Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przewlekłe, ostre i reaktywowane zakażenie wirusem HIV w humanizowanych modelach myszy z niedoborem odporności

10.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60315

⸱

3 grudnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

W tym artykule

Podsumowanie

Opisane tutaj są trzy eksperymentalne podejścia do badania dynamiki infekcji HIV u humanizowanych myszy. Pierwsza z nich pozwala na badanie przewlekłych zdarzeń infekcyjnych, podczas gdy dwie ostatnie pozwalają na badanie ostrych zdarzeń po pierwotnym zakażeniu lub reaktywacji wirusa.

Streszczenie

Humanizowane myszyzerowe z γ-łańcuchowym receptorem NOD/SCID/IL-2 rekapitulują niektóre cechy ludzkiej odporności, które mogą być wykorzystane w podstawowych i przedklinicznych badaniach nad chorobami zakaźnymi. Opisano tutaj trzy modele humanizowanych myszy z niedoborem odporności do badania dynamiki zakażenia wirusem HIV. Pierwszy opiera się na dowątrobowym wstrzyknięciu hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + u nowonarodzonych myszy, co pozwala na odtworzenie kilku komórek zamkniętych w krwi i tkankach limfatycznych, a następnie zakażenie referencyjnym szczepem HIV. Model ten umożliwia monitorowanie do 36 tygodni po zakażeniu i dlatego nazywany jest modelem przewlekłym. Drugi i trzeci model są określane jako modele ostre i reaktywacyjne, w których komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są wstrzykiwane dootrzewnowo dorosłym myszom. W modelu ostrym komórki od zdrowego dawcy są wszczepiane drogą dootrzewnową, a następnie następuje zakażenie referencyjnym szczepem HIV. Wreszcie, w modelu reaktywacji, komórki od dawcy zakażonego wirusem HIV w ramach terapii antyretrowirusowej są wszczepiane drogą dootrzewnową. W tym przypadku środowisko wolne od leków u myszy pozwala na reaktywację wirusa i wzrost wiremii. Przedstawione tutaj protokoły opisują konwencjonalne podejście eksperymentalne dla humanizowanych mysich modeli zakażenia wirusem HIV z niedoborem odporności.

Wprowadzenie

Humanizowany modelmyszy z zerowym łańcuchem γ NOD/SCID/interleukiny (IL)-2 (zwanym dalej huNS γ-chainnull) jest szeroko stosowany do badania patogenezy infekcji, autoimmunizacji i raka, a także do badań przedklinicznych leków i terapii opartych na komórkach ludzkich1,2. Myszy te są oparte na nieotyłym tle cukrzycowym (NOD), z mutacją scid i mutacją celowaną w locus γ łańcucha receptora IL-2 (wspólny łańcuch γ dla IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 i IL-21), które wywołują poważne upośledzenie rozwoju mysich komórek T, B i NK (natural killer)1. W ten sposób wspierają wszczepianie tkanek ludzkich, ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych CD34+ (HSC) i ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs)3,4,5. Ponadto transgeniczna ekspresja ludzkich czynników krwiotwórczych, takich jak czynnik komórek macierzystych (SCF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów/makrofagów (GM-CSF) i IL-3, sprzyja wszczepianiu ludzkich populacji szpikowych6,7,8.

Dla badań nad HIV opisano kilka modeli myszy huNS γ-chainnull, które różnią się szczepem myszy, typem użytych komórek ludzkich, typem tkanek do wszczepienia i pochodzeniem komórek (tj. zdrowe vs. Dawca zakażony wirusem HIV)9,10. Oryginalny szczep jest jednak szeroko stosowany ze względu na wysoki poziom wszczepienia komórek ludzkich i replikacji wirusa po zakażeniu referencyjnym szczepem HIV11,12,13. Podobne szczepy myszy z niedoborem odporności z transgeniczną ekspresją ludzkich czynników krwiotwórczych (np. NOG-EXL lub NSG-SGM3) lub z implantami ludzkich tkanek wątroby i grasicy (myszy szpik kostny-wątroba-grasica [BLT]) są przydatne do oceny roli populacji szpiku w odpowiedzi immunologicznej anty-HIV, wpływu HIV na te tkanki i ich udziału jako rezerwuarów wirusa14,15. Ponadto niektóre szczepy z transgeniczną ekspresją cząsteczek ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA), a także myszy BLT, mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi limfocytów T na zakażenie wirusem HIV16,17.

Ogólnie, u tych myszy, humanizacja zależy od pochodzenia komórkowego, drogi dostarczania (dootrzewnowa, dowątrobowa, dożylna, wewnątrzsercowa) i wieku myszy w momencie wszczepienia18,19,20. Jeśli chodzi o pochodzenie komórek, ludzkie CD34 + HSC pochodzące z krwi pępowinowej, wątroby płodu lub zmobilizowanej krwi obwodowej można wstrzykiwać nowonarodzonym lub młodym myszom3,21. Ponadto dorosłe myszybez łańcuchów γ mogą być humanizowane przez wstrzyknięcie PBMC (tutaj określane jako myszyγ-łańcuchowe zero hu-PBL-NS), umożliwiając czasowe krążenie tych komórek we krwi, wtórnych narządach limfatycznych i tkankach objętych stanem zapalnym22,23,24.

Opisany tutaj jest szczegółowy protokół tworzenia modelimyszy o zerowym łańcuchu huNS γ do badania zakażenia wirusem HIV. Pierwszym z nich jest model przewlekły, w którym ludzkie HSC CD34+ pochodzące z krwi pępowinowej od zdrowego dawcy są wstrzykiwane nowonarodzonym myszom, a następnie po 14 tygodniach od odtworzenia ludzkiego układu odpornościowego następuje zakażenie referencyjnym szczepem HIV. Model ten umożliwia monitorowanie myszy do ~36 tygodni po zakażeniu. Drugi model to model ostry, w którym PBMC pochodzące od zdrowego dawcy są wstrzykiwane dorosłym myszomzerowym NS γ-chain, a następnie następuje zakażenie referencyjnym szczepem HIV po 3 tygodniach ekspansji ludzkich limfocytów T u myszy. Wreszcie trzecim modelem jest model reaktywacji, w którym PBMC pochodzące od dawcy zakażonego wirusem HIV w ramach supresyjnej terapii antyretrowirusowej (ART) są wstrzykiwane dorosłym myszomzerowym NS γ-chain. W tym przypadku środowisko wolne od leków pozwala na reaktywację wirusa i zwiększenie wiremii. Dwa ostatnie modele umożliwiają monitorowanie do ~9 tygodni po wszczepieniu.

Ogólnie rzecz biorąc, te trzy modele są przydatne do badań wirusologicznych, badań przedklinicznych nowych leków i oceny wpływu zakażenia wirusem HIV na globalną odpowiedź immunologiczną. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że wykorzystanie humanizowanych myszy zakażonych wirusem HIV wymaga przeglądu i zatwierdzenia przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC), a także przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) przed jakimkolwiek eksperymentem. Gwarantuje to, że badanie jest zgodne ze wszystkimi wewnętrznymi i zewnętrznymi regulacjami instytucjonalnymi dotyczącymi stosowania niebezpiecznego materiału biologicznego i humanitarnego obchodzenia się ze zwierzętami doświadczalnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W tej pracy, wszystkie procedury opieki nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami sprawdzonymi i zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na University of Maryland School of Medicine (numery protokołów 1018017, 1018018 i 0318009).

1. Ludzkie wszczepienie CD34+ HSC nowonarodzonym myszom

  1. Zawsze używaj jednorazowych środków ochrony osobistej (PPE), w tym sterylnych fartuchów, rękawiczek, dedykowanych butów, ochraniaczy na buty, maski, gogli, czepka do włosów/brody i sterylnych fartuchów laboratoryjnych.
  2. Ponownie zawiesić 1 x 106 zamrożonych CD34+ HSC (patrz tabela materiałów) w 10 ml pożywki RPMI 1640 10% FBS w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego i utrzymuj sterylne warunki.
  3. Użyć 10 μl zawiesiny do policzenia (w celu zapewnienia obecności oczekiwanej liczby komórek) i sprawdzić żywotność komórek przez barwienie wykluczające błękitem trypanowym w hemocytometrze.
  4. Wirować przy 400 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w zimnym 1x PBS do wymaganego stężenia (1,4 x 105 CD34+ HSC w 50 μL). Utrzymuj komórki na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
  5. Umieść młode (NS γ-łańcuchoweszczenięta zerowej obu płci w wieku od 1 do 4 dni) na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm2 wraz z niewielką ilością ściółki z klatki hodowlanej. Dodatkowo przetrzyj czystą pościel między rękami, aby jeszcze bardziej zamaskować wszelkie obce zapachy na biorcy pups.
    UWAGA: Minimalizuje to zapłodnienie szczeniąt przez obce zapachy, zwiększając w ten sposób szanse matek na przyjęcie swoich szczeniąt z powrotem do klatek po zabiegu.
  6. Umieść szalkę Petriego w czystej klatce transportowej i umieść klatkę w czystej klatce mikroizolatora myszy, aby chronić szczenięta przed środowiskiem. Przykryj klatkę transportową podkładką, aby uniknąć wystawiania zwierząt na działanie światła zewnętrznego podczas transportu do pomieszczenia napromieniania.
  7. Napromieniować młode promieniowaniem całego ciała (WBI) o wartości 100 cGy poprzez wystawienie na działanie źródła o temperaturze 137 Cs. Wyczyść wnętrze nagrzewnicy roztworem dezynfekującym, umieść myszy w promienniku i włącz gramofon tak, aby wszystkie szczenięta były jednorodnie napromieniowane. Zamknij promiennik i naciśnij wyłącznik zasilania, aby rozpocząć proces napromieniania. Poczekaj, aż czas naświetlania dobiegnie końca i natychmiast usuń myszy.
    UWAGA: Ponieważ napromienianie nie generuje stresu u myszy, wcześniejsze znieczulenie nie jest wymagane.
  8. 2–4 godziny po zabiegu napromieniania umieścić młode w komorze bezpieczeństwa biologicznego w schłodzonej sterylnej szalce Petriego pokrytej sterylną gazą na lodzie, do momentu znieczulenia (~5–10 min). Wystarczające znieczulenie uzyskuje się, gdy ustają duże ruchy.
  9. Załadować strzykawkę z dołączoną igłą (29 G, 0,5") z 50 μl zawiesiny komórek i 1,4 x 105 CD34+ HSC pod certyfikowaną szafką bezpieczeństwa biologicznego.
  10. W przypadku wszczepienia przez wstrzyknięcie do wątroby należy przytrzymać młode kciukiem i palcem wskazującym. Aby zminimalizować unieruchomienie myszy (~30–45 s), pozwól jednemu badaczowi trzymać szczenię i podać zastrzyk, a drugi badacz niech załaduje strzykawkę zawiesiną HSC. Oczyścić miejsce wstrzyknięcia 70% alkoholem i dostarczyć 50 μl komórek bezpośrednio do wątroby. Podczas wstrzykiwania należy stosować płytki kąt igły, aby uniknąć całkowitego przebicia wątroby. Jako kontrolę, wstrzyknij myszom 50 μl 1x PBS do wątroby.
  11. Umieść młode na wstępnie podgrzanej sterylnej szalce Petriego pokrytej sterylną gazą na 1–5 minut, aby umożliwić regenerację. Podgrzej naczynie za pomocą podkładki grzewczej na podczerwień dla gryzoni w temperaturze 20 °C, aby upewnić się, że szczenięta nie zostaną nadmiernie ogrzane.
  12. Bezpośrednio przed zwróceniem szczeniąt do rodziców, nałóż niewielką ilość maści na bazie mentolu i eukaliptusa, używając kciuka i palca wskazującego, na pysk obojga rodziców, aby uniknąć kanibalizmu lub odrzucenia szczeniąt.
  13. Codziennie sprawdzaj klatki, szukając wszelkich oznak choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) u szczeniąt, takich jak suchość skóry, brak karmienia, wysypka i łysienie. Poddaj zwierzęta eutanazji, jeśli zaobserwuje się którykolwiek z tych objawów.
  14. Odsadzaj myszy w wieku 3 tygodni, grupując je według płci. Nie umieszczaj więcej niż 5 zwierząt w klatce. Sprawdzić wszczepienie do krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej w wieku 14 tygodni.
    UWAGA: Wskaźnik powodzenia wszczepienia wynosi od 80% do 100%.

2. Ludzka infuzja PBMC młodych myszy

  1. W przypadku modeli ostrej i reaktywacyjnej wstrzyknij 6-8 tygodniowym myszomzerowym NS o łańcuchu γ dootrzewnowo ludzkie PBMC pochodzące odpowiednio od zdrowego dawcy lub pacjenta zakażonego wirusem HIV, który był pod ART. W obu modelach należy uwzględnić myszy, którym wstrzyknięto PBMC od zdrowego dawcy bez zakażenia wirusem HIV (pozorowanego) jako kontrolę.
  2. Umieść 15 ml krwi pełnej w 5 ml sterylnej pożywki o gradiencie gęstości w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  3. Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, bez hamulców, aby uniknąć zmieszania się kożucha z podłożem o gradiencie gęstości.
  4. Ostrożnie zebrać frakcję komórek jednojądrzastych (między pożywką o gradiencie gęstości a supernatantem) i przenieść kożuszek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 1x PBS. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odrzucić supernatant i usunąć pozostałe krwinki czerwone przez lizę z 5 ml buforu ACK dodanym do granulowanych komórek. Inkubować przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml 1x PBS lub RPMI 1640 podłoża.
  7. Użyć 10 μl zawiesiny komórkowej do policzenia komórek i sprawdzenia żywotności przez barwienie wykluczające błękit trypanowy w hemocytometrze. Zazwyczaj na każdy 1 ml krwi uzyskuje się 1–2 x 106 komórek, z ponad 95% żywotnością.
  8. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i dostosować liczbę komórek do wymaganego stężenia (w tym przypadku 3,5 x 106 komórek w 200 μL 1x PBS).
  9. Załadować strzykawkę z dołączoną igłą (28 G, 0,5") z 3,5 x 106 PBMC w 200 μL 1x PBS pod certyfikowaną szafką bezpieczeństwa biologicznego.
  10. Wyjmij mysz z klatki i przytrzymaj ją za ogon, aby mogła chwycić siatkę, delikatnie ciągnąc do tyłu. Następnie połóż palce wskazujący i kciuk na ramionach zwierzęcia, chwytając luźną skórę szyi i używając środkowego palca, aby ustabilizować jego grzbiet.
  11. Przesuń głowicę myszy do tyłu, tak aby jej tył znajdował się nad głową. Pozwala to na przemieszczenie wnętrzności w jamie brzusznej do tyłu i zmniejsza ryzyko przebicia narządów wewnętrznych podczas iniekcji.
  12. Oczyścić miejsce wstrzyknięcia 70% alkoholem.
  13. Przeniknąć przez ścianę jamy brzusznej strzykawkę użytą w kroku 2.9 i odessać przed wstrzyknięciem komórek, jeśli jakikolwiek materiał jest odessany, wyjąć strzykawkę i wyrzucić ją. W przeciwnym razie należy powoli wstrzykiwać komórki do jamy dootrzewnowej, wyjąć strzykawkę i wyrzucić ją. Wstrzyknij 1x PBS, aby kontrolować myszy.
  14. Umieść zwierzę z powrotem w klatce.
  15. Sprawdź wszczepienie do krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej po 3 tygodniach od wstrzyknięcia.

3. Opieka po wszczepieniu

  1. Identyfikuj myszy na podstawie kolczykowania uszu.
  2. Uważnie obserwuj myszy używane w tych eksperymentach 2 razy dziennie po każdym zabiegu pod kątem klinicznych objawów niepokoju.
  3. Po przeszczepie komórek ludzkich monitoruj myszy pod kątem GVHD. W celu monitorowania objawów GVHD u nowonarodzonych, młodocianych i dorosłych myszy, oprócz pomiaru masy ciała, należy ocenić zwierzęta pod kątem pojawienia się choroby skóry (tj. koloru, suchości, wysypki, łysienia). Oceń zwierzęta, które wykazują te objawy, przez lekarza weterynarii, aby rozważyć wczesną eutanazję.

4. Procedura zakażenia wirusem HIV i procedura pozorowanego zakażenia

UWAGA: W przypadku modeli przewlekłych i ostrych, myszy są zakażone szczepem referencyjnym HIV BaL odpowiednio w 14 i 3 tygodniu po wszczepieniu. Wstrzyknięcia z wirusem HIV podaje się dootrzewnowo w dolne ćwiartki brzucha.

  1. Przeprowadź proces ładowania wirusa/PBS do strzykawek za pomocą igły 28 G 0,5" w szafkach BSL2 zgodnie z procedurami ABSL2. Całkowita ilość wstrzykniętego wirusa wynosi 15 000 mediany dawki zakaźnej kultury tkankowej (TCID50) w 200 μl sterylnego RPMI 1640.
  2. Wyjmij mysz z klatki i przytrzymaj ją za ogon, aby mogła chwycić siatkę, delikatnie ciągnąc do tyłu. Następnie połóż palec wskazujący i kciuk na ramionach zwierzęcia, chwytając luźną skórę szyi i używając środkowego palca do ustabilizowania grzbietu.
  3. Przesuń głowicę myszy do tyłu, tak aby jej tył znajdował się nad głową. Pozwala to na przemieszczenie wnętrzności w jamie brzusznej do tyłu i zmniejsza ryzyko przebicia narządów wewnętrznych podczas iniekcji.
  4. Oczyść myszy wstępnie zwilżoną wacikiem nasączonym alkoholem w lewym dolnym/prawym kwadrancie brzucha. Wstrzyknąć 15 000 TCID50 wirusa HIV BaL zawartego w 200 μl sterylnego RPMI 1640.
  5. Po wstrzyknięciu należy umieścić mysz z powrotem w klatce domowej.

5. Pobieranie krwi przez nakłucie zaoczodołowe

UWAGA: Krwawienie zadoczodołowe pozwala na szybkie pobranie krwi, skracając tym samym ogólny czas pobierania i zwiększając stabilność markerów ludzkich limfocytów. Użyj probówek EDTA do pobrania krwi myszy.

  1. W modelu przewlekłym, po 14 tygodniach od wstrzyknięcia HSC, należy pobrać krew przez żyłę zaoczodołową. W modelach ostrym i reaktywacyjnym należy wykonać tę procedurę po 3 tygodniach od wstrzyknięcia PBMC.
  2. Znieczulić zwierzęta za pomocą 250 μl izofluranu do inhalacji przed pobraniem krwi w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy B2, który jest podawany na zewnątrz.
  3. Dozować izofluran w waciki pod siatką drucianą w przezroczystym słoiku o pojemności 1 l w komorze bezpieczeństwa biologicznego wentylowanej na zewnątrz budynku. Zastosowanie siatki zapewnia, że zwierzęta nie mają kontaktu z podkładką nasączoną izofluranem, co może powodować podrażnienie skóry i potencjalne przedawkowanie, ponieważ izofluran jest również wchłaniany przez skórę. Umieść również miękki ręcznik papierowy między siatką a zwierzęciem, aby uniknąć obrażeń kończyn.
  4. Gdy słoik zostanie nasycony izofluranem (około 1 minuty po dodaniu), wprowadź zwierzę i obserwuj częstość oddechów, która będzie się zwiększać, a następnie zmniejszać. Sprawdź, czy nie ma wskazań klinicznych do głębokiej płaszczyzny znieczulenia, która obejmuje brak odruchu prostowania (po delikatnym przechyleniu słoika) i brak dużych ruchów. Procedurę krwawienia należy rozpocząć, gdy tylko zwierzę jest całkowicie zrelaksowane i nie ma odruchu szczypania palców.
    UWAGA: Ponieważ izofluran odparowuje, należy dozować więcej leku, jeśli nie obserwuje się żadnych objawów znieczulenia.
  5. W przypadku krwawienia zadoczodołowego przyciśnij kciukiem zewnętrzną żyłę szyjną ogonową myszy do żuchwy i tą samą ręką delikatnie unieś górną powiekę palcem wskazującym.
  6. Włóż rurkę hematokrytową do przyśrodkowej kanty oka i skieruj ją w kierunku brzuszno-bocznym, aż krew zacznie płynąć.
  7. Zbierz co najmniej 100 μl krwi. Po uzyskaniu pożądanej objętości krwi (objętość nie większa niż 1% masy ciała zwierzęcia) należy przerwać zewnętrzne ciśnienie szyjne i usunąć rurkę hematokrytową.
  8. Upewnij się, że hemostaza jest zakończona, wywierając bezpośredni nacisk na oko za pomocą sterylnej gazy przez co najmniej 30 sekund.
  9. Zastosuj krople tetrakainy do oka. Monitoruj zwierzę, dopóki całkowicie nie wyzdrowieje ze znieczulenia i umieść je z powrotem w klatce.
    UWAGA: 100 μL pobranej krwi służy do oceny poziomu wszczepienia ludzkiego CD45+ i innych populacji komórek krwi, a także do oceny wiremii w osoczu.

6. Badania przesiewowe poziomu wszczepienia i analiza cytometrii przepływowej

  1. Postępuj zgodnie z konwencjonalnym protokołem barwienia cytometrii przepływowej dla krwi pełnej, który obejmuje inkubację przeciwciał anty-ludzkich znakowanych fluorochromem (sugerowany panel przepływu znajduje się w Tabeli materiałów), a następnie lizę czerwonych krwinek i etapy mycia13,15.
    UWAGA: Do badań przesiewowych poziomu wszczepienia należy dołączyć przeciwciało anty-ludzkie CD45. Do porównania można również zastosować przeciwciało anty-mysie CD45. Obejmują kontrole kompensacyjne, a także próbkę krwi ludzkiej barwioną tą samą mieszanką przeciwciał, niebarwione próbki krwi myszy i krwi ludzkiej oraz niehumanizowaną kontrolę w celu zbadania reaktywności krzyżowej odczynników. Po barwieniu zawsze pojawia się jakiś sygnał tła; Jednak wszystkie sygnały pozytywne są wyraźnie odróżniane od kontroli negatywnych i krzyżowych.
  2. W odpowiednim cytometrze przepływowym uzyskaj co najmniej 10 000 zdarzeń na bramce limfocytów (FSC-A vs. SSC-A). W przypadku analizy cytometrii przepływowej, po zduplikowanym wykluczeniu, należy określić procent ludzkich komórek CD45 +, a także innych populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania.

7. Ocena wiremii w osoczu

  1. Oceń miano wirusa u zwierząt zakażonych wirusem HIV 1 raz w tygodniu po zakażeniu.
  2. Po krwawieniu zadoczodołowym (około 100 μl) należy uzyskać osocze poprzez pobranie supernatantu po odwirowaniu krwi przeciwzakrzepowej w dawce 3 500 x g przez 3 minuty w mikrowirówce. Osad służy do fenotypowania komórek krwi.
  3. Użyj dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA (patrz tabela materiałów), aby uzyskać RNA z 40 μl osocza.
  4. Przekształć RNA w cDNA za pomocą pierwszej mieszanki syntezy szczepów (patrz tabela materiałów) i startera knebla HIV SK431.
  5. Wykonaj ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów HIV Gag SK38/SK39 i fluorescencyjnych zielonych barwników (np. SYBR green), jak opisano w poprzednich badaniach13,25.

8. Podawanie terapii antyretrowirusowej

  1. Doustną dawkę ART należy podawać co najmniej 3 tygodnie po zakażeniu, gdy obserwuje się wysokie miano wirusa, w modelu przewlekłym, ostrym i reaktywacyjnym.
  2. Oblicz dawki fumaranu dizoproksylu tenofowiru (TDF), emtrycytabiny (FTC) i raltegrawiru (RAL), zgodnie z wartościami Km wynoszącymi odpowiednio 37 i 3 dla ludzi i myszy26. Zazwyczaj równoważne dla człowieka dawki TDF, FTC i RAL wynoszą odpowiednio 61,7 mg/kg mc./dobę, 40,7 mg/kg mc./dobę i 164 mg/kg mc./dobę.
  3. Do podawania w wodzie pitnej należy rozdrobnić tabletki leku i dodać odpowiednią ilość do butelki z wodą, upewniając się, że każda mysz w klatce otrzyma swoją dzienną dawkę. Ponieważ lek w proszku może tworzyć osad w butelce, należy okresowo wstrząsać butelką z wodą, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
  4. Zmieniaj butelkę z wodą co tydzień ze świeżo rozpuszczonymi lekami.
  5. Pobieraj krew przez żyłę zadoczodołową co tydzień lub co 2 tygodnie po rozpoczęciu ART, aby ocenić zmiany w wiremii i stosunku CD4:CD8.

9. Eutanazja myszy, pobranie wtórnych narządów limfatycznych i izolacja komórek jednojądrzastych

  1. Eutanazja jest przeprowadzana w trzech humanizowanych modelach mysich, okresowo w czasie infekcji lub pod koniec eksperymentu.
  2. Przeprowadzić eutanazję dorosłych myszy przez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Do uduszenia należy użyć nienapełnionej komory, dozować CO2 z komercyjnej butli ze stałym regulatorem ciśnienia i ogranicznikiem w linii kontrolującej przepływ gazu w zakresie 20%-30% objętości komory na minutę, aby zachować zgodność z wytycznymi AVMA z 2013 r.
  3. Utrzymuj przepływ CO2 przez >60 s, monitorując zatrzymanie oddechu (które może potrwać do 5 minut), a następnie zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić eutanazję.
  4. Poddaj eutanazji noworodki w wieku <7 dni metodą fizyczną (tj. przy użyciu ostrych nożyczek).
  5. Wizualizuj węzły chłonne pachowe, śródpiersiowe i krezkowe (które są zwykle obserwowane) i usuń je pęsetą i ostrymi nożyczkami. Wyciągnij również śledzionę, znajdującą się w lewej górnej części jamy otrzewnej.
  6. Umieść tkanki limfatyczne w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml zawierających sterylne podłoże RPMI 1640.
  7. Natychmiast przetworzyć tkanki limfatyczne w nylonowym sitku do komórek o wielkości porów 70 μm, zbierając komórki w probówce o pojemności 50 ml. Nie zasysać tkanek.
  8. Umyj komórki 5 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 1% FBS, aby ułatwić filtrowanie komórek.
  9. Po dezagregacji tkanek odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 3 500 x g przez 10 minut w mikrowirówce.
  10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 500 μl 1x PBS.
  11. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl sterylnego podłoża o gradiencie gęstości.
  12. Wirować przy 3 500 x g przez 3 minuty w mikrowirówce, bez hamulca, aby zapobiec mieszaniu się kożuchy z podłożem o gradinie gęstości
  13. Ostrożnie zebrać frakcję komórek jednojądrzastych (między pożywką o gradiencie gęstości a supernatantem) i przenieść kożuchową powłokę do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl 1x PBS. Wirować przy 3.000 x g przez 3 min.
  14. Usunąć pozostałe krwinki czerwone przez lizę z 500 μl buforu ACK, inkubując przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  15. Wirować przy 3 000 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml 1x PBS lub pożywce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z powyższym opisem, w 14. tygodniu po wstrzyknięciu HSC (model przewlekły) lub w 3. tygodniu po wstrzyknięciu PBMC (modele ostre i reaktywacji), pobiera się krew od myszy w celu oceny poziomu engraftmentu komórek ludzkich za pomocą cytometrii przepływowej. Reprezentatywna strategia bramkowania służąca do oceny 1) rekonstytucji ludzkich komórek CD45+ oraz 2) procentowego udziału limfocytów T CD4+ i CD8+ przedstawiona jest na Rysunku 1A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Osiągnięto ważne postępy w rozwoju szczepów myszy z niedoborem odporności do humanizacji, z wieloma różnymi opcjami, które można wykorzystać zgodnie z zainteresowaniami badawczymi1. Poniżej przedstawiono ogólny protokół humanizacji myszyzerowych NS o łańcuchu γ i genetycznie podobnych szczepów, który ma być zastosowany w trzech różnych modelach do badania zakażenia wirusem HIV. W pierwszym podejściu eksperymentalnym napromieniowanym nowonarodzonym myszom wstrzykuje się ludzkie HSC CD34 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez wewnętrzne fundusze oddziału klinicznego IHV dla JCZ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0. Probówki do mikrowirówek 5 mlNeptun3735.S.X
1. Probówki do mikrowirówek 5 mlNeptun3745.S.X
10 ml Pipety serologicznestellar sceintificVL-4090-0010
15 ml probówki stożkoweStellar scientificT15-600
25 ml Pipety serologicznestellar sceintificVL-4090-0025
5 ml Pipety serologicznestellar sceintificVL-4090-0005
Probówki stożkowe 50 mlBuforT50-600
ACKJakość biologiczna118-156-101
Wkładki nasączone alkoholemFisher scientific06-669-62Sterylny
anty-ludzki klon CD3 UCHT1Biolegend300439APC sprzężony
klon Anti-Human CD4 OKT4Biolegend317420AF488 sprzężony
klon Anti-Human CD45 2D1Biolegend368522BV421 sprzężony
klon Anti-Human CD8 SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 sprzężony
Biosafaty cabinet poziom 2Jeśli to możliwe, podłączony do chimeny exauste podczas obchodzenia się z izofluranem
BonnetFisher scientific17-100-900Jednorazowa nasadka do podstawowej ochrony
CavicideMetrex13-1000Środek do dezynfekcji powierzchni
Komórki CD34+Lonza2C-101Tyle fiolek dostępnych od jednego dawcy
WirówkaBeckman65-6KR
Przezroczysty słoikAmazon77977
Bawełniany gazikFisher scientific22-415-468Sterylne
jednorazowe fartuchy laboratoryjneFisher scientific19-472-422
Mikroprobówki EDTAGreiner bio-one450480
Maska na twarzFisher scientific17-100-897
Roztwór lizujący FACSBD340202
FBS premium HIAtlantabiologiczne S1115OH
FicollGE health one17-1440-02
CytometrUżyliśmy probówek do
cytometrii przepływowejFalcon3520545 ml polistyrenu i okrągłodennego
HIV BaLPrzygotowane w naszym głównym obiekcie uQUANT
Ludzkie PBMC Wolontariuszez dodatnim i ujemnym wynikiem testu na obecność wirusa HIV
Podczerwień Podkładka rozgrzewającaVenet scientificDCT-25Tymczasowa terapeutyczna podkładka rozgrzewająca dla małych zwierząt
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061Lek antyretrowirusowy do leczenia ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) - inhibitor integrazy
IsofluranHenry ScheinNDC 11695-6776-2
NaświetlaczSprzęt należący do uniwersytetu Maryland
Mikropipety
MikrowirówkaEppendorf
Kolczyki do uszu myszyNational Band & Etykietka firmy1005-1L1
Probówki do pobierania krwi NatelsonFisher scientific02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
Myszy NSGJackson5557Czas ciąży samice do wszczepienia CD34 i młode osobniki do wszczepienia PBMC
NSG-SGM3Jackson13062
Paraformaldehyd 16%Mikroskopia elektronowa nauki15710
PBS 1X pH 7,4Gibco100-10-023
Szalki PetriegoFisher scientific08-757-28
Maszyna Quantistudio qPCRThermoQS3
Zbiorniki odczynnikówCostar4870
RPMI media 1640 1XGibco11875-093
Buty pokrowceFisher scientific17-100-911
Sterylne rękawiczki jednorazoweMicroflexSUF-524
SuperScript II Synteza pierwszej nici SuperMixInvitrogen10080-400synteza cDNA
Strzykawki 28-G x 1/2BD329-461
Strzykawki 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtrycytabina i TenofovirGileadNDC 61958-0701-1Leki przeciwretrowirusowe do leczenia ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) - inhibitora analogu transkryptazy nikleozydu
Trypan blueSigmaT8154Liczba i żywotność komórek
Vick VaporubZdrowie szkolne43214Maść na bazie mentolu i eukaliptusa
Klasa biologii molekularnej wodyJakość biologiczna351-029-131
do lizy Stellar scientific przepływowy FACS Aria II Mark I

Bibliografia

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118(2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , Chapter 2 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280(2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Humanyzowane myszy z niedoborem odporno cimodele zaka enia HIVchroniczny model HIVostry model HIVmodel reaktywacji HIVkom rki macierzyste CD34mononuklearne kom rki krwi obwodowejcytometria przep ywowainiekcja doszpikowainiekcja wewn trzstryjkowa
Przewlekłe, ostre i reaktywowane zakażenie wirusem HIV w humanizowanych modelach myszy z niedoborem odporności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.