Artykuł metodologiczny

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

DOI:

10.3791/60314

⸱

8 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzutowy rak jasnokomórkowy nerki (ccRCC) jest najczęstszym podtypem raka nerki. Zlokalizowany ccRCC ma korzystny wynik chirurgiczny. Jednak u jednej trzeciej pacjentów z ccRCC rozwiną się przerzuty do płuc, co wiąże się z bardzo złym wynikiem dla pacjentów. Niestety, nie jest dostępna żadna terapia dla tego śmiertelnego etapu, ponieważ molekularny mechanizm przerzutów pozostaje nieznany. Od 25 lat wiadomo, że utrata funkcji genu supresorowego guza von Hippla-Lindaua (VHL) jest patognomoniczna ccRCC. Nie stworzono jednak klinicznie istotnego transgenicznego mysiego modelu ccRCC. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie i porównanie dwóch nowo opracowanych modeli zwierzęcych dla przerzutowego ccRCC. Pierwszym z nich jest implantacja nerki w modelu mysim. W naszym laboratorium system edycji genów CRISPR został wykorzystany do wyeliminowania genu VHL w kilku liniach komórkowych RCC. Ortotopowa implantacja heterogenicznych populacji ccRCC do torebki nerkowej stworzyła nowe modele ccRCC, które rozwijają silne przerzuty do płuc u myszy immunokompetentnych. Drugim modelem jest system błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka (CAM). W porównaniu z modelem myszy, ten model jest bardziej czasochłonny, pracochłonny i opłacalny. Model ten wspierał również solidne tworzenie guza i wewnątrznaczynienie. Ze względu na krótki, 10-dniowy okres wzrostu guza w CAM, nie zaobserwowano jawnych przerzutów metodą immunohistochemiczną (IHC) w pobranych tkankach zarodka. Jednak, gdy wzrost guza został przedłużony o dwa tygodnie u wyklutego kurczaka, mikroprzerzutowe zmiany ccRCC zaobserwowano przez IHC w płucach. Te dwa nowatorskie modele przedkliniczne będą przydatne do dalszego badania mechanizmu molekularnego stojącego za przerzutami, a także do ustanowienia nowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) w celu opracowania nowych metod leczenia przerzutowego ccRCC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak nerkowokomórkowy (RCC) jestsiódmym najczęściej występującym nowotworem w Stanach Zjednoczonych. Szacuje się, że rocznie 74 000 Amerykanów jest nowo zdiagnozowanych, co odpowiada za ponad 14 000 zgonów (podtyp histologiczny jasnokomórkowy lub ccRCC jest najczęstszym podtypem, stanowiącym około 80% przypadków RCC). Pacjenci z miejscowym nowotworem złośliwym są leczeni nefrektomią i mają korzystny wskaźnik 5-letniego przeżycia wynoszący 73%1. Jednak u 25%-30% pacjentów rozwijają się odległe przerzuty do ważnych narządów, takich jak płuca, co skutkuje słabym średnim przeżyciem wynoszącym 13 miesięcy i 5-letnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym zaledwie 11%1,2,3. Potrzebne jest dalsze zrozumienie mechanizmu przerzutów, aby poprawić śmiertelne wyniki w przypadku przerzutowego ccRCC.

Utrata genu supresorowego VHL jest charakterystyczną zmianą genetyczną obserwowaną w większości przypadków ccRCC u ludzi4,5,6,7. Jednak dokładny onkogenny mechanizm utraty VHL w ccRCC nie jest znany. Ponadto stan wyrażenia VHL nie jest predyktorem wyniku w ccRCC8. Warto zauważyć, że pomimo licznych prób nokautu VHL ukierunkowanego na nabłonek nerkowy, naukowcom nie udało się wygenerować nieprawidłowości nerek poza przednowotworowymi zmianami torbielowatymi obserwowanymi u myszy9, nawet w połączeniu z delecją innych supresorów nowotworów, takich jak PTEN i p5310. Wyniki te potwierdzają tezę, że sama utrata VHL jest niewystarczająca do nowotworzenia lub późniejszych spontanicznych przerzutów.

Niedawno, nasze laboratorium stworzyło nową linię komórkową VHL knockout (VHL-KO), wykorzystując delecję genu VHL za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w mysiej linii komórkowej VHL+ ccRCC (RENCA, lub VHL-WT)11,12. Wykazaliśmy, że VHL-KO jest nie tylko mezenchymalnym, ale także promuje przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) komórek VHL-WT12. Wiadomo, że EMT odgrywa ważną rolę w procesie przerzutowym13. Nasze prace wykazały ponadto, że odległe przerzuty do płuc występują tylko przy jednoczesnej implantacji komórek VHL-KO i VHL-WT w nerce, co wspiera kooperacyjny mechanizm przerzutów. Co ważne, nasz ortotopowo wszczepiony model VHL-KO i VHL-WT prowadzi do silnych przerzutów do płuc, podsumowując kliniczne przypadki ccRCC. Ten spontaniczny model ccRCC z przerzutami kompensuje brak transgenicznego modelu myszy z przerzutami, zwłaszcza w przypadku opracowywania nowych leków przeciwprzerzutowych. Protokół ten demonstruje implantację torebki nerkowej heterogenicznych populacji komórek genetycznie modyfikowanych komórek RENCA.

Modele CAM kurczaków mają długą historię w badaniach nad angiogenezą i biologią nowotworów ze względu na ich liczne zalety, jak podsumowano w Tabeli 114,15,16,17,18. Krótko mówiąc, okno czasowe dla wzrostu guza CAM jest krótkie, co pozwala na maksymalnie 11 dni, aż CAM zostanie zniszczony po wykluciu się kurczaka16. Pomimo krótkiego czasu wzrostu, bogate zaopatrzenie w składniki odżywcze i stan niedoboru odporności zarodka kurczaka umożliwiają bardzo skuteczne wszczepienie guza16,19,20,21. Wreszcie, koszt każdego zapłodnionego jaja wynosi ~ 1 USD, w porównaniu do ponad 100 USD za mysz SCID. Razem, model CAM może służyć jako cenny alternatywny model zwierzęcy w tworzeniu nowych PDX przy dużej oszczędności czasu i kosztów w porównaniu z myszą. W tym protokole oceniliśmy, czy model był w stanie podsumować biologię przerzutowego ccRCC obserwowaną w mysim modelu ortotopowym.

(SCID) Myszkrzywkanuta
koszt>100 $ za sztukę~$1 za sztukęRentowność w zakresie 50-75%
Potrzeba obudowy barierowejtakNieJeszcze bardziej obniża koszty i upraszcza seryjne monitorowanie guzów
Guz widoczny bezpośrednioNietakRysunek 3A
Czas do pierwszego wszczepienia (RENCA)2 tygodnie2-4 dniOdnośnik 14, 15
Punkt końcowy wzrostu (RENCA)3-6 tygodni10 dniOdnośnik 14, 15
Obserwowane przerzuty (RENCA)takTak u pisklątRysunek 3D
Przejścia szeregowetaktakOdnośnik 16-18
Przejście do myszy (RENCA)taktakHu, J. i in. w trakcie przeglądu (2019)
Utrzymuj heterogeniczność guzataktakHu, J. i in. w trakcie przeglądu (2019)

Tabela 1: Zalety i ograniczenia modeli myszy i CAM. W tej tabeli porównano oba modele pod kątem ich zalet i ograniczeń pod względem wymaganego czasu, kosztów, pracy, a także biologii. Model CAM ma zalety w zakresie wydajności, ale ma również swoje unikalne ograniczenia ze względu na różną morfologię ptaków i ssaków. Dlatego ważne jest, aby potwierdzić, że model może zachować biologię ksenoprzeszczepów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), wyznaczony jako Komitet Badań nad Zwierzętami Kanclerza UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 i ARC 2017-102-01A). Protokół 2002-049-53 jest zoptymalizowany pod kątem implantacji komórek nowotworowych ccRCC do torebki nerkowej myszy Nude lub BALB/c. Eksperymenty z implantacją guza w zapłodnionych jajach kurzych przed wykluciem nie wymagają zatwierdzenia przez IACUC. Aby wydłużyć czas tworzenia się przerzutów do płuc, zarodki z guzem CAM mogą się wykluć i wyrosnąć na kurczęta. Protokół 2017-102-01A obejmuje te eksperymenty na zwierzętach.

1. Badania ortotopowe guzów u myszy

UWAGA: Harmonogram tego eksperymentu jest pokazany w Rysunek 1A. Procedury te zostały zaadaptowane z poprzednich publikacji11,12.

  1. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej do szczepienia
    1. Odłączyć komórki RENCA VHL-WT i VHL-KO od szalek hodowlanych za pomocą trypsyny/EDTA.
    2. Policz komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawieś we wstępnie schłodzonej mieszaninie PBS i roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej w stosunku 1:1 o stężeniu 1 x 105 komórek/μL.
      UWAGA: W przypadku implantów heterogenicznych należy stosować komórki VHL-WT:VHL-KO w stosunku 1:4, a w przypadku implantów jednorodnych samą VHL-WT.
    3. Przenieś zawieszone komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i trzymaj na lodzie aż do implantacji.
  2. Implantacja do torebki nerkowej
    1. Znieczulenie: Rozgrzej ciepłą podkładkę do 37 °C i przykryj ją kawałkiem grubej, sterylnej zasłony. Znieczulić mysz przez inhalację izofluranu przez komorę indukcyjną lub dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie 1% pentobarbitalu sodu w dawce 10 ml / kg.
    2. Ogolić włosy z miejsca operowanego. Ten krok można pominąć w przypadku nagich myszy.
    3. Dezynfekcja i obłożenie chirurgiczne: Całkowicie zdezynfekuj grzbiet myszy 3x jodem powidonu, a następnie 70% etanolem 1x i wytrzyj do sucha sterylnymi wacikami. Następnie zastosuj kolejno trzy sterylne opatrunki medyczne, pokrywając całe plecy, aby stworzyć pole operacyjne, a także unieruchomić mysz.
    4. Nacięcie i eksterioryzacja nerki: Przed operacją należy zdezynfekować palce operatora powidonem lub użyć pary sterylnych rękawiczek. Umieść mysz w pozycji leżącej i palcami zlokalizuj lewą nerkę tuż pod lewym bokiem. Użyj kleszczy i nożyczek, aby przeciąć skórę i warstwę mięśni pod określonym miejscem. Użyj sterylnych bawełnianych wacików i kleszczyków, aby częściowo usunąć lewą nerkę z jamy brzusznej.
    5. Implantacja komórek nowotworowych: Załaduj zawiesinę komórkową przygotowaną w kroku 1.1 do strzykawek insulinowych lub niestandardowych strzykawek Hamiltona (specyfikacja znajduje się w tabeli materiałów). Wstrzyknąć 20 μl zawieszonych komórek pod kapsułkę nerkową.
      UWAGA: O udanym wstrzyknięciu decyduje utworzenie się półprzezroczystego wybrzuszenia na powierzchni nerki. Przypadkowe wstrzyknięcie do miąższu nerki powoduje krwawienie i śmiertelność pooperacyjną sięgającą nawet 90% z powodu śmiertelnego krwotoku w miejscu wstrzyknięcia.
    6. Powoli wyciągnij igłę, aby umożliwić zestalenie się roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej i zapobiec krwotokowi lub wyciekowi komórek nowotworowych. Następnie za pomocą sterylnego wacika wepchnij nerkę z powrotem do jamy brzusznej.
    7. Szycie ran: Użyj nici VICTRYL powlekanej 5-0, aby zszyć warstwę mięśniową. Zdezynfekuj skórę powidonem raz i zamknij skórę za pomocą autoklipsów do ran.
    8. Odzyskiwanie: Umieść mysz na ciepłej podkładce, aż się obudzi. Jeśli mysz została znieczulona przez inhalację, odstaw izofluran i trzymaj mysz na ciepłej podkładce, dopóki się nie obudzi.
  3. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) i pobieranie tkanek
    1. Sześć tygodni po implantacji guza wykonaj obrazy BLI na bazie lucyferazy świetlika. Następnie poddaj myszy eutanazji za pomocą inhalacji izofluranu, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
    2. Zbierz krew do wykrywania krążących komórek nowotworowych (CTC) za pomocą cytometrii przepływowej.
    3. Pobieranie guzów i narządów będących przedmiotem zainteresowania (nerki, płuca, wątroba, jelita i śledziona) przy użyciu techniki pobierania sterylnych tkanek22. Utrwal je w 4% paraformaldehydzie na noc w celu zatopienia w wosku parafinowym.

2. Model ksenoprzeszczepu guza CAM

UWAGA: Te procedury zostały zaadaptowane i zmodyfikowane na podstawie wcześniej opublikowanych protokołów23,24. Harmonogram tej procedury jest pokazany w Rysunek 1B. W tym artykule przedstawiono tylko uproszczony protokół. Aby zapoznać się ze szczegółowymi protokołami, zapoznaj się z innym artykułem JoVE opublikowanym przez naszą grupę25.

  1. Inkubacja wstępna: Inkubować świeżo zniesione, zapłodnione jaja kurze w obrotowym inkubatorze jaj w temperaturze 37 °C i wilgotności 55-65% przez 7 dni.
  2. Upuść CAM i otwórz okno (7 dzień rozwoju):
    1. Zlokalizuj i oznacz worek powietrzny i żyły.
      UWAGA: Zwykle 10-15% jaj jest usuwanych, ponieważ są one albo niezapłodnione, albo umierają w ciągu 7 dni od zapłodnienia.
    2. Utwórz nowy worek powietrzny na zaznaczonej żyle.
    3. Wyznacz nowy worek powietrzny, nałóż taśmę pakową i włóż jaja z powrotem do inkubatora.
      UWAGA: W tym miejscu procedurę można wstrzymać. Zaleca się wznowienie zabiegów w ciągu tego samego dnia, ponieważ worek powietrzny może się poruszać.
    4. Otwórz okno: Używając zakrzywionych nożyczek do mikropreparacji i kleszczy z igłami, wytnij okrągłe okienko o wymiarach 1,5 x 1,5 cm w skorupie.
      UWAGA: Przerwanie CAM jest sygnalizowane przez krew i kawałek CAM obecny na odciętym kawałku skorupy.
    5. Uszczelnij otwór przezroczystym opatrunkiem medycznym i umieść jaja w stacjonarnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i wilgotności 55%-65%.
      UWAGA: Użyj tego samego inkubatora do jaj, co w kroku 2.1. Wyłącz rotator, aby go zatrzymać.
  3. Kontrola stanu zdrowia (9 dzień rozwoju): Usuń martwe komórki jajowe, a następnie losowo pogrupuj pozostałe komórki jajowe w celu implantacji komórek nowotworowych.
    UWAGA: Idealnie, wskaźnik przeżycia w tym momencie wynosi około 80% dnia rozwoju 0.
  4. Przeszczepienie komórek nowotworowych do nowo odsłoniętego CAM (10 dzień rozwoju)
    1. Rozcieńczyć roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej w podwójnej objętości wstępnie schłodzonego RPMI 1640 (z L-glutaminą). Odłączyć ogniwa RENCA i ponownie zawiesić w powyższym roztworze do uzyskania stężenia 2 x 104 komórek/μL.
      UWAGA: Do implantów heterogenicznych należy stosować komórki VHL-WT:VHL-KO w stosunku 1:1, a do implantacji jednorodnej samą VHL-WT.
    2. Aby wstępnie zestalić zawiesinę komórek, należy napełnić 100 μl każdej mieszanki komórek końcówkami do pipet o pojemności 200 μl i umieścić je w inkubatorze komórkowym na 15 minut.
    3. Wszczepić 100 μl zawiesiny komórkowej dla każdej komórki jajowej na powierzchni CAM przez okienko.
      UWAGA: Niektóre protokoły wymagają zarysowania CAM przed implantacją23. Nie jest to konieczne w przypadku komórek RENCA, ponieważ rosną one bardzo szybko.
  5. Hoduj komórki na CAM przez 10 dni i fotografuj co 2 dni.
  6. Poddaj eutanazji i zbierz guza, krew i narządy.
    1. W 20. dniu rozwoju (10. dzień guza) należy pobrać krew przez żyłę kosmówkowo-omocznikową za pomocą heparynizowanej strzykawki o pojemności 10 ml.
    2. Poddaj zarodki eutanazji, umieszczając je na lodzie na 15 minut.
    3. Zbierz i zważ guzy. Wypreparuj płuca i wątroby przy użyciu sterylnej techniki pobierania tkanek, podobnej do tej stosowanej u myszy22.
      UWAGA: Wątroby kurczaków mają dwa płaty, które są pierwszymi narządami widocznymi w jamie brzusznej. Nie należy ich mylić z płucami. Płuca kurczaka znajdują się pod sercem i przegrodą26. Udane pobranie płuc można potwierdzić za pomocą odsłoniętych żeber.
    4. Utrwal guzy i wypreparowane narządy w 4% paraformaldehydzie na noc w celu zatopienia w wosku parafinowym.
  7. Wykluj kurczaki.
    1. Aby umożliwić dłuższy okres wzrostu guza, kontynuuj inkubację do 21 dnia i pozwól kurczakom wykluć się w temperaturze 37 °C i wilgotności co najmniej 60%.
      UWAGA: Kurczaki naturalnie wykluwają się po 21 dniu w ciągu 24 godzin, ale czasami mają problemy z samodzielnym wykluciem. W takim przypadku pomaga rozbicie skorupek jajek. Ważne jest, aby kurczaki zakończyły proces wylęgu w ciągu 24 godzin, ponieważ po tym czasie umrą z powodu braku składników odżywczych.
    2. Hoduj kurczaki w obiekcie dla zwierząt (2017-102-01A) przez 2 tygodnie.
    3. W 34. dniu rozwoju (24. dzień guza) pisklęta należy poddać eutanazji za pomocą inhalacji izofluranu, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
    4. Wypreparuj płuca za pomocą sterylnej techniki pobierania tkanek, podobnej do tych stosowanych u myszy22. Następnie utrwal je na noc w 4% paraformaldehydzie w celu zatopienia w wosku parafinowym.

3. Immunohistochemia

UWAGA: Wszystkie sekcje tkanek i barwienie H&E zostały wykonane przez Translational Pathology Core Laboratory (TPCL) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles.

  1. Piec szkiełka w temperaturze 65 °C przez 20 minut i 3x deparafinować za pomocą ksylenu i ponownie nawadniać seryjnie ze 100% etanolu do wody.
  2. Odzyskaj antygeny w buforze cytrynianowym gotowanym w parowarze do warzyw przez 25 minut.
  3. Zastosuj 1% BSA do blokowania. Następnie nanieść przeciwciała pierwszorzędowe (anty-VHL, anty-HA, anty-flag) przygotowane w stosunku rozcieńczenia 1:200 w PBS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Po przemyciu 3x TBST (7 min każde), inkubować szkiełka z przeciwciałem drugorzędowym w rozcieńczeniu 1:200. Przemyć 3x TBST (po 7 minut) i nałożyć odczynniki DAB, a następnie przeciwbarwić hematoksyliną.

4. Cytometria przepływowa

  1. Przetwarzaj krew myszy lub kurczaka za pomocą buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC) zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Wystarczająca liza RBC jest szczególnie ważna podczas analizy krwi CAM, ponieważ RBC kurczaka są jądrzaste i nie można ich łatwo odróżnić w cytometrii przepływowej przy użyciu rozproszenia do przodu i boku.
  2. Uruchom cytometrię przepływową na lizacie krwi i przeanalizuj dane pod kątem ekspresji mStrawberry i EGFP.
  3. Ustaw bramki główne w oparciu o rozproszenie z przodu i z boku, z wyłączeniem gruzu, martwych komórek i niezlizanych erytrocytów.
  4. Ustaw bramki fluorescencyjne na podstawie niebarwionych próbek i pojedynczych barwionych kontroli. Użyj lizatu krwi zagruntowanego VHL-WT, VHL-KO lub nieznakowanymi komórkami RENCA jako odpowiednio pojedynczych barwionych i niebarwionych kontroli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Każdy eksperyment został przeprowadzony co najmniej 3x, chyba że zaznaczono inaczej. Dane są prezentowane jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Istotność określano za pomocą sparowanego testu T Studenta, gdy były dwie grupy, lub jednoczynnikowej ANOVA, gdy były trzy lub więcej grup. Do ustalenia istotności wykorzystano wartość odcięcia wynoszącą 0,05.

Ortotopowo wszczepione komórki RENCA pomyślnie wyhodowały się na nerkach...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla wielu pacjentów z nowotworami nabłonkowymi przerzuty do ważnych narządów są główną przyczyną śmiertelności. Dlatego tak ważne jest znalezienie mechanizmu leżącego u podstaw choroby przerzutowej i nowej drogi leczenia. Niestety, brakuje odpowiednich przerzutowych modeli zwierzęcych ccRCC. Wyzwanie to w dużej mierze wynika z niemożności odtworzenia ccRCC u myszy, pomimo generowania wielu transgenicznych modeli myszy VHL z nokautem ukierunkowanym na nabłonek nerek 9,10

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez UCLA JCCC seed grant, UCLA 3R grant, UCLA CTSI i UC TRDRP (LW). Dziękujemy Zakładowi Obrazowania Przedklinicznego Instytutu Crumpa, TPCL oraz Wydziałowi Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych UCLA (DLAM) za pomoc w opracowaniu metod eksperymentalnych. Cytometrię przepływową przeprowadzono w UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility, które są wspierane przez National Institutes of Health awards P30 CA016042 i 5P30 AI028697, oraz przez JCCC, UCLA AIDS Institute, David Geffen School of Medicine na UCLA, Biuro Kanclerza UCLA, oraz Biuro Rektora UCLA ds. Badań. Usługi konsultingowe w zakresie statystyk i analizy danych były świadczone przez program UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiology, and Research Design (BERD), który jest wspierany przez NIH/National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna, 0,1% EDTA w HBSS bez wodorowęglanu wapnia, magnezu i soduCorning25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Zestaw narzędziDremel8050-N/18
Przeciwciało anty-VHLAbcamab135576
BD Lo-Dose U-100 Strzykawki do insulinyBD Biosciences14-826-79
BD Pharm LyseBD Biosciences
BDGogrodalne zastosowanie i igły podskórne PrecisionGlideFisher Scientific14-826-5D
DAB Chromogen KitBiocare MedicalDB801R
D-Luciferin Firefly, sól potasowaGoldbioLUCK-1G
DPBS bez wapnia i magnezuGibcoLS14190250
DYKDDDDK Tag Przeciwciało monoklonalne (FG4R)eBioscience14-6681-82
Etanol 200 ProofCylinders Management43196-11Przygotuj 70% w wodzie
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, zatwierdzona przez USDARegiony Fisher Scientific10-437-028
Fisherbrand Ostre nożyczki preparacyjneFisher Scientific08-940
Fisherbrand Sterylne wacikiFisher Scientific22-456-885
FisherbrandWysoka precyzja, prosta, stożkowa, ultra cienka pęseta/kleszczeFisher Scientific12-000-122
Probówki do mikrowirówek FisherbrandPremium: 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Roztwór formaldehydu, 4%, buforowany, pH 6,9 (ok. 10% roztworu formaliny), do histologiiMilliporeSigma1.00496.5000
Dostosowana strzykawka HamiltonHamilton8040825 i mikro; L, Model 702 SN, Grubość: 30, Styl punktu: 4, Kąt: 30, Długość igły: 17 mm
Przeciwciało z sondą HA (Y-11)Santa Cruz Biotechnologysc805
HemocytometrHausser Scientific3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Inkubator do jaj Zestaw ComboMagazynHB1588D
roztworem Isothesia (Isoflurane)Henry Schein Zdrowie zwierząt1169567762
IVIS Lumina II System obrazowania in vivoPerkin Elmer
Matrigel GFR Matryca membranowaCorningC354230
Medline Zasłona na instrumenty chirurgiczne, przezroczysty klej, 24 "x 18"Medex SupplyMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, frakcja V [albumina surowicy bydlęcej] Izolacja szoku cieplnegoMilliporeSigma2910-25GM
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100X, 10 000 j.m. Penicylina, 10 000 ug/ml StreptomycynaFisher ScientificMT-30-002-CI
Pentobarbital SodiumSigma Aldrich57-33-0Przygotuj 1% w soli fizjologicznej
Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-062
Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-045
Roztwór jodu powidonu USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Dostępny jod, do użytku laboratoryjnegoRicca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
Hydrat dichlorowodorku puromycyny, 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC227420500
RencaATCC CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X z L-GlutaminąCorning10040CV
Scientific 96-dołkowe płytki bez listew, niskoprofiloweFisher ScientificAB-0700
SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-200, 200 i mikro; l, 960 (10 stojaków po 96 sztuk)Taśma1159M40
, uniwersalna, 1,89" x 109,4 jarda, jasnobrązowa, opakowanie 6 rolekOffice Depot220717
SzewEthiconJ385H
Tegaderm Przezroczysty opatrunek Oryginalny styl ramy 2 3/8" x 2 3/4"Moore Medical1634
Podgrzewana podkładka termiczna z kurczakiemK& H manufacturing1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - ściana 1/4 x 3/8 x 1/16 (50 stóp)TygonAACUN017
VHL-KOCRISPR/Cas9, a następnie znakowany lentiwirusowo za pomocą znakowanej flagą EGFP i lucyferazy świetlika
VHL-WTLentiviralnie znakowany fluorescencyjnym białkiem mStrawberry znakowanym HA i lucyferazem
świetlikówŚwiatowy instrument precyzyjny KLESZCZE IRIS 10CM CVD SERRFisher Scientific50-822-331
Zestaw automatycznych klipsów do ranBraintree scientific, inc.ZESTAW
ACS Ksyleny (histologiczne), Fisher ChemicalFisher ScientificX3S-4
555899 wysyłkowa Thomas Scientific nokaut VHL za pośrednictwem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009(2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032(2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6(2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815(2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Implantacja do nerki myszynokaut genu VHLortotopowa implantacja guzaanaliza przerzut w do p uclicznik kr cych kom rek nowotworowychdetekcja immunohistochemicznaedycja gen w CRISPRksenoprzeszczepy pochodz ce od pacjenta

Powiązane artykuły