System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Podsumowanie

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

Streszczenie

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) to trójwymiarowe rusztowanie, które działa jako główne wsparcie dla komórek w tkankach. Oprócz swojej funkcji strukturalnej, ECM uczestniczy również w migracji, proliferacji i różnicowaniu komórek. Fibroblasty są głównym typem komórek modyfikujących ułożenie i produkcję włókien ECM. W przypadku raka CAF (fibroblasty związane z rakiem) są w stanie trwałej aktywacji, uczestnicząc w przebudowie ECM, ułatwiając migrację komórek nowotworowych i stymulując angiogenezę związaną z nowotworem, a także pełniąc inne role pronowotworowe. Celem tej metody jest stworzenie trójwymiarowej matrycy o składzie włókien zbliżonym do matryc in vivo, przy użyciu unieśmiertelnionych fibroblastów lub ludzkich pierwotnych CAF. Fibroblasty są hodowane na wstępnie poddanych działaniu preparatów do hodowli komórkowych i hodowane pod wpływem stymulacji kwasem askorbinowym. Następnie fibroblasty są usuwane, a matryce blokowane do dalszego wysiewu komórek. W tym modelu ECM fibroblasty mogą być aktywowane lub modyfikowane w celu wytworzenia różnych rodzajów macierzy, których działanie można badać w hodowli komórkowej. Matryce 3D są również kształtowane przez sygnały komórkowe, takie jak enzymy degradacji lub sieciowania, które mogą modyfikować rozkład włókien. W tym kontekście można badać angiogenezę wraz z innymi typami komórek, takimi jak nabłonkowe komórki nowotworowe.

Wprowadzenie

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest dynamiczną strukturą obecną we wszystkich typach tkanek. Składa się z białek i polisacharydów, które tworzą sieć włókien kluczowych dla adhezji komórek, migracji i komunikacji¹. Skład ECM różni się w zależności od tkanki. Podczas gdy kolagen typu I jest najbardziej rozpowszechnionym białkiem strukturalnym, kolagen typu II, III, V i XI można również znaleźć w różnych tkankach². Fibronektyna wytwarzana przez fibroblasty jest potrzebna do adhezji komórek². Ponadto istnieją inne cząsteczki strukturalne, takie jak elastyna, laminina i receptory powierzchniowe zwane integrynami, które pośredniczą w składaniu włókien i są specyficzne dla różnych tkanek ECM². ECM odgrywa ważną rolę jako rusztowanie komórkowe i może być również zaangażowany zarówno w procesy fizjologiczne, jak i patologiczne¹. Nieprawidłowości w ECM obserwuje się w patologiach, takich jak rak, który zmienia skład ECM i/lub jego organizację. W nowotworach ECM reprezentuje niekomórkowy składnik mikrośrodowiska guza (TME), złożonego środowiska składników komórkowych, takich jak fibroblasty, komórki odpornościowe, komórki śródbłonka, perycyty i różne rozpuszczalne czynniki. Wiadomo, że TME sprzyja progresji raka i przerzutom; W procesie tym biorą udział fibroblasty związane z rakiem, jako dominujący typ komórek w zrębie guza³. W przeciwieństwie do normalnych fibroblastów, CAF są w stanie stałej aktywacji, wykazując zwiększone wydzielanie białek ECM i czynników wzrostu (np. Transforming Growth Factor-β, TGF-β), a także wyższą ekspresję niektórych markerów, takich jak aktyna α-mięśni gładkich (α-SMA) i białko aktywujące fibroblasty (FAP)⁴. Jednak CAF to niejednorodna populacja komórek, wykazująca różne poziomy aktywacji lub ekspresji markerów⁵. Można zatem założyć, że skład i struktura matryc pochodzących z fibroblastów będzie zależała od statusu i charakterystyki fibroblastów.

W tym kontekście, celem tej metodologii jest ustanowienie odpowiedniego modelu in vitro do generowania ECM przez fibroblasty, równoważnego ustawieniu ECM in vivo. Proponujemy to podejście jako metodologię translacyjną in vitro do dalszych badań funkcji komórek nowotworowych, takich jak chemooporność lub migracja, w których pośredniczy ECM. Jak nasza grupa opublikowała w innym miejscu, CAF można uzyskać ze świeżych próbek tkanek, ale należy zauważyć, że przeżywalność CAF w hodowli jest ograniczona, a liczba ich pasaży komórkowych jest zmniejszona⁶. Ponadto do generowania matrycy można wykorzystać pierwotne kultury CAF utworzone z próbek pobranych od pacjentów. Manipulowanie ekspresją genów w fibroblastach jest również interesującym sposobem wytwarzania zróżnicowanych matryc in vitro w celu oceny możliwego wpływu na skład matrycy, orientację włókien itp. W związku z tym nasza grupa niedawno poinformowała o roli fibroblastów wyrażających ślimaka w składzie i orientacji włókien różnych pochodnych matryc⁷.

Ponadto, CAFy i ECM są zaangażowane w układ naczyniowy, zarówno w generowaniu naczyń, jak i jako część zewnętrznej warstwy wazonu⁸. Przebudowa ECM indukuje angiogenezę; Metaloproteinazy macierzy (MMP) wydają się być najważniejszym typem enzymu przyczyniającym się do tego procesu^9,10. Unaczynienie tkanek komórek pierwotnych, które generują ECM, makrocząsteczki ECM, resztkowe czynniki wzrostu zawarte w ECM, elastyczność matrycy i grubość matrycy są opisane jako czynniki zaangażowane w aktywację komórek śródbłonka¹¹. W nowotworach niedotlenienie zwiększa sztywność ECM i generowanie kiełków śródbłonka¹². Ponadto CAF wydzielają czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) i płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF), które stymulują angiogenezę w zrębie guza¹³. W tej dziedzinie generowanie matryc in vitro może być wykorzystywane do badania procesów angiogenezy lub działania MMP w różnych warunkach eksperymentalnych. W związku z tym reprodukcja in vitro najbardziej analogicznej matrycy in vivo może być cennym narzędziem do badania roli ECM w angiogenezie lub mikrośrodowiskowych interakcjach komórkowych.

Stymulacja hodowanych fibroblastów kwasem askorbinowym w celu zwiększenia osadzania matrycy i generowania ECM jest akceptowanym sposobem wytwarzania analogicznych matryc in vivo. Unieśmiertelnione linie komórkowe fibroblastów są łatwe do hodowli i są aktywowane przez różne czynniki wzrostu, takie jak PDGF-BB, Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) lub TGF-β¹⁴. W ramach TME CAF syntetyzują kolagen typu I i fibronektynę jako główne składniki ECM⁴. Podobnie, składniki te znajdują się jako główne składniki matryc pochodzących z fibroblastów generowanych in vitro (ryc. 1).

Istnieją różne metodologie symulacji in vivo ECM. Zastosowanie powlekanych szalek hodowlanych z mieszaninami włókien ECM zostało rozszerzone w poprzednich latach, ale to podejście 2D wymagało ulepszenia struktur 3D, takich jak usieciowane żele (np. Matrigel)¹. Konfiguracja podobna do Matrigela stała się standardową metodą symulacji matrycy 3D. Fibryna jest również alternatywą przy generowaniu matryc, ale zawodzi pod względem wytrzymałości i trwałości klasy ECM1. Kolagen stosowany w połączeniu z innymi składnikami ECM rozwiązuje niektóre z wyżej wymienionych problemów. Jednak te żele kolagenowe tworzą silną sieć z włóknami, które można zorientować, ale są bardzo niejednorodne, co może stanowić problem w powtórzeniach eksperymentów¹. Niemniej jednak należy założyć, że w zależności od celu eksperymentów, bardziej odpowiednie jest stosowanie Matrigelu lub innych hydrożeli (np. w badaniach skurczu matrycowego, w których skurcz żelu można łatwo wykryć).

Potencjalna immunogenność wygenerowanych matryc może stanowić problem w eksperymentach z niektórymi typami komórek. Dlatego, aby zmniejszyć możliwość odpowiedzi immunologicznej spowodowanej komórkami generującymi ECM podczas korzystania z naszej metody, matryce są decellularizowane i myte, chociaż usunięcie fragmentów komórek nie może być całkowite¹⁵. Idealny ECM musi być kompatybilny z hodowlą komórkową i zdolny do komunikowania się i reagowania na sygnały komórkowe. Nasza procedura pozwala na bezproblemowe wprowadzenie zmian podczas produkcji ECM (np. dodanie czynników wzrostu stymulujących fibroblasty).

Protokół

Próbki tkanek ludzkich uzyskano za zgodą Komisji Etyki Badań Szpitala Ramón y Cajal w Madrycie.

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 0,2% roztwór żelatyny: dodaj 1 g żelatyny do 500 ml PBS. Roztwór należy sterylizować w autoklawie i utrzymywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem przefiltrować go filtrem 0,22 μm.
2. Przygotuj 1% aldehydu glutarowego: Dodaj 1 ml 25% roztworu podstawowego aldehydu glutarowego do 24 ml PBS. Przed użyciem przefiltrować filtrem 0,22 μm.
3. Przygotować 1 M etanoloaminę: przygotować roztwór etanoloaminy ze sterylnym_H2O. Przed użyciem przefiltrować filtrem 0,22 μm.
   UWAGA: Ponieważ etanoloamina jest dostarczana z nasadką zabezpieczającą, potrzebna będzie igła i strzykawka.
4. Przygotować kwas askorbinowy: dodać 0,1 ml 50 mg/ml roztworu podstawowego kwasu askorbinowego (wrażliwego na światło) do 100 ml pożywki.
5. Przygotuj bufor do lizy: przygotuj PBS 0,5% Triton 100X z 20 nM NH₄OH. Dodaj NH₄OH bezpośrednio przed użyciem.
6. Przygotować PBS Pen/Strep: rozcieńczyć roztwór podstawowy Pen/Strep do 100 U/ml Pen i 100 μg/ml Strep.
7. Przygotuj DMEM z 10% FBS: Dodaj 10% FBS do 500 ml DMEM. Suplement zawierający 100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,1 mg/ml normocyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B.
8. Przygotuj 2% BSA denaturowanego na gorąco: dodaj 2 g BSA do 100 ml sterylnej wody. Podgrzewać we wrzącej wodzie przez 7 min.
9. Przygotuj FBS z antybiotykami: uzupełnij FBS o 200 U/ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyny, 100 μg/ml gentamycyny i 2,5 g/ml amfoterycyny B.

2. Przygotowanie hodowli komórkowej

1. Unieśmiertelniona linia komórkowa fibroblastów
   1. Hodowla rekombinowanej telomerazy transfekowanej unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów napletka (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) w DMEM z 10% FBS i utrzymywać w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Komórki śródbłonka
   1. Hodowla ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC, ATCC PCS-100-013) w pożywce EBM-2 zawierającej 2% FBS i utrzymywanie w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
3. Pierwotna kultura fibroblastów
   UWAGA: W przypadku ustanowienia i hodowli CAF, protokół opublikowany wcześniej przez naszą grupę był przestrzegany⁶.
   1. Krótko mówiąc, pokrój próbki tkanek na małe kawałki o wielkości około 2-3 mm³ i zasiej w FBS z wysokim stężeniem antybiotyków.
   2. Kiedy pojawią się pierwsze fibroblasty, zastąp pożywkę pożywką FBM do konserwacji komórek.
      UWAGA: W zależności od pochodzenia tkanki, kultury komórkowe mogą być łatwo skażone. Umyj próbki w PBS uzupełnionym antybiotykami, z silnie zanieczyszczoną tkanką (np. okrężnica⁶) i wstrząsaj przez 30-45 minut.

3. Matryce 3D pochodzące z fibroblastów (Na podstawie Castelló-Cros i Cukierman¹⁶)

1. Dodać 2 ml 0,2% roztworu żelatyny do każdego dołka na płytce 6-dołkowej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Odessać żelatynę i umyć ją w 2 ml PBS.
3. Dodać 2 ml 1% aldehydu glutarowego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aldehyd glutarowy sieciuje żelatynę.
4. Odessać aldehyd glutarowy i przemyć studzienki w 2 ml PBS przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.
5. Dodać 2 ml 1 M etanoloaminy i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Etanoloamina będzie działać w celu zablokowania pozostałego aldehydu glutarowego.
6. Odessać etanoloaminę i przemyć studzienki w 2 ml PBS przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.
7. Dodaj 1 ml DMEM z 10% FBS. Jeśli podłoże natychmiast zmieni kolor na różowy, usuń pożywkę, przemyj 2 ml PBS i ponownie dodaj 1 ml DMEM z 10% FBS.
8. Wysiewaj 1 ml zawiesiny fibroblastów, z 5 x 10⁵ komórek w każdym dołku. Całkowita objętość w każdym dołku wyniesie 2 ml.
9. Hoduj komórki, aż do osiągnięcia 100% zbieżności. Następnie usuń pożywkę i zastąp DMEM 10% FBS z 50 μg/ml kwasu askorbinowego i dodatkową obróbką, jeśli jest stosowana.
10. Zastąp pożywkę świeżym DMEM z 10% FBS i 50 μg/ml kwasu askorbinowego co 2 dni przez 6 dni.
    UWAGA: Jeśli stosuje się dodatkową obróbkę (np. PDGF-BB, TGF-β i/lub inne czynniki wzrostu), dodaj je w tych samych dniach, w których dodawana jest obróbka kwasem askorbinowym.
11. Dwa dni po ostatnim zabiegu kwasem askorbinowym usuń pożywkę i przemyj w 2 ml PBS.
12. Powoli dodawać 1 ml buforu do lizy, wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C, do każdego dołka. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej, aż fibroblasty zostaną poddane lizie (obserwowalnej pod mikroskopem).
13. Ostrożnie i bez usuwania buforu do lizy dodać 2 ml PBS. Następnie odessać około 2,5 ml PBS. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania.
14. Na koniec usuń 2,5 ml PBS i dodaj 2 ml PBS za pomocą Pen/Strep (odpowiednio 100 U/ml i 100 μg/ml). Uszczelnić folią i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
    UWAGA: W zależności od eksperymentu, długotrwałe przechowywanie wygenerowanych matryc może mieć wpływ na wyniki. Zalecamy jak najszybsze użycie matryc, a tym bardziej, jeśli eksperyment obejmuje wysiewanie komórek, ze względu na możliwą degradację białek. Jeśli matryce są używane do testów strukturalnych, takich jak obserwacja kolagenu, matryce mogą być utrwalane i przechowywane przez dłuższy czas. Protokół ten jest wskazany dla 6-dołkowej płytki hodowlanej. Można użyć innych płytek, ale objętości reaktywne i stężenie zawiesiny komórek należy ponownie obliczyć w zależności od powierzchni studzienki.

4. Test tworzenia probówek

1. Hoduj komórki HUVEC w EBM-2 2% FBS aż do maksymalnej konfluencji.
2. Wymień pożywkę na EBM-2 bez FBS na 8 godzin.
3. Przygotuj matryce przed wysiewem komórek.
   1. Wyjmij matryce z lodówki i umieść na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. Blokuj matryce, dodając 2 ml denaturowanego termicznie 2% BSA. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   3. Odessać BSA i przemyć w 2 ml PBS.
4. Zasiać 2 x 10⁵ komórek HUVEC w pożywce zubożonej w FBS na każdym dołku 6-dołkowej płytki uprzednio pokrytej matrycami pochodzącymi z fibroblastów 3D.
5. Inkubować komórki śródbłonka w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
6. Zbadaj tworzenie się struktury przypominającej rurkę pod standardowym mikroskopem jasnego pola przy powiększeniu 20-40x.

Wyniki

fibroblasty stymulowane PDGF-BB tworzą grubszy ECM. Herrera i wsp. wykazali, w jaki sposób fibroblasty stymulowane przez PDGF generowały grubszą matrycę, a także wyższą orientację włókien⁷. Fibroblasty BJ-hTERT inkubowano z PDGF lub bez, a obserwowane reprezentatywne obszary wykazały bardziej wyrównany rozkład komórek w matrycach wytwarzanych przez fibroblasty stymulowane PDGF (Figura 1a). Ekspresja kolagenu I i białka fibronekt...

Dyskusja

Matryce mogą być generowane z unieśmiertelnionych fibroblastów lub pierwotnych kultur fibroblastów. Fibroblasty są łatwe w utrzymaniu w hodowli in vitro o wysokim tempie wzrostu i odporności na stres. Można je nawet wyizolować z tkanki pośmiertnej³, chociaż zanieczyszczenie może być ograniczeniem, w zależności od pochodzenia tkanki.

Model matrycowy 3D oferuje nowatorski i skuteczny system do skutecznego badania składu ECM i orientacji włókien. Nadaje się również do anal...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wodorotlenek amonu (NH4OH)	Roth	A990.1
Amfoterycyna-B	Corning	30-003-CF
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A7906-50G
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)	Corning	10-014-CVR
Śródbłonkowe podłoże podstawowe (EBM)	Lonza	CC-3121	Dodaj suplementy przed użyciem
Śródbłonkowe podłoże Podstawowe suplementy (EGM-2)	Lonza	CC-4176
Etanoloamina	Sigma	411000-100ML
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Biowest	S181B-500	inaktywowana termicznie przed użyciem
Fibroblast Growth Basal Medium (FBM)	Lonza	CC-3131	dodaj suplementy przed użyciem
Pożywka wzrostowa fibroblastów Suplementy i czynniki wzrostu (FGM-2)	Lonza	CC-4126
Żelatyna ze skóry bydlęcej	Sigma	G9391-100G
Aldehyd glutarowy	Sigma	g5882
Kwas L-askorbinowy	Sigma	A92902-100G	światłoczuła
L-Glutamina	Lonza	BE17-605E
Normocin	Invivogen	3ANT-NR-2
Pencillin/Streptomycyna (długopis/paciorkowiec)	Gibco	15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Corning	21-040-CVR
Triton X100	Roth	3051
Rekombinowana telomeraza transfekowana unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty napletka (BJ-hTERT)	ATCC	ATCC CRL-4001
Ludzka żyła pępowinowa komórki śródbłonka (HUVEC)	ATCC	PCS-100-013