Artykuł metodologiczny

Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60309

⸱

17 października 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mięsień lotu Drosophila to potężny model do badania regulacji transkrypcji, alternatywnego splicingu, metabolizmu i mechanobiologii. Przedstawiamy protokół preparacji znakowanych fluorescencyjnie mięśni lotnych z żywych poczwarek w celu wygenerowania wysoce wzbogaconych próbek, idealnych do proteomiki i głębokiego sekwencjonowania. Próbki te mogą dostarczyć ważnych mechanistycznych wglądów w różne aspekty rozwoju mięśni.

Streszczenie

Mięsień lotu Drosophila to potężny model do badania różnorodnych procesów, takich jak regulacja transkrypcji, alternatywne splicing, metabolizm i mechanobiologia, które wpływają na rozwój mięśni i miofibrylogenezę. Dane omiczne, takie jak te generowane przez spektrometrię mas lub głębokie sekwencjonowanie, mogą dostarczyć ważnych mechanistycznych wglądów w te procesy biologiczne. W przypadku takich podejść korzystna jest analiza próbek specyficznych dla tkanek w celu zwiększenia zarówno selektywności, jak i swoistości omicznych odcisków palców. W tym miejscu przedstawiamy protokół preparacji znakowanych fluorescencyjnie mięśni lotu z żywych poczwarek w celu wygenerowania wysoce wzbogaconych próbek mięśni do zastosowań omicznych. Najpierw opisujemy, jak preparować mięśnie lotu we wczesnych stadiach poczwarki (<48 h po utworzeniu poczwarki [APF]), kiedy mięśnie są rozpoznawalne przez znakowanie białkiem zielonej fluorescencji (GFP). Następnie opisujemy, jak preparować mięśnie od późnych poczwarek (>48 h APF) lub dorosłych, gdy mięśnie są rozróżnialne pod mikroskopem preparacyjnym. Dołączony protokół wideo sprawi, że te wymagające technicznie sekcje będą szerzej dostępne dla społeczności badawczej zajmującej się mięśniami i Drosophila. W przypadku zastosowań RNA oznaczamy ilość i jakość RNA, które można wyizolować w różnych punktach czasowych i przy różnych podejściach. Ponadto pokazujemy, że Bruno1 (Bru1) jest niezbędny do czasowego przesunięcia w splicingu ciężkiego łańcucha miozyny (Mhc), wykazując, że wypreparowane mięśnie mogą być wykorzystywane do zastosowań w mRNA-Seq, spektrometrii mas i reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Ten protokół preparacyjny pomoże promować analizy omiczne specyficzne dla tkanek i może być ogólnie stosowany do badania wielu biologicznych aspektów miogenezy.

Wprowadzenie

Nowoczesne technologie omiczne dostarczają ważnych informacji na temat rozwoju mięśni i mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń mięśni u ludzi. Na przykład analiza danych transkryptomicznych w połączeniu z weryfikacją genetyczną i biochemiczną w modelach zwierzęcych ujawniła, że utrata czynnika splicingu RBM20 powoduje kardiomiopatię rozstrzeniową ze względu na regulację docelowej sieci ponad 30 genów sarkomerowych wcześniej związanych z chorobami serca, w tym tytyny1,2,3.

W drugim przykładzie, badania z hodowli komórkowych, modeli zwierzęcych i pacjentów wykazały, że dystrofia miotoniczna jest spowodowana zakłóceniem regulacji RNA spowodowanym sekwestracją ślepoty mięśniowej (MBNL) i regulacją w górę CELF14,5. Dynamika krzyżowa i czasowa między MBNL i CELF1 (zwana również CUGBP1 lub Bruno-Like 2) pomaga wyjaśnić utrzymujące się wzorce splicingu embrionalnego u pacjentów z dystrofią miotoniczną. Dodatkowo, duża sieć nieprawidłowo regulowanych celów pomaga wyjaśnić złożoną naturę choroby4,6,7,8. Większość takich badań wykorzystuje podejścia omiczne w organizmach modeli genetycznych, aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw chorób mięśni ludzkich. Ponadto podkreślają znaczenie pierwszego zrozumienia czasowej i specyficznej dla typu tkanki ekspresji genów, modyfikacji białek i wzorców metabolicznych w zdrowych mięśniach, aby zrozumieć zmiany w chorych lub starzejących się mięśniach.

Drosophila melanogaster to kolejny dobrze znany model genetyczny organizmu. Struktura sarkomeru, jak również poszczególne składniki sarkomery, są wysoce konserwatywne od much do kręgowców4,9,10, a mięśnie lotu pośredniego (IFM) stały się potężnym modelem do badania wielu aspektów rozwoju mięśni11,12. Po pierwsze, mięśnie lotu fibrylarnego różnią się funkcjonalnie i morfologicznie od rurkowatych mięśni ciała11,13, co pozwala na badanie mechanizmów rozwojowych specyficznych dla danego typu mięśni. Czynniki transkrypcyjne, w tym Spalt major (Salm)14, Extradenticle (Exd) i Homothorax (Hth)15 zostały zidentyfikowane jako regulatory losu fibrillar. Dodatkowo, za Salm, homolog CELF1 Bruno1 (Bru1, Aret) kieruje specyficznym dla fibrylaru programem splicingu16,17.

Po drugie, IFM są ważnym modelem do zrozumienia samego procesu miogenezy, od fuzji mioblastów i przyłączania miotubówek do miofibrylogenezy i dojrzewania sarkomeru9,18,19. Po trzecie, genetyka Drosophila pozwala na badanie wkładu poszczególnych białek, domen białkowych i izoform białek w powstawanie, funkcję i właściwości biofizyczne sarkomeru20,21,22,23. Wreszcie, modele IFM zostały opracowane do badania wielu zaburzeń mięśni u ludzi, takich jak dystrofia miotoniczna, miopatie miofibrylarne, choroby zwyrodnieniowe mięśni, aktynopatie itp.24,25,26,27, i dostarczyły ważnych informacji na temat mechanizmów chorobowych i potencjalnych terapii28,29,30. W związku z tym Drosophila jest użytecznym modelem do rozwiązywania wielu otwartych pytań w dziedzinie miogenezy, w tym mechanizmów transkrypcji, splicingu i regulacji chromatyny specyficznych dla typu mięśni, a także roli metabolizmu w rozwoju mięśni. Zastosowanie nowoczesnych technologii omicznych, w szczególności w połączeniu z szeroką gamą testów genetycznych, biochemicznych i biologicznych dostępnych u Drosophila, może znacznie przyczynić się do lepszego zrozumienia rozwoju mięśni, starzenia się i chorób.

IFM to największe mięśnie w locie, rozciągające się prawie 1 mm na całej długości klatki piersiowej u dorosłych31,32. Jednak ten mały rozmiar stwarza wyzwanie polegające na uzyskaniu wystarczającej ilości próbki, aby zastosować technologie omiczne u Drosophila w sposób specyficzny dla typu tkanki. Co więcej, IFM są częścią dorosłej muskulatury, która powstaje w stadiach poczwarki. Mioblasty łączą się, tworząc miotuby, które przyczepiają się do ścięgien około 24 godziny po utworzeniu poczwarki (APF) i przechodzą etap zagęszczenia niezbędny do zainicjowania miofibrylogenezy około 30 godzin APF (Rysunek 1A-D)18,33,34.

Włókna mięśniowe następnie rosną i obejmują całą długość klatki piersiowej, przy czym miofibryle przechodzą początkową fazę wzrostu skoncentrowaną na dodawaniu sarkomeru do około 48 h APF, a następnie przechodzą do fazy dojrzewania, w której sarkomery rosną na długość i szerokość i są przebudowywane, aby ustanowić aktywację rozciągania przez 72 h APF (Rysunek 1A-D)32, 35. Początek dojrzewania włókien jest przynajmniej częściowo kontrolowany przez Salm i E2F32,36,37, a wiele izoform białka sarkomerowego specyficznych dla IFM, których splicing jest kontrolowany przez Bru1, jest włączanych podczas tej fazy16,17. Dojrzałe muchy zamykają się od 90–100 h APF. Oznacza to, że aby badać rozwój mięśni, IFM musi zostać wyizolowany z wystarczającą ilością, jakością i czystością z wielu punktów czasowych poczwarki, aby ułatwić analizę przy użyciu podejść omicznych.

Opublikowano kilka protokołów do analizy IFM. Chociaż protokoły te działają dobrze w zamierzonych zastosowaniach, żaden z nich nie jest idealny dla podejść omicznych. Protokoły, które zachowują morfologię IFM do immunofluorescencji poczwarek i dorosłych IFM19, izolują włókna IFM do oceny mechanicznej31, lub wykorzystują mikrodysekcję IFM poczwarki z kriosekcji38 są zbyt specjalistyczne, czasochłonne i pracochłonne, aby racjonalnie uzyskać wystarczającą ilość tkanki IFM do zastosowań omicznych. Inne protokoły zostały opracowane do szybkiej sekcji specyficznie dorosłych IFM38,39, dlatego nie mają zastosowania do stadiów poczwarki i używają, które nie są idealne lub mogą być niekompatybilne, na przykład, z izolacją RNA. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania nowych podejść do izolowania poczwarki IFM do zastosowań biochemicznych lub omicznych.

Tutaj prezentujemy protokół do analizy IFM podczas stadium poczwarki, który został z powodzeniem wykorzystany do analizy mRNA-Seq od 16 h APF do stadium dorosłego16,32. W protokole zastosowano etykietę białka zielonej fluorescencji (GFP) do identyfikacji IFM na wszystkich etapach rozwoju poczwarki i dorosłego osobnika, umożliwiając preparację na żywo pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Podejście to jest mniej pracochłonne, z wyższą przepustowością niż istniejące protokoły preparacji IFM. Pozwala to na szybką izolację i kriokonserwację próbek, generując wystarczającą ilość materiału po kilku rundach sekcji, aby można było zastosować metody omiczne, a także standardową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) lub western blotting.

Prezentujemy protokół w dwóch częściach, pokazując, jak szybko rozłożyć IFM na czynniki pierwsze zarówno przed 48 h APF (podczas wczesnej metamorfozy, kiedy przyczepy IFM są bardziej wątłe), jak i po 48 h APF (gdy plan ciała poczwarki i przyczepy IFM są dobrze zdefiniowane). Pokazujemy, że możemy wyizolować wysokiej jakości RNA z wypreparowanych IFM we wszystkich punktach czasowych i prezentujemy dane na temat różnych podejść do izolacji RNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec pokazujemy zastosowanie protokołu rozbioru do mRNA-Seq, spektrometrii mas i RT-PCR na przykładzie homologu CELF1 Bruno1. Pokazujemy błędną ekspresję izoform białka sarkomeru w danych proteomicznych z mutacji IFM Bruno1 i badamy regulację Bruno1 w przypadku C-końcowego splicingu łańcucha ciężkiego miozyny (Mhc). Wyniki te ilustrują, w jaki sposób dane omiczne mogą zapewnić głębsze zrozumienie zjawisk biologicznych, uzupełniając eksperymenty genetyczne i biochemiczne.

Protokół

1. Inscenizacja poczwarek

  1. Hoduj muchy o pożądanym genotypie w butelkach (Rysunek 1E). Albo wykonaj nowy rzut kolby preparacyjnej, albo ustaw krzyżówkę z co najmniej 20 samicami dziewiczych much. Trzymaj butelki, aż muchy zaczną się przepoczwarzać.
  2. Zbierz poczwarki za pomocą zwilżonego pędzla i przenieś na zwilżoną bibułę filtracyjną na 60-milimetrowej szalce Petriego (Rysunek 1F).
  3. Określ płeć poczwarek, zbierając odpowiednią płeć do eksperymentu (Rysunek 1G). Samce identyfikuje się po obecności jąder, które pojawiają się jako półprzezroczyste kulki w nieprzezroczystej poczwarce.
  4. Oznacz szalkę Petriego godziną, datą i genotypem, a następnie postarzej poczwarki do pożądanego etapu (Rysunek 1H).
    nuta: Utrzymuj krzyżówki/stada i wiek poczwarek w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (tj. 25 °C lub 27 °C w przypadku krzyżówek RNAi, ponieważ zwiększona aktywność Gal4 w wyższych temperaturach zwiększa skuteczność powalania40). Upewnij się, że wilgotność jest wystarczająco wysoka, aby poczwarki nie wysychały podczas starzenia się przez kilka dni.

2. Sekcja IFM przed 48 h APF

  1. Zbierz niezbędny sprzęt, w tym dwa kleszczyki klasy biologicznej #5, pipetę, końcówki do pipet, suchy lód i (w przypadku próbek RNA) odczynnik izolacyjny (patrz Tabela materiałów). Ponadto schłodzić na lodzie czarne naczynia rozwarstwiające (patrz tabela materiałów), 1x bufor soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) i 1,5 ml probówek do mikrowirówek na lodzie.
  2. Za pomocą zwilżonego pędzla przenieś zainscenizowane poczwarki do czarnej naczynia preparacyjnego wypełnionej około dwóch trzecich zimnym 1x PBS (Rysunek 2A,B). Przejdź do fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego.
    nuta: Użyj tylu poczwarek, ile można wyciąć w ciągu 30 minut. W zależności od doświadczenia waha się to od 3 do 15 poczwarek. Zobacz Metody uzupełniające, aby zapoznać się z omówieniem alternatyw dla czarnych naczyń preparacyjnych.
  3. Używając kleszczyków #5, popchnij jedną z poczwarek na dno czarnej naczynia preparacyjnej i dostosuj powiększenie mikroskopu i ostrość, aby wyraźnie zobaczyć poczwarkę (Rysunek 2C).
  4. Chwyć przednią część poczwarki jednym kleszczem (Ryc. 2D), a następnie szturchnij poczwarki pojedynczą końcówką drugiego kleszcza nieco poza środkiem w jamie brzusznej, tuż za klatką piersiową. To utrzymuje poczwarkę w miejscu i zapobiega przemieszczaniu się IFM do jamy brzusznej (Rysunek 2E).
    nuta: Rozpocznij mierzenie czasu trwania sekcji od tego punktu, gdy tylko integralność poczwarki zostanie zakłócona. Użyj określonej długości sekcji (na przykład 20-30 minut), aby zminimalizować śmierć mięśni i związane z nią zmiany transkryptomiczne i proteomiczne. Wypreparuj jak najwięcej much w tym okresie.
  5. Za pomocą pierwszych kleszczy usuń przednią połowę obudowy poczwarki (Ryc. 2F).
  6. Użyj tych samych kleszczy, aby uszczypnąć odsłonięte poczwarki tuż za klatką piersiową i oddzielić brzuch od klatki piersiowej (Rysunek 2G).
  7. Za pomocą kleszczy delikatnie ściśnij przednią część klatki piersiowej (przez <35 h APF) lub rozerwij klatkę piersiową, aby odsłonić fluorescencyjnie znakowane IFM (Rysunek 2H). IFM łatwo odczepiają się od naskórka, ponieważ przyczepy ścięgien we wczesnych punktach czasowych są delikatne. Wyrzuć pozostałą tuszę za pomocą kleszczy, aby przepchnąć ją na przeciwną stronę naczynia.
  8. Powtarzając kroki 2.3–2.7, wypreparuj dodatkowe poczwarki.
  9. Zbierz włókna IFM za pomocą kleszczy i ułóż je w stos na dnie czarnego naczynia preparacyjnego (Rysunek 2I,J). Usuń wszelkie zanieczyszczenia, wypychając je poza pole view za pomocą kleszczy.
    nuta: Przy nabraniu wprawy końcówki kleszczy można zbliżyć do siebie, nie dotykając się nawzajem. Ta technika może być używana do luźnego chwytania IFM bez ich niszczenia. Alternatywne metody obejmują delikatne popychanie lub podnoszenie IFM za pomocą jednej końcówki lub całkowicie zamkniętych kleszczy lub pobieranie części tłuszczu lub innej tkanki za pomocą IFM i usuwanie tłuszczu, jak opisano w kroku 2.10.
  10. Kontrola jakości próbki mięśni IFM, za pomocą kleszczy do usuwania mięśni, tłuszczu, naskórka itp. z próbki (Rysunek 2K,L).
    nuta: W przypadku Mef2-Gal4, IFM jest znakowany silniej niż inne typy mięśni we wczesnych punktach czasowych (Rysunek 2K,K'), umożliwiając usunięcie mięśni skokowych i mięśni larwalnych w oparciu o intensywność fluorescencji i kształt mięśni. Tkanka tłuszczowa i tkanka naskórka wyglądają inaczej i nie są oznaczone specyficzną dla mięśni etykietą fluorescencyjną (Rysunek 2K,K'). Zobacz sekcję dyskusji, aby zapoznać się z innymi liniami Gal4, które oznaczają IFM.
  11. Za pomocą przyciętej końcówki pipety przenieś stos IFM do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 250 μl schłodzonego 1x PBS (Rysunek 2M-O). Przejdź natychmiast do sekcji 4.
    nuta: Próbki IFM mogą zostać utracone przez zwykłe przyklejenie się do boku końcówki pipety. Kilkakrotnie pipetowanie buforu w górę i w dół przed pobraniem IFM może sprawić, że standardowe końcówki będą mniej lepkie, a silikonowane lub perfluoroalkoksylowe (PFA) końcówki o niższych napięciach powierzchniowych mogą pomóc w zapobieganiu utracie próbki.

3. Sekcja IFM po 48 godzinach APF

  1. Zbierz niezbędny sprzęt, w tym dwa kleszczyki klasy biologicznej #5, drobne nożyczki, standardowe szklane szkiełka mikroskopowe, taśmę dwusztyftową, pipetę, końcówki do pipet, suchy lód i (w przypadku zastosowań RNA) odczynnik izolacyjny (patrz Tabela materiałów). Schłodzić 1x PBS i probówki mikrowirówkowe na lodzie.
  2. Za pomocą lekko zwilżonego pędzla przenieś poczwarki na pasek dwustronnej taśmy klejącej zamontowany na szkiełku mikroskopowym (Rysunek 3A). Umieść poczwarki w linii zorientowanej w tej samej orientacji (brzusznie do dołu i do przodu w kierunku dołu szkiełka).
    nuta: Uważaj, aby nie użyć zbyt dużo wody na pędzel lub filtr, w przeciwnym razie poczwarki nie będą się dobrze trzymać. Jeśli poczwarki się nie przyklejają, wysusz je, najpierw przenosząc do suchego filtra lub bibuły. Zamontuj tyle poczwarek, ile można wyciąć w ciągu 30 minut, najlepiej ~10 poczwarek.
  3. Usuń poczwarkę z etui na poczwarkę. Użyj kleszczy, aby rozdzielić i otworzyć skrzynkę poczwarki powyżej przetchlinków przednich (Ryc. 3B).
  4. Delikatnie przesuń parę kleszczy grzbietowo w kierunku tyłu, przecinając obudowę poczwarki, gdy kleszcze się poruszają (Rysunek 3B'). Uważaj, aby nie rozerwać leżącej pod spodem poczwarki. Uwolnij poczwarkę z otwartego pudełka i natychmiast przenieś ją do kropli 1x PBS na drugim szkiełku mikroskopowym (Rysunek 3B",C).
  5. Powtórz kroki 3.3 i 3.4 dla wszystkich poczwarek w linii, a następnie odłóż na bok suwak z taśmą dwupatyczkową.
  6. Za pomocą cienkich nożyczek odetnij odwłok poczwarki od klatki piersiowej i wepchnij go do osobnego stosu (Rysunek 3D,D'). Powtórz dla pozostałych poczwarek.
    nuta: Rozpocznij mierzenie czasu trwania sekcji od kroku 3.6, gdy tylko integralność poczwarki zostanie zakłócona. Wypreparuj jak najwięcej much w ciągu 20-30 minut, aby zapobiec śmierci komórki i związanym z nią zmianom transkryptomicznym i proteomicznym. Podczas preparacji 1 d dorosłych lub poczwarek >90 h, często wygodnie jest w późniejszych krokach dodatkowo usunąć głowę cienkimi nożyczkami.
  7. Za pomocą bibuły usuń większość 1x PBS (zazwyczaj mętny z zawieszonym tłuszczem), a także stos brzuchów (Rysunek 3E). Dodaj kroplę świeżego, schłodzonego 1x PBS do pozostałych torsów.
  8. Użyj nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową na pół (Rysunek 3F,F'), przecinając od głowy w dół podłużnej osi ciała jednym ruchem. Alternatywnie, jeśli głowa została usunięta, najpierw włóż nożyczki w miejscu, w którym głowa była przymocowana i przetnij górną połowę klatki piersiowej wzdłużnie między IFM. Następnie przetnij brzuszną stronę klatki piersiowej drugim cięciem w tej samej orientacji.
  9. Powtórz kroki 3.7 i 3.8 dla wszystkich poczwarek, które mają zostać wycięte, generując stos półsekcji klatki piersiowej w pobliżu środka szkiełka. Upewnij się, że na szkiełku jest wystarczająca ilość schłodzonego 1x PBS, aby hemisekcje nie wyschły.
    nuta: Po 48 godzinach APF IFM są na tyle duże, że są widoczne dla wprawnego oka pod standardowym mikroskopem preparacyjnym. Na tym etapie protokołu mięśnie z etykietą fluorescencyjną mogą zostać przeniesione do fluorescencyjnego zakresu preparacyjnego, aby pomóc w identyfikacji IFM lub w celach treningowych, ale nie jest to konieczne.
  10. Wypreparuj IFM z klatki piersiowej. Odizoluj jedną z półsekcji za pomocą kleszczy #5 (Rysunek 3G,H). Delikatnie włóż końcówki jednego kleszcza powyżej i poniżej środka IFM (Rysunek 3G',H'). Trzymając pierwsze kleszcze nieruchomo, użyj cienkich nożyczek, aby odciąć jeden koniec IFM od naskórka i ścięgien. Następnie odetnij drugi koniec IFM od naskórka (Rysunek 3G'',H'').
    nuta: W zależności od orientacji klatki piersiowej po pierwszym cięciu IFM, przydatne jest obrócenie klatki piersiowej o 180°, aby drugie cięcie IFM było łatwiejsze do wykonania.
  11. Usuń wiązkę IFM z klatki piersiowej za pomocą kleszczy (Rysunek 3G''',H'''), przenosząc ją na krawędź pęcherzyka PBS, aby użyć napięcia wody do utrzymania jej na miejscu (Rysunek 3I). Popchnij tuszę na przeciwną stronę zjeżdżalni. Powtórz te czynności dla pozostałych hemisekcji klatki piersiowej, generując kolekcję wypreparowanych IFMs.
    nuta: Jeśli IFM nie pozostają w schludnym stosie, usuń część 1x PBS za pomocą chusteczki. Uważaj, aby nie dopuścić do wyparowania wszystkich PBS i upewnij się, że wypreparowane IFM i hemithoraxs pozostają pokryte buforem.
  12. Po przeprowadzeniu sekcji wszystkich IFM szybko przeprowadź kontrolę jakości wypreparowanego mięśnia. Za pomocą kleszczy #5 usuń wszelkie fragmenty mięśni skokowych lub naskórka, które mogły znaleźć się w próbce (Rysunek 3J-K'').
    nuta: Mięsień skoku wygląda inaczej niż IFM. Jeśli rozwarstwia się mięsień znakowany Mef2-Gal4 pod wpływem fluorescencji, mięsień skokowy ma słabszą fluorescencję oraz inny kształt i teksturę. W normalnym świetle wydaje się prawie przezroczysty, podczas gdy IFM są nieprzezroczyste, mlecznożółte (Rysunek 3J-J'',K).
  13. Używając naprężenia wody, chwyć (ale nie zgniataj) rozcięte IFM między parą kleszczy (Rysunek 3L). Przenieś IFM do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wstępnie napełnionej 250 μl schłodzonego 1x PBS (Rysunek 3M). Natychmiast przejść do punktu 4.
    nuta: Kiedy końcówki kleszczy są zbliżane do siebie i wyjmowane z roztworu buforowego, napięcie wody powoduje wychwytywanie pęcherzyka buforu między końcówkami kleszczy. Jeśli IFM są również obecne w tym pęcherzyku, można je wyjąć z roztworu i łatwo przenieść do innego pojemnika wypełnionego buforem. Ważne jest, aby ścisnąć kleszcze, aby zbliżyć końcówki do siebie, nie dotykając się nawzajem, aby uniknąć maceracji tkanki uchwyconej w pęcherzyku buforowym.

4. Osadzanie i przechowywanie próbki IFM

  1. Osadzaj IFM, odwirowując probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml przez 3–5 minut przy 2,000 x g w wirówce stołowej (Rysunek 4A,B).
  2. Usuń bufor za pomocą końcówki pipety (Rysunek 4C).
  3. W przypadku zastosowań RNA należy ponownie zawiesić osad IFM w 50–100 μl żądanego bufora izolacyjnego RNA (patrz Tabela materiałów, Rysunek 4D). W przeciwnym razie przejdź do kroku 4.4.
    nuta: IFM mogą być zamrażane na sucho po kroku 4.2 w celu przygotowania spektrometrii mas lub izolacji RNA za pomocą komercyjnych zestawów (patrz reprezentatywne wyniki). W przypadku zastosowań RNA lepsze wyniki uzyskuje się poprzez natychmiastowe ponowne zawieszenie i zamrożenie osadu IFM w buforze izolacyjnym
    4. .
  4. Zamrożenie próbki na suchym lodzie lub szybkie zamrożenie w ciekłym azocie (Rysunek 4E). Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie gotowe do kolejnych etapów przygotowania próbki do dalszej analizy.
    nuta: Po kriopkonserwacji próbki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy przed przetworzeniem w celu dalszego badania.

Wyniki

Przedstawione powyżej protokoły preparacji są przydatne do generowania próbek wzbogaconych IFM od 16 godzin po utworzeniu poczwarki (APF) aż do osiągnięcia dorosłego stadium. Wypreparowane próbki mięśni lotu mogą być używane do wielu zastosowań i do tej pory były z powodzeniem stosowane w RT-PCR4,17, RNA-Seq16,32, ChIP36,37, Western blotting14,41 i eksperymenty ze spektrometrią mas (patrz poniżej). Aby pomóc potencjalnym użytkownikom w analizie zastosowań opartych na RNA, najpierw przedstawiamy nasze wyniki, podkreślając ważne kwestie, szczególnie dotyczące izolacji RNA od IFM. Aby szerzej zademonstrować użyteczność naszych protokołów sekcyjnych, ilustrujemy niektóre z możliwych zastosowań –omicznych, wykorzystując nasze dane na temat białka wiążącego RNA Bruno1.

Protokół sekcji IFM daje wysokiej jakości RNA

Ważne jest, aby określić liczbę muszek do preparowania z wyprzedzeniem, ponieważ szacuje się, że kodujące mRNA stanowi tylko 1-5% całkowitego RNA42. Uzyskaliśmy średnio 24 ± 9 ng całkowitego RNA na muchę z IFM wypreparowanego od 1 d dorosłych (Rysunek 4F i Rysunek uzupełniający 1A), przy czym plony zwykle rosną wraz z doświadczeniem. Ta wydajność całkowitego RNA na muchę jest względnie stała, wahając się wokół 25 ng dla IFM preparowanego w 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF i 90 h APF (Rysunek 4F i Rysunek uzupełniający 1B, D, E). Obserwacje te odzwierciedlają również wszelkie RNA wyizolowane z zanieczyszczonego tłuszczu, ścięgien, tchawicy lub innych typów komórek, które mogą być wyższe w próbkach wyizolowanych z wcześniejszych punktów czasowych. W ten sposób uzyskaliśmy >1 μg całkowitego RNA z IFM od 50 much i zazwyczaj preparujemy IFM od 100-150 much, aby wygenerować >3 μg całkowitego RNA dla próbek RNA-Seq.

Metoda izolacji RNA wpływa na ilość i jakość odzyskanego RNA, dlatego zachęcamy użytkowników do sprawdzenia swojego podejścia do izolacji. Na przykład, podczas gdy izolacja przy użyciu metody 1 daje średnio 1143 ± 465 ng całkowitego RNA z IFM od 50 dorosłych much 1 d, izolacja za pomocą różnych komercyjnych zestawów daje od 186 ± 8 ng do 1261 ± 355 ng całkowitego RNA (Rysunek 4G i rysunek uzupełniający 1C). RNA wyizolowane z komercyjnych zestawów jest na ogół dobrej jakości (Rysunek 4H i Rysunek uzupełniający 1F), ale niskie poziomy odzysku sugerują, że RNA może nie być skutecznie eluowany z kolumn. Integralność RNA może być również zagrożona przez użycie zestawu, jak to ma miejsce w metodzie 2 (Rysunek 4H, drugi wykres), prawdopodobnie z powodu budowy buforu i obróbki cieplnej, co prowadzi do poważnej fragmentacji, która może mieć wpływ na dalsze eksperymenty.

Ważne jest również przestrzeganie prawidłowej techniki wolnej od RNaz podczas izolowania i obchodzenia się z próbkami RNA. Chociaż cykle zamrażania i rozmrażania oraz 4-godzinna inkubacja w temperaturze pokojowej nie wpływają dramatycznie na profile integralności RNA, nawet niewielkie ilości RNazy prowadzą do szybkiej degradacji RNA (Rysunek 4I i metody uzupełniające). Użytkownicy są nadal zachęcani do pracy na lodzie i ograniczania zamrażania i rozmrażania, aby zapobiec hydrolizie i fragmentacji RNA. Nie zostało to tutaj wykryte, ale zapobieganie zanieczyszczeniu RNazą za pomocą końcówek filtrów i poddanych działaniu DEPC jest absolutnie niezbędne.

Efektywność odwrotnej transkrypcji również wpływa na sukces aplikacji podrzędnych. Uzyskaliśmy wiarygodne wyniki za pomocą dwóch z trzech testowanych przez nas komercyjnych zestawów RT, które wzmacniają silne prążki RT-PCR dla genu rybosomalnego rp49 (Rysunek 4J). Jednak RT Kit #2 może być bardziej czuły na wykrywanie transkryptów o niskiej ekspresji, ponieważ uzyskaliśmy silniejsze prążki dla białka wiążącego RNA bru1 dla wszystkich trzech kontrprób biologicznych (Figura 4J). Podsumowując, wyniki te pokazują, że wysokiej jakości RNA można wyizolować z IFM wypreparowanych za pomocą tej procedury.

Wycięte IFM dostarczają wysokiej jakości danych mRNA-Seq i proteomicznych

Korzystając z IFM wypreparowanego zgodnie z powyższym protokołem po 30 h APF, 72 h APF i od 1 d dorosłych muszek, wcześniej pokazaliśmy, że białko wiążące RNA i homolog CELF1 Bruno1 (Bru1, Arrest, Aret) kontroluje specyficzny dla IFM szlak splicingu poniżej czynnika transkrypcyjnego Spalt major (Salm)16. IFM z mutantów zerowych, a także muchy ze specyficznym dla mięśni bruno1 RNAi (bru1-IR) wykazują defekty wzrostu sarkomeru, nieprawidłową regulację aktywności miozyny i ostatecznie hiperskurcz i utratę włókien mięśniowych16,17. Poniżej pokazujemy użyteczność wypreparowanych IFM dla spektrometrii mas całego proteomu i pokazujemy, że kilka zmian ekspresji, które zaobserwowaliśmy na poziomie RNA, jest również widocznych na poziomie białka. Ponadto podkreślamy specyficzne zdarzenie splicingu rozwojowego w Mhc, które okazało się być regulowane przez Bruno1, ilustrując, że mRNA-Seq i RT-PCR z wypreparowanych IFM można wykorzystać do zademonstrowania regulacji alternatywnych zdarzeń splicingowych.

W zależności od jakości i głębokości biblioteki, dane mRNA-Seq mogą być analizowane na poziomie jednostek genów (uśredniając liczbę odczytów dla wszystkich eksonów genu), pojedynczych eksonów lub połączeń splicingowych. Dane mRNA-Seq z IFM bru1-IR w porównaniu z typem dzikim pokazują słabe zmiany w ekspresji na poziomie jednostki genu16 (Rysunek 5A). W 72 h APF istnieje już tendencja do obniżania genów sarkomery, takich jak białko mięśniowe LIM w 60A [Mlp60A], aktyna 57B [Act57B], białko specyficzne dla mięśni 300 kDa [Msp300] lub Stretchin-Mlck [Strn-Mlck]), które są ważne dla prawidłowego rozwoju mięśni, aby być regulowane w dół w mięśniach bru1-IR (Rysunek 5A i Tabela uzupełniająca 1). Jednak wykazaliśmy wcześniej, że na poziomie poszczególnych eksonów występuje znacznie silniejsza regulacja w dół określonych izoform genu sarkomery16, co sugeruje, że główną funkcją Bruno1 jest kontrolowanie alternatywnego splicingu (Tabela uzupełniająca 1).

Korzystając ze spektrometrii mas całego proteomu na wypreparowanych IFM, możemy pokazać podobną regulację na poziomie białka (Rysunek 5B i Tabela uzupełniająca 2). Spośród 1895 wykrytych grup peptydowych, 524 (28%) z nich jest nieprawidłowo regulowanych w zmutowanym Bru1M2 IFM u dorosłych 1 d (Tabela uzupełniająca 2). Obserwuje się również regulację w dół zarówno białka Strn-Mlck, jak i Mlp60A, co odpowiada obserwacjom na poziomie transkryptu w naszych danych mRNA-Seq. Pomimo ograniczonej liczby peptydów bazodanowych, które mapują do określonych izoform białek (szczegóły analizy znajdują się w metodach uzupełniających), dla białek sarkomerowych tropomiozyny 1 (Tm1), podtrzymywanej (up/TnT), Mhc, wygiętej (bt/projektyny) i paramiozyny (Prm) obserwujemy regulację w górę peptydów z jednej izoformy i regulację w dół innej (Rysunek 5B), potwierdzając nasze wcześniejsze obserwacje podobnej regulacji na poziomie RNA16. Pokazuje to, że wypreparowane IFM są przydatne zarówno w zastosowaniach mRNA-Seq, jak i proteomicznych.

Jako kolejny przykład tego, jak dane omiczne mogą uzupełniać tradycyjne podejścia do wzmacniania i rozszerzania wiedzy biologicznej, zdecydowaliśmy się skupić na splicingu na C-końcu Mhc. Wcześniej scharakteryzowana linia pułapki białkowej o nazwie weeP26 jest wstawiona do końcowego intronu klasy Mhc 43,< sup class="xref">44 (dokładna lokalizacja znajduje się w Metodach uzupełniających). weeP26 zawiera silny akceptor splicingu i jest włączony do przypuszczalnie wszystkich transkryptów Mhc (Rysunek 5C). Jednak białko znakowane GFP w IFM jest włączone do dwóch "kropek" po obu stronach linii M, podczas gdy w mięśniach nóg włącza się równomiernie w poprzek linii M i słabo w poprzek grubych włókien (Figura 5E). Orfanos i Sparrow pokazali te "kropki" w formie IFM dzięki rozwojowemu przełącznikowi izoformy Mhc: izoforma Mhc wyrażona przed 48 h APF jest znakowana GFP, gdy ekson weeP26 wstawia się w otwartą ramkę odczytu, podczas gdy izoforma Mhc wyrażona po 48 h APF jest nieznakowana, ponieważ ekson weeP26 jest zawarty za kodonem stop w klasie 3'-UTR44.

Nasze dane mRNA-Seq pozwoliły nam scharakteryzować ekspresję C-końcowej izoformy Mhc bardziej szczegółowo. Chociaż zgłoszono dwie różne terminacje Mhc43,44, nasze dane mRNA-Seq i obecna adnotacja Flybase (FB2019_02) sugerują, że w rzeczywistości istnieją trzy możliwe alternatywne zdarzenia splicingu na C-końcu Mhc (Exon 34-35, 34-36 lub 34-37) (Rysunek 5C), co potwierdza RT-PCR (Figura 5D). weeP26 powiedział:GFP jest wstawiany do intronu między eksonem 36 i 37; w związku z tym, ponieważ zarówno izoformy eksonu 34-35, jak i eksonu 34-36 zawierają kodony stop, GFP może ulegać translacji tylko w izoformie eksonu 34-37 (co daje ekson 34-GFP-37). Dalej mogliśmy zaobserwować zarówno czasową, jak i przestrzenną regulację wszystkich izoform Mhc. W IFM obserwujemy przejście izoformy Mhc z eksonu 34-37 na ekson 34-35 między 30 h APF a 48 h APF (Rysunek 5C,D,F) w temperaturze 27 °C, mimo że nie jest to jeszcze widoczne przez immunofluorescencję w 48 h APF (Rysunek 5E). Nogi wyrażają już mieszaninę eksonów 34-37 i eksonów 34-35 po 30 godzinach APF, a po 72 godzinach APF wyrażają wszystkie trzy izoformy Mhc (Rysunek 5D,F). Dorosły mięsień skokowy (TDT) również wyraża wszystkie trzy izoformy Mhc (Rysunek 5F), co sugeruje, że jest to ogólnie prawdziwe dla rurowych mięśni somatycznych. W związku z tym nasze dane mRNA-Seq pozwalają na rozszerzenie wcześniejszych ustaleń poprzez zawężenie ram czasowych dla przełącznika izoformy Mhc w IFM i scharakteryzowanie zastosowania izoformy Mhc w mięśniach rurkowych.

Następnie zbadano

Regulacja izoformy Mhc w IFM z mutacją salm i bru1. W obu przypadkach zaobserwowaliśmy niewłaściwą regulację weeP26. IFM z mutacją Salm nie są w stanie ukończyć przełącznika rozwojowego w ekspresji izoformy Mhc i fenokopowych wzorcach łączenia nóg na późniejszych etapach, w tym wzmocnienia zdarzenia Exon 34-36 (Figura 5F). Zgadza się to z wcześniejszymi ustaleniami, że utrata Salm powoduje prawie całkowitą transformację losu IFM w mięśnie rurkowe16. Zmutowany IFM Bru1-IR i bru1, podobny do salm-/- IFM, zachowuje zdarzenie splicingu eksonu 34-37 przez stadia dorosłe (Rysunek 5E,F), co skutkuje wzorcem znakowania weeP26 GFP przypominającym mięsień nogi, ale nie zyskuje zdarzenia Exon 34-36. Sugeruje to, że Bruno1 jest niezbędny w IFM, aby przynajmniej częściowo kontrolować przełącznik rozwojowy w alternatywnym splicingu Mhc, ale wskazuje, że dodatkowe czynniki splicingu są również źle regulowane w kontekście salm-/-. Co więcej, przykład ten ilustruje, w jaki sposób dane RT-PCR i mRNA-Seq z wypreparowanych IFM mogą być cenne w lepszym zrozumieniu rozwojowych mechanizmów splicingu i obserwowanych wad morfologicznych.

figure-results-1
Rysunek 1: Rozwój IFM i inscenizacja poczwarek. (A) Schemat rozwoju IFM po 24 h APF, 32 h APF, 48 h APF, 72 h APF i 1 d dorosłych pokazujących zagęszczenie mięśni lotu (zielony) przy ~32 h APF i późniejszy wzrost włókien w celu wypełnienia klatki piersiowej. Ścięgna są w kolorze ciemnoszarym. (B) Konfokalne obrazy utrwalonych IFM z sekcji otwartej książki (24 h, 32 h, 48 h) 19 lub hemisekcji klatki piersiowej (72 godziny, 1 dzień) wybarwionych na obecność aktyny (rodamina, falloidyna, magenta) i GFP (zielony). (C,D) Obrazy fluorescencji GFP w żywych poczwarkach ilustrujące nienaruszoną morfologię IFM linii rozwarstwienia muchy w płaszczyźnie grzbietowej (C) lub bocznej (D). Gwiazdki oznaczają lokalizację IFM. (E) Aby przygotować się do sekcji, muchy powinny być przewrócone lub skrzyżowane z 3-4 dniowym wyprzedzeniem. (F) Poczwarki są wybierane na podstawie ich białego koloru (żółte groty strzałek) i izolowane za pomocą zwilżonego pędzla (F',F''). (G) Przedpoczwarki powinny być płciowane w taki sposób, aby oddzielić samice od samców na podstawie obecności jąder, które wyglądają jak półprzezroczyste kulki położone z tyłu (żółte gwiazdki). (H) Poczwarki leżakuje się na zwilżonej bibule filtracyjnej w szalkach o średnicy 60 mm. Podziałka = 100 μm (B), 1 cm (C,D,E,H), 1 mm (F,F'',G). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza IFM przed 48 h APF. (A) Dodanie 1x buforu PBS do czarnego naczynia preparacyjnego za pomocą pipety transferowej. (B) Przenoszenie poczwarek w stadium za pomocą pędzla. (C) Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym do wizualizacji GFP, delikatne dociśnięcie poczwarki do dna naczynia preparacyjnego za pomocą kleszczy #5 (zaznaczonych na szaro). Litera "X" w okręgu oznacza ruch w głąb obrazu. (D,E) Chwytanie poczwarki z przodu (D), a następnie szturchanie poczwarki tuż za klatką piersiową (E). Kreska w okręgu oznacza brak ruchu. (F,G) Ciągnięcie kleszczami przednimi (strzałka) w celu usunięcia obudowy poczwarki (F), a następnie usunięcie brzucha (G). (H) Powtórzenie C-G dla kilku poczwarek. Żółte przerywane linie są ponumerowane, co oznacza poczwarki przyczyniające się do jego składowania. (I, J) Użycie kleszczy (I) do izolowania IFM od otaczających tkanek (J). Kropka w okręgu oznacza ruch poza stroną. (K,L) Usuwanie zanieczyszczeń, w tym tłuszczu i mięśni skokowych (TDT) (K) w celu wytworzenia czystej próbki IFM (L). TDT ma niższą ekspresję GFP i inny kształt niż włókna IFM (K'). (M,N,O) Użycie przyciętej końcówki pipety (M) do zebrania wypreparowanych IFM (N) i przeniesienia ich do probówki mikrowirówkowej (O). Podziałka = 1 cm (A,B,M,O), 1 mm (C-G), 500 μm (H-L,N). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza IFM po 48 h APF. (A) Ustawianie poczwarek na podwójnej taśmie klejącej. (B) Usunięcie poczwarki z obudowy poczwarki poprzez otwarcie jej do przodu (B), przecięcie koperty grzbietowo (B'), oraz wyjęcie poczwarki (B''). Symbole okręgów reprezentują to samo, co Rysunek 2. (C) Przeniesienie poczwarek do bufora. (D) Usunięcie brzucha poprzez przecięcie nożyczkami (żółte podwójne strzały) i oddzielenie od klatki piersiowej (D'). (E, F) Dodanie czystego buforu (E), a następnie przecięcie klatki piersiowej na pół wzdłużnie (F,F'). (G,H) Dykcje można wykonywać w świetle białym (G) lub fluorescencji w celu uwidocznienia GFP (H); cięcie IFM z jednej strony (G'), a następnie z drugiej strony (G''); podnoszenie z klatki piersiowej za pomocą kleszczy (obrysowanych na szaro) (G'''). (I,J,K) Zbieranie IFM w buforze (I) i usuwanie zanieczyszczającego brzusznego rdzenia nerwowego (VNC), jelit i mięśni skokowych (TDT) (J) w celu wygenerowania czystej próbki IFM (K). TDT ma niższą ekspresję GFP i inny kształt niż włókna IFM (J'', K'). (L,M) Użycie kleszczyków do przenoszenia IFM (L) do probówki mikrowirówkowej (M). Podziałka = 1 cm (A,E,M), 1 mm (B-D',F-L). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Szczegóły dotyczące zachowania IFM i izolacji RNA. (A) IFM są granulowane przez odwirowanie przez 5 minut przy 2000 x g. (B) Osad IFM (strzałka) i osad pod fluorescencją (B'). (C) Usunięcie całego buforu za pomocą końcówki pipety. (D) Do ekstrakcji RNA, ponowne zawieszenie osadu w buforze izolacyjnym. Ten krok można pominąć, aby zamrozić na sucho wypreparowane IFM. (E) Zamrażanie próbki w ciekłym azocie lub na suchym lodzie i przechowywanie w temperaturze -80 °C. Podziałka = 10 cm (A), 1 mm (B,B'), 1 cm (C,D,E). (F) Nanogramy (ng) całkowitego RNA z wypreparowanego IFM uzyskanego na muchę w 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF i 1 d dorosłej osobie. Słupki błędów = SD. (G) Całkowite RNA wyizolowane z IFM wypreparowane od 50 dorosłych muszek 1 d przy użyciu różnych metod ekstrakcji. Słupki błędów = SD. (H) Reprezentatywne ślady do oznaczania integralności RNA po różnych metodach ekstrakcji. Pasma rybosomalne przebiegają nieco poniżej 2000 nukleotydów (nt), a pasmo markerowe 25 nt. Dodatkowe ślady dostępne na rysunku uzupełniającym 1. (I) Reprezentatywne ślady świeżo wyizolowanej próbki RNA (u góry), próbki rozmrożonej 25 razy na suchym lodzie (druga powierzchnia), próbki pozostawionej na 4 godziny na stole (trzecia powierzchnia) oraz próbki poddanej działaniu RNazy A (dolna powierzchnia). Należy zwrócić uwagę na całkowitą degradację RNA po dodaniu RNazy A. (J) żelu RT-PCR z zestawów oznaczonych dla bru1 i rp49. Względna intensywność pasma bru1 znormalizowana w stosunku do rp49 jest wykreślona poniżej. Słupki błędów = SEM (niesparowany test t, p = 0,0119). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Zastosowanie sekcji IFM do badania funkcji Bruno1 w alternatywnym łączeniu. (A) Wykres wulkaniczny danych mRNA-Seq (jednostka genowa) z IFM wypreparowanych w 72 godzinach APF. Geny, które są istotnie regulowane w różny sposób między bru1-IR a IFM typu dzikiego (padj < 0,05, abs (log2FC) >1,5) są pokazane na niebiesko, a nieistotne geny na szaro. Białka sarkomerowe są podświetlone na czerwono, a wybrane geny są znakowane. (B) Wykres wulkaniczny spektrometrii mas całego proteomu wynika z 1 d dorosłych IFM. Białka istotnie różniące się między mutantami bruM2 a typem dzikim (FDR < 0,05) są pokazane w kolorze niebieskim, a nieistotne białka w kolorze szarym. Białka sromemiczne są podświetlone na czerwono. Peptydy odpowiadające genom w (A) są oznaczone na czerwono. Zestawy peptydów odwzorowujących różne izoformy tego samego białka są oznaczone tym samym kolorem. (C) Schemat C-końca Mhc ilustrujący odrębne izoformy transkryptu i miejsce insercji pułapki genu weeP26 (patrz Metody uzupełniające dla punktu insercji). Startery RT-PCR są oznaczone czarnymi liniami nad transkryptami. Liczby odczytów na kilozasadę na milion zasad (RPKM) z mRNA-Seq są pokazane dla IFM wypreparowanych z typu dzikiego w 30 h APF (pomarańczowy) i 72 h APF (czerwony), z bru1-IR (niebieski) i salm-/- (cyjan) po 72 h APF i z całej nogi (zielony) w 72 h APF. (D) RT-PCR ze starterami przeciwko Mhc pokazującymi zmianę izoformy w IFM między 30 godzinami APF a późniejszymi punktami czasowymi. Zdarzenie splicingu eksonu 34-35 jest tylko słabo obserwowane w IFM z mutacją bruM3 lub w dorosłej nodze. (E) Konfokalne obrazy lokalizacji GFP weeP26 w dzikich sarkomerach IFM przy 48 h APF i 90 h APF w porównaniu do 90 h APF mięśnia nogi. Paski skali = 1 μm. (F) Kwantyfikacja złącza splicowego na podstawie danych mRNA-Seq dla genotypów i punktów czasowych zgodnie z oznaczeniem. Odczyty skrzyżowania są przedstawiane jako stosunek określonego zdarzenia splicingu (ekson 34 do 35 w kolorze szarym, 34 do 36 w kolorze fioletowym i 34 do 37 w kolorze zielonym) do całkowitej liczby zdarzeń dzielących donor splicingu eksonu 34. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek uzupełniający 1: (A,B,C) RNA daje próbki tego samego genotypu wypreparowane przez tego samego badacza w tym samym tygodniu. Po wypreparowaniu wszystkich próbek, RNA wyizolowano i zmierzono tego samego dnia. (A) Nanogramy (ng) całkowitego RNA uzyskanego z sekcji IFM na 1 d dorosłej muchy. Słupki błędów = SEM. (B) Całkowite RNA uzyskane z wypreparowanego IFM na muchę w 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF i 1 d dorosłe. (C) Całkowity RNA wyizolowany z IFM wypreparowany od 50 dorosłych much 1 d przy użyciu różnych metod ekstrakcji. (D) Całkowite stężenia RNA na muchę z wypreparowanych nóg, mięśni skokowych (TDT) i IFM. Więcej RNA uzyskuje się z większych IFM. Słupki błędów = SD. (E) Całkowite stężenia RNA na muchę IFM wypreparowanego z kontroli w porównaniu z RNAi lub próbkami zmutowanymi po 30 godzinach APF, 72 godzinach APF i 1 d osoby dorosłej. W przypadku mutantów w1118 był używany jako kontrola typu dzikiego. Dane dotyczące mutantów są kompilowane z bru1-IR, salm-/- i innego mutanta białka wiążącego RNA. Należy zauważyć, że w przypadku tych manipulacji wydajność RNA jest zmniejszona u 1 dorosłego człowieka z powodu atrofii i utraty mięśni, więc więcej much musi zostać wypreparowanych, aby uzyskać wystarczające ilości do podejść omicznych. Słupki błędów = SD. (F) Dodatkowe ślady pokazujące integralność RNA dla metod izolacji RNA pokazane na Rysunek 4G i na Rysunku uzupełniającym 1C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Metody uzupełniające: Szczegółowy opis metod i odczynników użytych w całym tekście, a w szczególności do generowania danych pokazanych w Rysunek 1A-D, Rysunek 4F-K, Rysunek 5, Tabela uzupełniająca 1 i Tabela uzupełniająca 2. Dane te motywują protokół sekcji i pokazują jego użyteczność do izolacji RNA, mRNA-Seq, RT-PCR i proteomiki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Powiązane z rysunkiem 5 i powiązanymi akapitami w tekście głównym
Nazwa kartyPodsumowanie danych
Białka sarkomeroweLista genów sarkomerowych ze Spletter et al. Elife 2018; Tutaj podajemy aktualną nazwę FBgn i genu.
Gen SP units_DESeq2_72hKorzystając z danych ze Spletter et al. EMBO Rep 2015, przyjrzeliśmy się w szczególności genom sarkomeru w danych mRNA-Seq przy 72 h APF. Wynika to z analizy DESeq2 wykrywającej różnicową ekspresję na poziomie jednostki genu między kontrolą (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma skrzyżowaną z w1118) a Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. Wiersze zaznaczone na żółto są wyraźnie regulowane geny w górę lub w dół (powyżej/poniżej progu log2FC=abs(1.5)). Dane te są nakładką czerwonej kropki na rysunku 5A. Dla każdego genu sarkomeru podajemy informacje o identyfikatorze, log2FC z DESeq2, wartość P i skorygowaną wartość P, a także znormalizowane liczby ekspresji DESeq2.
SP exon_DEXSeq_72hKorzystając z danych ze Spletter i wsp. EMBO Rep 2015, przyjrzeliśmy się w szczególności wykorzystaniu eksonów genu sarkomeru w danych mRNA-Seq po 72 godzinach APF. Pochodzi to z analizy DEXSeq wykrywającej różnicowe użycie eksonów między kontrolą (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma skrzyżowaną z w1118) a Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. Wiersze zaznaczone na żółto są wyraźnie regulowanymi eksonami regulowanymi w górę lub w dół (powyżej/poniżej progu log2FC=abs(1.5)). Udostępniamy informacje o identyfikatorze eksonu i genu, log2FC z DEXSeq, wartość P i skorygowaną wartość P, a także listę powiązanych transkryptów.
Należy zauważyć, że wiele genów wykazuje regulację jednego lub więcej eksonów w analizie DEXSeq, często z wysokimi wartościami log2FC i niskimi wartościami P/dostosuj P, podczas gdy ograniczona lista genów wykazuje zmiany po 72 godzinach APF. Potwierdza to silny wpływ utraty Bruno na regulację alternatywnego splicingu.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela 72 h danych mRNA-Seq APF dla białek sarkomerowych identyfikujących geny o zróżnicowanej ekspresji (poprzez DESeq2) i eksony (przez DEXSeq) w IFM bru1-IR vs. wildtype.

Powiązane z rysunkiem 5B i powiązanymi akapitami w tekście głównym
Nazwa kartyPodsumowanie danych
Dane wyjściowe PerseusaJest to arkusz kalkulacyjny z przetworzonymi danymi przedstawiający dane spektrometrii mas użyte do wygenerowania rysunku 5B. Próbki IFM pochodzą od 1 d dorosłej próby kontrolnej (w1118) i zmutowanych (bruno1-M2). Ważnymi kolumnami są przekształcone wartości intensywności dla każdej z 4 kontrprób dla każdej próbki, statystyka i istotność testu t, identyfikatory peptydów i odpowiadające im nazwy genów oraz identyfikatory Flybase. Znaczenie zostało obliczone przy użyciu standardowych ustawień w Perseus (FDR<.05). Wykryto 1859 białek/peptydów, z których 524 (28%) znacznie różnią się między próbkami.
Regulowany w dółSą to WSZYSTKIE 252 białka / peptydy z wyjścia Perseusa, które są regulowane w dół w zmutowanym IFM bruno1-M2. Ponieważ identyfikatory i nazwy genów Flybase są nieaktualne, dodatkowo podajemy aktualny identyfikator genu Flybase i nazwę genu.
Regulowany w góręSą to WSZYSTKIE 272 białka / peptydy z wyjścia Perseusa, które są regulowane w górę w zmutowanym IFM bruno1-M2. Ponieważ identyfikatory i nazwy genów Flybase są nieaktualne, dodatkowo podajemy aktualny identyfikator genu Flybase i nazwę genu.
Należy pamiętać, że białka sarkomerowe zaznaczone na czerwono na rysunku 5B są obecne na powyższych listach. Lista genów uznawanych za część sarkomeru jest dostępna w jednej z zakładek w Tabeli Uzupełniającej 1.

Tabela uzupełniająca 2: Tabela danych spektrometrii mas całego proteomu od dorosłego osobnika 1d identyfikującego białka i izoformy o zróżnicowanej ekspresji w mutantach bruM2 i IFM typu dzikiego.

Dyskusja

W tym protokole przedstawiamy podstawową technikę preparowania IFM Drosophila z poczwarek we wczesnym i późnym stadium w celu dalszej izolacji białka, DNA, RNA lub innych makrocząsteczek. Protokół można łatwo dostosować do preparowania IFM od dorosłych much. Demonstrujemy użyteczność naszego protokołu preparacji w zastosowaniach mRNA-Seq, proteomiki i RT-PCR. Dzięki ciągłemu doskonaleniu technologii omicznych, które umożliwiają analizę próbek z mniejszą ilością materiału wyjściowego i niższymi stężeniami wejściowymi, sekcje te prawdopodobnie staną się cenne dla wielu dodatkowych zastosowań. Ponieważ IFM są uznanym modelem ludzkich miopatii 4,24 i rozwoju specyficznego dla typu mięśni 9,12, przewidujemy na przykład metabolomikę wzbogaconą o IFM, badania konformacji chromatyny za pośrednictwem 3C lub 4C, ocenę sieci splicingowej za pomocą interakcji CLiP lub fosfoproteomikę miofibrylogenezy.

Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że w wyniku tych rozbiorów powstaje próbka wzbogacona o IFM zamiast czystej próbki IFM. Jest to nieuniknione ze względu na unerwienie neuronów ruchowych, przyczepy ścięgien i inwazję tchawicy włókien mięśniowych. Analiza bioinformatyczna może być wykorzystana do identyfikacji genów lub białek wzbogaconych w IFM, ale potrzebne są dalsze eksperymenty, aby wykazać, że są one w rzeczywistości specyficzne dla IFM. Czystość próbki można oznaczyć za pomocą opublikowanych markerów specyficznych dla tkanki, takich jak Stripe45 (ścięgno), Act79B 4,44 (mięsień rurkowy), Act88F15 (IFM) lub syb46 (specyficzny dla neuronów). Możliwe jest użycie takich markerów do normalizacji zbiorów danych do treści specyficznej dla IFM, ale ostrzega się, że czasowe zmiany w ekspresji genów używanych do normalizacji, na przykład genów specyficznych dla IFM lub tubuliny, mogą skłaniać do takiego podejścia.

W ostatnich latach opracowano genetycznie kodowane metody znakowania specyficznego dla tkanki, na przykład znakowanie EC47,48 lub znakowanie PABP49,50 w celu izolacji RNA, które mogą pomóc w uzyskaniu próbki RNA naprawdę specyficznej tkankowo. Znakowanie EC wymaga jednak stałego karmienia much47 i dlatego nie ma zastosowania w stadiach poczwarki. Czułość i kompletność transkryptomów znakowanych PABP może mieć ograniczenia51. Podejścia FACS do izolowania pojedynczych włókien mięśniowych są skomplikowane ze względu na duży rozmiar i syncytialny charakter IFM. Podejścia w stylu INTACT52,53 mogą być stosowane do izolowania określonych przedziałów subkomórkowych od IFM, co może okazać się przydatne do izolowania czystych populacji jąder lub mitochondriów IFM. Ręczne sekcje są nadal aktualnym standardem w celu uzyskania nienaruszonej tkanki IFM w większości dalszych zastosowań.

Jakość próbki zależy od kilku krytycznych etapów procesu preparacji. Sekcje są wymagające technicznie, a szybkość preparowania i czystość próbki rosną wraz z doświadczeniem. Preparacja przez krótki czas (20–30 minut) w schłodzonym buforze bez detergentu i natychmiastowe zamrożenie pomaga zachować integralność próbki, jak zaobserwowano wcześniej w przypadku izolacji ścięgien myszy54. IFM można z powodzeniem zamrażać na sucho po usunięciu całego buforu z osadu, ale szczególnie w przypadku izolacji RNA, zamrażanie próbek w buforze izolacyjnym ma tendencję do uzyskiwania lepszych wyników. IFM z maksymalnie 20 oddzielnych sekcji są łączone przed izolacją RNA lub białka, co pozwala na zwiększenie skali i zebranie wystarczającej ilości materiału, nawet z wczesnych punktów czasowych lub mutantów16,32, do dalszej analizy.

W przypadku zastosowań RNA najbardziej krytycznym krokiem może być izolacja samego RNA. Izolacja tiocyjanianianu guanidyny, fenolu i chloroformu (metoda 1 powyżej) przewyższa większość testowanych zestawów komercyjnych i, jak wcześniej wspomniano, jest znacznie tańsza55. Zmienność obserwowana w wynikach izolacji RNA w przypadku zestawów komercyjnych jest zgodna z wcześniejszymi obserwacjami56,57. Następnie dodajemy glikogen podczas wytrącania izopropanolu, aby pomóc odzyskać całe RNA. Oprócz wydajności RNA ważne jest, aby zweryfikować integralność RNA, aby upewnić się, że próbka nie została rozdrobniona lub zdegradowana podczas procesów rozwarstwiania i izolacji. Istotne jest również, aby pracować bez RNaz. Wreszcie, wybór RT-kit może mieć wpływ na czułość procesu odwrotnej transkrypcji. Chociaż często nie omawia się ich szczegółowo, wszystkie te punkty wpływają na jakość próbki IFM i danych uzyskanych z dalszych aplikacji.

Kilka ważnych modyfikacji odróżnia protokół od istniejących protokołów sekcji IFM. Chociaż istnieje szczegółowy protokół preparacji immunofluorescencji IFM19, protokół ten przedstawia inne podejście do sekcji poczwarek, które umożliwia szybszą izolację tkanki IFM. Pozwala to na pobranie dużych ilości tkanki IFM (relatywnie rzecz biorąc) przy ograniczonym czasie preparacji, aby zapobiec zmianom proteomu lub transkryptomu. Inne protokoły opisują preparację dorosłego IFM w celu wizualizacji barwienia GFP w poszczególnych miofibrylach39 lub do barwienia mięśni ciała larwalnego58, ale nie dotyczą one preparacji w stadium poczwarki lub izolacji RNA lub białka. Podejście to różni się również od istniejącego protokołu mikrodysekcji poczwarek IFM z kriosekcji38, który może generować czystszą próbkę IFM, ale jest bardziej pracochłonny i wytwarza mniej materiału. W porównaniu z innymi protokołami szybkiej selekcji IFMu dorosłych 38,39, IFM są izolowane w buforze PBS bez detergentu, aby ograniczyć indukcję stresu i inne poważne zmiany ekspresji.

Kluczowym postępem w tym protokole jest włączenie żywego, fluorescencyjnego reportera, co pozwala na izolację IFM we wczesnych stadiach poczwarki. Standardowo używamy Mef2-GAL4 59 do sterowania UAS-CD8::GFP lub UAS-GFP::Gma60. Pozwala to na różnicowe znakowanie IFM (mięśnie lotu są silniej znakowane i mają inny kształt niż inne mięśnie poczwarki), a także wykonywanie manipulacji opartych na GAL4-UAS, na przykład eksperymentów ratunkowych lub RNAi. Możliwe jest również połączenie Mef2-GAL4 z tub-GAL80ts, aby uniknąć wczesnej śmiertelności związanej z RNAi lub z UAS-Dcr2 w celu zwiększenia wydajności RNAi40.

Dostępne są dodatkowe sterowniki GAL4 lub linie GFP, które różnią się specyficznością typu mięśni, wzorcem ekspresji czasowej i siłą sterownika19,61, które mogą być używane zamiast Mef2-GAL4. Na przykład Act88F-GAL4 jest po raz pierwszy wyrażany około 24 godzin APF, więc nie można go używać dla wcześniejszych punktów czasowych; jednak silnie oznacza IFM i może być przydatny, aby uniknąć wczesnej śmiertelności związanej z RNAi. Him-GFP lub Act88F-GFP oznaczają IFM, ponownie z ograniczeniami czasowymi, ale unikają zależności GAL4 od ekspresji markera i mogą być przydatne w połączeniu ze zmutowanym tłem będącym przedmiotem zainteresowania. Listy innych możliwych linii znaczników są dostępne19. Należy również zauważyć, że stosowanie transgenów i systemu GAL4/UAS może powodować artefakty ekspresji genów, dlatego ważne jest stosowanie odpowiednich kontroli, na przykład linii sterującej skrzyżowanej ze szczepem tła typu dzikiego, tak aby takie artefakty były przypuszczalnie takie same we wszystkich próbkach.

Wraz z dołączonym filmem, ten szczegółowy protokół ma na celu ułatwienie dostępu do sekcji IFM poczwarki i promowanie stosowania podejść omicznych do badania rozwoju mięśni. Połączenie mocy genetyki i biologii komórki Drosophila z biochemią i testami omicznymi dostępnymi dzięki wypreparowanemu IFM może przyczynić się do pogłębienia mechanistycznego zrozumienia miogenezy i funkcji mięśni. Przyszłe badania łączące obserwacje transkryptomu i regulacji proteomu na poziomie systemowym z wynikami metabolicznymi i funkcjonalnymi zapewnią głębsze zrozumienie specyficznego rozwoju typu mięśniowego i patogenezy zaburzeń mięśniowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Andreasowi Ladurnerowi i Frankowi Schnorrerowi za hojne wsparcie. Dziękujemy Sandrze Esser za doskonałą pomoc techniczną i Akanksha Roy za wygenerowanie danych ze spektrometrii mas. Dziękujemy centrom hodowli w Bloomington i Wiedniu za dostarczanie much. Dziękujemy Core Facility Bioimaging za pomoc w obrazowaniu konfokalnym oraz Zentrallabor für Proteinanalytik za analizę próbek spektrometrii mas, oba w Centrum Biomedycznym LMU (Martinsried, DE). Nasze prace były wspierane przez Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) przy Uniwersytecie Ludwiga Maximiliana w Monachium (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS) oraz International Max Planck Research School (EN).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5x bufor High Fidelity (HF)Thermo FisherF518L
Naczynia hodowlane 60 mmSigma-AldrichZ643084-600EASzalki Greinera, 60 mm x 15 mM, wentylowane
miska sekcyjna (szkło)Augusta Laborbedarf42021010Lymphbecken, czarne szkło, 4 cm x 4 cm
Czarne silikonowe naczynia preparacyjne: węgiel aktywny w proszkuSigma-AldrichC9157Dostępne również w większości aptek
Czarne silikonowe naczynia preparacyjne: Sylgard 184Sigma-Aldrich761036Naczynia są wytwarzane przez zmieszanie Sylgarda (~50g) z węglem aktywnym w proszku (200 mg) i utwardzenie go na szalkach Petriego (~4 szalki 60 mm).
Niebieski tłuczekSigma-AldrichZ359947-100EAKażdy tłuczek do granulek, który można sterylizować, może być również używany ze szlifierką napędzaną silnikiem
Aparat w telefonie komórkowym, Samsung Galaxy S9SamsungSM-G960F/DSużywany do zdjęć nie zrobionych pod mikroskopem
ChloroformPanReac AppliChemA3691,0500
Mikroskop konfokalny, Leica SP8X pionowy konfokalnyLeicawww.leica-microsystems.com
Mikroskop konfokalny, Zeiss LSM 780 odwrócony konfokalnyZeisswww.zeiss.com
Podwójna taśma klejącaScotch/3M3M ID 70005108587Taśma dwustronna, dostępna w większości biurowych Uchwyty
Dumont #5 KleszczeFine Science Tools11252-20Inox z prostą końcówką 11 cm, klasa biologiczna z końcówką 0,05 mm x 0,02 mm
EtOH (100%, RNaza darmowy)Sigma-Aldrich32205-M
fluorescencyjny mikroskop preparacyjny, Leica DFC310 FX KameraLeicawww.leica-microsystems.com
Oprogramowanie do fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, Leica Application Suite (LAS) wersja 4.0.0Leicawww.leica-microsystems.com
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny, Leica M165 FCLeicawww.leica-microsystems.com
Mucha: Bru1[M2]Mucha; Ten papier
Mucha: Bru1 [M3]Mucha kolba; Ten artykuł
Mucha: Mef2-GAL4Bloomington Stock CenterBDSC:27390Mucha
Mucha: salm[1]Bloomington Stock Center3274Mucha
Mucha: salm[FRT]Mucha; patrz Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IRVienna Drosophila Research CenterGD41568Fly stock, RNAi spinka do włosów
Fly: UAS-GFP::GmaBloomington Stock CenterBDSC:31776Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFPBloomington Stock CenterBDSC:5130Fly stock
Fly: w[1118]Bloomington Stock Center3605Fly stock
Fly: weeP26Fly stock; patrz Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-BoosterChromoTekgba488-100
GlycogenInvitrogen10814-010
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu, Photoshop CS6Adobewww.adobe.com
IsopropanolSigma-AldrichI9516-25ML2-propanol
Metoda 1 (izolacja RNA): TRIzolLife Technologies15596018izotiocyjanian guanidyny i jednofazowy roztwór fenolu
Metoda 2 (izolacja RNA): Metoda 1 + TURBO Zestaw bez DNAInvitrogenAM1907a następnie leczenie zestawem do usuwania DNA
Metoda 3 (izolacja RNA): Zestaw Direct-zol RNA Miniprep Plus ZymoResearchR2070SIzolacja RNA w TRIzolu, ale nad komercyjnymi kolumnami zamiast przy użyciu separacji faz. Zalecane leczenie DNazą wykonane z użyciem Monarch Dnazy I w buforze reakcyjnym Monarch DNazy I.
Metoda 4 (izolacja RNA): RNeasy Plus Mini KitQiagen74134Zastosowaliśmy dostarczoną obróbkę DNazą. Granulki IFM homogenizowano w buforze RTL, zgodnie z sugestiami dla tkanek zwierzęcych.
Metoda 5 (izolacja RNA): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep SystemPromegaZ6110Zastosowaliśmy protokół dla " Oczyszczanie RNA z tkanek włóknistych".
Metoda 6 (izolacja RNA): Zestaw Monarch Total RNA Miniprep NewEngland BiolabsT2010GZastosowaliśmy protokół dla tkanek / leukocytów i poddaliśmy lizie w 300 μ L odczynnika do ochrony RNA.
Probówki do mikrowirówekThermo FisherAM12400Probówki do mikrofuge bez RNaz, 1,5 ml
Szkiełka mikroskopoweThermo Fisher12342108Szkiełka standardowe, nienaładowane, 1 mm
Ostrza mikrotomuPFM Medical207500003C35 pióro 80 mm
Monarch DNase IEngland BiolabsT2004-21
Monarch DNase I Bufor reakcyjnyNowość Anglia BiolabsT2005-21
Normalna surowica koziaThermo Fisher16210072
OneTaq PolimerazaNew England BiolabsM0480X
PędzelMarabu1910000000Marabu Fino Round No. 0 lub podobny pędzel z dowolnego materiału artystycznego
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
bufor PBS (1x)Sigma-AldrichP4417Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami do roztworów 1 l, pH 7,4
Końcówki do pipet PFA PureTipElemental ScientificES-7000-0101Opcjonalny zamiennik standardowych końcówek do pipet w celu zmniejszenia strat próbki; 100 mL, otwór 0,8 mm
Phusion High Fidelity PolymeraseThermo FisherF-530XL
Końcówki do pipetSigma-AldrichP5161Uniwersalna pipeta 200 ml Wskazówki
Zestaw Preomics iST 8x ZestawPreomicsP.O.00001do spektrometrii
Q Exactive spektrometrThermo Fisher725500została wykonana w Zakładzie Analizy Białek Centrum Biomedycznego LMU
Zestaw do oznaczania RNA kubitówLife TechnologiesQ32855
Invitrogen rodamino-falloidyna, sondy molekularne
Stężenie RNA Podejście 1 & Ślady integralności RNA, BioanalizatorAgilent TechnologiesG2939BA
Stężenie RNA Podejście 2, NanodropThermo FisherND-2000
Stężenie RNA Podejście 3, Fluorometr Qubit 4InvitrogenQ33238
RNA Pico ChipsAgilent Technologies5067-1513
RNaza APromegaA7937
Woda wolna od RNaz, pirowęglan dietylu (DEPC)Sigma-AldrichD5758DEPC uzdatnia wodę przez noc, a następnie autoklawu, aby usunąć całą RNazę.
Zestaw RT #1: Zestaw odwrotnej transkrypcji Super Script IIIZestaw do odwrotnej transkrypcjiInvitrogen18080-044
Zestaw RT #2: Zestawdo odwrotnej transkrypcjiNew England BiolabsE3010S
Zestaw RT #3: Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiNova Zestawdo odwrotnej transkrypcjiQiagen205410
Bufor do montażu na suwaku, VectashieldVector LaboratoriesH-1200zawierające DAPI
Oprogramowanie statystyczne: GraphPad PrismGraphPad Prismwww.graphpad.com
Oprogramowanie statystyczne: Microscoft ExcelMicrosoftZakupione w ramach pakietu: Office Home & Student 2019
Wirówka stołowaEppendorf5405000760Eppendorf Wirówka 5425 lub równoważna
Chusteczki higieniczne/ KimwipesSigma-AldrichZ188956Standardowe chusteczki do tkanek
Pipeta transferowaSigma-AldrichZ350796Pipeta plastikowa
Triton-X100Sigma-AldrichT9284-500ML
Nożyczki sprężynoweVannasFine Science Tools15000-00Krawędź tnąca 3 mm, średnica końcówki 0,05 mm, długość 8 cm
Papier WhatmanSigma-Aldrich1004-070Koła z bibuły filtracyjnej, klasa 4, 70 mm
Izolacja TRIzolu , New do przygotowania peptydów mas mas Spektrometria mas 10063052LunaScript

Bibliografia

  1. Rexiati, M., Sun, M., Guo, W. Muscle-Specific Mis-Splicing and Heart Disease Exemplified by RBM20. Genes. 9 (1), 18(2018).
  2. Guo, W., et al. RBM20, a gene for hereditary cardiomyopathy, regulates titin splicing. Nature Medicine. 18 (5), 766-773 (2012).
  3. Guo, W., et al. Splicing Factor RBM20 Regulates Transcriptional Network of Titin Associated and Calcium Handling Genes in The Heart. International Journal of Biological Sciences. 14 (4), 369-380 (2018).
  4. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Ravichandran, K., Wittner, A., Spletter, M. L. Conserved functions of RNA-binding proteins in muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 110, 29-49 (2019).
  5. Wang, E. T., et al. Dysregulation of mRNA Localization and Translation in Genetic Disease. The Journal of Neuroscience. 36 (45), 11418-11426 (2016).
  6. Wang, E. T., et al. Antagonistic regulation of mRNA expression and splicing by CELF and MBNL proteins. Genome Research. 25 (6), 858-871 (2015).
  7. Kalsotra, A., et al. A postnatal switch of CELF and MBNL proteins reprograms alternative splicing in the developing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20333-20338 (2008).
  8. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. The EMBO Journal. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  9. Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mechanisms of Development. 144, Pt A 92-101 (2017).
  10. Iwamoto, H. Structure, function and evolution of insect flight muscle. Biophysics. 7, 21-28 (2011).
  11. Schnorrer, F., Dickson, B. J. Muscle building; mechanisms of myotube guidance and attachment site selection. Developmental Cell. 7 (1), 9-20 (2004).
  12. Spletter, M. L., Schnorrer, F. Transcriptional regulation and alternative splicing cooperate in muscle fiber-type specification in flies and mammals. Experimental Cell Research. 321 (1), 90-98 (2014).
  13. Benoist, P., Mas, J. A., Marco, R., Cervera, M. Differential muscle-type expression of the Drosophila troponin T gene. A 3-base pair microexon is involved in visceral and adult hypodermic muscle specification. Journal of Biological Chemistry. 273 (13), 7538-7546 (1998).
  14. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  15. Bryantsev, A. L., et al. Extradenticle and Homothorax Control Adult Muscle Fiber Identity in Drosophila. Developmental Cell. 23 (3), 664-673 (2012).
  16. Spletter, M. L., et al. The RNA-binding protein Arrest (Bruno) regulates alternative splicing to enable myofibril maturation in Drosophila flight muscle. EMBO Reports. 16 (2), 178-191 (2015).
  17. Oas, S. T., Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Arrest is a regulator of fiber-specific alternative splicing in the indirect flight muscles of Drosophila. The Journal of Cell Biology. 206 (7), 895-908 (2014).
  18. Kim, J. H., Jin, P., Duan, R., Chen, E. H. ScienceDirect Mechanisms of myoblast fusion during muscle development. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 162-170 (2015).
  19. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 2-14 (2014).
  20. Rai, M., Nongthomba, U., Grounds, M. D. Skeletal Muscle Degeneration and Regeneration in Mice and Flies. Mechanisms of Regeneration. 108, Elsevier Inc. 247-281 (2014).
  21. Swank, D. M., Wells, L., Kronert, W. A., Morrill, G. E., Bernstein, S. I. Determining structure/function relationships for sarcomeric myosin heavy chain by genetic and transgenic manipulation of Drosophila. Microscopy Research and Technique. 50 (6), 430-442 (2000).
  22. de Joussineau, C., Bataillé, L., Jagla, T., Jagla, K. Diversification of muscle types in Drosophila: upstream and downstream of identity genes. Current Topics in Developmental Biology. 98, 277-301 (2012).
  23. Maqbool, T., Jagla, K. Genetic control of muscle development: learning from Drosophila. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 28 (7-8), 397-407 (2008).
  24. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: Emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Seminars in Cell & Developmental Biology. 64, 171-180 (2017).
  25. Haigh, S. E., et al. Drosophila indirect flight muscle specific Act88F actin mutants as a model system for studying congenital myopathies of the human ACTA1 skeletal muscle actin gene. Neuromuscular Disorders. 20 (6), 363-374 (2010).
  26. Batonnet-Pichon, S., et al. Myofibrillar Myopathies: New Perspectives from Animal Models to Potential Therapeutic Approaches. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (1), 1-15 (2017).
  27. Kreipke, R. E., Kwon, Y. V., Shcherbata, H. R., Ruohola-Baker, H. Drosophila melanogaster as a Model of Muscle Degeneration Disorders. Current Topics in Developmental Biology. 121, 83-109 (2017).
  28. Souidi, A., Zmojdzian, M., Jagla, K. Dissecting Pathogenetic Mechanisms and Therapeutic Strategies in Drosophila Models of Myotonic Dystrophy Type 1. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4104(2018).
  29. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other Model Organisms for Sarcomeric Muscle Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 642, 192-206 (2008).
  30. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1184, 1-20 (2010).
  31. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  32. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, 1361(2018).
  33. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Current Biology. 24 (7), 705-716 (2014).
  34. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Seminars in Cell & Developmental Biology. 72, 56-66 (2017).
  35. Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).
  36. Zappia, M. P., Rogers, A., Islam, A. B. M. M. K., Frolov, M. V. Rbf Activates the Myogenic Transcriptional Program to Promote Skeletal Muscle Differentiation. Cell Reports. 26 (3), 702-719 (2019).
  37. Zappia, M. P., Frolov, M. V. E2F function in muscle growth is necessary and sufficient for viability in Drosophila. Nature Communications. 7 (1), 10509(2016).
  38. Bryantsev, A. L., et al. Myogenesis in Drosophila melanogaster: Dissection of Distinct Muscle Types for Molecular Analysis. Methods in Molecular Biology. 1889 (5), 267-281 (2019).
  39. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM Dissection for Visualizing Fluorescently Tagged Sarcomeric Proteins. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  40. Kaya-Çopur, A., Schnorrer, F. RNA Interference Screening for Genes Regulating Drosophila Muscle Morphogenesis. Myogenesis. 1889, Chapter 20 331-348 (2019).
  41. Chechenova, M. B., et al. Functional redundancy and non-redundancy between two Troponin C isoforms in Drosophila adult muscles. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 760-770 (2017).
  42. Alberts, B. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York, NY. (2017).
  43. Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green fluorescent protein tagging Drosophila proteins at their native genomic loci with small P elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
  44. Orfanos, Z., Sparrow, J. C. Myosin isoform switching during assembly of the Drosophila flight muscle thick filament lattice. Journal of Cell Science. 126 (1), 139-148 (2013).
  45. Volohonsky, G., Edenfeld, G., Klambt, C., Volk, T. Muscle-dependent maturation of tendon cells is induced by post-transcriptional regulation of stripeA. Development. 134 (2), 347-356 (2007).
  46. Estes, P. S., Ho, G. L., Narayanan, R., Ramaswami, M. Synaptic localization and restricted diffusion of a Drosophila neuronal synaptobrevin--green fluorescent protein chimera in vivo. Journal of Neurogenetics. 13 (4), 233-255 (2000).
  47. Hida, N., et al. EC-tagging allows cell type-specific RNA analysis. Nucleic Acids Research. 45 (15), 138(2017).
  48. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PLoS ONE. 7 (7), 40276(2012).
  49. Yang, Z. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucleic Acids Research. 33 (17), 148(2005).
  50. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  51. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 1775-1821 (2015).
  52. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9691-9704 (2012).
  53. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  54. Grinstein, M., Dingwall, H. L., Shah, R. R., Capellini, T. D., Galloway, J. L. A robust method for RNA extraction and purification from a single adult mouse tendon. PeerJ. 6 (8), 4664(2018).
  55. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , (2012).
  56. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), 16(2018).
  57. Ford, K. L., et al. Optimisation of laboratory methods for whole transcriptomic RNA analyses in human left ventricular biopsies and blood samples of clinical relevance. PLoS ONE. 14 (3), 02136855(2019).
  58. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harbor Protocols. (8), 5469(2010).
  59. Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Developmental Biology. 176 (1), 143-148 (1996).
  60. Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gómez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34 (1-2), 146-151 (2002).
  61. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. Journal of Visualized Experiments. (132), e57312(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mi sie lataj cy Drosophilasekcja mi nia lataj cegomi nie znakowane GFPwyznaczanie stadium poczwarkipobieranie pr bek specyficznych dla tkankiizolacja RNAspektrometria maszastosowania RT PCRci ki a cuch miozynyfunkcja Bruno1
Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.