Ten artykuł opisuje metodę hodowli i analizy wyrostków komórek kłębuszkowych nabłonków ciemieniowych zamkniętych kłębuszków wyizolowanych z nerki myszy. Metoda ta może być stosowana do badania szlaków zaangażowanych w proliferację i migrację komórek nabłonka okładzinowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rozrost kłębuszków nerkowych jako test ex vivo do analizy szlaków zaangażowanych w aktywację komórek nabłonka ciemieniowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aktywacja komórek nabłonka ciemieniowego (PEC) jest jednym z kluczowych czynników związanych z rozwojem i postępem stwardnienia kłębuszków nerkowych. Hamowanie szlaków zaangażowanych w aktywację komórek nabłonka ciemieniowego może być zatem narzędziem do osłabienia postępu chorób kłębuszków nerkowych. W artykule opisano metodę hodowli i analizy wzrostu komórek nabłonka okładzinowego otoczkowanych kłębuszków wyizolowanych z nerki myszy. Po wypreparowaniu izolowanych nerek myszy tkanka jest mielona, a kłębuszki są izolowane przez przesiewanie. Zbiera się otorbione kłębuszki, a pojedyncze kłębuszki są hodowane przez 6 dni w celu uzyskania kłębuszkowego wzrostu komórek nabłonka ciemieniowego. W tym okresie proliferację i migrację komórek nabłonka okładzinowego można analizować, określając liczbę komórek lub powierzchnię wyrastających komórek. Test ten może być zatem wykorzystany jako narzędzie do badania wpływu zmienionej ekspresji genów u myszy transgenicznych lub myszy z nokautem lub wpływu warunków hodowli na charakterystykę wzrostu komórek nabłonka ciemieniowego i sygnalizację. Za pomocą tej metody można badać ważne szlaki biorące udział w procesie aktywacji komórek nabłonka ciemieniowego, a w konsekwencji w stwardnieniu kłębuszków nerkowych.
Wprowadzenie
Choroby kłębuszków nerkowych są ważną grupą zaburzeń nerek i stanowią główną przyczynę schyłkowej niewydolności nerek (ESRD). Niestety, konkretne możliwości leczenia są ograniczone, a progresja do ESRD jest nieunikniona. Choroby kłębuszków nerkowych są definiowane przez obecność uszkodzenia kłębuszków nerkowych i można je podzielić na choroby zapalne i niezapalne. Chociaż początkowa zniewaga jest inna, ostatnie badania wykazały, że wspólny mechanizm komórkowy prowadzi do przerostu komórek nabłonka kłębuszków nerkowych i ostatecznie do stwardnienia kłębuszków nerkowych we wszystkich chorobach kłębuszków nerkowych, niezależnie od przyczyny1,2,xref"3,4.
W szczególności wykazano, że zmiany miażdżycowe kłębuszków składają się głównie z aktywowanych komórek nabłonka ciemieniowego5,6. W warunkach fizjologicznych komórki nabłonka ciemieniowego to płaskie, spokojne komórki nabłonkowe, które wyściełają torebkę Bowmana kłębuszków nerkowych. Jednak każde uszkodzenie kłębuszków nerkowych spowodowane mutacjami genetycznymi (np. cytopatiami specyficznymi dla podocytów lub mitochondriami), stanem zapalnym lub hiperfiltracją (np. spowodowane zmniejszoną masą nerkową, nadciśnieniem, otyłością lub cukrzycą) może wywołać aktywację komórek nabłonka okładzinowego. Aktywowane komórki nabłonka ciemieniowego namnażają się i odkładają macierz zewnątrzkomórkową, co powoduje powstawanie półksiężyców komórkowych lub zmian sklerotycznych5,7,8. Postęp tych procesów powoduje utratę funkcji nerek9. Dlatego aktywacja komórek nabłonka ciemieniowego jest kluczowym czynnikiem w rozwoju i progresji stwardnienia kłębuszków nerkowych zarówno w zapalnych, jak i niezapalnych chorobach kłębuszków nerkowych1,2,3,4,10.
Procesy molekularne pośredniczące w aktywacji komórek nabłonka ciemieniowego są nadal w dużej mierze nieznane. Ostatnie badania pokazują, że aktywowane komórki nabłonka ciemieniowego de novo wyrażają CD44, receptor, który jest ważny dla aktywacji różnych szlaków zaangażowanych w proliferację i migrację komórek. Ponadto wykazano, że hamowanie CD44 hamuje aktywację komórek nabłonka okładzinowego ciemieniowego i hamuje postęp tworzenia się półksiężyca i stwardnienia kłębuszków nerkowych w modelach zwierzęcych chorób zapalnych i niezapalnych kłębuszków nerkowych11,12.
Ponieważ aktywacja komórek nabłonka ciemieniowego jest kluczowym czynnikiem dla rozwoju stwardnienia kłębuszków nerkowych i tworzenia półksiężyców, hamowanie tych komórek może spowolnić postęp chorób kłębuszków nerkowych. Wyjaśnienie szlaków molekularnych kierujących aktywacją komórek nabłonka ciemieniowego może prowadzić do opracowania specyficznych interwencji terapeutycznych, które hamują powstawanie zmian hiperplastycznych i miażdżycowych w chorobie kłębuszków nerkowych.
W eksperymentalnych modelach zwierzęcych często trudno jest dostarczyć dowodów na bezpośredni wpływ zmienionej ekspresji genów (modele knock-out lub transgeniczne modele myszy) lub leczenia farmakologicznego na komórki nabłonka ciemieniowego. U konwencjonalnej myszy z nokautem obserwowane in vivo zmiany można wytłumaczyć bezpośrednimi zmianami w komórkach nabłonka ciemieniowego. Ponieważ jednak ekspresja genów jest również zmieniona w innych typach komórek myszy, nie można wykluczyć efektów pośrednich, w których pośredniczą inne typy komórek. Rozwój warunkowych myszy cre-lox napędzanych przez promotory aktywne głównie w komórkach nabłonka ciemieniowego dostarczył rozwiązania w niektórych przypadkach13. Niemniej jednak, warunkowe modele transgeniczne są złożone i chociaż dostępnych staje się więcej linii warunkowych, dla wielu konwencjonalnych linii myszy z nokautem lub transgenicznych nie ma jeszcze warunkowego substytutu.
Aby zbadać bezpośredni wpływ na komórki nabłonka ciemieniowego, nasza grupa opracowała test ex vivo z wykorzystaniem pojedynczych otoczkowanych kłębuszków wyizolowanych z nerek myszy do pomiaru i analizy proliferacji i migracji komórek nabłonka ciemieniowego. Metoda ta pozwoli nam określić specyficzne efekty dla komórek nabłonka okładzinowego i znaleźć odpowiedzialne szlaki aktywacji komórek nabłonka okładzinowego oraz przetestować opcje leczenia w celu zahamowania tej aktywacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komisji Etyki Zwierząt Uniwersytetu Radboud w Nijmegen.
UWAGA: Nieleczone, zdrowe myszy typu dzikiego (WT) (n = 4) i myszy cd44-/- (n = 4) zostały uśmiercone w wieku 12−16 tygodni. Wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy. Wszystkie myszy znajdowały się na tle C57Bl/6.
1. Wycięcie nerki myszy
- Poświęć zdrowe myszy WT lub myszy zmodyfikowane genetycznie przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Wypreparuj całe nerki myszy bezpośrednio po złożeniu myszy w ofierze. W tym celu wykonaj laparotomię pośrodkową za pomocą nożyczek brzusznych, przecinając skórę, a następnie mięśnie brzucha. Usuń jelito i umieść je obok myszy.
- Uwolnij nerki z tkanki łączącej i wyciągnij nerkę za pomocą kleszczy chirurgicznych, przecinając nożyczkami tętnicę nerkową, żyłę nerkową i moczowód .
- Usuń kapsułki nerkowe z nerek, przytrzymując nerkę kleszczami chirurgicznymi i zdejmij kapsułkę za pomocą innej pary kleszczy.
- Umieść nerki na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej (2 nerki/dołek) przygotowanej z 2 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) na dołek i umieść na lodzie.
2. Izolacja kłębuszków nerkowych od nerki myszy
- Przenieś nerki na szalkę Petriego o średnicy 100 mm i zmiel nerki na małe kawałki o wielkości 1-2 mm za pomocą dwóch skalpeli. Utrzymuj zmielone kawałki nerki w stanie mokrym, używając 1-2 ml HBSS.
- Umieścić zmielone kawałki nerki na metalowym sicie o grubości 300 μm i przecisnąć nerkę przez sito za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 20 ml. Kilkakrotnie przepłukać sito HBSS pomiędzy nimi i zebrać przepływ na czystą płytkę Petriego za pomocą pipety serologicznej. Zebrać również wszystko, co pozostało/przykleiło się do dolnej strony sita, zeskrobując je skalpelem i przenieść do zebranego przepływu (homogenatu nerkowego).
- Przepłukać homogenat nerkowy przez sito o wielkości 75 μm za pomocą HBSS. Zebrać przepływ, a następnie przepłukać go przez sito o średnicy 53 μm. Umyj oba sita za pomocą HBSS, aby usunąć wszystkie mniejsze struktury.
UWAGA: Na tym etapie przepływowy przepływ jest tylko płukany, ale nie przetłaczany przez sito 75 μm i 53 μm. Mycie HBSS jest konieczne do usunięcia zanieczyszczeń i mniejszych struktur na sitach. Dlatego zwykle stosuje się łącznie 200-300 ml HBSS. - Zebrać struktury/materiał nerkowy, które pozostały na sicie 75 μm i 53 μm, przemywając górną powierzchnię sit zmodyfikowanym podłożem Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 20% płodową surowicą cielęcą (FCS) i przenieść materiał do 6-dołkowej mikropłytki o bardzo niskim przyłączeniu.
UWAGA: Aby umyć górną powierzchnię sita, należy przepłukać sitko w pozycji przechylonej (>45°) i zebrać materiał nerkowy na krawędzi sita. Pobrany materiał wzbogacony jest zarówno o kłębuszki otorbione, jak i dekapsulowane, ukazując jedynie kilka fragmentów rurkowych. Kłębuszki otorbione są bardzo lepkie. Aby zebrać pojedyncze kłębuszki nerkowe, ważne jest zatem, aby zapobiec przyleganiu kłębuszków do powierzchni szalki Petriego lub płytki studzienki. Aby uniknąć przywierania, użyj podłoża z 20% FCS i użyj na tym etapie płytek mocujących o bardzo niskim poziomie.
3. Hodowla kłębuszków nerkowych
- Przynieś mikropłytkę o bardzo niskim nasadce do mikroskopu światła odwróconego i zbierz pojedyncze kłębuszki nerkowe w kapsułkach i/lub pozbawione kapsułki za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Unikaj pipetowania innych struktur i zanieczyszczeń. Po pobraniu pojedynczego kłębuszka nerkowego do końcówki pipety dodać świeże podłoże DMEM bez zebranego materiału nerkowego do tej samej końcówki pipety w objętości 20 μl.
- Przenieść pojedyncze kłębuszki nerkowe z 20 μl pożywki DMEM do środka studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% (v/v) CO2 , aby umożliwić przyłączenie kłębuszków nerkowych do środka studzienki. Ostrożnie przesuń płytkę, aby uniknąć unoszenia się kłębuszków nerkowych do granic studni.
- Po 3 godzinach inkubacji kłębuszek nerkowy jest przymocowany do środka studni. Ostrożnie dodać 500 μl śródbłonkowej pożywki podstawowej (EBM) uzupełnionej zestawem czynników wzrostu zawierającym hydrokortyzon, ludzki czynnik wzrostu śródbłonka, ekstrakt z mózgu bydlęcego i siarczan gentamycyny-amfoterycynę B (tabela materiałów) i dodatkowe 5% (v/v) FBS i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny (pióro/paciorkowiec) do każdej studzienki.
- Hodować pojedyncze kłębuszki nerkowe przez 6 dni w temperaturze 37 °C, 5% (v/v) CO2,
UWAGA: W ciągu 6 dni powstaje wyrostek składający się z komórek nabłonka ciemieniowego. Jeśli ktoś ma na celu przetestowanie wpływu określonych związków lub leków na komórki nabłonka okładziny, należy go dodać do pożywki w ciągu tych sześciu dni.
4. Analiza proliferacji komórek nabłonka ciemieniowego
- Przeanalizuj wyrostek kłębuszków nerkowych po 6 dniach. Wykonuj obrazy mikroskopowe za pomocą cyfrowego mikroskopu światła odwróconego.
- Użyj oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ/FIJI), aby określić powierzchnię i średnicę wyrostka kłębuszkowego oraz liczbę wyrastających komórek lub wyrastających kłębuszków nerkowych.
- Aby określić pole powierzchni wyrostu kłębuszkowego kłębuszka, otwórz plik tif. wyrostka kłębuszkowego z paskiem skali w ImageJ. Narysuj linię prostą na pasku skali i określ odległość w pikselach, klikając Analizuj i zmierz (np. 1 mm = 460 pikseli).
- Określ skalę, klikając Analizuj, ustaw skalę i wpisz znaną odległość w pikselach (np. 460), wpisz również znaną odległość (np. 1) i jednostkę długości (np. 1 mm). Kliknij przycisk OK.
- Określ, które wyniki pojawią się w tabeli wyników, klikając analizuj, a następnie ustaw pomiary. Aby określić pole powierzchni wyrostu kłębuszkowego, aktywuj obszar opcji i wyświetl etykietę. Kliknij przycisk OK.
- Aby określić powierzchnię wyrostka kłębuszkowego, narysuj odręczne zaznaczenie wokół wyrostka kłębuszkowego. Kliknij analizuj, a następnie zmierz, w ImageJ pojawi się tabela wyników pokazująca powierzchnię wzrostu we wcześniej ustalonej skali (patrz krok 4.4, np. mm2).
5. Charakterystyka rozrostu komórek kłębuszków nerkowych
UWAGA: Aby ocenić skład komórkowy wyrostka, na wyrostkach kłębuszkowych przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne dla markerów specyficznych dla komórek w t = 6 dni.
- Ostrożnie usunąć pożywkę i delikatnie umyć kłębuszki dwukrotnie za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Utrwalać przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy użyciu 2% (w/v) paraformaldehydu (PFA) uzupełnionego 4% (w/v) sacharozy w PBS i ostrożnie przemyć 2x za pomocą PBS.
- Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem o odpowiednim stężeniu (tabela materiałów) rozcieńczonym w PBS-albumina surowicy owczej (BSA) 1% (v/v) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Usuń roztwór przeciwciał i ostrożnie przemyj 3x PBS.
- Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (tabela materiałów) rozcieńczonym w PBS-BSA 1% (v/v) w ciemności przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
- Ostrożnie przemyć 3x PBS i zamocować za pomocą 1−2 kropli wodnego podłoża mocującego z 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) w celu uwidocznienia jąder i przykryć studzienkę okrągłym szkiełkiem nakrywkowym.
- Rób zdjęcia mikroskopowe za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schematyczny diagram metody przeprowadzania testu przerostu kłębuszków przedstawiono na Rycini 1. Na Rycini 2A-D przedstawiono przerosty kłębuszków z enkapsulowanych kłębuszków w różnych punktach czasowych, zaobserwowane przy użyciu mikroskopii świetlnej. Przerosty pokazano w 2., 4. i 6. dniu (Rycina 2B-D) hodowli po izolacji kłębuszków z nerki mysiej. Aby potwierdzi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Korzystając z protokołu opisanego w tym artykule, można użyć pojedynczych otoczkowanych kłębuszków nerkowych do oceny proliferacji komórek nabłonka ciemieniowego, która jest konsekwencją aktywacji komórek nabłonka ciemieniowego. Ten model ex vivo pozwoli nam szczegółowo zbadać szlaki molekularne, które są zaangażowane w aktywację komórek nabłonka ciemieniowego. Opisana metoda opiera się na prostej koncepcji rozwarstwienia nerki i przesiewania w celu wyizolowania i hodowli kłębuszków nerkowych oraz porównania proliferacji...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Dutch Kidney Foundation (grant 14A3D104) oraz Holenderską Organizację Badań Naukowych (grant NWO VIDI: 016.156.363).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej | Corning Costar | ||
| anty-CD31 | BD Pharmingen | Marker komórek śródbłonka (używane stężenie 1:200) | |
| kurczak-anty-szczur Alexa 647 | Thermo Fisher | ( używane stężenie 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Podłoże montażowe zawierające DAPI | |
| Cyfrowy mikroskop światła odwróconego | Westburg, mikroskop | ||
| osioł-anty-koza Alexa 568 | Thermo Fisher | ( używane stężenie 1:200) | |
| osioł-anty-królik Alexa 568 | Thermo Fisher | ( używane stężenie 1:200) | |
| Zmodyfikowane podłoże Dulbecco | Lonza | ||
| EBM Medium | Zestaw Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots | Lonza | zawierający hydrokortyzon, hEGF, GA-1000, FBS i BBE | |
| Surowica bydlęca | Lonza | ||
| Płodowa surowica cielęca | Lonza Mikroskop | ||
| Leica Microsystems GmbH | |||
| kozio-antysynaptopodyna | Cruz | Marker podocytów (używane stężenie 1:200) | |
| Zbilansowany roztwór soli Hanksa | Gibco | ||
| ImageJ | FIJI 1.51n | ||
| szalka Petriego | Sarstedt | rozmiar 100 | |
| królicza anty-klaudyna1 | Abcam | Marker komórek nabłonka ciemieniowego (używane stężenie 1:100) | |
| królik anty-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, USA | dzięki uprzejmości dr E. Gelmana, marker | |
| szczur-anty-CD44 | BD Pharmingen | Marker komórek nabłonka ciemieniowego (używane stężenie 1:200) | |
| skalpel | Dahlhausen | rozmiar 10 | |
| sit | Endecotts Ltd | rozmiar 300 &mikro; m, 75 i mikro; m, 53 i mikro; m, stalowa | |
| strzykawka | BD Plastipak | rozmiar: 20 ml | |
| Mikropłytki o bardzo niskim nasadce | Płytki 6-dołkowe | Corning Costar |
Bibliografia
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
