Artykuł metodologiczny

Transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja Ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60302

⸱

11 marca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Center for Plant Stress Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Shanghai Institutes of Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems, Estación Experimental del Zaidín (CSIC)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy wszechstronną metodę transformacji korzenia pomidora, a następnie inokulacji Ralstonia solanacearum, aby przeprowadzić prostą analizę genetyczną do badania bakteryjnej choroby więdnięcia.

Streszczenie

Ralstonia solanacearum to niszczący patogen naczyniowy przenoszony przez glebę, który może infekować wiele gatunków roślin, stanowiąc poważne zagrożenie dla rolnictwa. Jednak model Ralstonia jest znacznie słabo zbadany w porównaniu z innymi modelami obejmującymi bakteryjne patogeny roślin, takie jak Pseudomonas syringae u rzodkiewnika. Badania mające na celu zrozumienie interakcji między Ralstonią a roślinami uprawnymi są niezbędne do opracowania zrównoważonych rozwiązań w walce z bakteryjną chorobą więdnięcia, ale obecnie są utrudnione przez brak prostych testów eksperymentalnych charakteryzujących różne składniki interakcji w rodzimych roślinach żywicielskich. W tym scenariuszu opracowaliśmy metodę przeprowadzania analizy genetycznej zakażenia Ralstonia pomidora, naturalnego żywiciela Ralstonia. Metoda ta opiera się na transformacji korzeni pomidora za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes, a następnie na nasiąkaniu glebą otrzymanych roślin za pomocą Ralstonia, zawierających przekształcone korzenie wyrażające interesujący nas konstrukt. Wszechstronność testu transformacji korzeniowej pozwala na przeprowadzenie nadekspresji genów lub wyciszenia genów za pośrednictwem RNAi. Jako dowód słuszności koncepcji zastosowaliśmy tę metodę, aby wykazać, że wyciszanie SlCESA6 w korzeniach pomidora za pośrednictwem RNAi nadało odporność na Ralstonia. W tym miejscu szczegółowo opisujemy tę metodę, umożliwiającą podejście genetyczne do zrozumienia bakteryjnej choroby więdnięcia w stosunkowo krótkim czasie i przy niewielkich wymaganiach dotyczących sprzętu i przestrzeni do wzrostu roślin.

Wprowadzenie

Ralstonia solanacearum, czynnik wywołujący bakteryjną chorobę więdnięcia, jest niszczycielskim patogenem naczyniowym przenoszonym przez glebę o światowym zasięgu, który może infekować wiele gatunków roślin, w tym między innymi ziemniaki, pomidory, tytoń, banany, papryki i bakłażan1,2. Straty w plonach spowodowane przez Ralstonia mogą sięgać 80-90% produkcji pomidorów, ziemniaków lub bananów, w zależności od odmiany, klimatu, gleby i innych czynników3. Model Ralstonia jest jednak znacznie słabo zbadany w porównaniu z innymi modelami obejmującymi bakteryjne patogeny roślin, takimi jak Pseudomonas syringae czy Xanthomonas spp. Ponadto większość badań nad interakcjami między roślinami a mikroorganizmami koncentruje się na roślinie modelowej Arabidopsis thaliana. Chociaż badania z wykorzystaniem tych modeli w dużej mierze przyczyniły się do naszego zrozumienia interakcji między roślinami a bakteriami, nie rozwiązują one obecnej potrzeby zrozumienia tych interakcji w roślinach uprawnych. Badania mające na celu zrozumienie interakcji między Ralstonią a roślinami uprawnymi są niezbędne do opracowania zrównoważonych rozwiązań w walce z bakteryjną chorobą więdnięcia, ale obecnie są utrudnione przez brak prostych testów eksperymentalnych charakteryzujących różne składniki interakcji. W szczególności pomidor, naturalny żywiciel Ralstonia, jest drugą najważniejszą uprawą warzyw na świecie i jest dotknięty mnóstwem chorób4, w tym bakteryjną chorobą więdnięcia. W niniejszej pracy opracowaliśmy łatwą metodę przeprowadzania analizy genetycznej zakażenia pomidora Ralstonia. Metoda ta opiera się na transformacji korzeni pomidora za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes, przy użyciu fluorescencji DsRed jako markera selekcji5, a następnie inokulacji Ralstonia glebowo powstałych roślin, zawierających przekształcone korzenie wyrażające interesujący nas konstrukt. Wszechstronność testu transformacji korzeniowej pozwala na przeprowadzenie nadekspresji genów lub wyciszenia genów za pośrednictwem RNAi.

Potencjalne ograniczenie tej metody polega na szczątkowym wzroście nieprzekształconych korzeni. Jest to szczególnie ważne w przypadkach, gdy zastosowany plazmid nie ma genu reporterowego, który umożliwia selekcję przekształconych korzeni. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy alternatywną metodę opartą na selekcji antybiotyków, która hamuje wzrost nieprzekształconych korzeni, umożliwiając jednocześnie wzrost zdrowych, odpornych na antybiotyki przekształconych korzeni. Ponieważ A. rhizogenes nie indukuje przemiany pędów, są one wrażliwe na antybiotyk i dlatego powinny być trzymane oddzielnie od pożywki zawierającej antybiotyk.

Chociaż odporność roślin na Ralstonia nie jest dobrze poznana, kilka raportów wiąże zmiany w ścianie komórkowej ze zwiększoną odpornością na więdnięcie bakterii6,7,8,9. Zasugerowano, że te zmiany w ścianie komórkowej wpływają na rozwój naczyń krwionośnych, co jest istotnym aspektem stylu życia Ralstonia wewnątrz rośliny10. Wykazano, że mutacje w genach kodujących syntazy celulozy CESA4, CESA7 i CESA8 u Arabidopsis thaliana upośledzają wtórną integralność ściany komórkowej, powodując zwiększoną oporność na Ralstonia, co wydaje się być związane z sygnalizacją ABA8. Dlatego, jako dowód słuszności koncepcji naszej metody, przeprowadziliśmy wyciszanie genu SlCESA6 (Solyc02g072240), wtórnej syntazy celulozy ściany komórkowej za pośrednictwem RNAi, oraz ortologa AtCESA8 (At4g18780). Późniejsze nasiąkanie gleby preparatem Ralstonia wykazało, że wyciszenie SlCESA6 zwiększyło odporność na objawy więdnięcia bakterii, co sugeruje, że oporność na Ralstonia za pośrednictwem ściany komórkowej jest prawdopodobnie zachowana w pomidorze i potwierdza naszą metodę przeprowadzania analizy genetycznej odporności bakterii na więdnięcie w korzeniach pomidora. W tym miejscu szczegółowo opisujemy tę metodę, umożliwiającą podejście genetyczne do zrozumienia bakteryjnej choroby więdnięcia w stosunkowo krótkim czasie i przy niewielkich wymaganiach dotyczących sprzętu i przestrzeni do wzrostu roślin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ważne części tej metody obejmują przetwarzanie materiałów roślinnych in vitro, dlatego ważne jest utrzymanie sterylnych warunków podczas wszystkich tych procedur, w tym wizualizacji fluorescencji DsRed. Podczas całego procesu przemiany siewki pomidorów rosną w temperaturze 25−28 °C i 16 h/8 h światła/ciemności (130 μmol fotonów m-2 s-1 światło). Płytki są uszczelnione taśmą mikroporową w celu ułatwienia wymiany gazowej i transpiracji.

1. Przygotowanie pomidorów i Agrobacterium rhizogenes

  1. Nasiona pomidora (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC) sterylizować 5% (v/v) podchlorynem sodu przez 5 minut. Umyj 4-5 razy destylowaną sterylną wodą i utrzymuj nasiona powoli potrząsające w sterylnej wodzie przez noc, aby ułatwić kiełkowanie.
  2. Przenieś nasiona pomidora na pożywkę o połowie mocy Murashige i Skoog (1/2 MS) bez sacharozy (2,21 g/L MS, 8% w/v agar). Trzymaj nasiona w ciemności w temperaturze 25−28 °C przez trzy dni (Rysunek 1A).
    UWAGA: Do każdego konstruktu potrzeba zwykle około 40 nasion.
  3. Autoklaw 8,5 cm2 kwadratowe bibuły filtracyjne. Umieść kwadratowe bibuły filtracyjne w 9 cm2 kwadratowych szalkach Petriego zawierających 1/2 MS podłoża (umieść papier na wierzchu agaru) i umieść sześć kiełkujących nasion pomidora na każdej płytce (Rysunek 1B). Uszczelnij płytkę taśmą z mikroporami i inkubuj kiełkujące nasiona w temperaturze 25−28 °C przez 3−4 dni.
  4. Uprawiać Agrobacterium rhizogenes MSU440 w stałym podłożu LB (z odpowiednimi antybiotykami) w temperaturze 28 °C dwa dni przed przemianą rośliny.
    UWAGA: A. rhizogenes jest dostarczany przez Dr. Juan Antonio López Ráez, EEZ-CSIC, Grenada, Hiszpania. W eksperymencie opisanym w tym artykule użyto A. rhizogenes zawierającego pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6 lub pusty wektor, jako kontrolę. pK7GWIWG2_II-RedRoot zawiera gen reporterowy, DsRed, napędzany przez promotor ubikwityny Arabidopsis thaliana (pAtUBQ10) i nadaje oporność na spektynomycynę (50 μg/ml). Możliwe jest użycie innych wektorów do nadekspresji genów, jak opisano wcześniej5. W niniejszej pracy amplifikację specyficznego fragmentu do wyciszania SlCESA6 uzyskano za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją (RT) przy użyciu RNA wyizolowanego z pomidora (S. lycopersicum cv. Moneymaker) i podligowanego do wektora p-ENTR/D-TOPO (Tabela 1). Następnie fragment SlCESA6-RNAi został sklonowany do wektora binarnego pK7GWIWG2_II-RedRoot.

2. Transformacja i selekcja roślin

  1. Za pomocą sterylnego skalpela odetnij korzonek i spód hipokotylu sadzonek pomidorów (Rysunek 1C,D).
  2. Zbierz biomasę A. rhizogenes z powierzchni podłoża LB za pomocą plastikowych końcówek lub ostrza skalpela i ostrożnie zanurz pokrojone sadzonki pomidorów w biomasie bakteryjnej (Rysunek 1E).
  3. Po zaszczepieniu A. rhizogenes przykryj sadzonki pomidorów półokrągłą bibułą filtracyjną o wymiarach 2 cm x 4 cm (Rysunek 1F), aby utrzymać wysoką wilgotność i ułatwić przetrwanie oraz rozwój nowych korzeni.
  4. Przechowuj przekształcone sadzonki pomidorów przez 6-7 dni. Następnie użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć nowo pojawiające się owłosione korzenie (Rysunek 1G,H; na tym etapie korzenie nie są jeszcze przekształcone) i pozwól siewkom wytworzyć nowe, owłosione korzenie.
  5. Gdy pojawi się druga generacja nowych owłosionych korzeni (Rysunek 1I), usuń bibułę filtracyjną z wierzchu sadzonek i ponownie uszczelnij płytkę taśmą mikroporową.
    UWAGA: W tym momencie obecność markera fluorescencyjnego DsRed w wektorze transformacji pozwala na wizualizację efektywności przemiany w nowych korzeniach.
  6. Aby zobrazować fluorescencję DsRed, użyj mikroskopu stereoskopowego lub innego sprzętu do obrazowania in vivo roślin (Rysunek 1J). Zaznacz korzenie przekształcone w dodatnią (czerwona fluorescencja) i usuń ujemne nieprzekształcone korzenie (bez czerwonej fluorescencji) za pomocą sterylnego skalpela.
  7. Przenieś siewki wykazujące czerwoną fluorescencję na nową płytkę zawierającą 1/2 MS pożywki, aby ułatwić rozwój przekształconego korzenia jako głównego korzenia (Rysunek 1K). Trzymaj sadzonki, które nie wykazują czerwonej fluorescencji, na tej samej płytce, aby sprawdzić pojawienie się fluorescencyjnych korzeni (Rysunek 1L) w późniejszych punktach czasowych.
  8. Alternatywna metoda oparta na doborze antybiotyków
    1. Alternatywą dla kroku 2.5 jest przygotowanie do połowy napełnionych 9 cm2 kwadratowych talerzy zawierających 1/2 MS pożywki z odpowiednim antybiotykiem. Nachyl płytki o około 5° podczas procesu przygotowania, aby wytworzyć pustą przestrzeń bez podłoża (Rysunek 2A), umożliwiając wzrost pędów unikając kontaktu z antybiotykiem.
    2. Alternatywnie do kroku 2.6, po przecięciu pierwszych nieprzekształconych owłosionych korzeni, które się pojawiły (krok 2.4), przenieś siewki bez korzeni na częściowo wypełnione płytki za pomocą bibuł filtracyjnych o odpowiednim rozmiarze (Rysunek 2B).
      UWAGA: Jako kontrolę pozytywną zaleca się przekształcenie kilku sadzonek w plazmid zawierający tę samą oporność na antybiotyki i gen reporterowy (w tym protokole pK7GWIWG2_II-RedRoot; kanamycyna 50 μg/ml).
    3. Alternatywnie do kroku 2.7, pozwól siewkom rozwinąć nowe owłosione korzenie i odetnij te korzenie, które nie mają bezpośredniego kontaktu z powierzchnią bibuły warstwowej filtracyjnej, ponieważ korzenie te mogą uniknąć selekcji antybiotyków.
      UWAGA: Ze względu na działanie antybiotykowe rozwój korzeni może być wolniejszy niż w płytkach bez antybiotyków. Nowe przekształcone owłosione korzenie pojawiają się w ciągu 14−18 dni po przeniesieniu siewek bez korzeni na częściowo wypełnione płytki (krok 2.8.2) (Rysunek 2C-E).
  9. Przykryj sadzonki półokrągłą bibułą filtracyjną o wymiarach 2 cm x 4 cm, uszczelnij płytkę i inkubuj sadzonki, aby mogły rozwinąć nowe owłosione korzenie.
    UWAGA: Nie jest konieczne eliminowanie A. rhizogenes za pomocą antybiotyków. Bibuła filtracyjna na wierzchu pożywki MS i brak sacharozy hamują rozprzestrzenianie się A. rhizogenes na talerzu5.
  10. Pięć do siedmiu dni po pierwszej selekcji korzeni powtórz proces selekcji, aby wybrać nowe przekształcone korzenie i usunąć nieprzekształcone korzenie. Przenieś sadzonki zawierające przekształcone korzenie na nową płytkę zawierającą 1/2 MS podłoża.

3. Przeniesienie do doniczek do inokulacji

  1. Przygotuj doniczki do zaszczepiania, w których powierzchnia korzeni będzie wystawiona na działanie inokulum bakteryjnego: namocz doniczki do zaszczepiania wodą, odlej nadmiar wody i umieść je w plastikowej tacy do sadzenia. Przenieś wybrane sadzonki z przekształconymi korzeniami do doniczek do zaszczepiania za pomocą pęsety (Rysunek 3A).
  2. Przykryj tacę folią spożywczą lub przezroczystą pokrywką i utrzymuj je w temperaturze 25−28 °C i wilgotności 65% (16 h/8 h jasno/ciemno; 130 μmol fotonów m-2 s-1 światło), aby utrzymać wysoki poziom wilgotności Rysunek 3B). Zdejmij pokrywę po pięciu lub sześciu dniach.
    UWAGA: Przekształcone rośliny pomidora są gotowe do zaszczepienia dwa do trzech tygodni po przeniesieniu ich do gleby (Rysunek 3C). Podczas wzrostu na glebie rośliny pomidora mogą wytwarzać nowe korzenie, które nie są przekształcane. Aby określić zakres tego zjawiska, zaobserwowano czerwoną fluorescencję w korzeniach 3-tygodniowych przekształconych roślin pomidora. Większość korzeni (80%-100%) wykazywała czerwoną fluorescencję, co wskazuje, że rzeczywiście uległy transformacji (Rysunek 3D,E).

4. Inokulacja zraszająca glebę

  1. Hoduj R. solancearum (szczep GMI1000 w tym protokole) w płynnym podłożu phi (Tabela 211) w wytrząsarce orbitalnej (200 obr./min) w temperaturze 28 °C do fazy stacjonarnej.
  2. Określ liczbę bakterii, mierząc gęstość optyczną kultury bakteryjnej przy 600 nm (OD600). Rozcieńczyć kulturę bakteryjną wodą do OD600 0,1 (w stosowanych tutaj warunkach odpowiada to około 108 jednostkom tworzącym kolonie [CFU]/ml).
  3. Umieść 16−20 doniczek do zaszczepiania zawierających przekształcone pomidory na tacy do zaszczepiania (29 cm x 20 cm; Rysunek 4A).
  4. Wlej 300 ml (~ 15 ml na roślinę) inokulum bakteryjnego (OD600 0,1) do tacki zawierającej doniczki do inokulacji. Pozwól im moczyć się w inokulum przez 20 minut (Rysunek 4B).
  5. Przygotuj nową tacę z warstwą ziemi doniczkowej. Przenieś zaszczepione doniczki do nowej tacki (Rysunek 4C) i umieść tace w komorze wzrostu o wilgotności 75%, temperaturze 26−28 °C i fotoperiodzie 12 godzin światła i 12 godzin ciemności (130 μmol fotonów m-2 s-1 światła).

5. Określenie parametrów infekcji i analiza statystyczna

  1. Oceń objawy choroby zgodnie z wcześniejszym opisem12,13, używając skali od 0 (brak objawów) do 4 (całkowite więdnięcie) (Rysunek 4D-H), każdego dnia po inokulacji Ralstonia przez dwa tygodnie.
    UWAGA: Dane dotyczące indeksu chorób są zbierane z tej samej jednostki doświadczalnej (każdej rośliny) w czasie.

6. Analiza ekspresji genów

UWAGA: Ekspresję transgenu lub wyciszenie genu docelowego można określić za pomocą RT-PCR lub ilościowego RT-PCR (qRT-PCR).

  1. Pobrać próbki i wyekstrahować RNA z reprezentatywnej części przekształconego systemu korzeniowego (w celu oceny wpływu na gen docelowy) i liści (w ramach kontroli wewnętrznej).
  2. Zsyntetyzuj cDNA przy użyciu 1 μg całkowitego RNA poddanego działaniu DNazy.
  3. Analizuj ekspresję genów docelowych za pomocą qRT-PCR. Oblicz względne poziomy transkrypcji za pomocą metody 2-ΔΔCT14, używając SlEFα-1 jako genów porządkowych15.
    UWAGA: Sekwencje starterów są wymienione w Tabeli 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 5 przedstawia rozwój objawów choroby u roślin pomidora z korzeniami przekształconymi za pomocą pustego wektora (EV) oraz u roślin z korzeniami przekształconymi konstruktem RNAi celującym w SlCESA6 (Solyc02g07240). Dane indeksu choroby (Rysunek 5A) zostały zebrane z tej samej jednostki eksperymentalnej (każda roślina) w czasie według arbitralnej skali od 0 do 4 i nie wykazują rozkładu Gau...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ralstonia solanacearum stanowi poważne zagrożenie dla rolnictwa; Jednak jego interakcja z naturalnymi żywicielami o znaczeniu rolniczym jest nadal słabo poznana w porównaniu z innymi patogenami bakteryjnymi, zwłaszcza w przypadku gatunków roślin uprawnych. W większości przypadków analiza genetyczna jest utrudniona ze względu na czas i koszty wymagane do genetycznej modyfikacji roślin żywicielskich. Aby rozwiązać ten problem i ułatwić analizę genetyczną zakażenia R. solanacearum w pomidorach, opracowaliś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Macho za pomocne dyskusje, Alvaro López-García za porady statystyczne oraz Xinyu Jian za pomoc techniczną i administracyjną podczas tej pracy. Dziękujemy głównej placówce PSC Cell Biology za pomoc w obrazowaniu fluorescencyjnym Prace te były wspierane przez Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (grant XDB27040204), Szanghajskie Centrum Biologii Stresu Roślinnego (Chińska Akademia Nauk) oraz chiński program 1000 talentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
90 mm kwadratowe szalki
Agar w proszkuSigma-Aldrich
Bacto peptonBD (Becton i Dickinson)
Casamino kwasySigma-Aldrich
Bibuła
System obrazowania roślin In Vivo NightShade LB 985Berthold Technologies
GarnkiJiffy Jiffy Products International A.S.
Taśma mikroporowa3M
Murashige and Skoog medium (M519)Phytotechlab
Podłoże PindstrupPindstrup Mosebrug A/S
Skalpel i ostrze
Podchloryn soduSigma-Aldrich
Sterylna czysta ławka
Pęseta
Papier WahtmanWahtman International Ltd. Maldstone
Ekstrakt drożdżowyOXOID
Petriegofiltracyjna

Bibliografia

  1. Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).
  2. Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
  3. Elphinstone, J. G. The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. , American Phytopathological Society Press. St Paul, MN. 9-28 (2005).
  4. Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. Compendium of Tomato 1094 Diseases. , APS Press. St Paul, MN. (1991).
  5. Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34(2018).
  6. Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
  7. Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
  8. Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
  9. Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
  10. Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
  11. Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
  12. Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
  13. Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
  16. Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Agrobacterium rhizogeneswyciszanie RNAigen CESA6indeks chorobypole pod krzywtest nieparametryczny

Powiązane artykuły