Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bezkomórkowa synteza białek (CFPS) to nowa technologia w systemach i biologii syntetycznej do produkcji białek in vitro. Jeśli jednak CFPS ma wyjść poza laboratorium i stać się powszechną i standardową technologią produkcji just in time, musimy zrozumieć ograniczenia wydajności tych systemów. W odpowiedzi na to pytanie opracowaliśmy solidny protokół ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w glikolizie, szlaku pentozofosforanowym, cyklu kwasów trikarboksylowych, metabolizmie energetycznym i regeneracji kofaktora w reakcjach CFPS. W metodzie wykorzystuje się wzorce wewnętrzne oznaczone 13C-aniliną, natomiast związki w próbce są derywatyzowane 12C-aniliną. Wzorce wewnętrzne i próbkę zmieszano i przeanalizowano za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas z odwróconymi fazami (LC/MS). Koelucja związków wyeliminowała supresję jonów, umożliwiając dokładne określenie ilościowe stężeń metabolitów w zakresie 2-3 rzędów wielkości, gdzie średni współczynnik korelacji wynosił 0,988. Pięć z czterdziestu związków nie było oznakowanych aniliną, jednak nadal były one wykrywane w próbce CFPS i oznaczane ilościowo metodą krzywej standardowej. Przebieg chromatograficzny trwa około 10 minut. Podsumowując, opracowaliśmy szybką, solidną metodę separacji i dokładnego ilościowego oznaczania 40 związków wchodzących w skład CFPS w jednym cyklu LC/MS. Metoda ta jest kompleksowym i dokładnym podejściem do charakteryzowania metabolizmu bezkomórkowego, dzięki czemu ostatecznie możemy zrozumieć i poprawić wydajność, produktywność i efektywność energetyczną systemów bezkomórkowych.
Wprowadzenie
Bezkomórkowa synteza białek (CFPS) to obiecująca platforma do produkcji białek i substancji chemicznych, która tradycyjnie była zarezerwowana dla żywych komórek. Systemy bezkomórkowe pochodzą z surowych ekstraktów komórkowych i eliminują komplikacje związane ze wzrostem komórek1. Ponadto CFPS umożliwia bezpośredni dostęp do metabolitów i maszynerii biosyntezy bez ingerencji ściany komórkowej. Brakowało jednak podstawowej wiedzy na temat ograniczeń wydajności procesów bezkomórkowych. Wysokoprzepustowe metody kwantyfikacji metabolitów są cenne dla charakterystyki metabolizmu i mają kluczowe znaczenie dla budowy metabolicznych modeli obliczeniowych2,3,4. Typowe metody stosowane do określania stężeń metabolitów obejmują magnetyczny rezonans jądrowy (NMR), spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR), testy enzymatyczne i spektrometrię mas (MS)5,6,7,8. Metody te są jednak często ograniczone ze względu na ich niezdolność do skutecznego pomiaru wielu związków jednocześnie i często wymagają próbki o wielkości większej niż typowe reakcje bezkomórkowe. Na przykład testy oparte na enzymach mogą być często stosowane tylko do ilościowego oznaczania pojedynczego związku w serii i są ograniczone, gdy wielkość próbki jest mała, na przykład w bezkomórkowych reakcjach syntezy białek (zwykle przeprowadzanych w skali 10-15 μl). Tymczasem NMR wymaga dużej ilości metabolitów do wykrywania i kwantyfikacji5. W obliczu tych niedociągnięć, metody chromatograficzne w połączeniu ze spektrometrią mas (LC/MS) zapewniają kilka zalet, w tym wysoką czułość i możliwość jednoczesnego pomiaru wielu gatunków9; Złożoność analityczna znacznie wzrasta jednak wraz z liczbą i różnorodnością mierzonych gatunków. Dlatego ważne jest, aby opracować metody, które w pełni wykorzystają potencjał systemów LC/MS w zakresie wysokiej przepustowości. Związki w próbce rozdziela się metodą chromatografii cieczowej i identyfikuje za pomocą spektrometrii mas. Sygnał związku zależy od jego stężenia i skuteczności jonizacji, przy czym jonizacja może się różnić w zależności od związków, a także może zależeć od matrycy próbki.
Osiągnięcie takiej samej efektywności jonizacji między próbką a wzorcami jest wyzwaniem przy użyciu LC/MS do ilościowego oznaczania analitów. Co więcej, kwantyfikacja staje się trudniejsza w przypadku różnorodności metabolitów ze względu na podział sygnału i niejednorodność powinowactwa i polaryzacji protonów10. Wreszcie, matryca koelucyjna próbki może również wpływać na wydajność jonizacji związków. Aby rozwiązać te problemy, metabolity mogą być derywatyzowane chemicznie, co zwiększa rozdzielczość i czułość separacji przez systemy LC/MS, jednocześnie zmniejszając w niektórych przypadkach rozszczepianie sygnału10,11. Derywatyzacja chemiczna polega na znakowaniu określonych grup funkcyjnych metabolitów w celu dostosowania ich właściwości fizycznych, takich jak ładunek lub hydrofobowość, w celu zwiększenia wydajności jonizacji11. Różne środki znakujące mogą być stosowane do celowania w różne grupy funkcyjne (np. aminy, hydroksyle, fosforany, kwasy karboksylowe itp.). Anilina, jeden z takich środków do derywatyzacji, celuje w wiele grup funkcyjnych jednocześnie i dodaje składnik hydrofobowy do cząsteczek hydrofilowych, zwiększając w ten sposób ich rozdzielczość separacji i signal12. Aby rozwiązać problem efektu tłumienia jonów w matrycy koelucyjnej, Yang i współpracownicy opracowali technikę opartą na znakowaniu technologii wzorców wewnętrznych specyficznych dla grupy (GSIST), w której wzorce są oznaczane izotopami aniliny 13C i mieszane z próbką12,13. Metabolit i odpowiadający mu wzorzec wewnętrzny mają taką samą wydajność jonizacji, ponieważ współeluują, a ich stosunek intensywności można wykorzystać do ilościowego określenia stężenia w próbce doświadczalnej.
W tym badaniu opracowaliśmy protokół do wykrywania i ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w glikolizie, szlaku pentozy fosforanowej, cyklu kwasów trikarboksylowych, metabolizmie energii i regeneracji kofaktora w reakcjach CFPS. Metoda opiera się na podejściu GSIST, w którym użyliśmy 12C-aniliny i 13C-aniliny do znakowania, wykrywania i ilościowego oznaczania metabolitów za pomocą odwróconej fazy LC/MS. Zakres liniowy wszystkich związków wynosił 2-3 rzędy wielkości ze średnim współczynnikiem korelacji wynoszącym 0,988. W związku z tym metoda ta jest solidnym i dokładnym podejściem do badania metabolizmu wolnego od komórek i ewentualnie ekstraktów z całych komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników do znakowania aniliną
- Przygotować 6 M roztwór aniliny o pH 4,5. Pracując w dygestorium, połączyć 550 µL aniliny z 337,5 µL wody klasy LCMS oraz 112,5 µL 12 M kwasu solnego (HCl) w probówce do wirowania. Dokładnie wymieszać na wortexie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Anilinę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 miesiące.
OSTROŻNIE: Anilina jest silnie toksyczna i należy z nią pracować w dygestorium. Kwas solny jest silnie żrący - Przygotować 6 M roztwór 13C-aniliny o pH 4,5. Połączyć 250 mg 13C6-aniliny z 132 µL wody i 44 µL 12 M HCl. Dokładnie wymieszać na wortexie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować 200 mg/mL roztwór chlorowodorku N-(3-dimetyloaminopropylo)-N-etylokarbodiimidu (EDC). Rozpuścić 2 mg EDC w 10 µL wody dla każdej próbki przeznaczonej do znakowania i dokładnie wymieszać na wortexie.
UWAGA: Roztwór EDC należy przygotować w dniu przeprowadzenia reakcji. EDC działa jako katalizator w procesie pochodnej związków z aniliną12.
2. Przygotowanie standardów
- Przygotować oddzielne roztwory stokowe wszystkich związków rozpuszczonych w wodzie klasy LC/MS (Tabela 1).
- Przygotowanie roztworu stokowego wzorca wewnętrznego
- Połączyć wszystkie związki z wyjątkiem nikotynamidoadeniny dinukleotydu (NAD), nikotynamidoadeniny dinukleotydofosforanu (NADP), flawinoadeniny dinukleotydu (FAD), acetylo-koenzymu A (ACA) oraz glicerolo-3-fosforanu (Gly3P), stosując odpowiednie objętości w celu otrzymania 2 mM roztworu stokowego wszystkich związków.
- Połączyć NAD, NADP, FAD, ACA oraz Gly3P z odpowiednimi objętościami w celu otrzymania 2 mM roztworu stokowego.
3. Przygotowanie próbki (Rysunek 1)
- Zatrzymaj reakcję i wytrąć białka z bezkomórkowej syntezy białek, dodając do mieszaniny równą objętość lodowatego 100% etanolu. Odwiruj próbkę z prędkością 12,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Przenieś nadsącz do nowej probówki wirówkowej.
UWAGA: Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C i poddać analizie w późniejszym terminie
4. Reakcja znakowania
- Znakowanie próbki roztworem 12C-aniliny
- Przenieść 6 µL próbki do nowej probówki do wirowania i uzupełnić objętość do 50 µL wodą.
UWAGA: Objętość próbki może zależeć od konkretnej reakcji CFPS. - Dodać 5 µL roztworu EDC o stężeniu 200 mg/mL.
- Dodać 5 µL roztworu 12C-aniliny.
UWAGA: Roztwór aniliny rozwarstwia się na dwie fazy. Przed dodaniem do reakcji należy go dokładnie wymieszać. - Wymieszać reakcję na wstrząsarze (vortex) przy łagodnym wstrząsaniu przez 2 h w temperaturze pokojowej.
- Po 2 h wyjąć probówki z wstrząsarki i dodać 1,5 µL trietyloaminy (TEA) do reakcji w dygestorium.
UWAGA: Trietyloamina podnosi pH roztworu, co zatrzymuje reakcję znakowania aniliną i stabilizuje związki.
OSTROŻNIE: Trietyloamina jest toksyczna i powoduje podrażnienie oczu oraz dróg oddechowych. - Wirować przy 13 500 x g przez 3 min.
- Przenieść 6 µL próbki do nowej probówki do wirowania i uzupełnić objętość do 50 µL wodą.
- Znakowanie standardów wewnętrznych roztworem 13C-aniliny
- Rozcieńczyć roztwór zapasowy standardu wewnętrznego do stężenia 80 µM przy objętości końcowej 50 µL.
UWAGA: Stężenie standardów wewnętrznych można dostosować do poziomów zbliżonych do próbki eksperymentalnej. - Dodać 5 µL roztworu EDC o stężeniu 200 mg/mL.
- Dodać 5 µL roztworu 13C-aniliny.
- Wymieszać reakcję na wstrząsarze (vortex) przy łagodnym wstrząsaniu przez 2 h w temperaturze pokojowej.
- Po 2 h wyjąć probówki z wstrząsarki i dodać 1,5 µL TEA do reakcji w dygestorium.
- Wirować przy 13 500 x g przez 3 min.
- Rozcieńczyć roztwór zapasowy standardu wewnętrznego do stężenia 80 µM przy objętości końcowej 50 µL.
- Łączenie znakowanego standardu wewnętrznego i znakowanej próbki
- Wymieszać 25 µL próbki znakowanej 12C-aniliną z 25 µL standardu znakowanego 13C-aniliną.
- Przenieść do fiolki autosamplera i przeanalizować zgodnie z procedurą LC/MS.
- Tworzenie krzywej wzorcowej dla metabolitów nieznakowanych
- Rozcieńczyć roztwór zapasowy metabolitów nieznakowanych (NAD, NADP, FAD, ACA i Gly3P) do stężeń końcowych 320 µM, 80 µM, 20 µM i 5 µM przy objętości 50 µL.
- Dodać 5 µL roztworu EDC o stężeniu 200 mg/mL.
- Dodać 5 µL roztworu 12C-aniliny.
- Wymieszać reakcję na wstrząsarze (vortex) przy łagodnym wstrząsaniu przez 2 h w temperaturze pokojowej.
- Po 2 h wyjąć probówki z wstrząsarki i dodać 1,5 µL TEA do reakcji w dygestorium.
- Wirować przy 13 500 x g przez 3 min.
- Przenieść nadsącz do fiolki autosamplera i przeanalizować zgodnie z procedurą LC/MS.
UWAGA: Metabolity nieznakowane są poddawane tej samej procedurze co próbka, aby odwzorować macierz próbki w celu zachowania podobnej wydajności jonizacji.
5. Konfiguracja procedury LC/MS
- Przygotowanie rozpuszczalników
- Przygotować 5 mM wodny roztwór tri-butylaminy (TBA) z pH skorygowanym do 4,75 za pomocą kwasu octowego.
UWAGA: TBA w fazie ruchomej pomaga uzyskać dobrą rozdzielczość i separację analitów14. - Przygotować 5 mM TBA w acetonitrylu (ACN).
- Przygotować rozpuszczalnik do mycia składający się z 5% wody i 95% ACN.
- Przygotować rozpuszczalnik do płukania składający się z 95% wody i 5% ACN.
- Przygotować 5 mM wodny roztwór tri-butylaminy (TBA) z pH skorygowanym do 4,75 za pomocą kwasu octowego.
- Ustawienie warunków MS
- Ustawić spektrometr mas w trybie jonów ujemnych z temperaturą sondy 520 °C, ujemnym napięciem kapilarnym -0,8 kV, dodatnim napięciem kapilarnym 0,8 kV i skonfigurować oprogramowanie do pozyskiwania danych z częstotliwością 5 punktów/s.
- Ustawić rejestrację wybranych jonów (SIR) dla każdego metabolitu z określonymi napięciami stożka i wartościami stosunku masy do ładunku (m/z). Patrz Tabela 1.
- Inicjalizacja LC/MS zgodnie z instrukcjami producenta
- Przepłukać linie rozpuszczalników w menedżerze rozpuszczalników przez 3 min.
- Przepłukać rozpuszczalnikiem do mycia (5% wody, 95% ACN) i rozpuszczalnikiem do płukania (95% wody, 5% ACN) przez 15 s przez 5 cykli.
- Ustawić temperaturę w menedżerze próbek na 10 °C.
- Zainstalować kolumnę C18 (1,7µm, 2,1mm x 150mm) i zainicjować kolumnę 100% ACN przy przepływie 0,3 mL/min przez 10 min.
- Kondycjonować kolumnę w 95% wody i 5% ACN przy 0,3 mL/min przez 10 min przed wprowadzeniem rozpuszczalników z buforami.
- Kondycjonować kolumnę w 95% rozpuszczalnika A (5mM TBA w wodzie, pH 4,75) i 5% rozpuszczalnika B (5 mM TBA w ACN) przy 0,3 mL/min przez 10 min.
- Ustawić protokół gradientowy z elucją rozpoczynającą się od 95% rozpuszczalnika A i 5% rozpuszczalnika B, zwiększoną do 70% rozpuszczalnika B w ciągu 10 min, zwiększoną do 100% rozpuszczalnika B w ciągu 2 min i utrzymywaną na poziomie 100% rozpuszczalnika B przez 3 min. Powrócić do warunków początkowych (95% rozpuszczalnika A, 5% rozpuszczalnika B) w ciągu 1 min i utrzymać przez 9 min w celu ponownej równowagi kolumny.
- Kondycjonować kolumnę zgodnie z protokołem gradientowym 3 razy przed jakimikolwiek wtryskami na kolumnę.
- Wtryskiwanie próbki i wzorców
- Wtrysnąć 5 µL próbki na kolumnę i pozyskać odpowiednie intensywności jonów m/z dla próbki znakowanej 12C-aniliną.
- Wtrysnąć ponownie 5 µL tej samej próbki, ale tym razem pozyskać intensywności jonów m/z dla wzorców znakowanych 13C-aniliną.
UWAGA: Nasz system LC/MS nie jest w stanie pozyskiwać intensywności m/z dla 12C i 13C jednocześnie w określonych oknach czasowych SIR, ponieważ jest to zbyt duża ilość danych do pozyskania w danym oknie czasowym. Dlatego wtryskujemy tę samą próbkę dwukrotnie. - Wtrysnąć nieznakowane wzorce metabolitów od najniższego do najwyższego stężenia i zarejestrować odpowiednie intensywności jonów m/z.
6. Ilościowe oznaczenie
- Tworzenie metody eksportu
- W oprogramowaniu do akwizycji danych należy wybrać Plik > Nowa metoda > Metoda eksportu.
- Określ nazwę pliku, na przykład Znakowanie aniliną_Data.
- Sprawdź Eksport ASCII Wybierz folder, do którego zostanie wyeksportowany plik tekstowy.
- W Typ raportuwybierz Podsumowanie wszystkich osób.
- W ograniczniki, dla Kolumna wybierz a ,Dla Rządwybierz [cr][if].
- W Tablewybierz Eksport a następnie Edytuj tabelę zawierać NazwaPróbki, Obszar, Wysokość, Ilość i Jednostki.
- Zapisz metodę eksportu.
- Ilościowe oznaczanie metabolitów z użyciem standardów wewnętrznych przy pomocy oprogramowania do akwizycji danych
- Pod Zestawy próbek karta, kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiedni LC/MS uruchom i wybierz Wyświetl jako > Kanały.
- Wybierz wszystkie kanały SIR dla 13standardy wewnętrzne C-aniliny z jednego wtrysku, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Przegląd.
- Jeśli Układ metody przetwarzania LC jeśli okno nie pojawi się automatycznie, przejdź do Widok > Układ metody przetwarzania.
- W Układ metody przetwarzaniaprzejdź do Integracja zakładka i zestaw ApexTrack jako algorytm.
- Przejdź do Wygładzanie zakładka i ustaw typ na Średnia or poziom wygładzania na 13.
UWAGA: Można wybrać dowolny poziom wygładzania, pod warunkiem że będzie on spójny dla wszystkich próbek. - W stwardnienie rozsiane Kanał karta, wyłącz stwardnienie rozsiane 3D Przetwarzanie.
- W oknie kanału SIR zintegruj każdy pik, przetwarzając po jednym kanale na raz. Po zintegrowaniu piku przejdź do Opcje > Wypełnij z wyniku a szczegóły piku zostaną uzupełnione w Komponenty tab. Zmień nazwę piku na nazwę odpowiadającego mu związku.
- Po przeanalizowaniu wszystkich kanałów SIR należy zapisać metodę przetwarzania i zamknąć okno.
- Wybierz wszystkie kanały SIR z 13C-anilina i 12próbka znakowana C-aniliną, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Proces.
- Sprawdź Proces pole, wybierz Stosuj określoną metodę przetwarzaniai wybierz metodę przetwarzania, która została właśnie zapisana. Sprawdź również Eksport pole, wybierz Użyj określonej metody eksportu i wybierz zapisaną metodę eksportu utworzoną wcześniej. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
- Otwórz wyeksportowany plik tekstowy w programie Excel i oblicz stężenie nieznanego związku, korzystając z:
gdzie Cx,i stężenie metabolitu i w próbce nieznanej, Ax,i czy pole zintegrowane nieznanego metabolitu i, Astd,i jest polem całkowania (powierzchnią piku) standardu wewnętrznego dla metabolitu i, Cstd,i jest stężeniem standardu wewnętrznego metabolitu i, a D to czynnik rozcieńczenia.
- Ilościowe oznaczanie nieoznakowanych metabolitów przy użyciu krzywej wzorcowej
- Pod Próbka Zbiory zakładka, kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiedni pomiar LC/MS i wybierz Wyświetl jako > Kanały.
- Zaznacz wszystkie kanały SIR dla nieoznaczonych standardów jednego wtrysku, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Przegląd.
- Jeśli Schemat metody przetwarzania LC jeśli okno nie pojawi się automatycznie, przejdź do Widok > Układ metody przetwarzania.
- W sekcji Układ metody przetwarzania przejdź do Integracja zakładka i zestaw ApexTrack jako algorytm.
- Przejdź do Wygładzanie kartę i ustaw typ na Średnia or poziom wygładzania na 13.
UWAGA: Można wybrać dowolny poziom wygładzania, pod warunkiem że będzie on spójny dla wszystkich próbek. - W MS Kanał karta, wyłącz stwardnienie rozsiane 3D Przetwarzanie.
- W oknie kanału SIR zintegruj każdy pik, przetwarzając po jednym kanale naraz. Po zintegrowaniu piku przejdź do Opcje > Wypełnij z rezultatu a szczegóły piku zostaną uzupełnione w Komponenty tab. Zmień nazwę piku na nazwę odpowiadającego mu związku.
- Po ocenie wszystkich kanałów SIR należy zapisać metodę przetwarzania i zamknąć okno.
- Pod Próbka Zbiory karta, kliknij prawym przyciskiem myszy na zestawie próbek i wybierz Zmiana próbki.
- Wybierz Ilość w nowym oknie.
- Wybierz kopię z Proces metodę i wybrać właśnie zapisaną metodę procesu.
- Wprowadź stężenie każdego metabolitu dla każdej fiolki i wprowadź jednostkę jako <μM dla każdego komponentu (lub odpowiadającej mu jednostki) i wybierz Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
- Ponownie zaznacz zestaw próbek, kliknij prawym przyciskiem myszy, Wyświetl jako > Kanały.
- Zaznacz wszystkie kanały SIR nieoznakowanych metabolitów dla standardów, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Proces.
- Sprawdź Proces zaznacz i wybierz Stosuj określoną metodę przetwarzaniaWybierz odpowiednią metodę przetwarzania i kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
- Wybierz kanały SIR dla wszystkich nieoznaczonych metabolitów w próbkach, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Proces.
- Sprawdź Proces pole, wybierz Stosuj określone przetwarzanie metodę i wybrać metodę przetwarzania, która została przed chwilą zapisana. Należy również sprawdzić Eksport pole, wybierz Użyj określonej metody eksportu i wybierz zapisaną metodę eksportu utworzoną wcześniej. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
- Ilościowo oznacz nieznakowane metabolity przy użyciu krzywej wzorcowej i wyeksportuj wyniki do pliku tekstowego w wskazanym katalogu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W ramach dowodu koncepcji wykorzystaliśmy ten protokół do ilościowego oznaczenia metabolitów w systemie CFPS opartym na E. coli wykazującym ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Reakcję CFPS (14 μL) zatrzymano i przeprowadzono deproteinizację za pomocą etanolu. Próbkę CFPS znakowano następnie 12C-aniliną, natomiast standardy znakowano 13C-aniliną. Znakowaną próbkę oraz standardy połączono i wstrzyknięto do układu LC/MS (Rysunek 1). Protokół pozwo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Systemy bezkomórkowe nie mają ściany komórkowej, dzięki czemu istnieje bezpośredni dostęp do metabolitów i maszynerii biosyntetycznej bez konieczności skomplikowanego przygotowywania próbek. Jednak bardzo niewiele pracy włożono w opracowanie dokładnych i solidnych protokołów do ilościowego badania bezkomórkowych systemów reakcyjnych. W tym badaniu opracowaliśmy szybką, solidną metodę ilościowego oznaczania metabolitów w bezkomórkowych mieszaninach reakcyjnych i potencjalnie w ekstraktach całokomórkowych. Indywidualne ozn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Opisana praca była wspierana przez Centrum Fizyki Metabolizmu Nowotworów poprzez Nagrodę Numer 1U54CA210184-01 od National Cancer Institute ( https://www.cancer.gov/ ). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Cancer Institute lub National Institutes of Health. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 12C Anilina | Sigma-Aldrich | 242284 | Anilina 12C 13C |
| znakowana anilina | Sigma-Aldrich | 485797 | Anilina 13C6 |
| Kwas 3-fosfoglicerynowy Kwas | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| FisherScientific | AC222140010 | ACE | |
| Acetonitryl, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetylokoenzym A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1,7 μ M, 2,1 x 150 mm Wody kolumnowe | 186002353 | Kolumna | |
| Difosforan adenozyny | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Monofosforan adenozyny | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Trifosforan adenozyny | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alfa-ketoglutaran | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Cytrynian | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Difosforan cytydyny | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Monofosforan cytydyny | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Trifosforan cytydyny | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| 3-fosforan D-gliceryny | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| 4-fosforan | erytrozySigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Etanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Wirówka | FisherScientific | Wirówka | |
| Dinukleotyd flawinoadeninowy | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| 1,6-bisfosforan fruktozy | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| 6-fosforan fruktozy | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumaran | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Glukonian 6-fosforan | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glukoza 6-fosforan | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| 3-fosforan glicerolu | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Difosforan guanozyny | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Monofosforan guanozyny | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Trifosforan guanozyny | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Kwas solny | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Izocytrynian | Sigma-Aldrich | I1252 | Mleczan ICIT |
| Jabłczan Sigma-Aldrich | L1750 | LAC | |
| Sigma-Aldrich | 02288 | MAL | |
| myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Bezkomórkowa synteza białek |
| Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy | zredukowany Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Szczawiotanian | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Fosfoenolopirogronian | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pirogronian | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| 5-fosforan rybozy | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Rybuloza 5-fosforan | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| 7-fosforan sedoheptulozy | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Bursztynian | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributyloamina | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Trietyloamina | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultraczysta woda | FisherScientific | 10977-015 | woda |
| Difosforan urydyny | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Monofosforan urydyny | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Trifosforan urydyny | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H Klasa UPLC Czwartorzędowy rozpuszczalnik Manager | Wody | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Detektor Waters Acquity Qda | Wody | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Fiolka do całkowitego odzyskiwania | Wody | 186000384c | Fiolka LCMS |
Bibliografia
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012(2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
