Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60317

⸱

7 stycznia 2020

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Queen's University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Streszczenie

Uporczywa reakcja zapalna gospodarza na wszczepiony biomateriał, znana jako reakcja ciała obcego, jest znaczącym wyzwaniem w rozwoju i wdrażaniu urządzeń biomedycznych i konstruktów inżynierii tkankowej. Makrofagi, wrodzona komórka odpornościowa, odgrywają kluczową rolę w reakcji na ciało obce, ponieważ pozostają w miejscu implantacji przez cały okres użytkowania urządzenia i są powszechnie badane w celu zrozumienia tej szkodliwej odpowiedzi gospodarza. Wielu badaczy zajmujących się biomateriałami wykazało, że zaadsorbowane warstwy białek na wszczepionych materiałach wpływają na zachowanie makrofagów, a następnie na odpowiedź gospodarza. Metody opisane w tym artykule opisują model in vitro wykorzystujący zaadsorbowane warstwy białek zawierające cząsteczki uszkodzenia komórkowego na powierzchniach biomateriałów polimerowych w celu oceny odpowiedzi makrofagów. Reporterową linię komórkową makrofagów NF-кB/AP-1 i związany z nią test kolorymetrycznej fosfatazy alkalicznej zastosowano jako szybką metodę pośredniego badania aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 w odpowiedzi na złożone zaadsorbowane warstwy białkowe zawierające białka krwi i wzorce molekularne związane z uszkodzeniem, jako model złożonych zaadsorbowanych warstw białkowych utworzonych na powierzchni biomateriału in vivo.

Wprowadzenie

Reakcja na ciało obce (FBR) to przewlekła reakcja gospodarza, która może negatywnie wpłynąć na działanie wszczepionego materiału lub urządzenia (np. urządzeń do dostarczania leków, biosensorów), poprzez ciągłe uwalnianie mediatorów stanu zapalnego i utrudnianie integracji między wszczepionym materiałem a otaczającą tkanką1. Ta wrodzona odpowiedź immunologiczna jest inicjowana przez procedurę implantacji i charakteryzuje się długotrwałą obecnością wrodzonych komórek odpornościowych i tworzeniem się włóknistych torebek wokół implantu1. W kontekście istotnych odpowiedzi gospodarza, interakcje makrofag-materiał mają znaczący wpływ na postęp odpowiedzi gospodarza i rozwój klasy FBR1. Makrofagi to zróżnicowana wrodzona populacja komórek odpornościowych, rekrutowana do miejsca implantacji z populacji makrofagów rezydujących w tkankach lub z krwi jako makrofagi pochodzące z monocytów. Zaczynają się one gromadzić w miejscu implantacji wkrótce po implantacji, a w ciągu kilku dni stają się dominującą populacją komórek w mikrośrodowisku implantu. Makrofagi przylegające do materiału, wraz z gigantycznymi komórkami ciała obcego (FBGC) powstałymi w wyniku fuzji makrofagów, mogą utrzymywać się na powierzchni materiału przez cały okres użytkowania implantu2,3. W związku z tym makrofagi są uważane za kluczowych graczy w odpowiedzi na ciało obce ze względu na ich role w koordynowaniu charakterystycznych etapów FBR: ostrej odpowiedzi zapalnej, przebudowy tkanek i tworzenia tkanki zwłóknieniowej1.

Receptory toll-podobne (TLR) to rodzina receptorów rozpoznawania wzorców, które są wyrażane przez wiele komórek odpornościowych, w tym makrofagi, i wykazano, że odgrywają znaczącą rolę w stanach zapalnych i gojeniu się ran. Oprócz ligandów pochodzących od patogenów, TLR są w stanie wiązać endogenne cząsteczki, znane jako wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP), które są uwalniane podczas martwicy komórek i aktywują zapalne szlaki sygnałowe, powodując produkcję cytokin prozapalnych4. My i inni zasugerowaliśmy, że uszkodzenia powstałe podczas procedur implantacji biomateriału tkanek miękkich uwalniają DAMPs, które następnie adsorbują się na powierzchniach biomateriału oprócz białek krwi i modulują kolejne interakcje komórka-materiał5,6. Kiedy makrofagi oddziałują z zaadsorbowaną warstwą białka na implancie, ich powierzchniowe TLR mogą rozpoznawać zaadsorbowane DAMP i aktywować prozapalne kaskady sygnalizacyjne, prowadząc do aktywacji czynników transkrypcyjnych NF-κB i AP-1 oraz produkcji cytokin prozapalnych. Wcześniej wykazaliśmy, że mysie makrofagi znacznie zwiększyły aktywność NF-κB / AP-1 i wydzielanie czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α, cytokiny prozapalne) w odpowiedzi na zaadsorbowane warstwy białka zawierające DAMP na różnych powierzchniach polimerowych w porównaniu z powierzchniami z zaadsorbowaną surowicą lub osoczem (tj. Brak obecnych DAMP), i że odpowiedź ta jest w dużej mierze pośredniczona przez TLR2, podczas gdy TLR4 odgrywa mniejszą rolę5.

Linia komórkowa reporterowa makrofagów NF-κB/AP-1 (Tabela materiałów) używana w tym protokole jest wygodną metodą pomiaru względnej aktywności NF-κB i AP-1 w makrofagach5,7,8. W połączeniu z inhibitorami szlaku TLR, ta linia komórkowa jest użytecznym narzędziem do badania aktywacji TLR i jej roli w stanie zapalnym w odpowiedzi na różne bodźce5,7,8. Komórki reporterowe są zmodyfikowaną mysią linią komórkową podobną do makrofagów, która może stabilnie wytwarzać wydzielaną embrionalną fosfatazę alkaliczną (SEAP) po aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB i AP-19. Kolorymetryczny enzymatyczny test fosfatazy alkalicznej (tabela materiałów) może być następnie wykorzystany do ilościowego określenia względnych ilości ekspresji SEAP jako pośredniej miary aktywności NF-κB / AP-1. Ponieważ NF-κB i AP-1 znajdują się za wieloma szlakami sygnalizacji komórkowej, przeciwciała neutralizujące i inhibitory ukierunkowane na określone TLR (np. TLR2) lub cząsteczki adaptorowe TLR (np. MyD88) można wykorzystać do weryfikacji roli określonego szlaku. Metodologia opisana w tym artykule zapewnia proste i szybkie podejście do oceny udziału sygnalizacji TLR w odpowiedziach mysich makrofagów na różne powierzchnie polimerowe z zaadsorbowanymi warstwami białkowymi zawierającymi zarówno białka krwi, jak i DAMP jako model in vitro wszczepionych biomateriałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek i odczynników

  1. Przygotuj pożywkę fibroblastyczną. Połącz 450 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny/streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
  2. Przygotować reporterowe pożywki do wzrostu makrofagów w 50 ml podwielokrotności. Połącz 45 ml DMEM, 5 ml FBS, 5 μg/ml odczynnika do eliminacji mykoplazmy (tabela materiałów) i 200 μg/ml fleomycyny D1 (tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
  3. Przygotować pożywkę do oznaczania makrofagów reporterowych w 50 ml podwielokrotności. Połącz 45 ml DMEM, 5 ml inaktywowanego termicznie FBS (HI-FBS), 5 μg/ml odczynnika do eliminacji mykoplazmy i 200 μg/ml fleomycyny D1. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.

2. Powlekanie powierzchni kultur komórkowych poli(metakrylanem metylu)

  1. Rozpuścić poli(metakrylan metylu) (PMMA) w chloroformie w stężeniu 20 mg/ml (np. 100 mg PMMA w 5 ml chloroformu) w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. Umieścić mieszadło magnetyczne w fiolce i pozostawić do mieszania przez co najmniej 2 godziny, aż wszystkie ciała stałe się rozpuszczą.
    ostrożność: Chloroform jest szkodliwy w przypadku wdychania. Upewnij się, że używasz rozpuszczalnika w dygestorium podczas noszenia rękawic PVA.
  2. Odpipetować 400 μl roztworu PMMA na środek szkiełka mikroskopowego ze szkła borokrzemianowego w powlekarce wirowej i wirować z prędkością 3000 obr./min przez 2 minuty. Przygotować liczbę szkiełek podstawowych wymaganą do testu, a także 3−5 dodatkowych do pomiaru kąta zwilżania wody. Przechowuj szkiełka w czystym pudełku (spryskanym i przetartym 70% etanolem) do wykorzystania w przyszłości.
    nuta: Powłoka wirowa jest często używana do osadzania cienkiej, jednolitej powłoki na płaskiej powierzchni. Powlekarka wirowa obraca podłoże z dużą prędkością, wykorzystując siłę odśrodkową do rozprowadzenia roztworu powlekającego po powierzchni.
    1. Zmierz kąt zwilżania wody w dwóch losowych miejscach na powierzchni dodatkowo powlekanych szkiełek (tj. nie szkiełek używanych do hodowli komórkowych) za pomocą goniometru, aby upewnić się, że powierzchnia szkła jest całkowicie pokryta polimerem.
      nuta: Do pomiarów kąta zwilżania wody należy używać wyłącznie wody o najwyższej czystości (np. szklanej potrójnie destylowanej).
  3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) przymocuj 8-komorowe lepkie studzienki do szkiełek pokrytych PMMA za pomocą sterylnych kleszczy i zgodnie z techniką aseptyczną. Mocno dociśnij górną część lepkich studzienek, aby upewnić się, że są mocno przymocowane. Inkubować szkiełka z dołączonymi dołkami lepkimi w temperaturze 37 °C przez noc w celu zabezpieczenia zlomby.
    1. Przetestuj szczelność lepkich studzienek, dodając do każdej studzienki 200 μl wody klasy hodowli komórkowej (wolnej od endotoksyn). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 60 minut i upewnić się, że nie ma wycieków przed kontynuowaniem. Zassać wodę, uważając, aby nie naruszyć powłoki PMMA.
  4. Wykonaj płukanie wodą bez endotoksyn, dodając 300 μl wody wolnej od endotoksyn do każdej studzienki i inkubując przez 1 godzinę (trzy razy), 12 godzin i 24 godziny przed użyciem w celu usunięcia pozostałego rozpuszczalnika.
  5. Zbadać stężenie endotoksyn w szkiełkach, które mają być użyte do hodowli komórek. Inkubować 200 μl wody z odczynnikiem wolnym od endotoksyn (tabela materiałów) w jednym dołku każdego szkiełka przez 1 godzinę. Zmierzyć stężenie endotoksyny w ekstrakcie za pomocą końcowego testu endotoksyn chromogennych (tabela materiałów).
    nuta: Poniższy protokół jest specyficzny dla zestawu do oznaczania endotoksyn wymienionego w tabeli materiałów.
  6. Do tej pracy należy używać wyłącznie wody i materiałów eksploatacyjnych (tj. końcówek pipet, probówek do mikrowirówek i płytek studzienkowych), które są certyfikowane jako wolne od pirogenów (tj. wolne od endotoksyn). Ponadto, wszelkie wyroby szklane używane do przygotowania powierzchni pokrytych polimerem powinny być przed > Pomiar endotoksyny w roztworze ekstraktu, jak opisano tutaj, może spowodować niedoszacowanie endotoksyny na powierzchni materiału11,12. W związku z tym zaleca się, aby podczas opracowywania protokołu powlekania polimerowego przeprowadzić reakcję oznaczania endotoksyn (tj. kroki 2.5.4−2.5.6 dla próbek testowych [woda odczynnika] lub kontrole kolców) bezpośrednio w studzienkach zawierających pokrytą próbkę, aby upewnić się, że żadne źródła endotoksyny nie zostaną przypadkowo wprowadzone do systemu podczas procesu powlekania.
    1. Przynieś wszystkie badane próbki (tj. ekstrakty) i odczynniki do oznaczania endotoksyn do RT. Rozpuść odczynnik chromogenny w buforze testowym i wzorcu endotoksyny w wodzie z odczynnikiem, pozostaw do rozpuszczenia na 5 minut i delikatnie zawiruj przed użyciem. Przykryj wszystkie butelki folią parafinową, gdy nie są używane.
    2. Utwórz 5-8-punktową standardową krzywą rozcieńczenia wzorca endotoksyny, począwszy od dolnej do górnej granicy testu, wykonując seryjne rozcieńczanie wzorca endotoksyny w wodzie z odczynnikiem.
    3. Aby kontrolować wzmocnienie lub zahamowanie testu endotoksyn w próbkach testowych, należy przygotować kontrolę pozytywną (zwaną również kontrolą kolca lub próbką wzbogaconą) poprzez rozcieńczenie znanej ilości endotoksyny w niewykorzystanym roztworze próbki testowej.
      nuta: Stężenie kontroli dodatniej powinno być takie samo jak stężenie wzorca w środku krzywej wzorcowej. Jeżeli odzyskana ilość kolca endotoksyny (tj. stężenie kontroli dodatniej minus stężenie próbki testowej bez wzbogacania) mieści się w zakresie 50-200% nominalnego stężenia kolca endotoksyny, można uznać, że roztwór ekstrakcyjny nie zakłóca znacząco testu.
    4. Dodać 50 μl wzorców, próbek lub kontrolnych kolców do każdego dołka na 96-dołkowej płytce w dwóch lub trzech kroplach. Użyj wody odczynnika jako kontroli negatywnej.
    5. Dodaj 50 μl odczynnika chromogennego do każdego dołka. Szybko dodaj odczynnik do wszystkich studzienek. Użyj timera, aby zarejestrować czas potrzebny na dodanie odczynnika do wszystkich studzienek. Przykryć płytkę uszczelką adhezyjną i inkubować w temperaturze 37 °C (czas inkubacji zależy od partii i jest podany w certyfikacie analizy dołączonym do zestawu odczynników chromogennych). Alternatywnie, sprawdzaj na płytce co 15 minut podczas inkubacji, aż do momentu zaobserwowania zmiany koloru we wszystkich standardowych studzienkach.
    6. Po inkubacji dodać 25 μl 50% kwasu octowego do każdego dołka (końcowe stężenie 10% kwasu octowego na studzienkę), aby zatrzymać reakcję. Dodaj kwas octowy w tej samej kolejności, w jakiej dodano odczynnik chromogenny. Odczytać absorbancję płytki za pomocą czytnika płytek przy długości fali 405 nm. Odessać płyn i wyrzucić płytkę.
      nuta: Dodanie kwasu octowego powinno zająć tyle samo czasu, aby dodać do każdego dołka, ile zajęło odczynnik chromogenny (± 30 s).
  7. Ultrafioletem (UV) sterylizować szkiełka przez 30 minut przed eksperymentami z hodowlą komórkową.

3. Powlekanie powierzchni kultur komórkowych polidimetylosiloksanem

  1. Wymieszać elastomer polidimetylosiloksanu (PDMS) w stosunku wagowym 10:1 (baza do utwardzacza). W komorze bezpieczeństwa biologicznego odpipetować około 10 ml zasady polidimetylosiloksanu do sterylnej probówki. Zważyć probówkę i powoli dodawać utwardzacz, aż do dodania 10%.
    ostrożność: Używaj odczynników PDMS w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i unikaj kontaktu z oczami, nosząc okulary ochronne.
  2. Dokładnie wymieszać elastomer, mieszając sterylną końcówką pipety serologicznej i pipetując w górę i w dół. Dodać około 200 μl roztworu do każdego dołka na 48-dołkowej płytce. Powoli przechylaj płytę studzienki, aby zapewnić całkowite pokrycie studzienek roztworem elastomeru.
  3. Umieść płytkę studzienkową z elastomerem w piecu próżniowym ustawionym na 50 cmHg, 40 °C. Zdejmij pokrywkę i przykryj jednowarstwową chusteczką, aby zapobiec wpadaniu innych zanieczyszczeń do studzienek. Pozostawić do inkubacji na co najmniej 48 godzin.
    1. Upewnij się, że studzienki są całkowicie pokryte poprzez oględziny. Upewnij się, że elastomer jest w pełni utwardzony, delikatnie szturchając sterylną końcówką pipety przed wyjęciem.
  4. Dodać 300 μl 70% etanolu (sporządzonego z absolutnego etanolu i wody wolnej od endotoksyn) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usunąć etanol i przeprowadzić płukanie wodą bez endotoksyn, dodając 300 μl wody wolnej od endotoksyn do każdej studzienki i inkubując przez 1 godzinę (trzy razy), 12 godzin i 24 godziny przed użyciem w celu usunięcia pozostałego rozpuszczalnika.
    1. Inkubować 200 μl wody wolnej od endotoksyn w trzech dołkach każdej płytki przez 1 godzinę. Zmierzyć stężenie endotoksyn w ekstraktach wodnych za pomocą końcowego testu endotoksyn chromogennych (kroki 2.5.1−2.5.6).

4. Powlekanie powierzchni kultur komórkowych fluorowanym poli(tetrafluoroetylenem)

  1. Sporządzić 1 mg/ml roztwór fluorowanego poli(tetrafluoroetylenu) (fPTFE) (np. dodać 10 mg fPTFE do 10 ml rozpuszczalnika fluorowanego [Tabela materiałów]) w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. Umieścić mieszadło magnetyczne w fiolce i pozostawić do mieszania przez co najmniej 24 godziny, aż wszystkie ciała stałe się rozpuszczą.
  2. Dodać około 150 μl roztworu polimeru do każdego dołka 48-dołkowej płytki polistyrenowej (tj. nie poddanej działaniu hodowli tkankowej). Powoli przechylaj płytkę studzienki, aby zapewnić całkowite pokrycie wszystkich studzienek roztworem polimeru. Załóż pokrywę.
    1. Aby zapewnić skuteczną powłokę fPTFE studni, szkiełka nakrywkowe powinny być pokryte fPTFE i używane do pomiaru kąta zwilżania wody (krok 4.3.1). Umieść szkiełka nakrywkowe w dołkach 24-dołkowej płytki. Dodać około 400 μl roztworu polimeru do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe. Dociśnij szkiełka nakrywkowe za pomocą sterylnych kleszczyków, upewniając się, że są całkowicie pokryte roztworem polimeru, i przykryj płytkę studzienki pokrywką.
  3. Umieścić płytkę studzienkową z roztworem polimeru i/lub szkiełkami nakrywkowymi w piecu próżniowym ustawionym na 50 cmHg, 40 °C. Zdjąć pokrywkę i przykryć jednowarstwową chusteczką, aby zapobiec wpadaniu innych zanieczyszczeń do studzienek. Pozostawić do inkubacji na co najmniej 48 godzin.
    1. Zmierz kąt zwilżania wody szkiełek nakrywkowych pokrytych fPTFE za pomocą goniometru, aby zapewnić skuteczne powlekanie.
      nuta: Do pomiarów kąta zwilżania wody należy używać wyłącznie wody o najwyższej czystości (np. szklanej potrójnie destylowanej).
  4. Dodać 300 μl 70% etanolu (sporządzonego z absolutnego etanolu i wody wolnej od endotoksyn) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usunąć etanol i przeprowadzić płukanie wodą bez endotoksyn, dodając 300 μl wody wolnej od endotoksyn do każdej studzienki i inkubując przez 1 godzinę (trzy razy), 12 godzin i 24 godziny przed użyciem w celu usunięcia pozostałego rozpuszczalnika.
    1. Inkubować 200 μl wody wolnej od endotoksyn w trzech studzienkach każdej płytki przez 1 godzinę. Zmierzyć stężenie endotoksyn w ekstraktach wodnych za pomocą końcowego testu endotoksyn chromogennych (kroki 2.5.1−2.5.6).
  5. Sterylizuj UV płytki dołkowe przez 30 minut przed eksperymentami z hodowlą komórkową.

5. Wytwarzanie lizatu z komórek 3T3

  1. Hoduj komórki 3T3 w wielu kolbach T150 do 70% konfluencji. Aby odłączyć komórki, odessać pożywkę, umyć powierzchnię 5 ml PBS i odessać PBS. Dodać 5 ml niepochodzącego od zwierząt, rekombinowanego enzymu dysocjacji komórek (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 min.
  2. Odłączyć komórki, delikatnie przechylając kolbę do przodu i do tyłu. Dodaj 5 ml PBS, aby zneutralizować rekombinowany enzym używany do dysocjacji komórek. Przenieść oderwane komórki z kolb do probówki wirówkowej i wymieszać przez pipetowanie. Wykonaj zliczanie żywych komórek za pomocą hemocytometru i barwnika żywotności komórek.
    nuta: Wybrano enzym dysocjacji komórek, który można zneutralizować poprzez rozcieńczenie w PBS, aby uniknąć wprowadzania białek na bazie surowicy do preparatu lizatu. Jeśli trypsyna jest używana do dysocjacji komórek, należy ją zneutralizować roztworem zawierającym surowicę i przeprowadzić dodatkowe płukanie PBS w celu zmniejszenia ilości białek surowicy przenoszonych do preparatu lizatu.
  3. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pierwotnej objętości (tj. 10 ml x liczba kolb) PBS w celu zmycia pozostałej pożywki. Powtórzyć.
  4. Ponownie odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Dodać objętość PBS wymaganą do osiągnięcia końcowego stężenia komórek 1 x 106 komórek/ml. Umieścić roztwór komórkowy w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu całkowitego zamrożenia próbki (co najmniej 2 godziny).
  5. Rozmrozić roztwór komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po całkowitym rozmrożeniu umieść roztwór z powrotem w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aż do całkowitego zamrożenia. Powtórz w sumie 3 cykle zamrażania i rozmrażania.
  6. Wykonać test kwasu mikrobicinchoninowego (BCA) na lizacie komórkowym w różnych rozcieńczeniach (np. 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) w celu określenia stężenia białka. Rozcieńczyć lizat komórkowy do stężenia białka 468,75 μg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
    nuta: Końcowe stężenie białka w płytce 48-dołkowej wynosi 125 μg/cm2 (w przeliczeniu na powierzchnię jednego dołka, 0,75cm2).
  7. Wykonaj Western blot w celu oceny obecności DAMP w lizacie (np. białko szoku cieplnego 60 [HSP60], pole grupy wysokiej mobilności 1 [HMGB1]), ładując 40-60 μg białka lizatu w buforze ładującym na 10% żel poliakrylamidowy o grubości 1,5 mm i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami Western blot.

6. Ocena wpływu zaadsorbowanych warstw białkowych i receptorów toll-podobnych na aktywność NF-κB makrofagów

UWAGA: Aby zapoznać się ze schematem eksperymentalnego przepływu pracy i układu płyt, patrz odpowiednio Rysunek 1A i Rysunek uzupełniający 1.

  1. Hoduj makrofagi reporterowe w kolbie o odpowiedniej wielkości do 70% konfluencji. Zassać pożywkę, umyć powierzchnię PBS i odessać PBS. Dodać rekombinowany enzym dysocjacji komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 minut.
  2. Odłączyć komórki, mocno stukając w boki kolby. Dezaktywować rekombinowany enzym dysocjacji komórek, dodając równą objętość pożywki wzrostowej (zawierającej 10% FBS). Wykonaj zliczanie żywych komórek za pomocą hemocytometru i barwnika żywotności komórek.
    nuta: Oczekiwana żywotność makrofagów reporterowych po 8-minutowej inkubacji w enzymie dysocjacji komórek wynosi 90%.
  3. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w pierwotnej objętości PBS do przepłukania komórek. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 7,3 x 105 komórek/ml w pożywce testowej (zawierającej inaktywowany termicznie FBS).
  4. Oddziel zawiesinę komórkową do 3 różnych probówek: inhibitora TLR4, anty-TLR2 i nieleczonej. Inkubować komórki z 1 μg/ml inhibitorem TLR4 przez 60 minut w RT lub z 50 μg/ml anty-TLR2 przez 30 minut w RT.
  5. Dodać 200 μl lizatu, 10% FBS, 10% komercyjnego osocza myszy (tabela materiałów) lub mieszaninę roztworów białkowych do płytki 48-dołkowej (lub równoważnej) i pozostawić białko do adsorpcji w temperaturze 37 °C przez żądany czas (tj. 30 min, 60 min lub 24 h). Odessać roztwory białkowe ze studzienek, używając świeżej pipety Pasteura do każdego roztworu białkowego, i przemyć powierzchnie 250 μl PBS przez 5 minut. Powtórz w sumie 3 prania.
    nuta: Ten krok może wymagać wcześniejszego rozpoczęcia w protokole, w zależności od pożądanego czasu adsorpcji. Dostosuj odpowiednio protokół.
  6. Po okresie inkubacji z inhibitorem TLR4 lub anty-TLR2 należy ponownie zawiesić komórki pipetowane. Dodaj 200 μl roztworu komórkowego do każdej studzienki.
  7. W przypadku warunków kontroli pozytywnej TLR2 dodać Pam3CSK4 do końcowego stężenia 150 ng/ml. W przypadku warunków kontroli pozytywnej TLR4 dodać lipopolisacharyd (LPS) do końcowego stężenia 1,5 μg/ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 20 godzin.
  8. Pobrać próbkę 20 μl supernatantu z każdej studzienki i płytki w dwóch egzemplarzach do płytki 96-dołkowej. Dołączyć trzy studzienki z 20 μl pożywki do oznaczania jako kontrolę tła. Dodać 200 μl odczynnika reporterowego SEAP do każdego dołka. Przykryć płytkę uszczelką adhezyjną i inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze 37 °C.
    nuta: Czas inkubacji może się różnić w zależności od warunków doświadczalnych i powinien być zoptymalizowany pod kątem dużej różnicy w absorbancji między studzienkami kontroli dodatniej i ujemnej.
    1. Przenieść pozostałą część supernatantu do probówki o pojemności 1,5 ml (na studzienkę). Wirować przy 1,000 x g przez 10 minut, aby osadzać wszelkie zanieczyszczenia. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Analizować supernatant pod kątem obecności cytokin prozapalnych (np. TNF-α, interleukiny 6) za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).
  9. Usuń uszczelkę płytki samoprzylepnej. Odczytać absorbancję płytki za pomocą czytnika płytek przy długości fali 635 nm. Odessać płyn i wyrzucić płytkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przetestowano metody czyszczenia powierzchni pokrytych polimerem, aby upewnić się, że nie dochodzi do uszkodzenia powłoki, co objawiłoby się zmianą kąta zwilżania wodą w porównaniu do niepowlekanego szkiełka nakrywkowego (Rycina 2). Stwierdzono, że moczenie szkiełek mikroskopowych pokrytych PMMA w 70% etanolu przez 1 h powoduje usunięcie powłoki PMMA (Rycina 2, panel lewy), prawdopodobnie ze względu na rozpuszczalność PMMA w 80% wag. etanolu13<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Głównym celem naszego laboratorium jest odpowiedź gospodarza na implanty tkanek miękkich z biomateriału stałego, a w szczególności sposób, w jaki uszkodzenia komórkowe powstałe podczas procedury implantacji wpływają na odpowiedź gospodarza. Prezentowana praca opisuje wstępne eksperymenty z wykorzystaniem linii komórkowej makrofagów reporterowych i lizatu komórkowego zawierającego DAMP generowanego in vitro, w celu zbadania wpływu cząsteczek uwalnianych podczas uszkodzenia komórek (tj. w wyniku operacji implantologicznej)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za finansowanie operacyjne z Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), Queen's University Senate Advisory Research Committee oraz wsparcie infrastrukturalne od Canadian Foundation for Innovation John Evan's Leadership Fund (Projekt 34137) oraz Ministry of Research and Innovation Ontario Research Fund (Project 34137). L.A.M. było wspierane przez Queen's University R. Samuel McLaughlin Fellowship, Kanadyjska Rada ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada) – kanadyjskie stypendium dla absolwentów, nagroda dla absolwentów oraz stypendium dla absolwentów Ontario. Autorzy chcieliby podziękować dr Myronowi Szewczukowi za hojny dar linii komórek reporterowych makrofagów NF-κB/AP-1 oraz doktorom Michaelowi Blennerhassettowi i Sandrze Lourenssen za korzystanie z ich żelowego systemu obrazowania i czytnika płytek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki do hodowli komórkowych
anti-mysi/human CD282 (TLR2)Biolegend121802
CLI-095 (inhibitor TLR4)InvivogenTLRL-CLI95
C57 osocze dopełniacza K2 EDTA 10ml, innowacyjne pochodzenie z USAInnovativeResearchIGMSC57-K2 EDTA-Compl-10mlOsocze myszy
Zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco (DMEM)Sigma AldrichD6429-500ML
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Fisher Scientific14190250Bez wapnia, bez magnezu
Płodowa surowica bydlęca (FBS), klasa badawczaŻubr98150
LPS-EKInvivogenTLRL-EKLPSLipopolisacharyd z Escherichia coli K12
Fibroblasty NIH/3T3ATCCCRL-1658
Pam3CSK4Invivogentlrl-pmsSyntetyczny triacylowany lipopeptyd - ligand TLR1/2
Penicylina/streptomycynaSigma AldrichP4333-100ML
PlasmocinInvivogenANT-MPPOdczynnik do eliminacji mykoplazmy
RAW-Niebieskie komórkiInvivogenraw-spNF-κ Linia komórkowa makrofagów reporterowych B / AP-1
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Fisher Scientific15250061
Enzym ekspresji tryple (1X)Fisher Scientific12604021wolny od pochodzenia zwierzęcego rekombinowany enzym dysocjacji komórek
ZeocinInvivogenANT-ZN-1
Zestawy i testy
Płytki powlekane ELISA, mysie IL-6BiolegendB213022
Płytki powlekane ELISA, mysie TNF-αBiolegendB220233
Endotoksyna (Escherichia coli) - Kontroluj standardową endotoksynę (CSE)Współpracownicy Cape Cope Inc.E0005-5Endotoksyna do krzywej wzorcowej w chromogennym teście endotoksyn
LAL woda, 100 mlAssociates of Cape Cope Inc.WP1001Używany z testem endotoksyn chromogennych
Test białka Micro BCAFisher ScientificPI23235
Limulus Zestaw testowy na endotoksyny pirochromowejAssociates of Cape Cope, Inc.C1500-5Odczynnik do oznaczania endotoksyn chromogennych
QUANTI-Blue Pożywka do wykrywania fosfatazy alkalicznejInvivogenrep-qb2Test fosfatazy alkalicznej do pośredniego pomiaru NF-κ Aktywność B/AP-1
Odczynniki do powlekania polimerowego
Chloroform, bezwodnySigma Aldrich288306-1L
Alkohol etylowy bezwodnyAlkohole handloweP006EAANSigma: Odczynnik alkoholowy, bezwodny, 676829-1L
Proste stożkowe kleszczyki z cienką końcówkąFisher Scientific16-100-113
Rozpuszczalnik fluoroobojętny FC-40Sigma AldrichF9755-100MLFluorowany rozpuszczalnik do fPTFE
Woda klasy do hodowli komórkowych (bez endotoksyn)Fisher Scientific SH30529LS
Poli(metakrylan metylu) (PMMA)Sigma Aldrich182230-25G
Zestaw elastomerów Sylgard 184Fisher Scientific50822180
Teflon-AF (fPTFE)Sigma Aldrich469610-1GPoli[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluorometylo)-1,3-dioksol-ko-tetrafluoroetylen]
Materiały eksploatacyjne
samoprzylepneFisher ScientificAB-0580
Mikroprobówki Axygen, 1,5 mlFisher Scientific14-222-155
Fiolki scyntylacyjne ze szkła borokrzemianowego, z białymi nasadkami z polipropylenuFisher Scientific03-337-4
Przezroczysta 48-dołkowa płytka PSFisher Scientific08-772-52
Przezroczysta płytka 96-dołkowa TCPSFisher Scientific08-772-2C
Przezroczysta płytka 48-dołkowa TCPSFisher Scientific08-772-1C
Okulary nakrywkowe, kółkaFisher Scientific12-545-81
Kolby do hodowli tkankowych Sokoła, T25Fisher Scientific10-126-10
lepkie-Szkiełko 8 WellIbidi80828
Szkiełka mikroskopowe SuperfrostFisher Scientific12-550-15
Kolby poddane działaniu kultur tkankowych, T150Fisher Scientific08-772-48
Uszczelki

Bibliografia

  1. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
  2. Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
  3. Collier, T. O., Anderson, J. M. Protein and surface effects on monocyte and macrophage adhesion, maturation, and survival. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (3), 487-496 (2002).
  4. Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. Journal of Leukocyte Biology. 81 (1), 1-5 (2007).
  5. McKiel, L. A., Fitzpatrick, L. E. Toll-like Receptor 2-Dependent NF-κB/AP-1 Activation by Damage-Associated Molecular Patterns Adsorbed on Polymeric Surfaces. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3792-3801 (2018).
  6. Babensee, J. E. Interaction of dendritic cells with biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 101-108 (2008).
  7. Sintes, J., Romero, X., de Salort, J., Terhorst, C., Engel, P. Mouse CD84 is a pan-leukocyte cell-surface molecule that modulates LPS-induced cytokine secretion by macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 88 (4), 687-697 (2010).
  8. Tom, J. K., Mancini, R. J., Esser-Kahn, A. P. Covalent modification of cell surfaces with TLR agonists improves and directs immune stimulation. Chemical Communications. 49 (83), 9618-9620 (2013).
  9. Abdulkhalek, S., et al. Neu1 sialidase and matrix metalloproteinase-9 cross-talk is essential for toll-like receptor activation and cellular signaling. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36532-36549 (2011).
  10. Gorbet, M. B., Sefton, M. V. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 26 (34), 6811-6817 (2005).
  11. Xing, Z., Pabst, M. J., Hasty, K. A., Smith, R. A. Accumulation of LPS by polyethylene particles decreases bone attachment to implants. Journal of Orthopaedic Research. 24 (5), 959-966 (2006).
  12. Ding, H., et al. Comparison of the cytotoxic and inflammatory responses of titanium particles with different methods for endotoxin removal in RAW264.7 macrophages. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 23 (4), 1055-1062 (2012).
  13. Hoogenboom, R., Becer, C. R., Guerrero-Sanchez, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Solubility and thermoresponsiveness of PMMA in alcohol-water solvent mixtures. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1173-1178 (2010).
  14. Efimenko, K., Wallace, W. E., Genzer, J. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 254 (2), 306-315 (2002).
  15. Godek, M. L., Sampson, J. A., Duchsherer, N. L., McElwee, Q., Grainger, D. W. Rho GTPase protein expression and activation in murine monocytes/macrophages is not modulated by model biomaterial surfaces in serum-containing in vitro cultures. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 17 (10), 1141-1158 (2006).
  16. Park, J. S., et al. Involvement of Toll-like Receptors 2 and 4 in Cellular Activation by High Mobility Group Box 1 Protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (9), 7370-7377 (2004).
  17. Ohashi, K., Burkart, V., Flohé, S., Kolb, H. Cutting Edge: Heat Shock Protein 60 Is a Putative Endogenous Ligand of the Toll-Like Receptor-4 Complex. The Journal of Immunology. 164 (2), 558-561 (2000).
  18. Wong, T., McGrath, J. A., Navsaria, H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. British Journal of Dermatology. 156 (6), 1149-1155 (2007).
  19. van Wachem, P. B., et al. The influence of protein adsorption on interactions of cultured human endothelial cells with polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 21 (6), 701-718 (1987).
  20. Miller, K. M., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage activation and interleukin 1 generation by biomedical polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 22 (8), 713-731 (1988).
  21. Bonfield, T. L., Colton, E., Anderson, J. M. Plasma protein adsorbed biomedical polymers: Activation of human monocytes and induction of interleukin 1. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (6), 535-548 (1989).
  22. González, O., Smith, R. L., Goodman, S. B. Effect of size, concentration, surface area, and volume of polymethylmethacrylate particles on human macrophages in vitro. Journal of Biomedical Materials Research. 30 (4), 463-473 (1996).
  23. Anderson, J. M., et al. Protein adsorption and macrophage activation on polydimethylsiloxane and silicone rubber. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 7 (2), 159-169 (1995).
  24. Lord, M. S., Foss, M., Besenbacher, F. Influence of nanoscale surface topography on protein adsorption and cellular response. Nano Today. 5 (1), 66-78 (2010).
  25. Chen, S., et al. Characterization of topographical effects on macrophage behavior in a foreign body response model. Biomaterials. 31 (13), 3479-3491 (2010).
  26. Shen, M., Horbett, T. A. The effects of surface chemistry and adsorbed proteins on monocyte/macrophage adhesion to chemically modified polystyrene surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 57 (3), 336-345 (2001).
  27. Love, R. J., Jones, K. S. The recognition of biomaterials: Pattern recognition of medical polymers and their adsorbed biomolecules. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (9), 2740-2752 (2013).
  28. McNally, A. K., Anderson, J. M. Phenotypic expression in human monocyte-derived interleukin-4-induced foreign body giant cells and macrophages in vitro: Dependence on material surface properties. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1380-1390 (2015).
  29. Gambhir, V., et al. The TLR2 agonists lipoteichoic acid and Pam3CSK4 induce greater pro-inflammatory responses than inactivated Mycobacterium butyricum. Cellular Immunology. 280 (1), 101-107 (2012).
  30. Suzuki, O., Yagishita, H., Yamazaki, M., Aoba, T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Octacalcium Phosphate and its Hydrolyzates. Cells and Materials. 5 (1), 45-54 (1995).
  31. Johnston, R. L., Spalton, D. J., Hussain, A., Marshall, J. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 25 (8), 1109-1115 (1999).
  32. Jin, J., Jiang, W., Yin, J., Ji, X., Stagnaro, P. Plasma proteins adsorption mechanism on polyethylene-grafted poly(ethylene glycol) surface by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 29 (22), 6624-6633 (2013).
  33. Swartzlander, M. D., et al. Linking the foreign body response and protein adsorption to PEG-based hydrogels using proteomics. Biomaterials. 41, 26-36 (2015).
  34. Chamberlain, M. D., et al. Unbiased phosphoproteomic method identifies the initial effects of a methacrylic acid copolymer on macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (34), 10673-10678 (2015).
  35. Dillman, W. J., Miller, I. F. On the adsorption of serum proteins on polymer membrane surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 44 (2), 221-241 (1973).
  36. Ishihara, K., Ziats, N. P., Tierney, B. P., Nakabayashi, N., Anderson, J. M. Protein adsorption from human plasma is reduced on phospholipid polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (11), 1397-1407 (1991).
  37. Warkentin, P., Wälivaara, B., Lundström, I., Tengvall, P. Differential surface binding of albumin, immunoglobulin G and fibrinogen. Biomaterials. 15 (10), 786-795 (1994).
  38. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 33 (5), 443-454 (2010).
  39. Zhang, Y., Karki, R., Igwe, O. J. Toll-like receptor 4 signaling: A common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 (HMGB1) protein-coupled activation. Biochemical Pharmacology. 98 (1), 132-143 (2015).
  40. Mizel, S. B., Honko, A. N., Moors, M. A., Smith, P. S., West, A. P. Induction of macrophage nitric oxide production by Gram-negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll-like receptor 5/Toll-like receptor 4 complexes. Journal of Immunology. 170 (12), 6217-6223 (2003).
  41. Das, N., et al. HMGB1 Activates Proinflammatory Signaling via TLR5 Leading to Allodynia. Cell Reports. 17 (4), 1128-1140 (2016).
  42. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 Receptor Differentially Couples to Distinct Release Pathways for IL-1β in Mouse Macrophage. The Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  43. Tak, P. P., Firestein, G. S. NF-κB: A key role in inflammatory diseases. Journal of Clinical Investigation. 107 (1), 7-11 (2001).
  44. Ashkenazi, A., Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281 (5381), 1305-1308 (1998).
  45. Erridge, C. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants. Journal of Leukocyte Biology. 87 (6), 989-999 (2010).
  46. Feng, Y., et al. A macrophage-activating, injectable hydrogel to sequester endogenous growth factors for in situ angiogenesis. Biomaterials. 134, 128-142 (2017).
  47. Lonez, C., et al. Cationic lipid nanocarriers activate Toll-like receptor 2 and NLRP3 inflammasome pathways. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 10 (4), 775-782 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Reporter NF-kB AP-1sygnalizacja receptorów Toll-podobnychtest komórek makrofagówtest reporterowy SEAPanaliza cytometrycznaekspresja genów qPCRanaliza Western Blotanaliza cytokin ELISA
Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.