Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.

Streszczenie

Bezkomórkowa synteza białek (CFPS) to nowa technologia w systemach i biologii syntetycznej do produkcji białek in vitro. Jeśli jednak CFPS ma wyjść poza laboratorium i stać się powszechną i standardową technologią produkcji just in time, musimy zrozumieć ograniczenia wydajności tych systemów. W odpowiedzi na to pytanie opracowaliśmy solidny protokół ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w glikolizie, szlaku pentozofosforanowym, cyklu kwasów trikarboksylowych, metabolizmie energetycznym i regeneracji kofaktora w reakcjach CFPS. W metodzie wykorzystuje się wzorce wewnętrzne oznaczone ¹³C-aniliną, natomiast związki w próbce są derywatyzowane ¹²C-aniliną. Wzorce wewnętrzne i próbkę zmieszano i przeanalizowano za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas z odwróconymi fazami (LC/MS). Koelucja związków wyeliminowała supresję jonów, umożliwiając dokładne określenie ilościowe stężeń metabolitów w zakresie 2-3 rzędów wielkości, gdzie średni współczynnik korelacji wynosił 0,988. Pięć z czterdziestu związków nie było oznakowanych aniliną, jednak nadal były one wykrywane w próbce CFPS i oznaczane ilościowo metodą krzywej standardowej. Przebieg chromatograficzny trwa około 10 minut. Podsumowując, opracowaliśmy szybką, solidną metodę separacji i dokładnego ilościowego oznaczania 40 związków wchodzących w skład CFPS w jednym cyklu LC/MS. Metoda ta jest kompleksowym i dokładnym podejściem do charakteryzowania metabolizmu bezkomórkowego, dzięki czemu ostatecznie możemy zrozumieć i poprawić wydajność, produktywność i efektywność energetyczną systemów bezkomórkowych.

Wprowadzenie

Bezkomórkowa synteza białek (CFPS) to obiecująca platforma do produkcji białek i substancji chemicznych, która tradycyjnie była zarezerwowana dla żywych komórek. Systemy bezkomórkowe pochodzą z surowych ekstraktów komórkowych i eliminują komplikacje związane ze wzrostem komórek¹. Ponadto CFPS umożliwia bezpośredni dostęp do metabolitów i maszynerii biosyntezy bez ingerencji ściany komórkowej. Brakowało jednak podstawowej wiedzy na temat ograniczeń wydajności procesów bezkomórkowych. Wysokoprzepustowe metody kwantyfikacji metabolitów są cenne dla charakterystyki metabolizmu i mają kluczowe znaczenie dla budowy metabolicznych modeli obliczeniowych^2,3,4. Typowe metody stosowane do określania stężeń metabolitów obejmują magnetyczny rezonans jądrowy (NMR), spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR), testy enzymatyczne i spektrometrię mas (MS)^5,6,7,8. Metody te są jednak często ograniczone ze względu na ich niezdolność do skutecznego pomiaru wielu związków jednocześnie i często wymagają próbki o wielkości większej niż typowe reakcje bezkomórkowe. Na przykład testy oparte na enzymach mogą być często stosowane tylko do ilościowego oznaczania pojedynczego związku w serii i są ograniczone, gdy wielkość próbki jest mała, na przykład w bezkomórkowych reakcjach syntezy białek (zwykle przeprowadzanych w skali 10-15 μl). Tymczasem NMR wymaga dużej ilości metabolitów do wykrywania i kwantyfikacji⁵. W obliczu tych niedociągnięć, metody chromatograficzne w połączeniu ze spektrometrią mas (LC/MS) zapewniają kilka zalet, w tym wysoką czułość i możliwość jednoczesnego pomiaru wielu gatunków⁹; Złożoność analityczna znacznie wzrasta jednak wraz z liczbą i różnorodnością mierzonych gatunków. Dlatego ważne jest, aby opracować metody, które w pełni wykorzystają potencjał systemów LC/MS w zakresie wysokiej przepustowości. Związki w próbce rozdziela się metodą chromatografii cieczowej i identyfikuje za pomocą spektrometrii mas. Sygnał związku zależy od jego stężenia i skuteczności jonizacji, przy czym jonizacja może się różnić w zależności od związków, a także może zależeć od matrycy próbki.  

Osiągnięcie takiej samej efektywności jonizacji między próbką a wzorcami jest wyzwaniem przy użyciu LC/MS do ilościowego oznaczania analitów. Co więcej, kwantyfikacja staje się trudniejsza w przypadku różnorodności metabolitów ze względu na podział sygnału i niejednorodność powinowactwa i polaryzacji protonów¹⁰. Wreszcie, matryca koelucyjna próbki może również wpływać na wydajność jonizacji związków. Aby rozwiązać te problemy, metabolity mogą być derywatyzowane chemicznie, co zwiększa rozdzielczość i czułość separacji przez systemy LC/MS, jednocześnie zmniejszając w niektórych przypadkach rozszczepianie sygnału^10,11. Derywatyzacja chemiczna polega na znakowaniu określonych grup funkcyjnych metabolitów w celu dostosowania ich właściwości fizycznych, takich jak ładunek lub hydrofobowość, w celu zwiększenia wydajności jonizacji¹¹. Różne środki znakujące mogą być stosowane do celowania w różne grupy funkcyjne (np. aminy, hydroksyle, fosforany, kwasy karboksylowe itp.). Anilina, jeden z takich środków do derywatyzacji, celuje w wiele grup funkcyjnych jednocześnie i dodaje składnik hydrofobowy do cząsteczek hydrofilowych, zwiększając w ten sposób ich rozdzielczość separacji i signal¹². Aby rozwiązać problem efektu tłumienia jonów w matrycy koelucyjnej, Yang i współpracownicy opracowali technikę opartą na znakowaniu technologii wzorców wewnętrznych specyficznych dla grupy (GSIST), w której wzorce są oznaczane izotopami aniliny ¹³C i mieszane z próbką^12,13. Metabolit i odpowiadający mu wzorzec wewnętrzny mają taką samą wydajność jonizacji, ponieważ współeluują, a ich stosunek intensywności można wykorzystać do ilościowego określenia stężenia w próbce doświadczalnej.

W tym badaniu opracowaliśmy protokół do wykrywania i ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w glikolizie, szlaku pentozy fosforanowej, cyklu kwasów trikarboksylowych, metabolizmie energii i regeneracji kofaktora w reakcjach CFPS. Metoda opiera się na podejściu GSIST, w którym użyliśmy ¹²C-aniliny i ¹³C-aniliny do znakowania, wykrywania i ilościowego oznaczania metabolitów za pomocą odwróconej fazy LC/MS. Zakres liniowy wszystkich związków wynosił 2-3 rzędy wielkości ze średnim współczynnikiem korelacji wynoszącym 0,988. W związku z tym metoda ta jest solidnym i dokładnym podejściem do badania metabolizmu wolnego od komórek i ewentualnie ekstraktów z całych komórek.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników do znakowania aniliny

1. Przygotować 6 M roztwór aniliny o pH 4,5. Pracując w okapie, połącz 550 μl aniliny z 337,5 μl wody klasy LCMS i 112,5 μl 12 M kwasu solnego (HCl) w probówce wirówkowej. Dobrze przemieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Anilina może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 2 miesiące.
   UWAGA: Anilina jest wysoce toksyczna i powinna być używana w dygestorium. Kwas solny jest silnie
2. Przygotować 6 M ¹³C roztwór aniliny o pH 4,5. Połączyć 250 mg ¹³C 6-aniliny ze 132 μl wody i 44 μl 12 M HCl. Dobrze przemieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Przygotować 200 mg/ml roztworu chlorowodorku N-(3-dimetyloaminopropylo)-N-etylokarbodimidu (EDC). Rozpuścić 2 mg EDC w 10 μl wody dla każdej próbki, która ma być oznaczona i dobrze przemieszać.
   UWAGA: Roztwór EDC należy przygotować tego samego dnia, w którym nastąpiła reakcja. EDC działa jako katalizator derywatyzacji związków z aniliną¹².

2. Przygotowanie standardów

1. Sporządzić oddzielne roztwory podstawowe wszystkich związków rozpuszczonych w wodzie o czystości LC/MS (Tabela 1).
2. Przygotowanie roztworu podstawowego wzorca wewnętrznego
   1. Połącz wszystkie związki z wyjątkiem dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD), fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADP), dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD), acetylokoenzymu A (ACA) i 3-fosforanu glicerolu (Gly3P), o odpowiednich objętościach, aby utworzyć 2 mM roztwór podstawowy wszystkich związków.
3. Połącz NAD, NADP, FAD, ACA i Gly3P z odpowiednimi objętościami, aby utworzyć roztwór podstawowy o wielkości 2 mM.

3. Przygotowanie próbki (Rysunek 1)

1. Schładź i wytrącaj białka w bezkomórkowej reakcji syntezy białek, dodając do reakcji równą objętość lodowatego 100% etanolu. Odwirować próbkę o sile 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej.
   UWAGA: W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C i analizowane w późniejszym czasie

4. Reakcja na etykietowanie

1. Etykietowanie próbki roztworem ¹²C-aniliny
   1. Przenieść 6 μl próbki do nowej probówki wirówkowej i doprowadzić objętość do 50 μl wodą.
      UWAGA: Wielkość próbki objętościowej może zależeć od konkretnej reakcji CFPS.
   2. Dodać 5 μl 200 mg/ml roztworu EDC.
   3. Dodać 5 μl ¹²roztworu C-aniliny.
      UWAGA: Roztwór aniliny rozdziela się na dwie fazy. Dobrze wymieszaj przed dodaniem do reakcji.
   4. Wirować reakcję z delikatnym wstrząsaniem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   5. Po 2 godzinach wyjąć probówki z wytrząsarki i dodać 1,5 μl trietyloaminy (TEA) do reakcji w dygestorium.
      UWAGA: Trietyloamina podnosi pH roztworu, co zatrzymuje reakcję znakowania aniliną i stabilizuje związki.
      UWAGA: Trietyloamina jest toksyczna i powoduje podrażnienie oczu i dróg oddechowych.
   6. Wirować przy 13 500 x g przez 3 min.
2. Znakowanie wzorców wewnętrznych roztworem ¹³C-aniliny
   1. Rozcieńczyć wewnętrzny roztwór podstawowy do objętości 80 μM o końcowej objętości 50 μl.
      UWAGA: Stężenie wzorców wewnętrznych można dostosować do poziomów zbliżonych do próbki doświadczalnej.
   2. Dodać 5 μl 200 mg/ml roztworu EDC.
   3. Dodać 5 μl ¹³roztworu C-aniliny.
   4. Wirować reakcję z delikatnym wstrząsaniem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   5. Po 2 godzinach wyjmij probówki z wytrząsarki i dodaj 1,5 μl herbaty do reakcji w dygestorium.
   6. Wirować przy 13 500 x g przez 3 min.
3. Łączenie oznaczonego wzorca wewnętrznego i oznaczonej próbki
   1. Zmieszać 25 μl próbki znakowanej ¹²C-aniliną z 25 μl wzorca znakowanego ¹³C-aniliną.
   2. Przenieść do fiolki z automatycznym samplerem i przeprowadzić analizę zgodnie z procedurą LC/MS.
4. Tworzenie krzywej wzorcowej dla nieoznakowanych metabolitów
   1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy nieoznakowanych metabolitów (NAD, NADP, FAD, ACA i Gly3P) do końcowych stężeń 320 μM, 80 μM, 20 μM i 5 μM o objętości 50 μL.
   2. Dodać 5 μl 200 mg/ml roztworu EDC.
   3. Dodać 5 μl ¹²roztworu C-aniliny.
   4. Wirować reakcję z delikatnym wstrząsaniem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   5. Po 2 godzinach wyjmij probówki z wytrząsarki i dodaj 1,5 μl herbaty do reakcji w dygestorium.
   6. Wirować przy 13 500 x g przez 3 min.
   7. Przenieść supernatant do fiolki z automatycznym samplerem i przeprowadzić analizę zgodnie z procedurą LC/MS.
      UWAGA: Nieoznakowane metabolity postępują zgodnie z tą samą procedurą co próbka, aby powtórzyć matrycę próbki w celu utrzymania podobnej wydajności jonizacji.

5. Konfiguracja procedury LC/MS

1. Przygotowanie rozpuszczalników
   1. Przygotować 5 mM wodnego roztworu tributyloaminy (TBA) dostosowanego do pH 4,75 z kwasem octowym.
      UWAGA: TBA w fazie ruchomej pomaga analitom osiągnąć dobrą rozdzielczość i separację¹⁴.
   2. Przygotować 5 mM TBA w acetonitrylu (ACN).
   3. Przygotuj rozpuszczalnik do mycia z 5% wodą i 95% ACN.
   4. Przygotować rozpuszczalnik czyszczący z 95% wodą i 5% ACN.
2. Konfiguracja warunków MS
   1. Ustaw spektrometr mas w trybie jonów ujemnych z temperaturą sondy 520 °C, ujemnym napięciem kapilary -0,8 kV, dodatnim napięciem kapilary 0,8 kV i ustaw oprogramowanie tak, aby pozyskiwało dane z prędkością 5 punktów/s.
   2. Ustaw wybrane zapisy jonów (SIR) dla każdego metabolitu o określonych napięciach stożka i wartościach masy nad ładunkiem (m/z). Patrz tabela 1.
3. Inicjalizacja LC/MS zgodnie z instrukcjami producenta
   1. Zalać przewody rozpuszczalnikowe w menedżerze rozpuszczalników na 3 minuty.
   2. Zagruntować rozpuszczalnik do płukania (5% wody, 95% ACN) i rozpuszczalnik czyszczący (95% wody, 5% ACN) przez 15 sekund przez 5 cykli.
   3. Ustawić menedżer próbek na 10 °C.
   4. Zainstaluj kolumnę C18 (1.7 μm, 2.1 mm x 150 mm) i zainicjuj kolumnę ze 100% ACN przy 0.3 ml/min przez 10 minut.
   5. Kondycjonować kolumnę w 95% wody i 5% ACN w 0,3 ml/min przez 10 minut przed wprowadzeniem rozpuszczalników z.
   6. Kondycjonować kolumnę w 95% rozpuszczalniku A (5 mM TBA wodnego, pH 4,75) i 5% rozpuszczalniku B (5 mM TBA w ACN) w temperaturze 0,3 ml/min przez 10 minut.
   7. Ustal protokół gradientu, w którym elucja rozpoczyna się od 95% rozpuszczalnika A i 5% rozpuszczalnika B, podniesiona do 70% rozpuszczalnika B w ciągu 10 minut, podniesiona do 100% rozpuszczalnika B w ciągu 2 minut i utrzymywana w 100% rozpuszczalniku B przez 3 minuty. Wróć do warunków początkowych (95% rozpuszczalnika A, 5% rozpuszczalnika B) przez 1 minutę i przytrzymaj przez 9 minut, aby ponownie wyrównać kolumnę.
   8. Kondycjonować kolumnę za pomocą protokołu gradientu 3 razy przed jakimkolwiek wstrzyknięciem do kolumny.
4. Wstrzykiwanie próbki i wzorców
   1. Wstrzyknąć 5 μl próbki do kolumny i uzyskać odpowiednią intensywność jonów m/z dla próbki znakowanej ¹²C-aniliną.
   2. Ponownie wstrzyknąć 5 μl tej samej próbki, ale tym razem uzyskać intensywność jonów m/z dla ¹³wzorców oznaczonych C-aniliną.
      UWAGA: Nasz system LC/MS nie jest w stanie uzyskać zarówno intensywności ¹²C, jak i ¹³C m/z w określonych oknach czasowych SIR, ponieważ jest to zbyt dużo danych do pozyskania w określonym oknie czasowym. Dlatego wstrzykujemy tę samą próbkę dwukrotnie.
   3. Wstrzyknąć nieoznakowane wzorce metabolitów od najniższego do najwyższego stężenia i zapisać odpowiednie intensywności jonów m/z.

6. Kwantyfikacja

1. Tworzenie metody eksportu
   1. W oprogramowaniu do akwizycji danych wybierz Plik > Nowa metoda > Metoda eksportu.
   2. Określ nazwę pliku, na przykład AnilineTagging_Date.
   3. Zaznacz opcję Eksportuj plik ASCII i wybierz katalog, do którego chcesz wyeksportować plik tekstowy.
   4. W polu Typ raportu wybierz pozycję Podsumowanie według wszystkich.
   5. W polu Ograniczniki w polu Kolumna wybierz ,. W polu Wiersz wybierz opcję [cr][if].
   6. W polu Tabela wybierz opcję Eksportuj, a następnie Edytuj tabelę, aby uwzględnić nazwę próbki, obszar, wysokość, ilość i jednostki.
   7. Zapisz metodę eksportu.
2. Kwantyfikacja metabolitów za pomocą wzorców wewnętrznych przy użyciu oprogramowania do akwizycji danych
   1. Na karcie Sample Sets (Zestawy próbek) kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiedni przebieg LC/MS i wybierz opcję View as > Channels (Wyświetl jako kanały ).
   2. Wybierz wszystkie kanały SIR dla ¹³wewnętrznych wzorców C-aniliny dla jednego wstrzyknięcia, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Przejrzyj.
   3. Jeśli okno Układ metody przetwarzania LC nie pojawi się automatycznie, przejdź do opcji Widok układu metody przetwarzania >
   4. W Processing Method Layout przejdź do zakładki Integration i ustaw ApexTrack jako algorytm.
   5. Przejdź do zakładki Wygładzanie i ustaw typ na Średnia, a poziom wygładzania na 13,
      UWAGA: Można wybrać dowolny poziom wygładzania, o ile jest on spójny we wszystkich próbkach.
   6. W zakładce MS Channel wyłącz MS 3D Processing.
   7. W oknie kanału SIR zintegruj każdy szczyt, po jednym kanale na raz. Po zintegrowaniu piku przejdź do Opcje > Wypełnij z wyniku, a szczegóły piku zostaną wypełnione w zakładce Komponenty. Zmień nazwę piku na odpowiadającą jej nazwę złożoną.
   8. Po ocenie wszystkich kanałów SIR zapisz metodę przetwarzania i zamknij okno.
   9. Wybierz wszystkie kanały SIR próbki ^{oznaczonej 13}C-aniliną i ¹²C-aniliną, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Proces.
   10. Zaznacz pole Proces, wybierz opcję Użyj określonej metody przetwarzania i wybierz metodę przetwarzania, która została właśnie zapisana. Zaznacz również pole Eksportuj, wybierz Użyj określonej metody eksportu i wybierz zapisaną wcześniej metodę eksportu. Kliknij przycisk OK.
   11. Otwórz wyeksportowany plik tekstowy w programie Excel i oblicz stężenie nieznanego związku za pomocą:
       
       gdzie C_x,i jest stężeniem nieznanego próbki dla metabolitu i, A_x,i jest obszarem całkowania nieznanego metabolitu i, A_std,i jest obszarem całkowania wzorca wewnętrznego metabolitu i, C_std,i jest stężeniem wzorca wewnętrznego metabolitu i, a D jest współczynnikiem rozcieńczenia.
3. Kwantyfikacja nieznakowanych metabolitów za pomocą krzywej wzorcowej
   1. Na karcie Sample Sets (Zestawy próbek) kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiedni przebieg LC/MS i wybierz opcję View as > Channels (Wyświetl jako kanały ).
   2. Wybierz wszystkie kanały SIR dla nieoznakowanych standardów jednego wstrzyknięcia, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Przejrzyj.
   3. Jeśli okno Układ metody przetwarzania LC nie pojawi się automatycznie, przejdź do opcji Widok układu metody przetwarzania >
   4. W Processing Method Layout przejdź do zakładki Integration i ustaw ApexTrack jako algorytm.
   5. Przejdź do zakładki Wygładzanie i ustaw typ na Średnia, a poziom wygładzania na 13,
      UWAGA: Można wybrać dowolny poziom wygładzania, o ile jest on spójny we wszystkich próbkach.
   6. W zakładce MS Channel wyłącz MS 3D Processing.
   7. W oknie kanału SIR zintegruj każdy szczyt, po jednym kanale na raz. Po zintegrowaniu piku przejdź do Opcje > Wypełnij z wyniku, a szczegóły piku zostaną wypełnione w zakładce Komponenty. Zmień nazwę piku na odpowiadającą jej nazwę złożoną.
   8. Po ocenie wszystkich kanałów SIR zapisz metodę przetwarzania i zamknij okno.
   9. Na karcie Sample Sets (Zestawy próbek) kliknij prawym przyciskiem myszy na zestaw próbek i wybierz opcję Alter Sample.
   10. Wybierz opcję Kwota w nowym oknie.
   11. Wybierz opcję kopiuj z metody procesu i wybierz metodę procesu, która została właśnie zapisana.
   12. Wprowadź stężenie każdego metabolitu dla każdej fiolki i wprowadź jednostkę jako <μM dla każdego składnika (lub odpowiedniej jednostki) i wybierz przycisk OK.
   13. Ponownie wybierz przykładowy zestaw, kliknij prawym przyciskiem myszy, Wyświetl jako > kanały.
   14. Zaznacz wszystkie kanały SIR nieoznakowanych metabolitów dla wzorców, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Proces.
   15. Zaznacz pole Proces i wybierz opcję Użyj określonej metody przetwarzania. Wybierz odpowiednią metodę przetwarzania i kliknij przycisk OK.
   16. Wybierz kanały SIR dla wszystkich nieoznakowanych metabolitów dla próbek, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Proces.
   17. Zaznacz pole Proces, wybierz opcję Użyj określonej metody przetwarzania i wybierz metodę przetwarzania, która została właśnie zapisana. Zaznacz również pole Eksportuj, wybierz Użyj określonej metody eksportu i wybierz zapisaną wcześniej metodę eksportu. Kliknij przycisk OK.
   18. Określ ilościowo nieoznakowane metabolity za pomocą krzywej standardowej i wyeksportuj wyniki do pliku tekstowego do określonego katalogu.

Wyniki

Jako dowód słuszności koncepcji, użyliśmy protokołu do ilościowego określenia metabolitów w systemie CFPS opartym na E. coli, wyrażającym białko zielonej fluorescencji (GFP). Reakcja CFPS (14 μL) została wygaszona i odbiałczona etanolem. Próbka CFPS została następnie oznaczona ¹²C-aniliną, podczas gdy wzorce zostały oznaczone ¹³C-aniliną. Oznaczoną próbkę i wzorce połączono następnie i wstrzyknięto do LC/MS (Rysunek 1). W protokole wykryto i określono ilościowo 40 metabo...

Dyskusja

Systemy bezkomórkowe nie mają ściany komórkowej, dzięki czemu istnieje bezpośredni dostęp do metabolitów i maszynerii biosyntetycznej bez konieczności skomplikowanego przygotowywania próbek. Jednak bardzo niewiele pracy włożono w opracowanie dokładnych i solidnych protokołów do ilościowego badania bezkomórkowych systemów reakcyjnych. W tym badaniu opracowaliśmy szybką, solidną metodę ilościowego oznaczania metabolitów w bezkomórkowych mieszaninach reakcyjnych i potencjalnie w ekstraktach całokomórkowych. Indywidualne ozn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12C Anilina	Sigma-Aldrich	242284	Anilina 12C 13C
znakowana anilina	Sigma-Aldrich	485797	Anilina 13C6
Kwas 3-fosfoglicerynowy Kwas	Sigma-Aldrich	P8877	3PG
	FisherScientific	AC222140010	ACE
Acetonitryl, LCMS	JT BAKER	9829-03	ACN
Acetylokoenzym A	Sigma-Aldrich	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1,7 μ M, 2,1 x 150 mm Wody kolumnowe		186002353	Kolumna
Difosforan adenozyny	Sigma-Aldrich	A2754	ADP
Monofosforan adenozyny	Sigma-Aldrich	A1752	AMP
Trifosforan adenozyny	Sigma-Aldrich	A2383	ATP
Alfa-ketoglutaran	Sigma-Aldrich	K1128	aKG
Cytrynian	Sigma-Aldrich	251275	CIT
Difosforan cytydyny	Sigma-Aldrich	C9755	CDP
Monofosforan cytydyny	Sigma-Aldrich	C1006	CMP
Trifosforan cytydyny	Sigma-Aldrich	C9274	CTP
3-fosforan D-gliceryny	Sigma-Aldrich	39705	GAP
4-fosforan	erytrozySigma-Aldrich	E0377	E4P
Etanol	Sigma-Aldrich	EX0276	EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Wirówka	FisherScientific		Wirówka
Dinukleotyd flawinoadeninowy	Sigma-Aldrich	F6625	FAD
1,6-bisfosforan fruktozy	Sigma-Aldrich	F6803	F16P
6-fosforan fruktozy	Sigma-Aldrich	F3627	F6P
Fumaran	Sigma-Aldrich	F8509	FUM
Glukonian 6-fosforan	Sigma-Aldrich	P7877	6PG
Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270	GLC
Glukoza 6-fosforan	Sigma-Aldrich	G7879	G6P
3-fosforan glicerolu	Sigma-Aldrich	G7886	Gly3P
Difosforan guanozyny	Sigma-Aldrich	G7127	GDP
Monofosforan guanozyny	Sigma-Aldrich	G8377	GMP
Trifosforan guanozyny	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Kwas solny	Sigma-Aldrich	258148	HCl
Izocytrynian	Sigma-Aldrich	I1252	Mleczan ICIT
	Jabłczan Sigma-Aldrich	L1750	LAC
	Sigma-Aldrich	02288	MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit	ArborBiosciences	507024	Bezkomórkowa synteza białek
Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu	Sigma-Aldrich	03449	EDC
Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy	Sigma-Aldrich	43410	NAD
Fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego	Sigma-Aldrich	N5755	NADP
Zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego	Sigma-Aldrich	481973	NADPH
Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy	zredukowany Sigma-Aldrich	N8129	NADH
Szczawiotanian	Sigma-Aldrich	O4126	OAA
Fosfoenolopirogronian	Sigma-Aldrich	P0564	PEP
Pirogronian	Sigma-Aldrich	P5280	PYR
5-fosforan rybozy	Sigma-Aldrich	R7750	R5P
Rybuloza 5-fosforan	CarboSynth	MR45852	RL5P
7-fosforan sedoheptulozy	CarboSynth	MS07457	S7P
Bursztynian	Sigma-Aldrich	S3674	SUCC
Tributyloamina	Sigma-Aldrich	90780	TBA
Trietyloamina	FisherScientific	O4884	TEA
ultraczysta woda	FisherScientific	10977-015	woda
Difosforan urydyny	Sigma-Aldrich	U4125	UDP
Monofosforan urydyny	Sigma-Aldrich	U6375	UMP
Trifosforan urydyny	Sigma-Aldrich	U6625	UTP
VWR Heavy Duty Vortex	VWR		Vortex
Water, LCMS	JT BAKER	9831-03	WATER
Waters Acquity H Klasa UPLC Czwartorzędowy rozpuszczalnik Manager	Wody		LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN	Waters		LCMS
Detektor Waters Acquity Qda	Wody		LCMS
Waters Empower 3	Waters		Software
Waters LCMS Fiolka do całkowitego odzyskiwania	Wody	186000384c	Fiolka LCMS