Tutaj prezentujemy wszechstronną metodę transformacji korzenia pomidora, a następnie inokulacji Ralstonia solanacearum, aby przeprowadzić prostą analizę genetyczną do badania bakteryjnej choroby więdnięcia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja Ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ralstonia solanacearum to niszczący patogen naczyniowy przenoszony przez glebę, który może infekować wiele gatunków roślin, stanowiąc poważne zagrożenie dla rolnictwa. Jednak model Ralstonia jest znacznie słabo zbadany w porównaniu z innymi modelami obejmującymi bakteryjne patogeny roślin, takie jak Pseudomonas syringae u rzodkiewnika. Badania mające na celu zrozumienie interakcji między Ralstonią a roślinami uprawnymi są niezbędne do opracowania zrównoważonych rozwiązań w walce z bakteryjną chorobą więdnięcia, ale obecnie są utrudnione przez brak prostych testów eksperymentalnych charakteryzujących różne składniki interakcji w rodzimych roślinach żywicielskich. W tym scenariuszu opracowaliśmy metodę przeprowadzania analizy genetycznej zakażenia Ralstonia pomidora, naturalnego żywiciela Ralstonia. Metoda ta opiera się na transformacji korzeni pomidora za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes, a następnie na nasiąkaniu glebą otrzymanych roślin za pomocą Ralstonia, zawierających przekształcone korzenie wyrażające interesujący nas konstrukt. Wszechstronność testu transformacji korzeniowej pozwala na przeprowadzenie nadekspresji genów lub wyciszenia genów za pośrednictwem RNAi. Jako dowód słuszności koncepcji zastosowaliśmy tę metodę, aby wykazać, że wyciszanie SlCESA6 w korzeniach pomidora za pośrednictwem RNAi nadało odporność na Ralstonia. W tym miejscu szczegółowo opisujemy tę metodę, umożliwiającą podejście genetyczne do zrozumienia bakteryjnej choroby więdnięcia w stosunkowo krótkim czasie i przy niewielkich wymaganiach dotyczących sprzętu i przestrzeni do wzrostu roślin.
Wprowadzenie
Ralstonia solanacearum, czynnik wywołujący bakteryjną chorobę więdnięcia, jest niszczycielskim patogenem naczyniowym przenoszonym przez glebę o światowym zasięgu, który może infekować wiele gatunków roślin, w tym między innymi ziemniaki, pomidory, tytoń, banany, papryki i bakłażan1,2. Straty w plonach spowodowane przez Ralstonia mogą sięgać 80-90% produkcji pomidorów, ziemniaków lub bananów, w zależności od odmiany, klimatu, gleby i innych czynników3. Model Ralstonia jest jednak znacznie słabo zbadany w porównaniu z innymi modelami obejmującymi bakteryjne pato....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Ważne części tej metody obejmują przetwarzanie materiałów roślinnych in vitro, dlatego ważne jest utrzymanie sterylnych warunków podczas wszystkich tych procedur, w tym wizualizacji fluorescencji DsRed. Podczas całego procesu przemiany siewki pomidorów rosną w temperaturze 25−28 °C i 16 h/8 h światła/ciemności (130 μmol fotonów m-2 s-1 światło). Płytki są uszczelnione taśmą mikroporową w celu ułatwienia wymiany gazowej i transpiracji.
1. Przygotowanie pomidorów i Agrobacterium rhizogenes
- Nasiona pomidora (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 5 przedstawia rozwój objawów choroby u roślin pomidora z korzeniami przekształconymi za pomocą pustego wektora (EV) oraz u roślin z korzeniami przekształconymi konstruktem RNAi celującym w SlCESA6 (Solyc02g07240). Dane indeksu choroby (Rysunek 5A) zostały zebrane z tej samej jednostki eksperymentalnej (każda roślina) w czasie według arbitralnej skali od 0 do 4 i nie wykazują rozkładu Gau.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ralstonia solanacearum stanowi poważne zagrożenie dla rolnictwa; Jednak jego interakcja z naturalnymi żywicielami o znaczeniu rolniczym jest nadal słabo poznana w porównaniu z innymi patogenami bakteryjnymi, zwłaszcza w przypadku gatunków roślin uprawnych. W większości przypadków analiza genetyczna jest utrudniona ze względu na czas i koszty wymagane do genetycznej modyfikacji roślin żywicielskich. Aby rozwiązać ten problem i ułatwić analizę genetyczną zakażenia R. solanacearum w pomidorach, opracowaliś.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Macho za pomocne dyskusje, Alvaro López-García za porady statystyczne oraz Xinyu Jian za pomoc techniczną i administracyjną podczas tej pracy. Dziękujemy głównej placówce PSC Cell Biology za pomoc w obrazowaniu fluorescencyjnym Prace te były wspierane przez Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (grant XDB27040204), Szanghajskie Centrum Biologii Stresu Roślinnego (Chińska Akademia Nauk) oraz chiński program 1000 talentów.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 90 mm kwadratowe szalki | |||
| Agar w proszku | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto pepton | BD (Becton i Dickinson) | ||
| Casamino kwasy | Sigma-Aldrich | ||
| Bibuła | |||
| System obrazowania roślin In Vivo NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Garnki | Jiffy Jiffy Products International A.S. | ||
| Taśma mikroporowa | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Podłoże Pindstrup | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Skalpel i ostrze | |||
| Podchloryn sodu | Sigma-Aldrich | ||
| Sterylna czysta ławka | |||
| Pęseta | |||
| Papier Wahtman | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Ekstrakt drożdżowy | OXOID |
Bibliografia
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
