Artykuł metodologiczny

Zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie

DOI:

10.3791/60323

⸱

31 października 2019

 ,  ,  , 
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie opisuje mikroskopowe monitorowanie przylegania pneumokoków do ciągów czynnika von Willebranda wytwarzanych na powierzchni zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających w określonych warunkach przepływu. Protokół ten można rozszerzyć o szczegółową wizualizację określonych struktur komórkowych i kwantyfikację bakterii poprzez zastosowanie różnicowych procedur barwienia immunologicznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcja Streptococcus pneumoniae z powierzchnią komórek śródbłonka odbywa się za pośrednictwem przepływu krwi za pośrednictwem białek mechanowrażliwych, takich jak czynnik von Willebranda (VWF). Ta glikoproteina zmienia swoją konformację molekularną w odpowiedzi na naprężenia ścinające, odsłaniając w ten sposób miejsca wiązania dla szerokiego spektrum interakcji gospodarz-ligand. Ogólnie rzecz biorąc, wiadomo, że hodowla pierwotnych komórek śródbłonka pod określonym przepływem ścinającym sprzyja specyficznemu różnicowaniu komórkowemu i tworzeniu stabilnej i ściśle połączonej warstwy śródbłonka przypominającej fizjologię wewnętrznej wyściółki naczynia krwionośnego. W związku z tym funkcjonalna analiza interakcji między patogenami bakteryjnymi a układem naczyniowym gospodarza z udziałem białek wrażliwych na mechanizm wymaga ustanowienia systemów pomp, które mogą symulować fizjologiczne siły przepływu, o których wiadomo, że wpływają na powierzchnię komórek naczyniowych.

Urządzenie mikroprzepływowe użyte w tym badaniu umożliwia ciągłą i bezpulsacyjną recyrkulację płynów o określonym natężeniu przepływu. Sterowany komputerowo system pomp ciśnieniowych powietrza wywiera określone naprężenie ścinające na powierzchnie komórek śródbłonka, generując ciągły, jednokierunkowy i kontrolowany przepływ medium. Zmiany morfologiczne komórek i przyczepienia bakterii mogą być monitorowane mikroskopowo i określane ilościowo w przepływie za pomocą specjalnych szkiełek kanałowych, które są przeznaczone do wizualizacji mikroskopowej. W przeciwieństwie do statycznego zakażenia hodowli komórkowej, które na ogół wymaga utrwalenia próbki przed znakowaniem immunologicznym i analizami mikroskopowymi, szkiełka mikroprzepływowe umożliwiają zarówno oparte na fluorescencji wykrywanie białek, bakterii i składników komórkowych po utrwaleniu próbki; seryjne barwienie immunofluorescencyjne; i bezpośrednia detekcja oparta na fluorescencji w czasie rzeczywistym. W połączeniu z bakteriami fluorescencyjnymi i specyficznymi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie, ta procedura infekcji zapewnia wydajny wieloskładnikowy system wizualizacji dla szerokiego spektrum zastosowań naukowych związanych z procesami naczyniowymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogeneza zakażeń pneumokokami charakteryzuje się wieloaspektową interakcją z różnorodnymi związkami macierzy zewnątrzkomórkowej i składnikami ludzkiej hemostazy, takimi jak plazminogen i VWF1,2,3,4,5,6,7,8. Wielodomenowa glikoproteina VWF służy jako kluczowy regulator zrównoważonej hemostazy, pośrednicząc w rekrutacji trombocytów i inkorporacji fibryny w miejscu tworzenia się skrzepliny naczyniowej9. O znaczeniu funkcjonalnego, aktywnego VWF dla tamowania krwawień i gojenia się ran świadczy choroba von Willebranda, powszechne dziedziczne zaburzenie krzepnięcia10.

Kulisty VWF krąży w ludzkim układzie krwionośnym w stężeniu do 14,0 μg/mL11,10. W odpowiedzi na uszkodzenie naczyń krwionośnych, miejscowe uwalnianie VWF przez śródbłonkowe ciała Weibel Palade (WBP) jest znacznie zwiększone11,12. Wcześniejsze badania wykazały, że przyleganie pneumokoków do ludzkich komórek śródbłonka i wytwarzanie przez nie toksyny tworzącej pory pneumolizyny znacząco stymuluje wydzielanie światła VWF13. Siły hydrodynamiczne przepływu krwi indukują strukturalne otwarcie mechanofesalnych domen VWF. Przy natężeniu przepływu 10 dyn/cm2 VWF multimeryzuje do długich ciągów białkowych o długości do kilkuset mikrometrów, które pozostają przyłączone do podśródbłonka 10,12.

Aby zrozumieć funkcję multimeryzowanych łańcuchów VWF generowanych pod wpływem naprężeń ścinających w interakcji pneumokoków z powierzchnią śródbłonka, ustalono podejście do infekcji mikroprzepływowej hodowli komórek. Zastosowano urządzenie mikroprzepływowe z systemem pomp ciśnieniowych sterowanym programowo. Umożliwiło to ciągłą, jednokierunkową recyrkulację pożywki do hodowli komórkowych o określonym natężeniu przepływu. W ten sposób system przyłożył określone naprężenie ścinające na powierzchnię komórek śródbłonka, które pozostały przymocowane do specjalistycznych szkiełek kanałowych. Podejście to umożliwiło symulację siły ścinającej w krwiobiegu ludzkiego układu naczyniowego, w którym łańcuchy VWF są generowane na zróżnicowanych komórkach śródbłonka w określonych warunkach stałego przepływu. W tym celu komórki śródbłonka hodowano w specyficznych szkiełkach kanałowych (patrz tabela materiałów), które przystosowano do analiz mikroskopowych podczas przepływu. System pomp mikroprzepływowych zapewnił wysoce zdefiniowaną i kontrolowaną sytuację naprężeń ścinających, niezbędną do tworzenia wydłużonych ciągów VWF na zlewającej się warstwie komórek śródbłonka. Po stymulacji wydzielania VWF zlewających się ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) poprzez suplementację histaminą, tworzenie się strun zostało wywołane przez zastosowanie naprężenia ścinającego (Ɏ) 10 dyn / cm2. Naprężenie ścinające definiuje się jako siłę działającą na warstwę komórkową. Oblicza się go w przybliżeniu według Cornish et. al.14 z równaniem 1:
figure-introduction-1

Gdzie ɏ = naprężenie ścinające w dyn/cm2, η = lepkość w (dyn∙s)/cm2, h = połowa wysokości kanału, w = połowa szerokości kanału, a Φ = natężenie przepływu w ml/min.

Wynik równania 1 zależy od różnych wysokości i szerokości różnych użytych slajdów (zobacz Tabela materiałów). W tym badaniu zastosowano szkiełko z kanałem Luer o wielkości 0,4 μm, co dało współczynnik poślizgu komory wynoszący 131,6 (patrz wzór 2).
figure-introduction-2

Lepkość medium w temperaturze 37 °C wynosi 0,0072 dyn∙s/cm², a naprężenie ścinające 10 dyn/cm² zostało użyte. Dało to natężenie przepływu 10,5 ml/min (patrz wzór 3).
figure-introduction-3

Tutaj szczegółowo opisano adaptację i postęp procedury hodowli komórek mikroprzepływowych przy użyciu jednokierunkowego systemu przepływu laminarnego do badania i wizualizacji mechanizmów infekcji bakteryjnych w układzie naczyniowym gospodarza. Wytwarzanie ciągów VWF na warstwach śródbłonka może być również stymulowane za pomocą innych systemów pompowych, które są w stanie zastosować ciągłe i stałe naprężenie ścinające15.

Po wyhodowaniu pierwotnych komórek śródbłonka do zbiegu w przepływie i stymulacji tworzenia łańcuchów VWF, pneumokoki eksprymujące białko czerwonej fluorescencji (RFP)16 zostały dodane do warstwy komórek śródbłonka pod stałą kontrolą mikroskopową. Przyczepianie się bakterii do sznurków VWF na powierzchni komórek śródbłonka wizualizowano mikroskopowo i monitorowano przez okres do trzech godzin w czasie rzeczywistym przy użyciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie specyficznych dla VWF. Dzięki takiemu podejściu określono rolę VWF jako kofaktora adhezyjnego promującego przyczepianie się bakterii do śródbłonka naczyń krwionośnych8.

Oprócz mikroskopijnej wizualizacji wydzielania białek i zmian konformacyjnych, ta metoda może być wykorzystana do monitorowania pojedynczych etapów procesów infekcji bakteryjnej w czasie rzeczywistym oraz do ilościowego określenia ilości dołączonych bakterii w różnych punktach czasowych infekcji. Specjalny system pomp sterowany programowo zapewnia również możliwość hodowli komórek śródbłonka w określonych warunkach stałego przepływu przez okres do kilku dni i umożliwia zdefiniowaną inkubację z przepływem impulsowym. Co więcej, tę metodę można zastosować przy użyciu różnych typów komórek. Dostosowanie protokołu barwienia umożliwia również wykrywanie i wizualizację bakterii zinternalizowanych w komórkach eukariotycznych.

Ten manuskrypt opisuje ten zaawansowany protokół eksperymentalny, który może być używany jako zdefiniowane, niezawodne i powtarzalne podejście do efektywnej i wszechstronnej charakterystyki procesów patofizjologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla komórek mikroprzepływowych została przeprowadzona za pomocą komercyjnych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Firma wyizolowała komórki za świadomą zgodą dawcy. Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Izby Lekarskiej Kraju Związkowego Badenia-Wirtembergia pod numerem referencyjnym 219-04.

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby zapoznać się z protokołem.

1. Wstępna hodowla pierwotnych komórek śródbłonka

  1. Delikatnie rozmrozić zamrożoną fiolkę z glicerolem zawierającą 1 x 105 pierwotnych HUVEC od trzech różnych dawców w temperaturze 37 °C i umieścić komórki w 7 ml wstępnie podgrzanej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (ECGM, gotowa do użycia z suplementami) w kolbieo średnicy 2 2 cm.
    nuta: Pierwotne komórki śródbłonka tracą zdolność różnicowania po więcej niż 5 cyklach proliferacji. Dlatego tylko komórki z mniej niż 5 pasażami mogą być używane, jeśli wymagane są wysokie stopnie różnicowania komórek.
  2. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 przez 60 minut, aby umożliwić przyłączenie do powierzchni i wymianę pożywki do hodowli komórkowej ECGM w celu pozbycia się pozostałości po kriokonserwacji.
  3. Kontynuować hodowlę komórek w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 , aż utworzą one subkonfluentną warstwę komórkową.
    nuta: HUVEC nie może rozrastać się do warstwy zlewającej się, ponieważ ścisłe kontakty komórka-komórka uniemożliwiają tworzenie się stabilnej warstwy komórkowej w późniejszym przepływie.

2. Prekultura Streptococcus pneumoniae

UWAGA: Streptococcus pneumoniae jest czynnikiem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 i może być hodowany tylko w laboratoriach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Używaj czystej ławki sklasyfikowanej dla poziomu bezpieczeństwa 2 dla wszystkich zabiegów bakteryjnych, ściśle unikaj tworzenia się aerozoli i używaj wirówki z ochroną aerozolową do sedymentacji bakterii.

  1. Zaszczepić płytkę agaru z krwią Columbia klinicznym izolatem Streptococcus pneumoniae pochodzącym ATCC11733 z glicerolu przechowywanego stale w temperaturze -80 °C i hodować płytkę agarową przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Przygotuj 40 ml płynnego bulionu Todd Hewitt uzupełnionego 1% ekstraktem drożdżowym (THY) i 15 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4 do hodowli bakterii i mycia.
  3. Użyj sterylnej probówki do hodowli bakterii i zaszczep płynny bulion kulturowy masą bakteryjną. Kontrolować ilość inokulacji przez pomiar fotometryczny 1 ml podwielokrotności przy 600 nm w stosunku do nieinokulowanego bulionu płynnego jako odniesienia. Wlej masę bakteryjną do płynnego bulionu, aż osiągnie gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) wynoszącą 0,15.
  4. Inkubować zaszczepiony płynny bulion bez wstrząsania w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i oznaczać OD600 co 30 minut, odmierzając 1 ml porcji za pomocą plastikowych kuwet.
  5. Gdy tylko kultura bakteryjna osiągnie OD600 0,4, co odpowiada fazie wzrostu wykładniczego, należy odwirować zawiesinę kultur bakteryjnych przez 10 minut przy 1,000 x g w temperaturze pokojowej (RT).
    nuta: Nie należy dopuścić do tego, aby kultura pneumokoków osiągnęła OD600 większy niż 1,0, ponieważ wiadomo, że wysoka gęstość hodowli pneumokoków wywołuje autolizę bakterii, co może wpływać na ogólną sprawność bakterii.
  6. Delikatnie zawiesić osad bakteryjny za pomocą 10 ml PBS i ponownie osadzać się przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze pokojowej.
  7. Delikatnie zawiesić przemyty osad bakteryjny w 1 ml PBS i oznaczyć OD600 z 10 μl zawiesiny bakteryjnej, używając 1 ml PBS jako odniesienia.
  8. Dostosuj ilość bakterii w PBS do OD600 wynoszącej 2,0. Zgodnie z wcześniej ustalonym zliczaniem bakterii, OD600 wynoszący 2,0 odpowiada 2 x 109 jednostkom tworzącym kolonie (CFU). Natychmiast przystąp do procedury infekcji, aby zapobiec autolizie bakteryjnej.

3. Hodowla komórek śródbłonka HUVEC w warunkach mikroprzepływowych

  1. Odłączyć pierwotne komórki śródbłonka od kolby hodowli komórkowej za pomocą kontrolowanej proteolizy. Wykonaj następujące czynności w sterylnym środowisku przy użyciu czystej ławki. Przygotować objętość 15 ml sterylnego PBS na etapy mycia.
    1. Usunąć EKG z niezlewnie rosnącej warstwy HUVEC i przemyć warstwę komórkową 10 ml PBS za pomocą pipety serologicznej, aby pozbyć się pożywki do hodowli komórkowych.
    2. Inkubować przemyty HUVEC z 3 ml wstępnie podgrzanego roztworu do dysocjacji komórek o temperaturze 37 °C w temperaturze 37 °C przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Obserwuj odrywanie komórek proteolitycznych poprzez monitorowanie mikroskopowe co minutę.
    3. Odpipetować zawiesinę oddzielonych komórek do probówki zawierającej 7 ml ECGM uzupełnionej 2% płodową surowicą cielęcą (FCS) w celu zatrzymania proteolizy i osadzać komórki przez 3 minuty przy 220 x g w temperaturze pokojowej.
    4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić HUVEC w 250 μl ECGM uzupełnionym 5% FCS i 1 mMMgSO4. Użyć 10 μl zawiesiny komórek do zliczania komórek za pomocą komory do liczenia komórek Neubauera i dostosować liczbę komórek do 4 x 106 komórek/ml ECGM uzupełnionych 5% FCS i 1 mM MgSO4,
      nuta: Do każdego eksperymentu przepływowego wymagane będzie 30 ml pożywki EKG uzupełnionej 5% FCS i 1 mMMgSO4. Od tego momentu ta kompozycja pożywki jest nazywana ECGMS-medium. Wzrost stężenia FCS w pożywce hodowlanej z 2% do 5% wspomaga przyczepianie się komórek i żywotność komórek HUVEC wysiewanych na szkiełku kanałowym. Suplementy pożywki FCS iMgSO4 znacznie stabilizują przyłączanie komórek HUVEC w warunkach naprężeń ścinających.
  2. Wysiewaj i uprawiaj HUVEC na zjeżdżalni kanałowej. Pracuj w sterylnym środowisku przy użyciu czystego stołu. Komórki będą hodowane w warunkach stresu ścinającego przez 2 dni, a następnie przez kolejne 2 godziny poddawane jest zakażeniu bakteriami i monitorowaniu mikroskopowemu.
    1. Przez 24 godziny w inkubatorze z 5% atmosferąCO2 w temperaturze 37 °C należy zrównoważyć szkiełko kanałowe, zestaw perfuzyjny o średnicy 1,6 mm i długości 50 cm, podwielokrotność pożywki ECGMS oraz szkiełko kanałowe Luer o wysokości 0,4 μm w celu zmniejszenia liczby pęcherzyków powietrza.
      nuta: Ta procedura jest zalecana do odgazowania plastikowego sprzętu i wstępnego podgrzania medium, rurek perfuzyjnych i zbiorników. Jeśli materiały lub płyny były przechowywane w temperaturze pokojowej lub w lodówce, gazy rozpuszczone w plastiku i cieczach zostaną uwolnione po podgrzaniu w inkubatorze podczas eksperymentu. Pojawią się wtedy pęcherzyki gazu. Odgazowanie wszystkich plastikowych elementów przed eksperymentem wyeliminuje ten efekt. Za każdym razem, gdy system jest wyjmowany z inkubatora, proces absorpcji gazu rozpoczyna się od nowa. Dlatego należy pracować szybko w RT i nigdy nie pozostawiać jednostki fluidycznej poza inkubatorem przez dłuższy czas.
    2. Za pomocą pipety wstrzyknąć 100 μl 2% sterylnie przefiltrowanego roztworu żelatyny wieprzowej w roztworze PBS do jednego ze zbiorników szkiełka kanałowego o zrównoważonej temperaturze. Inkubować roztwór żelatyny przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i przepłukać kanał szkiełka 1 ml PBS w sterylnych warunkach za pomocą strzykawki Luer o pojemności 1 ml.
    3. Umieść pokrytą żelatyną prowadnicę kanałową na cienkiej płycie z polistyrenu lub styropianu, aby zapobiec spadkowi temperatury szkiełka. Dodać 100 μl zawiesiny 4 x 106/mL HUVEC ze strzykawką Luer o pojemności 1 ml do szkiełka.
      nuta: Umieszczenie suwaka kanałowego na zimnej metalowej powierzchni czystej ławki może obniżyć temperaturę dna zjeżdżalni, generując w ten sposób stres zimna w komórkach śródbłonka. Podczas pipetowania komórek należy przytrzymać szkiełko nieco do góry, aby pęcherzyki powietrza uniosły się i zniknęły z wnętrza szkiełka.
    4. Inkubować szkiełko kanałowe za pomocą HUVEC przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i napełnić zbiorniki pożywki na obu końcach szkiełka kanałowego 60 μl ECGMS każdy. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Dostosuj pompę mikroprzepływową i ustawienia oprogramowania.
    1. Podłączyć zestaw do perfuzji równowagi do zespołu pompy, napełnić 13,6 ml pożywki ECGMS i uruchomić oprogramowanie sterujące pompą. Wybierz odpowiedni zestaw perfuzyjny i typ szkiełka komorowego za pomocą przewijanych w dół okienek w menu konfiguracji zespołu fluidycznego. Wybierz 0,007 (dyn∙s/cm2) w oprogramowaniu dla średniej lepkości. (Patrz ustawienia oprogramowania pompy ciśnieniowej oznaczone czerwonymi strzałkami na rysunku uzupełniającym 1).
    2. Na zewnątrz inkubatora podłącz szklaną butelkę wypełnioną suszącymi kulkami krzemionki do rurki ciśnieniowej powietrza (patrz Rysunek 1, Wstawka 3). Powietrze pompy ciśnieniowej krąży między zbiornikami perfuzyjnymi a pompą i musi być suche przed ponownym wejściem do urządzenia pompy. Wybierz Parametry przepływu w menu oprogramowania, ustaw ciśnienie na 40 mbar i przepłucz rurki pompy ciekłym medium, uruchamiając ciągły przepływ medium. (Ustawienia te są również oznaczone czerwonymi strzałkami na rysunku uzupełniającym 1).
    3. Zaprogramuj żądane cykle naprężeń ścinających w uprawie przepływu. Zacznij od 5 dyn/cm2, kontroluj zrównoważone pompowanie w zbiorniku i upewnij się, że w układzie pompy nie krążą pęcherzyki powietrza.
      nuta: Naprężenie ścinające ścianki w ślizgu kanałowym zależy od natężenia przepływu i lepkości medium perfuzyjnego. W przypadku korzystania z innego systemu pompowego należy zapoznać się z równaniami opisanymi we wprowadzeniu, aby ustawić natężenie przepływu generujące żądany poziom naprężenia ścinającego. Opisane ustawienia odpowiadają natężeniu przepływu wynoszącemu 5,42 ml/min. (Przykładowy zrzut ekranu przedstawiający odpowiednie ustawienia parametrów przepływu w oprogramowaniu pompy ciśnieniowej pokazano na rysunku uzupełniającym 2).
    4. Zatrzymaj cyrkulację przepływu w oprogramowaniu sterującym pompą i utrzymuj przepływ medium w rurce perfuzyjnej, zaciskając rurki w pobliżu połączeń Luer. Podłączyć suwak kanałowy, unikając w ten sposób pęcherzyków powietrza, i umieścić jednostkę fluidyczną z podłączoną prowadnicą kanałową w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Rozpocznij naprężenie ścinające od 5 dyn/cm2 przez 30 minut, aby płynnie dostosować komórki do sił generowanych przez naprężenie ścinające przed przyspieszeniem poziomu naprężenia ścinającego (patrz rysunek uzupełniający 3).
      nuta: Należy uważać, aby po podłączeniu do systemu rurowego nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza w systemie rurowym lub w prowadnicy, ponieważ ruch pęcherzyków powietrza w przepływie może prowadzić do oderwania komórek.
    5. Przyspiesz naprężenie ścinające do 10 dyn/cm2 (co odpowiada 10,86 ml/min w tym ustawieniu przepływu) i inkubuj suwak kanałowy w ciągłym naprężeniu ścinającym przez 48 godzin w małym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby umożliwić różnicowanie komórek (odpowiednie ustawienia oprogramowania są oznaczone czerwonymi strzałkami na rysunku uzupełniającym 4).
      nuta: Komórki HUVEC mają tendencję do odrywania się od powierzchni kanału, jeśli uprawa przepływowa jest bezpośrednio rozpoczynana przy 10 dyn/cm2. Komórki pozostają przymocowane do powierzchni komory, jeśli hodowla przepływowa zostanie rozpoczęta przy mniejszym naprężeniu ścinającym przy użyciu 5 dyn/cm2 przez co najmniej 30 minut, a następnie powoli zwiększa się naprężenie ścinające, aż do pożądanej wartości 10 dyn/cm2. Naprężenie ścinające 10 dyn/cm2 jest minimalną wartością w tym ustawieniu perfuzji wymaganą do tworzenia strun VWF.
    6. Po 24 godzinach hodowli komórek mikroprzepływowych należy zatrzymać przepływ medium za pomocą oprogramowania sterującego pompą dokładnie wtedy, gdy w obu zbiornikach medium zostanie osiągnięty zrównoważony poziom. Umieścić jednostkę fluidyczną na czystej ławie i usunąć 10 ml krążącej pożywki uprawowej ze zbiorników perfuzyjnych za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Dodać 10 ml pożywki ECGMS do zbiorników w celu odnowienia pożywki, umieścić jednostkę fluidyczną z powrotem w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i wznowić uprawę fluidyczną za pomocą oprogramowania sterującego pompą.
      nuta: Działanie pompy ciśnieniowej może zostać nagle zakłócone przez maszyny laboratoryjne, takie jak duże wirówki, które mogą powodować silne zakłócenia pola magnetycznego. To nagłe zakłócenie może prowadzić do oderwania komórek. Należy uważać, aby takie maszyny nie były aktywne w pobliżu pompy ciśnieniowej podczas eksperymentu.
    7. Rozpocząć wstępne podgrzewanie komory inkubacyjnej obejmującej stolik mikroskopu fluorescencyjnego do temperatury 37 °C w celu wyrównania temperatury na 24 godziny przed wizualizacją mikroskopową. Po wstępnym podgrzaniu mikroskopu uruchom sterowanie oprogramowaniem mikroskopu i dostosuj główne ustawienia monitorowania mikroskopu fluorescencyjnego, wybierając odpowiednie ustawienia filtra (540 nm/590 nm do wykrywania bakterii wykazujących ekspresję RFP i 470 nm/515 nm do wykrywania emisji fluoresceiny przeciwciał specyficznych dla VWF sprzężonych z FITC). Podgrzać dodatkową komorę grzewczą do inkubacji jednostki fluidalnej w temperaturze 37 °C.
      nuta: Podczas analiz infekcji i monitorowania mikroskopowego temperatura szkiełka kanałowego i krążącego medium nie powinna znacznie spadać, ponieważ spowodowałoby to stres zimny w komórkach. Ogólnie rzecz biorąc, rozmiar komór temperaturowych pokrywających stolik mikroskopu nie jest wystarczający, aby pokryć całą jednostkę fluidyczną. Dlatego zaleca się stosowanie dodatkowej komory grzewczej podgrzanej do temperatury 37 °C.
    8. W celu wizualizacji mikroskopowej należy umieścić jednostkę fluidyczną w wstępnie podgrzanej komorze grzewczej o temperaturze 37 °C i umieścić szkiełko kanałowe na stoliku mikroskopu o temperaturze 37 °C.
      nuta: W celu wizualizacji mikroskopowej jednostka płynowa i szkiełko kanałowe musiały zostać usunięte z inkubatora CO2 ze względu na ograniczoną długość rurki perfuzyjnej. Jeżeli czas infekcji i monitorowanie mikroskopowe dłuższe niż 180 minut są wymagane poza atmosferą 5% CO2 w celu buforowania pH, do hodowli mikroprzepływowej należy użyć pożywki buforowanej pH.
    9. Kontroluj morfologię komórek i integralność warstwy HUVEC przed wstrzyknięciem histaminy i bakterii do krążenia przepływu przez cały czas eksperymentu przepływu i po zakończeniu eksperymentu przepływowego przy użyciu trybu jasnego pola mikroskopu.

4. Indukcja uwalniania VWF i wizualizacja zmultimeryzowanych ciągów VWF

  1. Utrzymuj ustawienie przepływu, ponieważ naprężenie ścinające 10 dyn/cm2 jest wymagane do wyzwolenia multimeryzacji VWF do długich ciągów do 200 MDa. Wywołać uwalnianie VWF ze śródbłonka WPB, wstrzykując 136 μl 100 mM roztworu podstawowego histaminy do pożywki ECGMS krążącej w rurkach perfuzyjnych za pomocą portu do wstrzykiwań. Końcowe stężenie histaminy w środowisku przepływowym wyniesie 1 mM. Jeśli port do wstrzykiwań nie jest dostępny, histaminę można dodać alternatywnie, pipetując do pożywki w zbiornikach pompy.
  2. W celu immunofluorescencyjnego wykrywania multimeryzowanych strun VWF należy zatrzymać przepływ po osiągnięciu zrównoważonego poziomu pożywki w zbiornikach i wstrzyknąć 20 μg przeciwciała sprzężonego z FITC specyficznego dla VWF w objętości 200 μl PBS (pH 7,4) do krążących 13,6 ml pożywki ECGMS za pomocą portu iniekcyjnego. Jeśli port do wstrzykiwań nie jest dostępny, przeciwciało można dodać alternatywnie, pipetując do pożywki znajdującej się w zbiornikach pompy. Daje to końcowe stężenie przeciwciał 1,3 μg/ml.
  3. Do skanowania mikroskopowego kilku pól widzenia w krótkim czasie należy użyć jednostki fluorescencyjnej mikroskopu z urządzeniem do fluorescencji ksenonowej o mocy 30% i kamerą epifluorescencyjną. Monitoruj kształt i morfologię warstwy HUVEC w trybie jasnego pola, aby wybrać reprezentatywne komórki odpowiednie do wizualizacji ciągów VWF.
  4. Aby uwidocznić ciągi fluorescencji VWF na zielono, wybierz obiektyw olejowy 63x/1,40 i filtr detekcyjny 470 nm w menu jednostki fluorescencji w oprogramowaniu mikroskopu (LasX). Twórz migawki stosów Z z co najmniej 50 reprezentatywnymi widokami pola, z których każdy zawiera około 10 morfologicznie nienaruszonych HUVEC. W celu ilościowego określenia ciągów VWF z zielonej fluorescencji w różnych punktach czasowych należy zeskanować kilka pól widzenia.

5. Mikroskopowa ocena przyczepiania się bakterii do ciągów VWF w przepływie w czasie rzeczywistym

  1. Ilościowe określenie przyczepiania się pneumokoków do strun VWF generowanych na powierzchni komórek HUVEC za pomocą detekcji immunofluorescencyjnej.
    1. Wstrzymać przepływ i wstrzyknąć 1,35 x 108 jtk/ml pneumokoków wykazujących ekspresję RFP w maksymalnej objętości 1 ml do pożywki ECGMS za pomocą portu iniekcyjnego. Alternatywnie, odpipetować bakterie do pożywki w zbiorniku pompy. Ponownie uruchomić naprężenie ścinające przy 10 dyn/cm2, aby bakterie mogły krążyć w układzie pompy.
    2. Wybierz obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 63x do powiększenia mikroskopu i dostosuj ustawienia filtra fluorescencyjnego w oprogramowaniu mikroskopu do kanału RFP (filtr detekcyjny 540 nm) w celu wykrywania pneumokoków wykazujących ekspresję RFP.
    3. W celu ilościowego określenia przyczepiania się bakterii do ciągów VWF, zatrzymaj przepływ i utwórz migawki stosów Z z co najmniej 30 reprezentatywnych widoków pola, z których każdy zawiera około 10 morfologicznie nienaruszonych HUVEC, a następnie policz ilość pneumokoków.
    4. W celu oceny danych należy użyć algorytmu statystyki jednoczynnikowej ANOVA, a następnie przeprowadzić post hoc dwustronny test próby niesparowanej w celu szczegółowego porównania statystycznego. Wartości P wynoszące <0,05 uznano za istotne statystycznie.

6. Mikroskopowa ocena przyczepiania się bakterii do ciągów VWF po utrwaleniu próbki

  1. Pobrać próbkę utrwalenia przed barwieniem immunofluorescencyjnym.
    1. Zatrzymaj przepływ, usuń 10 ml pożywki ECGMS ze zbiorników pompy i dodaj 10 ml PBS uzupełnionego 5% paraformaldehydem (PFA). Pozwól roztworowi PFA krążyć przez 10 minut przy naprężeniu ścinającym 10 dyn/cm2.
    2. Odłączyć suwak kanału od zespołu pompy.
  2. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania na powierzchni komórki i wykonaj immunodetekcję ciągów VWF i przyłączonych bakterii.
    1. Przygotować 4 ml roztworu myjącego zawierającego 100 mM Na2CO3 (pH 9,2) uzupełnionego 4% sacharozą dla wszystkich etapów płukania. Przygotować 1 ml roztworu blokującego zawierającego 100 mM Na2CO3 (pH 9,2) uzupełnionego 4% sacharozy i 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania.
    2. Przemyć szkiełko kanałowe inkubowane przez PFA 3x za pomocą strzykawki Luer o pojemności 1 ml w celu wstrzyknięcia 200 μl roztworu płuczącego i inkubować szkiełko przez 120 minut w temperaturze suchej temperatury z 200 μl roztworu blokującego.
    3. Przygotować 4 ml innego roztworu blokującego zawierającego 100 mM Na2CO3 (pH 9,2) uzupełnionego 4% sacharozy i 0,5% BSA w celu rozcieńczenia przeciwciał. Użyj 200 μl tego roztworu blokującego, aby rozcieńczyć surowicę króliczą specyficzną dla pneumokoków w stosunku 1:100. Użyj 200 μl tego roztworu blokującego, aby rozcieńczyć mysie przeciwciało specyficzne dla VWF w stosunku 1:50, aby uzyskać stężenie przeciwciał swoistych dla VWF wynoszące 4 μg/ml. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z AlexaFluor488 z roztworu podstawowego o stężeniu 2 mg/ml w stosunku 1:100 w 200 μl PBS (pH 7,4), aby uzyskać końcowe stężenie 20 μg/ml.
      nuta: W opisanych warunkach immunofluorescencji detekcja przeciwciał przyniosła optymalne wyniki, gdy przeciwciała zostały rozcieńczone w wyżej wymienionym alkalicznym buforze węglanowym. Na podstawie poprzednich wyników można stwierdzić, że zalecane roztwory blokujące i ilość przeciwciał są odpowiednie do wielu zastosowań. Jednak różne eksperymenty mogą wymagać indywidualnej optymalizacji kombinacji przeciwciał, stężenia przeciwciał, czasu inkubacji i składu buforu blokującego. Alternatywnie, system buforowany fosforanami o neutralnym zakresie pH może być odpowiedni, a nawet preferowany jako bufor do inkubacji. W przypadku słabych sygnałów fluorescencyjnych należy zwiększyć stężenie przeciwciał drugorzędowych. W przypadku wykrycia zbyt dużej ilości niespecyficznego fluorescencyjnego szumu tła należy zwiększyć ilość substancji blokujących.
    4. W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego VWF należy przemyć szkiełko kanałowe za pomocą strzykawki Luer o pojemności 1 ml poprzez wstrzyknięcie 200 μl roztworu płuczącego 3x i inkubować szkiełko z rozcieńczonym przeciwciałem specyficznym dla VWF w stosunku 1:50 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie przemyć szkiełko kanałowe 3x 200 μl roztworu płuczącego i inkubować szkiełko z rozcieńczonym w stosunku 1:100 sprzężonym z AlexaFluor488 przeciwciałem specyficznym dla myszy przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec ponownie przemyć szkiełko kanałowe 3x 200 μl roztworu myjącego.
      nuta: Fluorofory AlexaFluor są wrażliwe na wybielanie. Dlatego szkiełko należy chronić poprzez trzymanie go w ciemnej komorze podczas etapów inkubacji z przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem.
    5. W celu immunodetekcji pneumokoków inkubować szkiełko z rozcieńczonym w stosunku 1:100 przeciwciałem króliczym specyficznym dla pneumokoków przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć szkiełko kanałowe 3x 200 μl roztworu myjącego i inkubować szkiełko z rozcieńczonym w stosunku 1:100 sprzężonym z AlexaFluor568 przeciwciałem swoistym dla królika przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyć szkiełko kanałowe 3x 200 μl roztworu myjącego.
    6. Aby zabarwić komórkowy cytoszkielet aktynowy fluorescencyjną falloidyną, należy przepuścić HUVEC przez inkubację ze 120 μl 0,1% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć szkiełko kanałowe 3x 200 μl roztworu myjącego i inkubować szkiełko ze 120 μl rozcieńczonej falloidyny w stosunku 1:1,000 sprzężonej z AlexaFluor350. Ten etap inkubacji uwidoczni spolimeryzowany cytoszkielet aktynowy i umożliwi monitorowanie kształtu komórki oraz możliwych zmian morfologicznych wywołanych stresem.
    7. Przemyć szkiełko kanałowe 3x 200 μl roztworu myjącego. Na koniec umyj szkiełko 4x 200 μL ddH2O i uwidocznij zielone fluorescencyjne ciągi VWF, czerwone bakterie fluorescencyjne i niebiesko-fluorescencyjny cytoszkielet aktynowy przy użyciu odpowiednich ustawień filtra w mikroskopie fluorescencyjnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla pierwotnego HUVEC w stałym, jednokierunkowym przepływie powoduje powstanie zlewającej się i ciasno upakowanej warstwy komórek, która sprzyja generowaniu komórkowych WPB wypełnionych mechanowrażliwym VWF13,14. Protokół ten opisuje zastosowanie bezpulsacyjnego systemu recyrkulacji opartego na pompie ciśnieniowej powietrza do analizy infekcji, który wymaga naśladowania sytuacji naprężeń ścinających w przepływie krwi ludzkiej.

Ten ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Symulacja interakcji bakterii z mechanowrażliwymi białkami gospodarza, takimi jak VWF, wymaga perfuzyjnego systemu hodowli komórek, który umożliwia generowanie określonego, jednokierunkowego i ciągłego przepływu cieczy, generując w ten sposób niezawodne naprężenia ścinające. Opisano już kilka układów pomp mikroprzepływowych. Obszerny przegląd przeprowadzony przez Bergmanna i wsp. podsumowuje kluczowe aspekty różnych dwu- i trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych17.

T...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt został sfinansowany przez DFG (BE 4570/4-1) dla S.B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml strzykawka LuerFisher Scientific 10303002o pojemności 1 ml do wstrzykiwania żelatyny za pomocą połączenia luer szkiełek
Strzykawka Luer 2 mlSarstedt9077136Do płukania/wstrzykiwania płynów do połączeń luer w prowadnicach komory kanałowej
AccutaseeBioscience teraz thermo fisher00-4555-56mieszanina proteaz stosowana do delikatnego odwarstwiania komórek śródbłonka
AlexaFluor350-sprzężona z falloidynąAbcamab176751brak stężenia dostępnego u producenta, roztwór podstawowy wystarcza na 300 tets, firma zaleca stosowanie 100 &mikro; L o rozcieńczeniu 1:1,000, niebieska fluorescencja (ustawienia filtra DAPI)
AlexaFluor488-sprzężone kozie przeciwciało anty-mysieThermo Fisher SientificA11001stężenie podstawowe: 2 mg / ml do barwienia immunologicznego ludzkiego VWF w szkiełku mikroprzepływowym po utrwaleniu PFA, zielona fluorescencja
AlexaFluor568-sprzężone przeciwciało anty-królicze pochodzenia koziegoThermo Fisher ScientificA-11011Stężenie podstawowe: 2 mg/ml do barwienia immunologicznego pneumokoków na szkiełku mikroprzepływowym po utrwaleniu pFA, czerwona fluorescencja
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210złożone podłoże do hodowli bakteryjnych
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA2153-25Grozpuszczona, do przygotowania buforu blokującego
Kolby do hodowli komórkowych z filtremTPP90026hodowla HUVEC w niepowlekanych kolbach do hodowli komórkowych o powierzchni 25 cm2
Wirówka Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304odwirowania bakterii (objętość >2 ml)
Wirówka Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314wirowanie komórek eukariotycznych
Wirówka Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Modwirowanie bakterii (objętości mniejsze niż 2 ml)
ChloramfenikolCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2stosowany w stężeniu 0,2 mg/ml do hodowli pneumokoków przekształconych za pomocą konstruktu genetycznego przenoszącego białko czerwonej fluorescencji i kasetę odporności na chloramfenikol
Zacisk do rurki perfuzyjnejibidi10821do utrzymywania cieczy w rurce przed podłączeniem suwaka do układu pompy
Inkubator CO2Fisher ScientificMIDI 40jest idealnie dostosowany do wielkości jednostki przepływowej z podłączonym suwakiem kanałowym i był używany do uprawy przepływowej przy 37 stopniach; C i 5% CO2
CO2-InkubatorSanyoMCO-18 AICdo inkubacji bakterii i komórek w określonej atmosferze przy 5% CO2 i 37 ° C
Kolumbia płytki agarowe z krwiąBecton Dickinson GmbHPA-254005.06Złożone podłoże hodowlane na bazie agaru dla S. pneumoniae uzupełnione 7% krwią owczą
KomputerDellLatitude 3440Comuter z oprogramowaniem pompy ciśnieniowej
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)LeicaDMi8Mikroskop odwrotny ze stolikiem pokrytym podgrzewaną komorą i jednostką fluorescencyjną wyposażoną w filtr fluorescencyjny, ksenonowe źródło światła (SP8, DMi8) i DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 megapiksela)
Di wodorofosforan potasu (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3904.1używany do buforu PBS
Materiał suszącyMerck101969pomarańczowe kulki krzemionkowe do suszenia stosowane w szklanej butelce z adapterem rurki
Suplement ECGM MixPromocellC-39215mieszanka suplementów do ECGM -pożywka, wymagana do wstępnej hodowli komórek śródbłonka: 0,02 ml / ml Surowica cielęca płodu, 0,004 ml / ml suplement na wzrost komórek śródbłonka, 0,1 ng / ml naskórkowy czynnik wzrostu, 1 ng / ml zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów, 90 i mikro; g/ml heparyny, 1 i mikro; g/ml Hydrokortyzon
ECGMSPromocellC-22010ECGM uzupełniony o 5 % [w/w] FCS i 1 mM MgSO4 w celu zwiększenia adhezji komórek
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka (EKG w stanie gotowym)PromocellC-22010HUVEC, już uzupełniona wszystkimi składnikami mieszanki suplementów
Surowica cielęca płodu (FCS)biochrom teraz MerckS 0415suplement do hodowli komórkowych, stosowany do analiz zakażeń
Przeciwciało anty-ludzkie VWF przeciwko ludzkim kozomFITC Abcamab8822stężenie podstawowe: 10 mg/mL, do immunodetekcji globularyzowanego i multimeryzowanego VWF w przepływie
Fluidic Unitibidi10903fluidyczna do uprawy przepływowej
Żelatyna (wieprzowa)Sigma AldrichG-1890-100gdo wstępnego powlekania powierzchni kanału mikroślizgowego
Dichlorowodorek histaminySigma AldrichH-7250-10MGdo indukcji wydzielania VWF ze śródbłonka Weibel Palade Bodies
Ludzka komórka śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042pierwotne komórki śródbłonka od dawcy połączonego, przechowywane w krypkoserwie w ciekłym azocie
Ludzkie przeciwciało specyficzne dla VWF pochodzące od myszy (monoklonalne)Santa Cruzsc73268stężenie zapasów: 200 &mikro; g/ml do barwienia immunologicznego VWF na szkiełku mikroprzepływowym po utrwaleniu PFA
Port iniekcyjnyibidi10820do wstrzykiwania histaminy lub bakterii do rurki zbiornika podczas cyrkulacji przepływu
Mikroskop świetlnyZeissAxiovert 35Mdo kontroli odrywania i zliczania komórek eukariotycznych za pomocą 40-krotnego obiektywu wodnego umożliwiającego 400-krotne powiększenie
Szkiełka podstawowe I0,4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176fizycznie zmodyfikowane szkiełka do uprawy fludic (μ – Suwak I0,4Luer o wysokości kanału 0,4 mm, głośności kanału 100 μ l, obszar wzrostu 2,5 cm i obszar powlekania 25,4 cm2) Odpowiedni do wszystkich rodzajów testów przepływu, obróbka fizyczna generuje hydrofilową i adhezyjną powierzchnię.
Siarczan magnezu (MgSO4, nieuwodniony)Sigma AldrichM7506-500GDo przygotowania podłoża ECGMS
Pompa mikroprzepływowa Pompa ciśnieniowaibidi10905Komora ciśnieniowa
NeubauerKarl Hecht GmbH& Co KG40442002mikroskopijna komora zliczająca do HUVEC
Paraformaldehyd 16% (PFA)Mikroskopia elektronowa Sciences15710-Sdo sieciowania próbek
Zestaw perfuzyjnyibidi10964Zestaw perfuzyjny żółty/zielony ma średnicę rurki 1,6 mm, długość rurki 50 cm, całkowitą objętość roboczą 13,6 ml, objętość martwej probówki 2,8 ml i wielkość zbiornika 10 ml. w połączeniu z &mikroszkiełkiem L0,4Luer, w 37 ° C i lepkość 0,0072 dyn x s/cm2 zakres natężenia przepływu od 3,8 ml/min do 33,9 mL/min i naprężenie ścinające między 3,5 dyn/cm2 a 31,2 dyn/cm2. o długości 50 cm do mikroprzepływowego
roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)roztwór przygotowano przy użyciu następujących substancji chemicznych: 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4, 0,24 g/L KH2PO4 , pH 7,4
Kuwety plastikoweSarstedt67,741(2 x optyczne) do pomiaru OD przy 600 nm
Surowica swoista dla pneumokoków Pinedahodowana u królika przy użyciu inaktywowanego termicznie Streptococcus pneumoniae NCTC10319 i D39, oczyszczonego IgG za pomocą kolumny białkoA-sefarozy.
polistyrenu lub styropianujest to krok zapobiegawczy, aby uniknąć stresu zimna na komórkach zasianych w prowadnicach kanałowych. Można użyć dowolnego rodzaju styropianu, takiego jak opakowanie, pudełko. Talerz może mieć grubość 0,5 cm i powinien mieć rozmiar 20 cm2.
Chlorek potasu (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1używany do buforu PBS
Oprogramowanie sterujące pompą (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Oprogramowanie komputerowe do sterowania pompą ciśnieniową, ustawiania warunków przepływu i uruchamiania/kończenia przepływu
Probówki reakcyjne 1,5/2,0 mlSarstedt72.706/ 72.695.500wymagane do rozcieńczania przeciwciał
Probówki reakcyjne o pojemności 50 ml objętośćSarstedt6,25,48,004
Pneumokoki wyrażające RFPNarodowa Kolekcja Kultur Typów, Public Health England10,319Streptococcus pneumoniae serotyp 47 eksprymujący RFP połączony z białkiem podobnym do ahistone'a zintegrowany z genomem Pipety
serologiczne 5, 10 mlSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025do pipetowania większych objętości
Węglan sodu (Na2CO3, bez wody)Sigma Aldrich451614-25Gdo przygotowania 100 mM buforu węglanu sodu
Diwodorofosforan sodu (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2stosowany do buforu PBS
Fotometr spektralny Libra S22Biochrom80-2115-20pomiar gęstości optycznej (OD) zawiesiny bakteryjnej przy 600 nm
SacharozaSigma AldrichS0389-500Gdo przygotowania buforu blokującego
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLStosowany w 0,1% stężeniu końcowym rozcieńczonym w dH20 do przenikania komórek eukariotycznych po utrwaleniu PFA
Ekstrakt drożdżowyoxoidLP0021bakterie są hodowane w suplemencie THB z 1% [w/w] ekstraktem drożdżowym = kompletne podłoże do hodowli bakterii THY
Rozmiar inkubatora Pożywka hodowlana jednostka Mikroskop światła odwróconego Płyta z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
  29. Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Urz dzenie mikroprzep ywowenapr enie cinaj ceczynnik von Willebrandahodowla HUVECmikroskopia fluorescencyjnaadhezja bakteriinici VWF

Powiązane artykuły