuropatologicznego. Neuropatologia stanowi wyzwanie dla rozpoznania klinicznego i jest kluczem do prawidłowej interpretacji objawów klinicznych oraz do odkrycia histologicznych podstaw nowych wariantów syndromicznych. Rzeczywiście, diagnozę można przedefiniować na podstawie obrazu patologicznego. Niemniej jednak wskaźnik autopsji spadł w ostatnich dziesięcioleciach ze względu na niedawny rozwój innowacyjnych technik neuroobrazowania. Dzięki obrazowaniu mózgu można ocenić in vivo morfologiczne, funkcjonalne i metaboliczne zmiany w mózgu, a także zakres nieprawidłowego fałdowania białek. Jednak neuroobrazowanie in vivo i inne badania biomarkerów mogą dać jedynie "oszacowanie" obrazu patologicznego, ponieważ nie są w stanie wykryć subtelnych zmian komórkowych i molekularnych. Postępy w obrazowaniu molekularnym i odkrycie nowych biomarkerów, cząsteczek docelowych i znaczników⁷ (np. amyloid, TAU, znaczniki mikrogleju) sprawiają, że ludzki mózg jest jeszcze bardziej niezbędny do interpretacji danych uzyskanych z ocen klinicznych i testów biomarkerów. Co więcej, technologie omiczne (genomika, epigenomika, transkryptomika, metabolomika, proteomika, lipidomika itp.), przeprowadzone na świeżej i zamrożonej tkance mózgowej, otworzyły nowe możliwości zrozumienia mechanizmów choroby i odkrycia genów ryzyka, nowych markerów diagnostycznych i prognostycznych oraz potencjalnych celów leków^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}.

Dla tych celów, nowoczesne BBs archiwizują dobrze scharakteryzowane, wysokiej jakości tkanki mózgowe, udostępniając je społeczności naukowej^3,24. Do mózgów dostarczanych przez kulki powinien być dołączony pełny wywiad kliniczny. Działalność BB obejmuje: (1) Rozpoznawanie i rekrutację osób chorych i zdrowych do programów dawstwa mózgu; Idealnym warunkiem byłoby osiągnięcie multidyscyplinarnej obserwacji dawców przez całe życie w celu uzyskania pełnego wywiadu klinicznego, stylu życia i historii społecznej oraz profili biomarkerów; Rzeczywiście, rezerwa poznawcza i struktura mózgu zależą od stylu życia i czynników społeczno-edukacyjnych^25,26, więc te informacje wzbogacają całość dostępnych danych. (2) Pozyskanie mózgu (składającego się z mózgu, móżdżku i pnia mózgu) oraz tkanek pokrewnych (np. rdzenia kręgowego, nerwów czaszkowych i zwojów mózgowych itp.) po śmierci dawcy, przy jednoczesnym przestrzeganiu znormalizowanych przepisów prawnych i etycznych. (3) Odpowiednie przetwarzanie (rozwarstwienie, utrwalenie, zamrożenie) mózgu, zgodnie z definicją zawartą w znormalizowanym protokole operacyjnym, w celu uzyskania wysokiej jakości tkanki i umożliwienia jej wykorzystania w przyszłości w badaniach multidyscyplinarnych. (4) Szczegółowa charakterystyka neuropatologiczna zapewniająca ostateczną ostateczną ostateczną diagnozę. (5) Przechowywanie i dystrybucja materiału tkankowego do społeczności naukowej^27,28.

Wszystkie kulki przechowują zarówno zamrożone, jak i zatopione w formalinie tkanki parafinowe. Każda kulka ma swój własny protokół. Z wyjątkiem konkretnych badań, takich jak protokół cięcia dwupółkulowego Instytutu Badań Biomedycznych (New Jersey)²⁹ oraz badanie Deramecourt's patologii naczyń mózgowych³⁰, największe kulki na świecie po prostu przecinają mózg, móżdżek i pień mózgu wzdłuż linii środkowej (płaszczyzny strzałkowej). Jedna połowa jest preparowana na świeżo, a następnie zamrażana do badań biochemicznych, podczas gdy druga jest utrwalana w formalinie w celu oceny histopatologicznej. Tak więc analizy biochemiczne i histopatologiczne przeprowadza się osobno na każdej półkuli. Decyzja o tym, która strona jest nieruchoma, a która zamrożona (lateralizacja), zależy od liczby pojedynczej bank^{31,32,33,34,35}. Ponieważ wiele chorób neurologicznych jest asymetrycznych, nasz BB oferuje unikalny protokół krojenia świeżych mózgów: sąsiednie sekcje pnia mózgu i każda półkula są na przemian unieruchamiane i zamrażane; Stały wycinek na jednej półkuli odpowiada zamrożonemu na drugiej półkuli. Dzięki tej metodzie optymalizuje się wykorzystanie tkanki mózgowej i można uzyskać pełną charakterystykę histologiczną całego zamrożonego materiału z możliwością uzyskania i porównania informacji histologicznych i biochemicznych ze wszystkich obszarów obu półkul.

Ramy naszego projektu banku mózgów to miasto Abbiategrasso. Abbiategrasso to małe miasteczko położone około 22 km na południowy zachód od Mediolanu, w północnych Włoszech. Liczy około 32 600 mieszkańców. Jest siedzibą Fundacji Golgi-Cenci (GC). GC Foundation jest częścią dużego Geriatrycznego Szpitala Rehabilitacyjnego (ASP Golgi-Redaelli) i jest instytutem skupiającym się na badaniach nad starzeniem się i opieką nad osobami starszymi. W szczególności koncentruje się na badaniu starzenia się psychicznego, czynników społecznych i behawioralnych wpływających na nie oraz biologii i patologii leżących u podstaw zależnych od wieku zaburzeń neuropoznawczych (NCD). W 2009 roku Fundacja GC rozpoczęła nowe badanie podłużne z udziałem 1321 uczestników (z 1644 uprawnionych osób: wskaźnik początkowej odpowiedzi 80,3%) urodzonych w latach 1935-1939 (w wieku 70-75 lat), pochodzenia kaukaskiego, mieszkających na tym samym małym obszarze geograficznym. Badanie zostało nazwane InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; w języku angielskim: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) i jest obecnie w toku. Planuje się, że w ramach projektu InveCe.Ab uzyska się kohortę o maksymalnej jednorodności i najmniejszej zmienności w celu oceny występowania, rozpowszechnienia i historii naturalnej demencji, wraz z jej możliwymi czynnikami ryzyka lub czynnikami ochronnymi, w tym zmiennymi behawioralnymi, psychospołecznymi, klinicznymi i biologicznymi³⁶. Charakterystyka kohorty jest pokazana w Rysunek 1 i Tabela 1. Dane epidemiologiczne są zgodne z trendem demencji w populacji europejskiej^37,38 i uczestnicy InveCe.Ab mają jednorodne cechy genetyczne i środowiskowe, co stanowi dobry model do badania trajektorii od normalnego starzenia się do zaburzeń neuropoznawczych. Rzeczywiście, jednorodne populacje wymagają mniejszej liczby podmiotów, aby osiągnąć odpowiednią moc statystyczną. Metodologia InveCe.Ab została już opisana w innym miejscu³⁶, ale ważne jest, aby podkreślić jej wielowymiarowe podejście poprzez okresowe kontrole (co 2-3 lata) przy użyciu tego samego zestawu ocen, w tym: pobieranie próbek krwi (panel metaboliczny, homocysteina i witaminy, ekstrakcja DNA w celu profilu apolipoproteiny E (APOE) i innych polimorfizmów genetycznych związanych z funkcjami poznawczymi i starzeniem się), pomiary antropometryczne (waga, wzrost i talia), test mówienia podczas chodzenia (test dwuzadaniowy), wywiad w celu oceny stylu życia (przestrzeganie diety śródziemnomorskiej, poziom aktywności fizycznej i zaangażowanie poznawcze) oraz czynniki społeczne (zaangażowanie społeczne, samotność), ocena neuropsychologiczna i ogólne badanie kliniczne. Porównanie takich danych podłużnych z pośmiertnymi danymi neuropatologicznymi miałoby kluczowe znaczenie dla badań. Dlatego nasz zespół, a w szczególności dr Michela Mangieri, opracował wspomniane powyżej podejście neuropatologiczne. Od 2014 r., podczas drugiej obserwacji, uczestnicy projektu InveCe.Ab byli proszeni o oddanie swoich mózgów, co doprowadziło do powstania Banku Mózgu Abbiategrasso (ABB). Głównymi darczyńcami ABB są uczestnicy InveCe.Ab, ale ABB jest teraz otwarta na innych darczyńców-wolontariuszy. Są to pacjenci z ASP Golgi-Redaelli, gdzie przebywa kilku pacjentów cierpiących na różne choroby neurologiczne lub dorośli ochotnicy, którzy dowiadują się o projekcie ABB i należą do tego samego obszaru geograficznego (Abbiategrasso i okolice). Wszyscy dawcy są poddawani temu samemu protokołowi oceny.

Autorzy proponują metodę śledzenia indywidualnych trajektorii normalnego starzenia się i możliwego postępu do chorób niezakaźnych, a także dokładnego zarządzania, przetwarzania i charakteryzowania mózgów nabytych od takich dawców, śledzonych podłużnie. Ponadto naszym celem jest spotykanie się i angażowanie osób w okresowe oceny neurologiczne, seminaria i działania edukacyjne dotyczące dobrostanu mózgu oraz zwiększanie ich świadomości na temat dawstwa mózgu w celach badawczych.

Protocol

Zgodnie z Komitetem ds. Etyki Badań Naukowych naszej instytucji oraz Kodeksem Postępowania BNE, ABB wykonuje swoje działania zgodnie ze standardami etycznymi^39,40. Procedura pobierania próbek mózgu została przedłożona i zatwierdzona przez Komisję Etyki Uniwersytetu w Pawii w kontekście badania InveCe.Ab ³⁶. Procedury badawcze były zgodne z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 r. i późniejszymi zmianami. Formularz zgody jest kompletny i łatwo zrozumiały. Dołączenie do programu darowizn jest osobistą decyzją i potrzebna jest pełna świadomość. W przypadku, gdy dana osoba nie zostanie uznana za kompetentną do podpisania formularza zgody, wymagana jest autoryzacja od opiekuna prawnego lub najbliższej rodziny (NOK). W Tabeli 2 przedstawiono kryteria włączenia i wykluczenia dawstwa mózgu. Badania zostały przeprowadzone pod nadzorem Federazione Alzheimer Italia.

1. Rekrutacja do programu dawstwa mózgu

1. Zwołaj osoby, które wyraziły zainteresowanie dawstwem mózgu oraz ich NOK i/lub opiekuna prawnego, aby przedstawić projekt (zakres programu dawstwa; proces usuwania, konserwacji, wykorzystywania i dystrybucji mózgu), prawo do wycofania się z programu w dowolnym momencie, ochronę anonimowości oraz strategie działania. Omów możliwość przeprowadzenia dodatkowych badań biomarkerów i testów genetycznych. Zwróć uwagę na życzenia potencjalnego dawcy lub jego NOK, aby być poinformowanym o wynikach.
2. Wyjaśnij wszystkie aspekty ekonomiczne, w tym brak korzyści finansowych zarówno dla Fundacji, jak i darczyńcy (mózgi są oddawane i dystrybuowane w sposób altruistyczny). Poinformuj ich, że ABB pokrywa koszty transportu ciała, podczas gdy rodzina pokrywa koszty pogrzebu, pochówku lub kremacji.
3. W przypadku przyjęcia darowizny należy uzyskać podpis zgody na udział w programie darowizn. Nadaj dawcy indywidualny kod numeryczny, aby zagwarantować anonimowość. Zapisz numer identyfikacyjny osób biorących udział w badaniu podłużnym i podaj inny kod dla banku mózgu, aby łatwo oddzielić dwie podgrupy dawców (uczestników lub osoby nieuczestniczące w badaniu podłużnym; zob. tabela 3).
4. Przekaż dawcy kartę identyfikacyjną, która deklaruje jego status jako dawcy i wyświetla numer telefonu (dostępny 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu), aby powiadomić Bank Mózgu o jego śmierci.

2. Ocena dawców i seryjne działania następcze

UWAGA: Możliwe jest wyrażenie zgody tylko na niektóre, a nie wszystkie, z niżej wymienionych egzaminów. Wszystkie oceny kliniczne są wykonywane przez ten sam zespół, w skład którego wchodzi neurolog, geriatra z doświadczeniem w neurologii i 3 psychologów. Jeśli pojawią się nowe objawy lub pogorszenie funkcji poznawczych postępuje, odstęp czasu między wizytami kontrolnymi może zostać skrócony.

1. Podobnie jak w przypadku badania InveCe.Ab, należy uzyskać kwestionariusz stylu życia i społeczny, obejmujący stopień autonomii (ADL, IADL), osobiste nawyki, czynniki społeczne i styl życia, które mogą wpływać na funkcje umysłowe. Zbieraj historię rodzinną, medyczną i neurologiczną wraz z informacjami dotyczącymi chorób genetycznych, infekcyjnych, toksycznych, metabolicznych, autoimmunologicznych, sercowo-naczyniowych, pourazowych, zwyrodnieniowych, nowotworowych i neurologicznych. Zbierz poprzednie badania kliniczne i wymień leczenie farmakologiczne.
2. Przeprowadź obszerną ocenę neuromotoryczną, w tym testy funkcji nerwów czaszkowych, dna oka, pola widzenia, siły i tonu mięśni, wrażliwości, odruchów ścięgnistych, odruchów eksteroceptywnych i prymitywnych, objawów oponowych, postawy, chodu, ruchów, koordynacji, funkcji zwieraczy oraz jakiejkolwiek obecności objawów ogniskowych lub Babińskiego. Oceń język, stan psychiczny i wszelkie zmiany w zachowaniu.
3. Przeprowadź obszerną ocenę neuropoznawczą, w tym poznanie globalne i pełną ocenę neuropsychologiczną określonych domen poznawczych: pamięci werbalnej i wzrokowej, uwagi, szybkości psychomotorycznej, języka, pamięci semantycznej, funkcji wykonawczych i zdolności wzrokowo-przestrzennych (szczegóły w tabeli 4). Weź pod uwagę obecność depresji (skala CES-D).
4. Pobrać próbkę krwi, która jest używana zarówno do analizy biochemicznej krwi (Tabela 5), jak i do izolacji i przechowywania DNA, osocza i komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Określenie genotypowania APOE (rs429358 i rs7412) (bardziej obszerne profilowanie genetyczne zostało określone u uczestników InveCe.Ab; patrz Tabela 6). Zarejestruj EKG (zmiany w sercu, migotanie przedsionków) i elektroencefalogram w stanie spoczynku do analizy ilościowej (QEEG).
5. Rozważ opcjonalne badanie biomarkerów, w tym płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) TAU, fosfo-TAU i β-amyloidu oraz obrazowanie mózgu (MRI w celu wykrycia in vivo zwyrodnienia, niedokrwienia lub stanu zapalnego; FDG-PET do wykrywania niewydolności metabolicznej; PIB-PET do wykrywania amyloidozy mózgu związanej z patofizjologią choroby Alzheimera).
6. Zaplanuj kolejny program badań kontrolnych dawcy mózgu. Ustaw przedziały czasowe według różnych grup wiekowych (do 64 lat: co 10 lat, 65–74 lata: co 3 lata, od 75 roku życia: co 2 lata).
7. Przypisz diagnozę kliniczną i/lub diagnozę neurokognitywną zgodnie z DSM-V. Klasyfikuj stopień zaawansowania klinicznej demencji za pomocą wyniku oceny demencji klinicznej (CDR). Zaktualizuj CDR w ostatnim okresie przed śmiercią.
8. Przygotuj bazę danych graficznie podobną do papierowej. Wstaw wszystkie zebrane dane do bazy danych Brain Bank. Zaplanuj korektę przez innego urzędnika, aby sprawdzić, czy nie ma błędów.

3. Czas śmierci i usunięcia mózgu

UWAGA: Włoskie prawo stanowi, że asystolia musi trwać dłużej niż 20 minut, aby potwierdzić zgon. Rejestracja płaskiego elektrokardiogramu (EKG) przez co najmniej 20 minut (zwana tanatografią) pozwala na przeprowadzenie sekcji zwłok w ciągu 24 godzin od zgonu (DPR 285/90 art. 8 i ustawa nr 578 z 29 grudnia 1993 r.). Czas analizy pośmiertnej wynoszący <24 godziny jest dobrym celem dla zachowania ogólnej jakości tkanek. W przypadku sekcji zwłok trwającej >30 godzin, sekcja zwłok zostaje anulowana (patrz Tabela 2). Zespół przeprowadzający sekcję zwłok składa się z patologa, neurologa i/lub neurobiologa, pielęgniarki, technika sali anatomicznej oraz wszystkich studentów odbywających staż; Dwaj pierwsi członkowie zespołu przeprowadzają również diagnostykę neuropatomorfologiczną. Podczas obchodzenia się ze zwłokami i ich sekcji obowiązkowe jest stosowanie odpowiedniej odzieży (płaszcz, rękawice, okulary i siatka na włosy). W tej sekcji opisujemy główne narzędzia i sprzęt zwykle używany w naszym laboratorium. Czytelnicy mogą wybrać instrumenty, które mają być używane według własnego uznania. Szczegółowy opis wykorzystanych materiałów znajduje się w Tabeli materiałów.

1. Upewnij się, że wybrana przez rodzinę agencja pogrzebowa przywiezie ciało do placówek ABB. Wykonaj tanatografię, podczas której czynność serca musi być nieobecna. Jeśli tak, podpisz akt zgonu i rozpocznij procedury autopsyjne.
2. Przewieź zwłoki do sali sekcji zwłok. Zmierz obwód czaszki na poziomie najszerszej części głowy. Zmierz od nasiona do wcięcia, aby uzyskać średnicę przednio-tylną (APD), podczas gdy odległość od jednego ucha do drugiego daje średnicę poprzeczną (TD). Oblicz wskaźnik głowowy (CI) za pomocą wzoru: CI = TD/APD x 100.
3. Za pomocą ostrego skalpela wykonaj nacięcie skóry głowy w płaszczyźnie koronalnej, od czubka wyrostka sutkowatego po jednej stronie do drugiej, przechodząc przez wierzchołek. Przetnij włosy, skórę i tkankę podskórną i ostrożnie oddziel dwa fałdy skóry głowy od dolnej części czaszki. Wykonuj nacięcie, aż żółty tłuszcz nadoczodołowy stanie się widoczny i odbije skórę głowy do przodu. Pociągnij drugą część do tyłu.
4. Za pomocą skalpela i kleszczy pobrać małą próbkę mięśnia skroniowego z każdej strony, umieścić jedną w 4% formaldehydzie, a drugą zamrozić (patrz punkt 7).
5. Przetnij czaszkę za pomocą piły elektrycznej po nacięciu w kształcie litery V po przedniej stronie. Zdejmij jarmułkę i przetnij opony mózgowe. Próbki opony twardej są utrwalane w 4% formaldehydzie i zamrażane (patrz punkt 7).
6. Uzyskaj około 10 ml płynu mózgowo-rdzeniowego, wprowadzając igłę o wadze 20 g 3,5 cala przez ciało modzelowate, aby dotrzeć do trzeciej komory. Oceń wygląd, kolor i zmętnienie płynu mózgowo-rdzeniowego i zmierz pH. Następnie należy przygotować 10 porcji po około 1 ml każdy i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
7. Podnieś mózg delikatnie ciągnąc za oba płaty czołowe i przetnij oba nerwy wzrokowe, lejki nerwu wzrokowego, tętnice szyjne wewnętrzne (ICA) oraz trzeci, czwarty, piąty i szósty nerw czaszkowy. Przeciąć tentorium, aby dotrzeć do tylnego dołu i przeciąć tętnice kręgowe i dolne nerwy czaszkowe. Wbij skalpel jak najgłębiej przez otwór wielki, aby przeciąć najbardziej ogonową część rdzenia. W tym momencie delikatnie usuń cały mózg.
8. Za pomocą skalpela przebij kość nad jaskinią Meckla i zdobądź ganglion Gassera z obu stron. Umocować jeden ganglion w 4% formaldehydzie, a drugi zamrozić (patrz punkt 7). Złam kostny sella turcica za pomocą młotka chirurgicznego i dłuta, aby usunąć przysadkę mózgową, a następnie utrwalić ją w 4% formaldehydzie.
9. Sprawdź czaszkę i cały mózg pod kątem zmian makroskopowych i zmian naczyniowych. Za pomocą taśmy mierniczej zmierz mózg, uzyskując średnicę poprzeczną i przednio-tylną. Ostrożnie pobrać krąg Willisa i ocenić go makroskopowo (ryc. 2E) pod kątem obecności wariantów anatomicznych, zmian chorobowych lub zwężenia naczynia.
10. Weź 1-2 kawałki opon mózgowo-rdzeniowych o długości 2-4^cm2 z wypukłości i przechowuj je w kompletnej pożywce hodowlanej Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy Eagle (DMEM) w temperaturze 4 °C zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% pen/paciorkowca, 1% glutaminy i 1% aminokwasów endogennych (jak wcześniej opublikowano, z pewnymi modyfikacjami)⁴¹.
    1. W celu uzyskania kultur fibroblastów należy umieścić opony mózgowo-rdzeniowe na 10 cm szalce Petriego i dwukrotnie przemyć roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), za każdym razem wyrzucając płyn.
    2. Za pomocą skalpela i końcówki pipety pokrój opony mózgowe na małe kawałki o średnicy około 2 lub 3 mm, wysiew 3-4 kawałki w każdym dołku 6-dołkowej płytki uprzednio pokrytej żelatyną o stężeniu 0,5% i napełnij każdą studzienkę 2 ml kompletnego podłoża uzupełnionego 1% amfoterycyny B (przeprowadzić przetwarzanie w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zagwarantować sterylność hodowli).
    3. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na co najmniej tydzień i zmieniać zużyte podłoże co 3-4 dni. Trypsynizuj komórki sterylną 1x trypsyną, gdy studzienka znajduje się na około 70% konfluencji. Umieść fibroblasty opon mózgowo-rdzeniowych w kolbie T75 i wypełnij ją 12 ml kompletnej pożywki. Po 5 dniach trypsynizuj i zakonserwuj je w 900 μl FBS i 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).
11. Oddziel i zbadaj mózg, móżdżek i pień mózgu, a następnie zważ je indywidualnie. Zdejmij szyszynkę i utrwal ją w 4% formaldehydzie. Usuń opuszki węchowe i nerwy wzrokowe i zamocuj lub zamroź po jednej z każdej pary, niezależnie od strony. Trzymaj mózg, móżdżek i pień mózgu w lodzie w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2–4 godziny, aż będą gotowe do sekcji, aby zminimalizować rozerwanie tkanek i zmniejszyć miękkość tkanek.
12. Po zbiorach zwróć odpowiednią uwagę i troskę o zwłoki. Ponownie przymocuj kość za pomocą kleju super adhezyjnego i zszyj skórę głowy za pomocą igły chirurgicznej i niewchłanialnych szwów.
13. Okaż szacunek i wdzięczność zmarłej osobie, delikatnie traktując zwłoki. Oczyść i ogol twarz oraz umyj i osusz włosy, ponieważ zwłoki zostaną złożone w otwartej trumnie widocznej dla bliskich.
    UWAGA: Rekompozycja zwłok jest wykonywana przez technika. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Protokół sekcji ABB

UWAGA: Ten sam patolog i/lub neurolog tnie pień mózgu, móżdżek i mózg pod dygestoriami. Neurobiolog układa plastry po pokrojeniu. Stażysta, który nie ma do czynienia z wycinkami mózgu, dokumentuje całą procedurę za pomocą zdjęć, które są przesyłane do bazy danych, aby służyć jako przewodnik podczas kolejnych faz przetwarzania tkanek.

1. Za pomocą noża preparacyjnego przeciąć pień mózgu osiowo i wykonać pierwsze cięcie na poziomie śródmózgowia rostralnego, przez górny wzgórek, aby uzyskać dwa plasterki odsłaniające istotę czarną (SN).
2. Wykonaj resztę cięć, aby uzyskać 8 mm plastry pnia mózgu, aby uzyskać około 10 sekcji. Należy uważać, aby uwzględnić nacięcia przechodzące przez most rostralny w pobliżu górnych brzegów czwartej komory, aby obserwować miejsce sinawe (LC) i przez rdzeń przedłużony poniżej prążków akustycznych tuż nad dolnym wierzchołkiem czwartej komory, aby mieć przekroje zawierające grzbietowe jądro ruchowe błędnika (DMNV).
3. Nazwij wszystkie plasterki w sensie rostrocaudalnym jako BS (pień mózgu), a następnie cyfry arabskie, aby zidentyfikować sekcje. Po ostatnim przekroju pnia mózgu użyj oznaczenia SC (rdzeń kręgowy), a następnie cyfr 1–n. Uzyskuje się około 2-4 wycinków SC w zależności od liczby usuniętych metamerów rdzenia (Rysunek 2H–I).
4. Oznacz wszystkie sekcje, które mają być na przemian naprawione lub zamrożone, i zrób zdjęcie do archiwum zdjęć (Rysunek 2). Następnie napraw i zamroź wszystkie plasterki zgodnie z poniższym opisem (kroki 4.7 i 4.8).
5. Przetnij móżdżek na płaszczyźnie strzałkowej, aby oddzielić dwie półkule móżdżku na poziomie robaka. Wykonaj cięcie strzałkowe, aby uzyskać 5 plasterków z każdej półkuli (Rysunek 2F–G).
6. Nazwij wszystkie plastry z robaka jako CBR lub CBL (odpowiednio dla prawego i lewego móżdżku) i użyj liczb arabskich do identyfikacji sekcji. Oznacz wszystkie sekcje, które mają być naprzemiennie naprawione lub zablokowane, i zrób zdjęcie do archiwum (Rysunek 2). Następnie napraw i zamroź wszystkie plasterki, jak opisano poniżej.
7. Oddziel dwie półkule mózgu przez ciało modzelowate (Ryc. 2A–B) i przekrój je pojedynczo na płaszczyźnie koronalnej. Wykonaj pierwsze cięcie w płaszczyźnie przechodzącej między skrzyżowaniem wzrokowym a ciałami sutkowymi, przez płat czołowy, biegun skroniowy, przedni zakręt obręczy, spoidło przednie, jądro Meynerta i zwoje podstawy.
8. Wykonaj drugie cięcie około 1 cm z tyłu, przechodząc przez ciała sutkowe i odsłaniając zwoje podstawy, przednie wzgórze, podwzgórze i ciało migdałowate. Kontynuuj krojenie, aby wyciąć przednie i tylne obszary, aby uzyskać 1 cm plasterki, aby uzyskać od 15 do 20 sekcji na każdą półkulę.
9. Połóż plastry na płaskiej powierzchni. Ułóż je zgodnie z ich pierwotnym położeniem w kierunku przednio-tylnym, od bieguna czołowego do potylicznego, z częścią ciągłą z poprzednim plasterkiem skierowanym do góry.
10. Porównując sekcje z obu półkul, wybierz naprzemienne sekcje z każdej półkuli, które mają zostać zachowane jako materiał utrwalony lub zamrożony. Rozpoznaj główne sekcje, które mają zostać naprawione i przetworzone do histopatologii, w tym płaty czołowe i skroniowe, obręcz, zwoje podstawy, jądro podstawne Meynerta, ciało migdałowate, wzgórze, hipokamp i kora śródwęchowa, zakręt potyliczno-skroniowy, płaty ciemieniowe i potyliczne.
11. Nazwij wszystkie plasterki w sensie przednio-tylnym jako L (po lewej) lub R (po prawej), a następnie cyfry arabskie i umieść etykietę wskazującą, czy plasterek ma być utrwalony, czy zamrożony (Rysunek 2A–D). Aby zidentyfikować sekcje, zrób zdjęcie do archiwum zdjęć. Następnie napraw i zamroź wszystkie plasterki zgodnie z opisem w sekcjach 7 i 8.

5. Badanie mózgu i naczyń krwionośnych oraz makroskopowa ocena patologiczna (gołym okiem)

1. Przeprowadź ogólne badanie makroskopowe z uwzględnieniem zmian opon mózgowo-rdzeniowych, rozlanego lub zlokalizowanego zaniku kory mózgowej, rozlanego lub zlokalizowanego zaniku kory mózgowej, atrofii hipokampa, powiększenia komór, atrofii móżdżku, atrofii pnia mózgu, istoty czarnej, zmian w istocie czarnej (określić rodzaj i lokalizację).
2. Zbadaj krąg Willisa pod kątem miażdżycy i okluzji. Przypisz wynik = 1 w obecności miażdżycy bez zwężenia większego niż 50%, wynik = 2, jeśli co najmniej jedna tętnica jest zamknięta w 50% lub więcej, wynik = 3, jeśli dwie lub więcej tętnic jest w 50% lub więcej niedrożnych⁴². Oceń obecność lub brak patologii w innych naczyniach wewnątrzczaszkowych.
3. Aby wykryć zmiany naczyniowe w miąższu, zbadaj półkule mózgu, móżdżek i pień mózgu. Rozważ zmiany lakunarne (średnica < 10 mm), zawały niedokrwienne lub krwotoczne oraz krwotok (średnica > 10 mm). Jeśli występuje, określ rozmiar w milimetrach, liczbę i lokalizację. Weź również pod uwagę obecność lub brak krwotoku podpajęczynówkowego.

6. Kontrola jakości tkanek

UWAGA: Wynik czynnika agonalnego (AFS) waha się od 0 do 2 i jest ważny w ocenie jakości tkanek. Aby określić AFS, należy wziąć pod uwagę stany kliniczne występujące w czasie śmierci (szczególnie stany determinujące kwasicę mózgu) i czas trwania stanu agonalnego (nagła śmierć lub przedłużająca się agonia). Jeśli AFS > 1, tkanka mózgowa może nie być optymalnej jakości⁴³. Weź również pod uwagę pH mózgu i płynu mózgowo-rdzeniowego; jeśli pH < 6, tkanka mózgowa może nie być optymalnej jakości^43,44.

1. Sprawdź, czy śmierć została spowodowana stanami, które mogą uszkodzić tkankę mózgową, w tym niedotlenieniem, przedłużającą się kwasicą, wentylacją mechaniczną, niewydolnością wielonarządową, wysoką gorączką, ciężkim urazem czaszki, spożyciem substancji neurotoksycznych, ciężkim odwodnieniem, ciężką hipoglikemią, stanem padaczkowym i przedłużoną śpiączką. Jeśli spełniony jest jeden z tych warunków, przypisz 1 punkt.
2. Sprawdź czas trwania stanu agonalnego (szybki, jeśli śmierć następuje w ciągu 1 godziny, pośredni, jeśli śmierć następuje między 1 a 24 godzinami, powolny, jeśli stan agonalny trwa dłużej niż 1 dzień). Jeśli zdarzy się pośrednia lub powolna śmierć, przypisz 1 punkt.
3. Oblicz wynik AFS i zmierz pH płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą elektrody, igły pH, a pH tkanek za pomocą pH-metru powierzchniowego na wycinku mózgu z każdego płata i na odcinku móżdżku.

7. Zamrażanie tkanek

1. Przechowywać wszystkie tkanki do zamrożenia w lodzie w temperaturze 4 °C. Następnie szybko je zamroź. Umieść je na wstępnie zamrożonej aluminiowej tacy. Przykryj zazębiającą się aluminiową płytą, aby utrzymać je płasko. Umieścić je w ciekłym azocie w temperaturze -120 °C na 3 minuty.
2. Umieść plastry w plastikowej torbie oznaczonej odpowiednim kodem identyfikacyjnym i numerem plasterka. Podziel plastikowe torby na trzy pudełka kriogeniczne (dla prawej półkuli, lewej półkuli i pnia mózgu) i przechowuj w temperaturze -80 °C.

8. Utrwalenie tkanek

1. Zawiń plastry w gazę jeden po drugim i włóż je do 10% roztworu formaliny buforowanej fosforanem. Po 1 dniu zastąp roztwór formaliny świeżym roztworem. Pozostawić je na około 5 dni w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C.
2. Zachowaj wszystkie plasterki jako całość i podziel tylko plasterki zawierające hipokamp i ciało migdałowate na dwie części (Rysunek 3). Górna część obu plastrów będzie zawierała płat czołowy (R10a–L9a w Rysunek 3); dolne części będą zawierały odpowiednio: (1) ciało migdałowate, płat skroniowy i zwoje podstawy (L9b w Rysunek 3B) oraz (2) hipokamp i część płata skroniowego (R10b w Rysunek 3A). Ma to na celu utrzymanie relacji między różnymi strukturami.
3. Umieść wszystkie sekcje w buforze fosforanowym na co najmniej 2 dni, aby wypłukać i usunąć produkty sieciujące.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

9. Odwodnienie, oczyszczanie, zatapianie parafiny i przygotowanie preparatu

1. Przygotuj rosnące stężenia alkoholu etylowego od 70% do 100%, ksylen i dwa zestawy stopionego wosku parafinowego. Umieść skrawki mózgu w automatycznym procesorze w celu odwodnienia, procedury oczyszczania i infiltracji parafiny (użyj dwóch różnych protokołów przetwarzania tkanek dla makro (plastry mózgu i móżdżku) i mikropróbek (wycinki pnia mózgu i inne małe próbki); Tabela 7). Osadź tkankę w wosku parafinowym na metalowej lub plastikowej formie.
2. Wybierz sekcje do pokrojenia, aby ocenić wszystkie obszary zainteresowania przy użyciu wskaźnika Montine'a do charakterystyki neuropatologicznej⁴⁵ (Tabela 8). Następnie pokrój wybrane sekcje na plasterki.
3. Do makrosekcji należy używać mikrotomu saneczkowego, a do małych przekrojów mikrotomu obrotowego. Wyciąć 5 μm plastry do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz 8 μm do innych barwień i immunohistochemii. Plastry układamy na trzech różnych rodzajach szkiełek histologicznych: 8,5 cm x 11 cm dla największych plastrów, 5 cm x 7,5 cm dla średnich plastrów i klasycznych 2,5 cm x 7,5 cm dla najmniejszych.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

10. Deparafinizacja, barwienie histologiczne i immunohistochemia (IHC)

1. Przeprowadzić deparafinowanie, aby umożliwić reakcję z wodnymi roztworami barwników. Wykonaj to za pomocą ksylenu i zmniejszającego stężenia alkoholu (5 minut na każdy krok). Nawadniaj przez 5 minut wodą destylowaną.
2. Do oceny nieprawidłowości architektonicznych i strukturalnych tkanek oraz morfologii komórek należy użyć następujących barwień histologicznych: H&E (dla mikroskopijnych zmian naczyniowych i stanów zapalnych), Fiolet krezylowy (NISSL; dla utraty neuronów), Luxol Fast Blue (LFB; dla demielinizacji), Gallyas (dla blaszek neurytycznych i nici neuropilowych).
3. Stosować immunohistochemię (IHC) w celu podkreślenia obecności określonych struktur docelowych. Anty-NeuN i anty-GFAP są używane do identyfikacji przedziałów neuronalnych i glejowych; 4G8, AT8, α-SYN i TDP-43 służą do identyfikacji białek, które agregują się w chorobach neurodegeneracyjnych (tabela materiałów).
   1. Wstępnie potraktuj odparafinowane skrawki 3% H₂O₂ przez 10 minut, a następnie spłucz w PBS. Przeprowadzić zabieg pobierania buforu cytrynianowego 0,01 M pH 6 (podgrzewany w kuchence mikrofalowej szeregowo przez 2, 1 i 2 minuty) dla antygenów 4G8, α-SYN, TDP-43 i NeuN; użyj 70% kwasu mrówkowego dla 4G8 i α-SYN. Wstępnie inkubuj przez 30 minut w 5% normalnej surowicy koziej.
   2. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem pierwszorzędowym. Następnego dnia przepłukać skrawki w PBS przed inkubacją przeciwciałem drugorzędowym (polimer znakowany Envision+ System-HRP) w rozcieńczeniu 1:2 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   3. Przemyć kilkakrotnie w PBS i inkubować w systemie chromogenowym z diaminobenzydyną (Liquid DAB+Substrate Chromogen System), obserwując rozwój reakcji pod mikroskopem (powiększenie 4–10x). Na koniec umyj sekcje w PBS. Przeciwbarwić skrawki w hematoksylinie, odwodnieniu i szkiełku nakrywkowym za pomocą mocowania DPX.
      UWAGA: Tabela 8 podsumowuje standardowy protokół. Wykonaj barwienie H&E na wszystkich sekcjach, podczas gdy specjalne/specyficzne barwienia i reakcje są stosowane na wybranych sekcjach. Wybrane przypadki wymagają dodatkowych obszarów lub reakcji. Tabela materiałów zawiera szczegółowe informacje na temat przeciwciał stosowanych w IHC.

11. Podstawowa charakterystyka neuropatologiczna

UWAGA: Badane są niespecyficzne zmiany w tkance mózgowej, patologia naczyniowa, patologia choroby Alzheimera (AD), TAUopatie niezwiązane z AD, synukleinopatie, patologia białka wiążącego DNA TAR (TDP-43) i zmiany w hipokampie. Mikroskop optyczny podłączony do kamery służy do wykrywania miąższowych zmian mikroskopowych. Ocena histologiczna jest wykonywana przez ten sam zespół przeszkolonego personelu w zakresie neuropatologii, w skład którego wchodzi profesor neurologii, neurolog i patolog. Opiera się na zmodyfikowanym podejściu Montine'a⁴⁵ (Tabela 8) obejmuje również: (1) Heterogenne TAUopatie niezwiązane z AD, które stanowią patologiczne znamię zwyrodnienia płata czołowo-skroniowego (FTLD) związane ze złożami TAU: choroba Picka, niepłynna pierwotna afazja postępująca (TAU-nfPPA), postępujące porażenie nadjądrowe (PSP)^46,47 i zwyrodnienie korowo-podstawne (CBD)⁴⁸. Ponadto, TAUopatie niezwiązane z AD obejmują stany związane ze starzeniem się i bez określonego znaczenia klinicznego, takie jak Pierwotna TAUopatia związana z wiekiem (CZĘŚĆ)⁴⁹, Age-Related TAU Astro-Gliopathy (ARTAG)⁵⁰, argyrofilna choroba zbóż⁴⁸. (2) Synukleinopatia typu Lewy'ego (LTS), która jest związana z chorobą Parkinsona (PD) i otępieniem z ciałami Lewy'ego (LBD). Aby wyszukać LTS, zastosuj następujące kroki hierarchiczne: najpierw opuszka węchowa, pień mózgu, ciało migdałowate/kora skroniowa; Jeśli poprzednie obszary są pozytywne, dodaj struktury limbiczne (tworzenie hipokampa, kora śródwęchowa, przedni zakręt obręczy), środkowy zakręt czołowy, dolny płat ciemieniowy i kora potyliczna⁴⁵. Jeśli występują kliniczne cechy korowego LBD (tj. fluktuacje i/lub halucynacje), w pierwszym kroku należy rozważyć struktury limbiczne i izokorę. (3) Depozyty TDP-43, patologiczna cecha charakterystyczna FTLD związana ze złożami TDP-43: behawioralny wariant otępienia czołowo-skroniowego (bvFTD), otępienie semantyczne (SD lub svFTD), TDP-nfPPA i choroba neuronu ruchowego FTD (FTD-MND). IHC dla TDP-43 wykonuje się na następujących odcinkach: ciało migdałowate, hipokamp, kora śródwęchowa i środkowy zakręt czołowy; w przypadkach z podejrzeniem klinicznego FTLD rozważ zbadanie innych sekcji⁵¹.

1. Oceń niespecyficzne zmiany w tkance mózgowej w wybranych sekcjach za pomocą H&E, NISSL, LFB i IHC dla GFAP i NeuN. Weź pod uwagę rozrzedzenie neuronów, neurony balonowate, gąbczastość, glejozę, utratę mieliny, obecność lub brak nacieków zapalnych lub nowotworowych. Określ najczęstszą lokalizację tych zmian.
2. W celu wykrycia mikroskopijnych zmian naczyniowych należy zbadać szkiełka H&E i LFB zawierające co najmniej dwa makroprzekroje półkuli (pierwszy przechodzi przez ciała sutkowe (cięcie Charcota) z płatami czołowymi i skroniowymi, zwojami podstawy, przednim wzgórzem, ciałem migdałowatym, a drugi przechodzi przez płat potyliczny), odcinek "kolankowaty" formacji hipokampa, jeden przekrój móżdżku, i wszystkie trzy główne odcinki pnia mózgu (poprzez istotę czarną, locus coeruleus i DMNV).
   1. Wykryj chorobę małych naczyń, w tym miażdżycę tętnic, lipohyalinozę, poszerzenie przestrzeni okołonaczyniowej, utratę istoty białej, angiopatię oponowo-rdzeniową i/lub miąższową i/lub kapilarną mózgowo-rdzeniową. Określ nachylenie (0–3) i dominującą lokalizację^42,52. Weź pod uwagę obecność lub brak wycieku hemosyderyny, mikrokrwawień i mikrozawałów.
   2. Oceń wpływ uszkodzenia naczyń krwionośnych na upośledzenie funkcji poznawczych za pomocą hierarchicznego schematu Deramecourta (zmiany w ścianach naczyń - choroba małych naczyń - zawały makroskopowe). W tej ocenie należy wziąć pod uwagę przekrój płata czołowego i skroniowego, zwoje podstawy i hipokamp (wynik 0–20)³⁰. Oszacuj również prawdopodobieństwo, że choroba naczyniowa mózgu przyczyniła się do upośledzenia funkcji poznawczych, korzystając z wyniku VCING (niski-pośredni-wysoki), uzyskanego przez uwzględnienie makroskopowych zawałów półkuli i choroby małych naczyń płata potylicznego, w tym umiarkowanego do ciężkiego stwardnienia tętnic i angiopatii amyloidowej⁵³.
3. Oceń patologię AD za pomocą IHC (4G8) pod kątem rozprzestrzeniania się amyloidu. Zdefiniuj etapy Thala (1–5)⁵⁴, zagregowana punktacja amyloidu (0–3)⁴⁵ i morfologia dla każdego miejsca (rozlana, ogniskowa, rdzeniowa).
   1. Oceń patologię AD Tau za pomocą IHC (AT8) i opisz dominującą morfologię dla każdego miejsca (splątki neurofibrylarne, nici neuropilowe, blaszki neurytyczne). Zdefiniuj stadium Braaka (I–VI +; znak dodatni wskazuje na obecność dodatkowych obszarów hiperfosforylowanej patologii Tau, które nie są zgodne z hierarchią Braaka)⁵⁵ i łączna punktacja (0–3)⁴⁵.
   2. Oceń blaszki neurytyczne za pomocą barwienia Gallyasa i wyniku CERAD (0–3)⁵⁶. Następnie zdefiniuj prawdopodobieństwo wystąpienia cech neuropatologicznych odpowiadających zespołowi klinicznemu AD za pomocą wyniku ERAD Amyloid-B raak-C (wynik ABC 0–3): none-low-intermediate-high⁴⁵.
4. Użyj AT8 IHC, aby zauważyć obecność lub brak patologii TAU niezwiązanej z AD, określając dominującą lokalizację i osobliwy obraz morfologiczny. Rozważ inkluzje neuronalne, takie jak splątki w kształcie płomienia lub kuliste, inkluzje kulisto-kuliste (tj. ciała Picka)⁵⁷, nici neuropilowe, dystroficzne neuryty, ziarna argyrofilowe; oraz inkluzje glejowe, takie jak astrocyty kępkowe, astrocyty kolczaste, blaszki astrocytowe, ciała zwinięte, inkluzje kuliste^58,59.
5. Użyj α-syn IHC, aby wykryć LTS (ciała Lewy'ego, blade ciała i neuryty Lewy'ego) na obszarach w powyższej uwadze. W przypadku pozytywnego wyniku należy zastosować klasyfikację McKeitha (0–4), aby ocenić nasilenie zmian ⁶⁰; następnie użyj etapów Beacha (I–IV) do dystrybucji topograficznej (opuszka węchowa, z przewagą pnia mózgu, z dominacją limbiczną, korą nową)⁶¹. Porównaj etapy Beacha i Braaka, aby zdefiniować związek między LBD a patologią AD^60,61,62.
6. Rozważ obecność lub brak inkluzji cytoplazmatycznych gleju (GCI; synukleinopatia glejowa typu innego niż Lewy), które są patologiczną cechą charakterystyczną atrofii wieloukładowej (MSA) i określ ich powszechną lokalizację⁶³.
7. Użyj TDP-43 IHC, aby wykryć osady TDP-43 w obszarach w powyższej notatce. Zidentyfikuj dominującą morfologię na miejsce: inkluzje cytoplazmatyczne neuronów (NCI), inkluzje neurytów dystroficznych (DN), inkluzje jądrowe (NII). Zdefiniuj wzór: A (dominujące NCI i DN: bvFTD i nfPPA); B (dominujące KIK: FTD-MND); C (dominujące długie DN: svPPA i bvFTD)^51,64. Użyj schematu Nelsona, aby zdefiniować obecność TDP-43 w przypadkach AD^65,66.
8. Oceń hipokamp, zaczynając od subiculum i sektora Sommera (CA1). Użyj wyniku Rauramaa (0–4): 1–2 odpowiednio dla mikrozawałów i makrozawałów; 3-4 odpowiadające odpowiednio umiarkowanej i ciężkiej utracie neuronów oraz atrofii hipokampa (stwardnienie hipokampa: HS). Zwróć uwagę na obecność lub brak patologicznych złogów białkowych (w kolejności malejącej częstości: pTAU, TDP-43, α-syn)⁶⁷.
9. Zdefiniuj diagnozę neuropatomorfologiczną i wprowadź wszystkie dane patologiczne do bazy danych.
   UWAGA: Pomieszczenia, w których przechowywany jest materiał biologiczny i dane wrażliwe dawców, są zawsze zamknięte i wstęp do nich mają tylko upoważniony personel, w celu zagwarantowania zarówno bezpieczeństwa, jak i prywatności. Zamrożony materiał biologiczny jest przechowywany w zamkniętych zamrażarkach w temperaturze -80 °C, natomiast tkanki zatopione w parafinie utrwalone w formalinie są przechowywane w zamkniętych szafach w temperaturze pokojowej. Stosowane są zamrażarki z podwójnym silnikiem, a także zamrażarka zapasowa. Ponadto, aby zamrażarki zawsze działały, są one wyposażone w system monitorowania 24/7, który uruchamia alarm. Obecny jest również generator awaryjny na wypadek awarii zasilania. Uczestnicy są anonimizowani za pomocą kodu numerycznego, aby zapewnić im prywatność; Nieupoważniony personel nie ma możliwości powrotu do tożsamości dawców i ich wrażliwych danych. Wszystkie informacje są gromadzone w bazie danych chronionej hasłem; Podobnie, papierowa kopia tych danych jest przechowywana w zamkniętych archiwach.

Results

Dawcy mózgu i dane o pozyskiwaniu mózgów
W 2014 r. rekrutacja dawców rozpoczęła się podczas drugiej obserwacji InveCe.Ab, w której wzięło udział 1010 z 1061 uprawnionych osób (odsetek odpowiedzi: 93%; Rysunek 1). W odniesieniu do badania podłużnego InveCe.Ab 290 z 1010 uczestników (28,7%) wyraziło zgodę na rejestrację jako dawcy (160 już zarejestrowanych i 130 wyraziło zamiar rejestracji). Poziom wykształcenia jest wyższy u darczyńców niż u osób niebędących darczyńcami (66% naszych darczyńców ma średnio-wysoki poziom wykształcenia: 8 lub więcej lat szkoły), co wskazuje na znaczenie kultury i edukacji. Wiele "zdrowych" osób również wykazało zainteresowanie programem dawstwa mózgu. Większość naszych "kontrolnych" przyznaje, że potrafi współczuć chorym i ich krewnym, a także chce w jakiś sposób przyczynić się do badań prowadzących do lepszego zrozumienia chorób neurologicznych. Bezinteresowni ludzie, którzy za życia regularnie angażują się w programy dawstwa krwi lub szpiku, są bardziej otwarci na ideę dawstwa mózgu, podobnie jak osoby, które już zgodziły się na oddanie narządów po śmierci. Zdają sobie sprawę z tego, że choć nie znalazłby się żywy biorca, to ich dawstwo miałoby ogromne znaczenie dla badań. Innym czynnikiem przyczyniającym się do dawstwa mózgu jest preferencja do kremacji. Obecnie populacja dawców ABB liczy łącznie 427 osób (290 uczestników InveCe.Ab + 137 ochotników lub pacjentów ze Szpitala Geriatrycznego ASP Golgi-Redaelli), z których 75% to osoby w wieku 70 lat lub starsze. Wyraźna jest przewaga kobiet (64%) i osób w podeszłym wieku (ok. 85%). Do tej pory pobrano 27 mózgów od 40 zmarłych dawców (67% odsetek autopsji); 13 osób nie zostało poddanych autopsji z różnych powodów, w tym niezgłoszenia zgonu do ABB, poważnych obrażeń prowadzących do zniszczenia mózgu, niebezpiecznych chorób zakaźnych i 1 przypadku CJD; 4 osoby wycofały swoją zgodę. Do tej pory 24 z 27 pobranych mózgów otrzymało pełną charakterystykę neuropatomorfologiczną z jednoznaczną diagnozą kliniczno-patologiczną, podczas gdy pozostałe 3 mózgi są nadal badane (Tabela 3). Dodatkowe dane dotyczące pozyskiwania mózgów z ABB obejmują: średni wiek w chwili śmierci (81 lat); średni odstęp między badaniami poubojowymi (10,37 h); średnie pH płynu mózgowo-rdzeniowego (6,64); średnie pH tkanek (6,07); średnia masa mózgu (1012,86 gr); AFS występował u 1 na 90% zmarłych pacjentów.

Biomarkery neurofizjologiczne (QEEG)
QEEG wpisuje się w podejście wielowymiarowe. Jest to prosta, nieinwazyjna i niedroga metoda, z prawdopodobnym potencjałem do wykrycia konwersji z łagodnego zaburzenia neuropoznawczego (łagodne NCD lub MCI) do dużego zaburzenia neuropoznawczego (główne NCD lub demencja). Dzięki naszemu wielowymiarowemu podejściu przeprowadzane jest zwykłe badanie QEEG i badana jest jego możliwa rola jako biomarkera demencji. Nasze dane dotyczące wstępnej serii 36 dawców mózgu (18 osób w podeszłym wieku (NOLD), 11 osób z łagodnym NCD i 7 z dużą liczbą dawców NCD; z których 9 miało jednoznaczne rozpoznanie neuropatologiczne) wskazują, że średni odsetek rytmu alfa był znacznie niższy w przypadku dużej choroby niezakaźnej w porównaniu z łagodnym NCD (p: 0,002) i NOLD (p: 0,033). I odwrotnie, wolniejsze częstotliwości EEG (theta/delta) były znacznie wyższe w przypadku głównego NCD niż w NOLD/łagodnego NCD (patrz przykładowe przypadki w Ryc. 4). W naszej serii rozkład rytmu EEG może różnicować pacjentów z NOLD/łagodną chorobą niezakaźną od pacjentów z dużym NDC niezależnie od rozpoznania etiologicznego, co sugeruje, że na rytmy mózgu wpływa obciążenie zmianami zwyrodnieniowymi niezależnie od rodzaju zmiany. Rzeczywiście, 7 z 9 badanych mózgów wykazuje demencję z powodu mieszanych patologii. Specyficzność dotycząca charakteru patologii wydaje się być niska, a na rytmy elektryczne mózgu wydaje się mieć większy wpływ obciążenie i topografia zmian niż ich molekularny charakter (Poloni i wsp. Proceedings of AD/PD 2019, Lizbona, dane niepublikowane).

Emblematyczne przypadki
Protokół ABB może być przydatny i konieczny w niektórych przypadkach i warunkach. Przykładem jest obecność patologii asymetrycznej (Rysunek 5). Nasz protokół jest bardzo odpowiedni do identyfikacji i właściwej charakterystyki tego typu patologii. Do tej pory zbadaliśmy 4 mózgi z asymetrycznym zaangażowaniem, z których niektóre są pokazane na Rysunek 5. Makroskopowo, atrofia prawej strony (Rysunek 5A) występuje w jednym przypadku z ciężkim poszerzeniem komory w prawym odcinku koronalnym (Rysunek 5C) w porównaniu z lewą stroną ( Rysunek 5B). W innym przypadku widoczny jest zawał prawej półkuli (Ryc. 5D), a w innym wyraźny zanik prawego ciała sutkowego (Ryc. 5E). Na poziomie mikroskopowym przypadek FTLD wykazuje asymetryczną dodatniość TDP-43, która jest bardziej intensywna po prawej stronie czołowej w porównaniu z lewą (Rysunek 5F,G).

Makrosekcje (Rysunek 6A,C) są używane do uzyskania ogólnego widoku. Barwienie LFB pomaga zidentyfikować utratę mieliny (Rysunek 6D) i IHC zarówno dla 4G8, jak i AT8 ( Figura 6B) pozwala ocenić rozkład immunoreaktywności w półkulach gołym okiem. W serii ABB dostępne są mózgi spokrewnionych osób, które można porównać.

W Rysunek 7, mikroskopowe obrazy fragmentów mózgów bliźniąt homozygotycznych są umieszczone obok siebie dla łatwiejszego porównania (bliźniak 1 (BB137): Rysunek 7A,C,E,G,I,K kontra bliźniak 2 (BB138: Rysunek 7B,D,F,H,J,L). Podobnie jak w podobnym poprzednim badaniu⁶⁸, oba bliźnięta porównano za pomocą oceny klinicznej i neuropatologicznej. Bliźnięta zgłosiły tę samą diagnozę dużej choroby niezakaźnej z powodu wielu etiologii, ale zmarły w odstępie dwóch lat, odpowiednio w wieku 83 lat (początek demencji w wieku 72 lat) i 85 lat (początek demencji w wieku 76 lat). Ich mózgi mają bardzo podobny obraz neuropatologiczny, z wysoką patologią AD związaną z angiopatią amyloidową. Immunoreaktywność 4G8 jest rozproszona w całej korze mózgowej (Ryc. 7A,B) i zwojach podstawy (Ryc. 7C, D) z rozproszonymi, gęstymi i rdzeniowymi blaszkami. Jest również wyraźnie wykrywany zarówno w naczyniach miąższowych, jak i opon mózgowo-rdzeniowych kory mózgowej i móżdżku (Ryc. 7A,B,G–J). Przy większym powiększeniu capCAA jest wyraźnie widoczny (Rysunek 7G,H). Immunododatnie blaszki, splątki i nici AT8 są rozproszone w korze ciemieniowej obu mózgów (Ryc. 7E, F, L). Jeśli chodzi o obciążenie patologią amyloidu i NFT, bliźniak 1 jest uważany za stadium Thala 3 (montyna A2) i stadium Braaka 5 (montyna B3), podczas gdy bliźniak 2 jest uważany za stadium Thala 5 (montyna A3) i stadium Braaka 6 (montyna B3). Mieli te same lata edukacji i podobny styl życia; jednak jeden (BB137) był żonaty i wkrótce owdowiał, podczas gdy drugi był samotny (BB138). Wykazywały one różne stopnie zmienności kliniczno-patologicznej przy tym samym początku i tym samym przebiegu choroby, ale w różnych ramach czasowych. Potwierdza to fakt, że chociaż komponent genetyczny odgrywa kluczową rolę w rozwoju choroby, komponent epigenetyczny i środowiskowy mają fundamentalne znaczenie w określaniu nieco innych objawów.

W niektórych przypadkach obraz kliniczny nie odpowiada cechom neuropatologicznym. W Rysunek 8, dwa różne przypadki zostały klinicznie zdefiniowane jako przypadki AD; Analizy neuropatologiczne wykazują, oprócz pośredniej patologii AD, rozlaną dodatniość dla α-syn. W pierwszym przypadku ciężkie zdjęcie LTS (Beach IV) pokazuje ciała Lewy'ego jednorodnie znalezione w całym zakręcie cingoli (Figura 8A) i w SN jako inkluzje cytoplazmatyczne otoczone neuromelaniną ( Figura 8B, C). W drugim przypadku ciała Lewy'ego związane z neurytami Lewy'ego są rozproszone w ciele migdałowatym (Ryc. 8D,E) i w jądrze Meynerta (Figura 8F,G), co sugeruje limbiczną diagnozę LTS. Rzeczywiście, topografia zmian, a nie ich molekularny charakter, powoduje objawy kliniczne.

Rysunek 1: Schemat blokowy badania Inve.Ce.Ab. Na początku badania ogólna częstość występowania otępienia wynosiła 3%. W trakcie obserwacji wskaźniki rozpowszechnienia wynosiły: 4,4% (1^st)⁶⁹, 7,1% (2^nd), 10,9% (3^rd). Ośmioletni wskaźnik zapadalności wynosił 15 p/1000/rok (95% CI: 13–18 p/1000/rok). Rekrutacja dawców rozpoczęła się w 2014 r. (podczas drugiej obserwacji). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Protokół rozwarstwienia mózgu (A), móżdżku (F) i pnia mózgu (H). Krąg Willisa i pojedyncze półkule pokazane są w (E) i (B). Przecięcia koronalne prawej (C) i lewej strony (D) są ponumerowane i na przemian stałe ("F") i zamrożone ("C"). Pokazano strzałkowe przekroje móżdżku (G) i przekroje osiowe pnia mózgu (I). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Pokazano wycinki koronalne nieruchomego prawego (A) i lewego (B) płata czołowo-skroniowego.
Hipokamp i płat skroniowy (A, R10b) są oddzielone od płata czołowego (A, R10a) na prawym przekroju. Na przeciwległym przekroju ciało migdałowate i zwoje podstawy (B, L9b) są oddzielone od płata czołowego (B, L9a). Podziałka: 1,7 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Względny rozkład mocy spektralnej u pacjentów z NOLD i głównymi chorobami niezakaźnymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Reprezentatywne obrazy patologii asymetrycznych. (A) Pierwszy przypadek: mózg z atrofią prawą. Plastry koronalne (B) i (C) wykazują prawostronne poszerzenie komór szczególnie widoczne w sekcjach 10–12 (C, strzałki). W sekcjach (B) i (C) "F" oznacza stałe, a "C" - mrożone (po włosku: congelato). (D) Drugi przypadek: ciężki zawał prawej półkuli. (E) Trzeci przypadek: zanik prawego ciała sutkowego (strzałka). (F, G) Czwarty przypadek: obrazy mikroskopowe wykazują bardziej intensywną immunoreaktywność TDP-43 w prawej korze czołowej (G) w porównaniu z lewą (F) w przypadku otępienia czołowo-skroniowego. Podziałka skali: 183 μm (F, G). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 6: Makrosekcje. (A, C) Przekroje koronalne stałego płata czołowo-skroniowego (A) i świeżego płata ciemieniowego (C). (B) Histologiczny odcinek czołowo-skroniowy znakowany immunologicznie przeciwciałem AT8. Immunoreaktywność jest wyraźnie rozłożona w całej korze mózgowej, ale bardziej intensywna w płacie skroniowym. (D) Histologiczny wycinek ciemieniowy barwiony LFB. Strzałka wskazuje obszar demielinizacji istoty białej. Podziałka: 1,55 cm (B, D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Bliźnięta. Porównanie mózgów dwóch bliźniąt homozygotycznych: BB137 (A, C, E, G, I, K) i BB138 (B, D, F, H, J, L). Obrazy neuropatologiczne są bardzo podobne. (A) i (B) wykazują rozlaną dodatniość 4G8 w płacie potylicznym z blaszką amyloidową, naczyniami oponowo-rdzeniowymi (strzałki) i miąższowymi (groty strzał). Angiopatia amyloidowa włośniczkowa (gwiazdki) jest dobrze rozpoznawana przy większych powiększeniach (G) i (H). 4G8 jest rozlany w zwojach podstawy (C, D) i wokół naczyń oponowo-rdzeniowych móżdżku (I, J: strzałki). Immunoreaktywność AT8 identyfikuje splątki, nitki i blaszki (strzałki) w korze ciemieniowej (E, F). Barwienie Gallyasa (K) ujawnia blaszki neurytyczne, podobnie jak przeciwciało AT8 (L). Podziałka skali: 470 μm (A–F; I–J); 90 μm (G–H; K–L). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Diagnoza kliniczna a diagnoza neuropatologiczna. Na tym rysunku przedstawiono dwa różne przypadki, w których rozpoznanie neuropatologiczne różni się od rozpoznania klinicznego. Immunoreaktywność α-syn jest nieoczekiwanym wynikiem. (A–C) Przypadek pierwszy: Gyrus cingoli (A) wykazuje jednorodny rozkład ciał Lewy'ego w SN (strzałki B). W neuronie SN pokazane jest podwójne ciało Lewy'ego otoczone neuromelaniną (C). (D–G) Drugi przypadek: Dylacyjna dodatniość dla α-syn jest wykrywalna w ciele migdałowatym (D, E) i jądrze Meynerta (F, G). Ciała komórkowe i neuryty Lewy'ego (gwiazdka) są dobrze oznaczone. Podziałka liniowa: 154 μm (A, D, F); 37 μm (B, E, G); 20 μm (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Wzór umowy przeniesienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

TGL pkt. szt. pkt. SZT. TGL Rozdział pkt. szt. pkt. TGL pkt. TGL pkt. SZT. pkt. SZT. pkt.

		n	%
Płeć	Mężczyźni	Okręg wyborczy 607	45,9
	Kobiety	714	54,1
Kohorta urodzeniowa	Rok 1935	236	Rozdział 17,8
	Rok 1936	Rozdział 219	Rozdział 16,6
	Rok 1937	Rozdział 264	20,0
	Rok 1938	Rozdział 305	Rozdział 23,1
	Rok 1939	Rozdział 297	22,5
Stan cywilny	zamężna	872	66,1
	Konkubinatu	13	1,0
	Separacja/Rozwiedziony	29	2.2
	Owdowiały	Rozdział 325	Rejon 24,6
	pojedynczy	Rozdział 80	6.1
Podstawowe zajęcie życia	Pracownicy fizyczni	666	50,6
	Pracownicy umysłowi	Okręg wyborczy 459	34,9
	gospodyni domowa	Rozdział 191	14,5
Lata edukacji	≤5 lat	754	57,2
	>5 lat	565	42,8

Tabela 1: Cechy społeczno-demograficzne uczestników badania InveCe.Ab.

KRYTERIA WŁĄCZENIA	KRYTERIA WYKLUCZENIA
Wszystkie osoby w wieku 18 lat i starsze	Osoby, które kategorycznie odmawiają dawstwa
Osoby mieszkające na terytorium Abbiategrasso	Osoby mieszkające poza regionem Lombardii
Wolontariusze, którzy samodzielnie wyrażają zgodę	Rozbieżności między życzeniami potencjalnego dawcy a NOK dotyczącymi dawstwa mózgu
Podmioty, które nie mogą decydować za zgodą NOK	Sytuacje, które bardzo niszczą spójność mózgu
Śmierć z przyczyn naturalnych	Przebieg kliniczny trwający <2 lata, chyba że wykluczono możliwość wystąpienia choroby prionowej
	Śmierć spowodowana zabójstwem lub samobójstwem, z koniecznością sporządzenia raportu koronera
	Przerwa między ubojami >30 godzin

Tabela 2: Kryteria dawstwa mózgu.

pkt. Rozdział Rozdział Rozdział pkt. Rozdział pkt. Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział

Nr	płeć	KOD BB	KOD InveCe	wiek	edu (lata)	diagnoza kliniczna			Cdr	Afs	PM (godz.)	pH tkanki	Ciecz pH	diagnoza neuropatologiczna
1	Z	BB 37		Rozdział 87	5	Główne-NCD z powodu AD (BPSD)			5	cyfra arabska	29	Nd	Nd	Wysoka patologia AD, umiarkowana SVD, TDP43+, ctx LTS, HS
cyfra arabska	Z	BB 105		94 Rozdział 94	5	Główne-NCD z powodu AD			5	1	5	Klasa 5,72	6,78	Wysoka patologia AD, łagodne SVD, HS
3	Z	BB 137		Rozdział 83	3	Major-NCD ze względu na wieloraką etiologię (AD-VaD)			5	1	16	Nd	Nd	Wysoka patologia AD, umiarkowane SVD, zawał potyliczny, CAA-capCAA
4	M	BB 181		71 Rozdział 71	13	Główne-NCD z powodu AD (BPSD)			5	cyfra arabska	3	Nd	Nd	Ciężki LTS (Plaża IV), pośrednia patologia AD, łagodne SVD, mCAA
5	M	BB 115	I 636	78 Rozdział 78	Rozdział 18	Główne-NCD z powodu AD			5	1	6	Nd	Nd	Średnio zaawansowany AD, umiarkowany SVD, Zapalenie, ILBD (Plaża IIa), HS
6	Z	BB 23	I 65	79	3	Major-NCD z powodu choroby naczyniowej			5	1	14	Nd	Nd	Ciężki i rozległy CAA, pośrednia patologia AD
7	M	BB 102	I 412	79	8	Major-NCD z powodu choroby naczyniowej			3	1	8	Nd	Nd	Otępienie naczyniowe, ILBD
8	M	BB 224	I 16	Rozdział 80	3	Major-NCD ze względu na wielorakie etiologie			5	1	11	Nd	Klasa 5,99	Umiarkowane SVD, niska patologia AD, ILBD (plaża IIa), HS
9	Z	BB 47		78 Rozdział 78	5	Major-NCD o różnej etiologii (LBD-VaD BPSD)			5	0	8	Nd	Nd	Wysoka patologia AD, patologia BG TAU, ARTAG, łagodne SVD, HS
10	Z	BB 153	I 965	79	5	Łagodne NCD (zgon z powodu raka jelita grubego z rozległymi przerzutami)			0,5	1	8	Nd	6,73	Niski poziom choroby Alzheimera, umiarkowane BG-SVD
11	M	BB 118	I 1211	79	13	NOLD (śmierć z powodu raka wątroby)			0	cyfra arabska	3	Nd	6,51	Umiarkowany SVD
12	M	BB 236	I 521	Rozdział 80	3	Główne-NCD z powodu AD (BPSD)			4	1	15	Nd	6,15	Wysoka patologia AD, ciężkie BG-SVD (kilka mikrokrwawień), HS
13	Z	BB 138		Rozdział 85	3	Major-NCD ze względu na wieloraką etiologię (AD-VaD BPSD)			4	0	15	Nd	Godzina 6,75	Wysoka patologia AD, umiarkowane SVD, CAA, limbiczne TDP43
14	M	BB 109	I 876	79	8	NOLD (śmierć z powodu guza mózgu - GBL)			0	1	16	Nd	6,4	Niski poziom choroby Alzheimera, ILBD (Plaża IIa), łagodne SVD
15	Z	BB 271		Rozdział 84	8	Główne-NCD z powodu AD (BPSD)			4	1	cyfra arabska	Nd	6.7	Średnio zaawansowany AD, limbiczny LTS, umiarkowany BG-SVD, mCAA, TDP
16	Z	BB 71	I 1080	79	8	NOLD (śmierć z powodu niewydolności serca)			0	0	6	Nd	Lokal 6,26	Umiarkowane BG-SVD, ILBD, amy TDP, niski AD
17	Z	BB 189	I 858	Rozdział 80	5	Główne-NCD z powodu AD (BPSD)			3	0	20	Nd	Lokal 6,42	Średnio zaawansowany AD, CAA-capCAA, TDP43, umiarkowany BG-SVD, HS
Rozdział 18	Z	BB 278	I 924	Rozdział 80	5	Główne-NCD z powodu LBD (BPSD)			3	1	5	6.02	7.05	Średnio zaawansowany AD, limbiczny LTS (Plaża IV), limbiczny TDP, HS
Rozdział 19	Z	BB 247		Rozdział 104	8	Major-NCD z powodu wielorakiej etiologii (prawdopodobnie mieszana patologia)			3	0	6	Lokal 6,48	Rozdział 7,22	patologia TAU (PART-ARTA), HS
20	M	BB 85	I 19	Rozdział 83	10	Główne-NCD z powodu LBD (BPSD)			3	1	9	Lokal 6,26	7,3	Ciężki limbiczny LTS, pośredni AD, Umiarkowany SVD, ciężki CAA-capCAA, HS
21	Z	BB 14	I 222	Rozdział 82	8	Major-NCD ze względu na wieloraką etiologię (AD-VaD)			cyfra arabska	1	11	Klasa 5,59	6,4	Średnio zaawansowany stopień choroby Alzheimera, umiarkowane SVD
22 Rozdział 22	Z	BB 282		76 Rozdział 76	8	Główne NCD czołowo-skroniowe (nfPPA BPSD)			3	1	10	6.07	Lokal 6,39	TDP (typ A), ILBD, umiarkowane SVD, niskie AD, HS
23	Z	BB 154	I 1079	Rozdział 80	5	NOLD (śmierć z powodu raka z rozległymi przerzutami)			0	1	5	Lokal 6,49	6,9	umiarkowane SVD, CAA, niskie AD, limbiczne zapalenie mózgu
24	Z	BB 290		65	13	główne NCD czołowo-skroniowe (bvFTD BPSD)			5	1	12	Klasa 5,73	Lokal 6,42	TDP (typ A)
25	Z	BB 210		Rozdział 89	8	Główne-NCD z powodu AD (BPSD)			5	1	15	Klasa 5,94	6,4	w trakcie realizacji
26	M	BB 293		75	Rozdział 18	Główne NCD czołowo-skroniowe (bvFTD BPSD)			5	1	8	Lokal 6.14	Klasa 6,83	w trakcie realizacji
27 Rozdział 27	Z	BB 99	I 1370	79	9	NOLD (śmierć z powodu wstrząsu septycznego)			0	cyfra arabska	14	6,3	Rozdział 7.12	w trakcie realizacji
	M/K			znaczyć	znaczyć				znaczyć	znaczyć	znaczyć	znaczyć	znaczyć
	0,5			Rozdział 81	7,7				3.2	1,0	Rozdział 10.4	6.1	6,6

Tabela 3: Kliniczna/neuropatologiczna diagnoza serii ABB. BB: Bank mózgów; edu (lata): lata edukacyjne; CDR: Kliniczna ocena otępienia (0 = brak demencji; 0,5 = łagodne upośledzenie funkcji poznawczych; 1 = łagodna demencja; 2 = umiarkowana demencja; 3 = ciężka demencja; 4 = bardzo ciężka demencja; 5 = otępienie terminalne); AFS: Wynik czynnika agonalnego; PM (godz.): Godziny pośmiertne; ND: Nie zrobione; M/K: Mężczyźni/Kobiety; BPSD: Behawioralne i psychologiczne objawy demencji; VaD: Otępienie naczyniowe; NOLD: Normalna osoba w podeszłym wieku; GBL: glejak wielopostaciowy; nfPPA: niepłynna pierwotna afazja postępująca; bvFTD: behawioralny wariant otępienia czołowo-skroniowego; SVD: Choroba małych naczyń; LTS: synukleinopatia typu Lewy'ego; HS: Stwardnienie rozsiane hipokampa; CAA: angiopatia amyloidowa mózgu; capCAA: kapilarny CAA; mCAA: oponowy CAA; ILBD: Incydentalna choroba ciał Lewy'ego; BG: Zwoje podstawy; ARTAG: Astrogliopatia TAU związana z wiekiem; CZĘŚĆ: Pierwotna TAUopatia związana z wiekiem; Amy: Amigdala.

domena	Nazwa testu
depresja	Skala Depresji Centrum Badań Epidemiologicznych (CES-D) [2]
Globalne poznanie	Mini-Badanie Stanu Psychicznego (MMSE) [1]
Pamięć werbalna i wizualna	Bezpłatny i sygnalizowany test selektywnego przypominania [3]
	Test Corsi [4]
	Figura zespolona Rey-Osterrieth (ROCF) Przywołanie [5]
Uwaga/ szybkość psychomotoryczna	Tworzenie szlaków A [6]
	Macierze uwagi [4]
Pamięć semantyczna języka	Semantyczna płynność werbalna (kolory, zwierzęta, owoce, miasta) [4]
Funkcje wykonawcze	Tworzenie szlaków B [6]
	Kolorowe matryce Kruka [7]
Zdolności wzrokowo-przestrzenne	Test rysowania zegara (CDT) [8]
	Figura zespolona Reya-Osterrietha (ROCF) Kopiuj [5]

Tabela 4: Ocena neuropsychologiczna dla dawców mózgu.

metabolity

Pełna morfologia krwi

Cholesterol HDL i LDL

triglicerydy

glukoza

Hemoglobina glikowana (HbA1c)

Homocysteina

Kobalamina (witamina B12)

Kwasu foliowego

albumina

mocznik

kreatynina

Aminotransferazy (AlAT i AspAT)

Gamma glutamylotransferaza

Hormon tyreotropowy (TSH)

Witamina D (25-hydroksy-witamina D)

Białko C-reaktywne (CRP)

Elektrolitów

Tabela 5: Panel metaboliczny dla dawców mózgu.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:

NAZWA GENU	dbSNP (baza danych)
Apolipoproteina E (APOE)	rs429358
	Przekaźnik RS7412
Katalaza (CAT)	RS1001179
Dysmutaza ponadtlenkowa 2 (SOD2)	Przekaźnik rs4880
Angiotensynogen (AGT)	Przekaźnik RS699
Sirtuina 2 (SIRT2)	Przekaźnik rs10410544
Translokaza zewnętrznej błony mitochondrialnej 40 (TOMM40)	Przekaźnik rs2075650
Integrator mostów 1 (BIN1)	rs7561528
Katecholo-O-metylotransferaza (COMT)	Przekaźnik RS4680
Reduktaza metylenotetrahydrofolianu (MTHFR)	Przekaźnik rs1801133
	Przekaźnik rs1801131
Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)	Przekaźnik RS6265
rodzina nośników substancji rozpuszczonej 6, członek 4 (SLC6A4 lub 5HTT)	Region polimorficzny związany z transporterem genu hydroksytryptaminy (5-HTTLPR)
	Przekaźnik rs25531

Tabela 6: SNP analizowane pod kątem dawców mózgu InveCe.Ab.

. . . . . .

proces	rozwiązanie	CZAS TRWANIA
		PRÓBKI MAR	MIKROPRÓBKI
Utrwalenie	10% BUFOROWANA FORMALINA	8 dni w temperaturze 4 °C	8 dni w temperaturze 4 °C
mycie	BOR FOSFORANOWY	2-15 dni w temperaturze pokojowej	2-15 dni w temperaturze pokojowej
mycie	H2O MYCIE	2-3 h, woda z kranu	2-3 h, woda z kranu
odwodnienie	ALKOHOL ETYLOWY 70%	24 h	8 h
odwodnienie	ALKOHOL ETYLOWY 80%	24 h	4 godz
odwodnienie	ALKOHOL ETYLOWY 90%	60 h (zazwyczaj w weekendy)	4 godz
odwodnienie	ALKOHOL ETYLOWY 95%	12 h	4 godz
odwodnienie	ALKOHOL ETYLOWY 95%	12 h	4 godz
odwodnienie	ALKOHOL ETYLOWY 100%	6 godzin	4 godz
odwodnienie	ALKOHOL ETYLOWY 100%	6 godzin	4 godz
polana	KSYLEN I	12 h	10 h
polana	KSYLEN II	12 h	10 h
naciek	PARAFINA I	12 h	11 h
naciek	PARAFINA II	12 h	11 h
Osadzanie	WOSK PAPARAFINOWY

Tabela 7: Protokół przetwarzania tkanek ABB.

) powiedział: )

region	H&E	CRESIL FIOLETOWY	LFB (Biblioteka Przemysłowa	GALLYAS (RAJDY)	Sieć 4G8	Zobacz materiał AT8	α-SYN	TDP-43	NeuN	GFAP (Protokół GFAP
PIEŃ MÓZGU
Rdzeń - grzbietowe jądro ruchowe błędnika	x					x	x
Mosts - Locus Coeruleus	x					x	x
Śródmózgowie - Substantia Nigra	x				x	x	x
MÓŻDŻEK
Kora móżdżku i jądro zębate	x	x	x		x
CEREBRUM
Środkowy zakręt czołowy	x	x	x		x	x	x	x
Zwoje podstawy + jądro Meynerta	x	x	x		x				x	x
Klinulate, przednia	x	x	x		x		x		x	x
Ciało migdałowate	x					x	x	x	x	x
Wzgórze i jądro podwzgórzowe	x					x
Zakręt skroniowy górny i środkowy	x	x	x	x	x	x	x		x	x
Hipokamp i kora śródwęchowa	x	x	x	x	x	x	x	x	x	x
Płat ciemieniowy dolny	x	x	x	x	x	x	x
Kora potyliczna	x		x		x	x	x
Opuszka węchowa	x						x

Tabela 8: Oceniane regiony, barwienie i immunohistochemia.

Discussion

Krytyczne kroki w protokole
Naszym celem jest pozyskanie, scharakteryzowanie i przechowywanie dobrej jakości tkanek pochodzących od osób o szczegółowej historii wywodzącej się z obserwacji podłużnej. Aby osiągnąć ten cel, należy zająć się następującymi kluczowymi aspektami. Jak opisano powyżej, protokół rozpoczyna się od rekrutacji dawców, co jest pierwszym kluczowym krokiem. Następnie konieczne jest, aby dawcy kontynuowali program obserwacji i utrzymywali przynależność do projektu w czasie, aż do faktycznego oddania mózgu. W chwili śmierci konieczne jest niezwłoczne powiadomienie personelu ABB w celu zwołania zespołu autopsyjnego w ciągu 24 godzin, co jest ważne dla odpowiedniej jakości tkanek. Świeże cięcie półkul mózgowych wymaga pewnej ręki i specjalnego treningu. Aby uniknąć uszkodzeń komórek spowodowanych powolnym zamrażaniem i uzyskać dobrej jakości plastry do kriostatu i omiki, ważne jest, aby zostały one szybko zamrożone. Biorąc pod uwagę szybkość penetracji roztworu formaliny (1 mm/godz.), w celu zachowania antygenowości tkankowej czas namaczania pojedynczego plastra jest utrzymywany na minimalnym poziomie.

Rozwiązywanie problemów z metodą
Aby zająć się krytycznymi krokami wymienionymi powyżej, proponujemy następujące podejście. Rekrutacja dawców i przestrzeganie zaleceń kontrolnych: Istnieje kilka czynników, które utrudniają dawstwo mózgu, w tym obawy przed uszkodzeniem sylwetki, czystości i integralności ciała lub przed możliwością odczuwania bólu po śmierci. Niektórzy obawiają się nawet, że sekcja zwłok może zostać przeprowadzona, gdy jeszcze żyją^70,71. Pojawiają się również obawy związane z zakłóceniem organizacji pogrzebu i obciążeniem finansowym⁷². Co więcej, brak wiedzy personelu medycznego na temat procedur pośmiertnych i niezdolność do rozwiązania problemów potencjalnych dawców lub ich NOK może zniechęcić do rejestracji. Wszystkie te czynniki mogą powodować niski poziom świadomości przy małej liczbie zapisanych uczestników i wysokim prawdopodobieństwie utraty dawców w miarę upływu czasu. Rzeczywiście, program rekrutacji dawców powinien być skuteczny w szerzeniu świadomości, wzbudzaniu zaufania i przekonywaniu ludzi do rejestracji i utrzymywania wysokich wskaźników uczestnictwa w działaniach następczych. Z naszego doświadczenia wynika, że odbywa się to poprzez staranną selekcję potencjalnych dawców i dokładne wyjaśnienie celów BB. Oferujemy działania edukacyjne i empatyczne podejście odpowiadające na lęki i potrzeby zarówno osób zdrowych, jak i dotkniętych chorobami neurodegeneracyjnymi oraz ich rodzin. Okazuje się, że potencjalni dawcy są bardziej skłonni do wyrażenia zgody, gdy kontaktują się z nimi osobiście. Podejście bezpośrednie tworzy relację opartą na wzajemnym zaufaniu i szacunku, co ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia wysokiego odsetka rejestracji na dawstwo mózgu i oceny kontrolne. Wysoko wykwalifikowany personel z silnym poczuciem etyki najpierw zwraca się do potencjalnego dawcy, omawia możliwość oddania mózgu po śmierci, wyjaśnia wartość ludzkiej tkanki mózgowej dla badań neurobiologicznych i wyjaśnia wszelkie wątpliwości dotyczące procedur pośmiertnych. Równie ważna jest przychylna poczta pantoflowa. Po pobraniu mózgu poświęca się odpowiednią uwagę i troskę, aby ponownie skomponować zwłoki. Ważne jest, aby okazywać szacunek i wdzięczność zmarłej osobie poprzez delikatne obchodzenie się ze zwłokami. Kilka miesięcy później planowane jest spotkanie, na którym zostaną przedstawione wyniki analizy neuropatologicznej, gdy tylko poproszą o to członkowie rodziny.

Czas śmierci i pobrania mózgu: Kiedy dana osoba się zgadza, staje się dawcą i otrzymuje kartę identyfikacyjną z numerem, z którym można się kontaktować 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu (numer recepcji Szpitala Geriatrycznego ASP Golgi-Redaelli, który jest z nami połączony). Ponadto krewnym wręczana jest przywieszka samoprzylepna, która może być wykorzystana w przypadku hospitalizacji. Agencje pogrzebowe w okolicy zostały wcześniej poinformowane, aby sprowadzić ciało do obiektów ABB, gdzie wezwano zespół autopsyjny. Zespół autopsyjny składa się z patologa, neurologa i/lub neurobiologa oraz technika anatomicznego, którzy są dostępni codziennie od 6 rano do 23 wieczorem; Niektórzy studenci stażyści są również często obecni, aby pomóc i zrobić zdjęcia.

Precyzja i spójność procedur świeżego rozbioru jest zapewniona dzięki zaangażowaniu tych samych dwóch operatorów (neurologa i patologa), którzy opracowali metodę i mają kilkunastoletnie doświadczenie w neuropatologii. Podczas zamrażania plastrów umieszcza się je na wstępnie zamrożonej aluminiowej tacce i przykrywa zazębiającą się aluminiową płytą, aby były dobrze płaskie. Bezpośrednio po tym umieszcza się je w ciekłym azocie na 3 minuty, a następnie przechowuje w temperaturze -80 °C. Plastry do utrwalenia są pojedynczo zawijane w gazę i moczone w 10% buforowanym fosforanem roztworze formaliny, który podstawia się po jednym dniu. Następnie są przechowywane w formalinie nie dłużej niż 5 dodatkowych dni; Biorąc jednak pod uwagę, że roztwór formaliny wnika z prędkością 1 mm/dzień, chcielibyśmy jeszcze bardziej skrócić czas namaczania.

Ograniczenia metody
Opisana tu metoda badawcza obejmuje jedynie ograniczony obszar geograficzny, a osoby zaangażowane w program dawstwa posiadają cechy, które nie do końca reprezentują populację ogólną. Chociaż jest to więcej niż dopuszczalne, przerwa pośmiertna trwająca do 24 godzin może powodować zmiany w niektórych strukturach białkowych, enzymach i RNA tkanki mózgowej. Oznaczanie AFS i pH może nie być w pełni wystarczające do określenia jakości tkanek⁷³ i opracowujemy inne sposoby uwierzytelniania jakości tkanek w oparciu o integralność RNA.

Jeśli chodzi o procedurę wycinania mikrotomem, chociaż jest ona bardzo przydatna do rekonstrukcji relacji anatomicznych, należy zauważyć, że zastosowanie makrosekcji nie jest proste i wiąże się z pewnymi trudnościami technicznymi. Nasza metoda jest wymagająca i czasochłonna. Koszty są dość wysokie, a finansowanie nie zawsze jest łatwe. Fundusze pochodzą przede wszystkim ze środków publicznych (Szpital Geriatryczny ASP Golgi-Redaelli) i prywatnych (Fundacja Golgi-Cenci), darowizn prywatnych, organizacji non-profit (np. "Federazione Alzheimer Italia") oraz dotacji.

Znaczenie metody ABB w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod
Na początku nasz program dawstwa mózgu był skierowany do osób biorących udział w badaniu podłużnym InveCe.Ab. W związku z tym oddanym mózgom towarzyszą szczegółowe informacje kliniczne, biologiczne i społeczne gromadzone przez lata. Siła ABB wynika właśnie z tego charakterystycznego pochodzenia. Rzeczywiście, badanie grupy osób spokrewnionych społecznie i genetycznie, które mają wspólne cechy biologiczne i ekspozycje środowiskowe, poprawia analizę statystyczną. Ponadto badanie obejmuje następujące korzyści: 1) Dbanie o potrzeby społeczności i zaspokajanie jej potrzeb (akt "dawania przed prośbą"): ludzie otrzymują bezpłatne okresowe badania kontrolne, o których informuje się lekarza pierwszego kontaktu, podaje się numer telefonu do naszej sekretarki na konsultacje, a osoby o znacznym stopniu niepełnosprawności są odwiedzane w domu; 2) Angażowanie uczestników, osób pełniących funkcje publiczne i lekarzy rodzinnych w działania edukacyjne poprzez organizację cyklicznych seminariów (związanych ze zdrowiem mózgu, dawstwem mózgu i ogólnym stanem zdrowia) oraz planowanie kursów tematycznych (np. korzystanie z urządzeń informatycznych dla osób starszych); 3) Poznawanie ludzi i przyjmowanie podejścia twarzą w twarz. Wszystkie te elementy stanowią o sile projektu ABB. Ponadto projekt zwiększa możliwości kliniczne zaangażowanego personelu medycznego, ponieważ zdobywa on doświadczenie zarówno w ocenach antemortem, jak i pośmiertnych ocenach neuropatologicznych. W związku z tym chcielibyśmy wspomnieć o bardzo osobliwym doświadczeniu związanym z "badaniem starzenia się mniejszości". Badanie to obejmowało ograniczoną i wyselekcjonowaną liczbę Afroamerykanów mieszkających w rejonie Chicago (784 z 1357 uprawnionych osób: wskaźnik odpowiedzi 57%). Uczestnicy byli odwiedzani co roku w domach i proszeni byli o dołączenie do programu dawstwa mózgu. Badanie to opiera się na nietypowym podejściu, z pewnymi podobieństwami do naszego, uzyskując wysoki odsetek pozytywnych odpowiedzi na program dawstwa mózgu (352 dawców z 784 uczestników zostało włączonych: 44%), chociaż wskaźnik autopsji nie był do końca zadowalający (53%)⁷⁴. Podobnie jak w "The minority aging research study", oferujemy działania edukacyjne i empatyczne podejście, osiągając doskonałe rezultaty. W szczególności nasz wskaźnik odpowiedzi wynosi 93%, odsetek zapisów wynosi 28,7%, a wskaźnik autopsji w tej chwili wynosi 67%. Wskaźniki te pokazują, że projekty bezpośrednio angażujące ludzi mają większy odsetek darowizn. Inne programy dawstwa mózgu, w których mniej uwagi poświęca się budowaniu relacji z potencjalnymi dawcami, mają na ogół niski odsetek zapisów, wynoszący około 10-15% lub mniej^73,75.

Istnieje kilka wcześniejszych badań kohortowych zakończonych analizą neuropatologiczną. Co więcej, większość banków i repozytoriów mózgów jest skoncentrowana na chorobie i występuje niedobór "kontrolnych" mózgów od zdrowych dawców w porównaniu z liczbą "chorych" mózgów. Tylko ograniczona liczba BB opiera się na badaniach populacyjnych obejmujących zarówno osoby chore, jak i normalne, w celu zbadania trajektorii starzenia^się 73,74,76,77,78,79,80. Niektóre badania, takie jak "The minority aging research study" w USA⁷⁴ i "The Vantaa 85+ study" w Finlandii⁷⁶ są podobne do naszych, ale zwykle kończą się wraz z zakończeniem kohorty. Zamiast tego przewiduje się, że program dawstwa ABB będzie kontynuowany przez długi czas w przyszłości, pozyskując potencjalnych dawców i planując działania następcze nawet po zakończeniu badania podłużnego InveCe.Ab. Takie podejście sprawia, że nasza metoda rekrutacji jest podobna do tej z programu dawstwa mózgu "Sun Health Research Institute (SHRI)", który jest skierowany do społeczności emerytów⁷³. Protokół SHRI dla dawstwa mózgu jest bardzo skuteczny z najkrótszym średnim odstępem między pośmiertnymi czasami na świecie (3,92 godziny). Podobnie jak w przypadku największych kulek BB na świecie, protokół SHRI po prostu przecina mózg, móżdżek i pień mózgu w linii środkowej (płaszczyzna strzałkowa), następnie jedna połowa jest preparowana na świeżo i zamrażana do badań biochemicznych, podczas gdy druga jest utrwalana w formalinie w celu oceny histopatologicznej. Jednak jedną z mocnych stron protokołu preparacji SHRI jest utrwalenie pojedynczych wycinków, a nie całej półkuli. Rzeczywiście, utrwalenie półkuli jako całości nie jest optymalne ze względu na różne gradienty fiksacji między powierzchnią a rdzeniem. Co więcej, długotrwała ekspozycja na roztwór formaliny może mieć wpływ na białka korowe. Stąd powód, dla którego zdecydowaliśmy się naprawić poszczególne plasterki.

Decyzja o tym, która strona jest ustalona, a która zamrożona, zależy od pojedynczego banku (zawsze tego samego, losowo przypisanego lub przypisanego w zależności od tego, czy dzień sekcji jest parzysty czy nieparzysty)31,32,33,34,35. Tak więc analiza biochemiczna i histopatologiczna są przeprowadzane osobno na każdej półkuli. Ponieważ wiele chorób neurologicznych jest asymetrycznych, nasz BB oferuje unikalny protokół krojenia świeżych próbek: naprzemienne sekcje z pnia mózgu i z każdej półkuli móżdżku i mózgu są zachowywane jako materiał stały lub zamrożony; Stały wycinek na jednej półkuli odpowiada zamrożonemu na drugiej półkuli. Nasza metoda daje możliwość uzyskania pełnej charakterystyki histologicznej całego zamrożonego materiału oraz porównania wyników ze wszystkich obszarów obu stron. Jak wspomniano we wstępie, opisana metoda pozwala nam uzyskać jak najwięcej informacji z tkanki mózgowej. Co więcej, metoda ABB pozwala na podstawową, ale kompletną charakterystykę neuropatologiczną, obejmującą prawie wszystkie znane proteinopatie mózgu i patologię naczyniową. Ze względu na kontrowersyjną rolę urazów naczyniowych w określaniu zaburzeń poznawczych, zdecydowaliśmy się na zastosowanie podwójnej punktacji dla obciążenia naczyniowego^30,53.

Jak wyjaśniono w protokole, stosujemy podejście multidyscyplinarne. Chociaż jest to metoda czasochłonna i pracochłonna, uważamy, że zapewnia kilka korzyści dla badań. Na przykład w poprzedniej pracy wykazaliśmy, że wysoki tHcy per se, czyli MTHFR C677T TT związany z allelem APOE-ε4, może być związany z dysfunkcjami wykonawczymi, a nie utratą pamięci⁸¹. Dlatego interesująca może być ocena osób z tym konkretnym profilem genetycznym na poziomie neuropatologicznym. Jest to przykład tego, jak takie pogłębione działania następcze są przydatne w tworzeniu nowych hipotez badawczych, które można zweryfikować poprzez badanie materiału biologicznego zgromadzonego w naszym banku. Kolejnym dowodem na to, że nasze podejście ma zalety, jest włączenie QEEG do rutynowych ocen, ze względu na jego oryginalność i względną łatwość użycia. Rzeczywiście, EEG wykrywa aktywność synaptyczną kory mózgowej poprzez rejestrowanie potencjałów elektrycznych dendrytów należących do korowych neuronów piramidowych⁸². QEEG można uznać za biomarker do szacowania aktywności synaptycznej kory mózgowej, która jest związana z funkcjami poznawczymi⁸³. W szczególności spadek rytmów alfa w tylnej części mózgu przy ogólnym wzroście niższych częstotliwości (rytmy theta i delta) jest związany z rozpadem połączeń korowych. Należy wziąć pod uwagę, że większość badań korelacji diagnostycznych opierała się na diagnozie klinicznej, która jest jedynie prawdopodobną, a nie ostateczną diagnozą 84,85,86,87. Tylko w bardzo niewielu badaniach celowanych porównano dane dotyczące QEEG z obrazem neuropatologicznym w celu zbadania korelacji między wariantami QEEG i LTS^88,89 oraz rozróżnienia między FTLD a AD⁸³. Kończąc nasze badanie definicją diagnozy neuropatologicznej, możliwe jest prawidłowe zinterpretowanie poczynionych obserwacji dotyczących aktywności elektrycznej mózgu. Co więcej, wykonując seryjne QEEG u każdego badanego możemy śledzić wewnątrzosobniczą trajektorię fal EEG i ich korelacje z obrazem neuropatologicznym. Śledzenie indywidualnych modyfikacji aktywności elektrycznej kory mózgowej w czasie może prowadzić do lepszego zrozumienia jej znaczenia jako biomarkera rozpoczynającej się demencji.

Przyszłe zastosowania i kierunek metody
Wdrożenie dystrybucji tkanek jest jednym z naszych głównych celów perspektywicznych. W tym celu właśnie powołaliśmy komisję naukową, w skład której wchodzi dyrektor Fundacji GC (geriatra), pracownik naukowy neurologii z Uniwersytetu w Pawii, neurolog i patolog zarówno z Fundacji GC, jak i Szpitala Geriatrycznego ASP Golgi-Redaelli. Podczas dystrybucji tkanki mózgowej, szkiełek histologicznych i innych próbek biologicznych należy pamiętać, że dawcy wyrazili zgodę na dawstwo ze względu na potrzeby badań. Dystrybucja materiału powinna zatem odbywać się w sposób rozważny, zgodnie z opisem zawartym w Kodeksie postępowania BNE⁴⁰. Każda ze stron składających wniosek o udostępnienie materiału powinna wskazać rodzaj i ilość potrzebnej próbki, przedstawić opis projektu badawczego oraz sposób wykorzystania próbek, a także, w miarę możliwości, przedstawić dowody potwierdzające wcześniejsze publikacje (w odniesieniu do umowy o przeniesieniu zob . rys. 9). Bank mózgów nie działa dla korzyści finansowych. W związku z tym opłaty uiszczane przez badaczy powinny pokrywać jedynie wydatki związane z pozyskiwaniem, przetwarzaniem, przechowywaniem i dystrybucją tkanek.

W planach jest rozpoczęcie analizy przypadków za pomocą sekwencjonowania egzomu i technik omicznych, takich jak proteomika i transkryptomika. Nasza alternatywna metodologia pobierania próbek pozwoli na przeprowadzenie badań omicznych na dobrze zdefiniowanych histologicznie tkankach z obu półkul. Dzięki takiemu podejściu możliwe będzie porównanie wzorca aktywacji genów w różnych obszarach mózgu tej samej półkuli i w odpowiadających im obszarach drugiej półkuli, a także będzie możliwe skorelowanie aktywacji genów z histopatologią. W tej dziedzinie dużym zainteresowaniem cieszyłyby się zastosowania uczenia głębokiego, w tym komputerowa analiza preparatów histologicznych oraz najnowocześniejsza korelacja danych klinicznych, histologicznych i omicznych. Można zidentyfikować inne korelacje między wieloma różnymi zmiennymi, a także inne możliwe zastosowania technologiczne. Dostępność zamrożonego materiału z obu półkul pozwoli na dokładne określenie topografii aktywacji genów i dystrybucji białek. Będzie to szczególnie interesujące nawet u osób zdrowych, biorąc pod uwagę, że zarówno funkcje mózgu, jak i niektóre choroby są asymetryczne.

Co więcej, możemy uzyskać kultury komórkowe od dobrze scharakteryzowanych dawców mózgu. Rzeczywiście, hodowle komórkowe z opon mózgowo-rdzeniowych pobranych mózgów dostarczają żywych komórek, które można wykorzystać do dalszych badań nad chorobami lub mechanizmami starzenia, za pomocą technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), która polega na przeprogramowaniu fibroblastów opon mózgowo-rdzeniowych i różnicowaniu ich w komórki nerwowe w zaawansowanych modelach⁹⁰.

Wraz ze starzeniem się mózgu mogą zachodzić różne profile zmian na poziomie molekularnym, komórkowym i tkankowym. Każdy mózg jest wyjątkowy. Każdy z nich ma swój własny sposób reagowania na wewnętrzne i zewnętrzne czynniki stresogenne; Niektóre opierają się, podczas gdy inne ulegają i wykazują wyraźne patologie. Często występują rozbieżności między obrazem klinicznym a obrazem neuropatologicznym, ponieważ o obrazie klinicznym decyduje topografia zmian, a nie ich charakter molekularny. Prawidłowa i jednoznaczna diagnoza może być osiągnięta tylko poprzez połączenie zespołu klinicznego z objawami neuropatologicznymi, które często dostarczają ważnych wskazówek etiologicznych niezbędnych do rozwikłania patogenezy chorób. W Europie podejmowane są wysiłki na rzecz stworzenia standardowego podejścia do diagnostyki neuropatologicznej. Nasz protokół diagnostyczny jest prawie całkowicie zgodny z niedawno opublikowanymi wytycznymi dotyczącymi diagnozy neuropatologicznej dla bankowania mózgu⁹¹. Pozwoli nam to na gromadzenie i udostępnianie dobrze udokumentowanej tkanki mózgowej, a jej potencjalnym celem jest utworzenie pierwszego włoskiego banku mózgu. Rzeczywiście, we Włoszech istnieją repozytoria mózgu, ale nie ma banków mózgów opartych na badaniach kohortowych. Naszym celem jest opracowanie metody pobierania tkanki mózgowej, która może być wdrożona na szeroką skalę we Włoszech, aby stworzyć sieć, która wykorzystuje wspólny protokół i udostępnia porównywalny materiał. W tym celu zaangażowanie innych ośrodków badawczych oraz stworzenie specjalnej strony internetowej są jednymi z głównych celów na przyszłość.

Innowacyjne technologie są stale wykorzystywane do analizy molekularnego charakteru chorób neurodegeneracyjnych oraz do identyfikacji biomarkerów. W tym kontekście będzie rosło zapotrzebowanie na mózgi, którym będą towarzyszyć informacje o trajektoriach poznawczych i starzenia się uzyskane w badaniach podłużnych, podkreślając znaczenie neuropatologicznie zweryfikowanego podejścia epidemiologicznego⁹².

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50ml probówka stożkowa polipropylenowa 30x115mm	BD	405253
poliklonalne anty-GFAP	Dako	Z0334	(anty-królik); rozcieńczenie = 1:1000
monoklonalne anty-NeuN (A60)	Chemicon	MAB377	(anty-mysie); rozcieńczenie = 1:1000
Anty-fosfo TAU (AT8)	TermoScientific	MN1020	( anty-mysz); rozcieńczenie = 1:200
Anty-fosfo TDP-43 (pS409/410-2)	CosmoBio	TIP-PTD-P02	poliklonalne przeciwciało pierwszorzędowe (anty-królik) ; rozcieńczenie = 1:4000; obróbka wstępna: Trzyetapowe w kuchence mikrofalowej przez 2 min-1 min-2 min z buforem cytrynianowym 0,01M pH 6
Anty-&alfa;-SYN (KM51)	Novocastra	NCL-L-ASYN	pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne (anty-mysie); rozcieńczenie = 1:500; obróbka wstępna: 1) Trzyetapowe w kuchence mikrofalowej przez 2 min-1 min-2 min z buforem cytrynianowym 0,01 M pH 6; 2) 70% kwas mrówkowy w H2O przez 10 min
Anty-β amyloid (4G8)	BioLegend	800703	monoklonalne przeciwciało pierwszorzędowe (anty-mysie); rozcieńczenie = 1:1000; obróbka wstępna: 70% kwas mrówkowy w H2O przez 10 min
Deska do krojenia	BD	352070
DMEM High Glucose	Carlo Erba	FA30WL0101500	medium
Piła elektryczna z ostrzem 5d	CEA	06.06.14/06.00.16
Elektroda pH mierzy powierzchnię 12mm	CEA	70064.250 Elektroda HHH
Igła pH	Fisher Scientific	11796338
EnVision+System-HRP	Przeciwciało	K4001	(przeciw myszy); rozcieńczenie 1:2
EnVision+System-HRP	Przeciwciało	K4003	(anty-królik); rozcieńczenie 1:2
Eter etylowy	SMI	8401530
Bezpieczne przycinanie piór ostrze noża 14cm	Fisher Scientific	11749798
Płodowa surowica bydlęca	Carlo Erba	FA30WS1810500	średni suplement; rozcieńczenie = 20%
Kleszcze 15cm chirurgiczne lub anatomiczne	Rękawice Uvex	500XG
	CEA	01.28.14
Klej	Arcobaleno	2624000800002
Podparcie głowy	Lacor	60456
L-Glutamina (100X)	Carlo Erba	FA30WX0550100	średni suplement; rozcieńczenie = 1%
Miara zwijana	CEABIS	CEATA34
Nieadsorbowalny monofilament poliamid	UHU Bostik	8000053131470
Roztwór aminokwasów endogennych (100X)	Life Technologies	11140050	średni suplement; rozcieńczenie = 1%
Wstrzykiwacz/roztwór Strept (100X)	Carlo Erba	FA30WL0022100	średni suplement; rozcieńczenie = 1%
Igła rdzeniowa punkt końcówki quincke 20GA 3,50 CALA 0,9x90mm	CEA	03.06.16
Sterylny skalpel z n° 21 ostrzy
Miska chirurgiczna	Olcelli Farmaceutica	A930857255
Młotek chirurgiczny i cisel chirurgiczny	CEA	79.68.88
Nożyczki chirurgiczne	CEA	27.08.45/79.68.64
	Pióro	M130RC