Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowle organoidów prostaty jako narzędzia do translacji genotypów i profili mutacji na odpowiedzi farmakologiczne

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60346

⸱

24 października 2019

 ,  ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Howard Hughes Medical Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół do badania reakcji farmakologicznych w organoidach nabłonka prostaty. Organoidy bardzo przypominają biologię in vivo i podsumowują genetykę pacjenta, co czyni je atrakcyjnymi systemami modelowymi. Organoidy prostaty można ustalić z prostaty typu dzikiego, genetycznie modyfikowanych modeli myszy, łagodnych tkanek ludzkich i zaawansowanego raka prostaty.

Streszczenie

Prezentowany tutaj jest protokół do badania farmakodynamiki, potencjału komórek macierzystych i różnicowania raka w organoidach nabłonka prostaty. Organoidy prostaty to reagujące na androgeny, trójwymiarowe (3D) kultury hodowane w określonym podłożu przypominającym nabłonek gruczołu krokowego. Organoidy prostaty można ustalić na podstawie dzikich i genetycznie modyfikowanych modeli mysich, łagodnych tkanek ludzkich i zaawansowanego raka prostaty. Co ważne, organoidy pochodzące od pacjentów bardzo przypominają nowotwory w genetyce i biologii nowotworów in vivo. Co więcej, organoidy mogą być manipulowane genetycznie przy użyciu systemów CRISPR/Cas9 i shRNA. Ta kontrolowana genetyka sprawia, że hodowla organoidów jest atrakcyjna jako platforma do szybkiego testowania wpływu genotypów i profili mutacji na odpowiedzi farmakologiczne. Jednak protokoły eksperymentalne muszą być specjalnie dostosowane do trójwymiarowego charakteru kultur organoidów, aby uzyskać powtarzalne wyniki. Opisano tutaj szczegółowe protokoły wykonywania testów wysiewu w celu określenia zdolności tworzenia organoidów. Następnie raport ten pokazuje, jak przeprowadzać leczenie farmakologiczne i analizować odpowiedź farmakologiczną za pomocą pomiarów żywotności, izolacji białek i izolacji RNA. Wreszcie, protokół opisuje, w jaki sposób przygotować organoidy do ksenoprzeszczepu i późniejszych testów wzrostu in vivo przy użyciu szczepienia podskórnego. Protokoły te dają wysoce powtarzalne dane i mają szerokie zastosowanie w systemach hodowli 3D.

Wprowadzenie

Oporność na leki jest jednym z głównych problemów klinicznych w leczeniu raka. Leczenie raka gruczołu krokowego z przerzutami (PCa) jest ukierunkowane przede wszystkim na oś sygnalizacji androgenowej. Terapie antyandrogenowe nowej generacji (np. enzalutamid i abirateron) wykazały duży sukces kliniczny, ale praktycznie wszystkie PCa ostatecznie postępują w kierunku stanu niezależnego od androgenów, czyli raka prostaty opornego na kastrację (CRPC).

Ostatnie profilowanie genomiczne i transkryptomiczne CRPC ujawniło, że istnieją trzy główne mechanizmy oporności w raku prostaty: 1) aktywacja mutacji skutkująca przywróceniem sygnalizacji receptora androgenowego (AR)1; 2) aktywacja sygnalizacji obejściowej, czego przykładem jest model przedkliniczny oporności na terapię antyandrogenową nowej generacji, w którym aktywacja receptora glukokortykoidowego (GR) może kompensować utratę sygnalizacji AR2; oraz 3) niedawno zidentyfikowany proces plastyczności linii, w którym komórki nowotworowe nabywają oporność poprzez zmianę linii z typu komórki zależnego od celu leku na inny typ komórek, który nie jest od niego zależny (który w PCa jest reprezentowany jako AR-ujemna i/lub choroba neuroendokrynna [NEPC])3,4. Jednak mechanizmy molekularne, które powodują oporność na leki, nie są poznane. Co więcej, nabyta oporność na antyandrogeny może prowadzić do podatności terapeutycznych, które można wykorzystać. Dlatego tak ważna jest ocena reakcji leków w systemach modelowych, które naśladują fenotypy i genotypy pacjenta.

Organoidy prostaty to organotypowe kultury hodowane w matrycy białkowej 3D z określonym podłożem. Co ważne, organoidy prostaty można ustalić z łagodnej i nowotworowej tkanki pochodzenia mysiego lub ludzkiego i zachowują one cechy fenotypowe i genotypowe występujące in vivo5,6. Co ważne, zarówno wrażliwe na antyandrogeny komórki PCa, jak i CRPC są reprezentowane w aktualnym kompendium organoidów. Co więcej, organoidy prostaty można łatwo manipulować genetycznie za pomocą CRISPR/Cas9 i shRNA5. W związku z tym organoidy prostaty są odpowiednim systemem modelowym do testowania odpowiedzi na leki i wyjaśniania mechanizmów oporności. Tutaj opisano szczegółowy protokół wykonywania testów leków i analizy odpowiedzi farmakologicznych za pomocą organoidów prostaty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace opisane w tym protokole zostały wykonane z wcześniej ustalonymi organoidami mysimi i organoidami pochodzącymi od pacjentów. Wszystkie prace na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Research Animal Resource Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Wszystkie tkanki pobrane od pacjenta zostały pobrane zgodnie z zasadami i przepisami Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).

1. Przygotowanie podłoża i bufora

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu rozmrozić matrycę błony podstawnej (np. Matrigel) w temperaturze 4 °C przez noc. Trzymaj go na lodzie podczas użytkowania.
  2. Umieścić płytki hodowlane w temperaturze 37 °C na 24 godziny przed eksperymentami. Pomoże to w polimeryzacji kopuły macierzystej membrany podstawnej (zwanej dalej kopułą matrycy). Posiewanie organoidów opisano w kroku 2.1.2.
  3. Przygotuj podłoże organoidowe zgodnie z ustalonym protokołem5.
  4. Przygotować podłoże organoidowe bez dodatku naskórkowego czynnika wzrostu (EGF; składniki znajdują się w tabeli materiałów). EGF hamuje wyjście transkrypcyjne AR i nadaje oporność antyandrogenową5.
  5. Przygotuj zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
    UWAGA: Pożywka ta służy do hamowania trawienia enzymatycznego z substytucją trypsyny w sekcjach 2-4.
  6. Przygotuj roztwory leków zgodnie z protokołem producenta. Dla enzalutamidu/mdv3100 (zwanego dalej antyandrogenem drugiej generacji) należy przygotować roztwór podstawowy 100 μM w dimetylosulfotlenku (DMSO). Wywar może być przechowywany w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy i nie musi być świeży.

2. Izolacja, trawienie enzymatyczne i tworzenie organoidów

  1. Wyizoluj organoidy prostaty z tkanek mysich lub ludzkich zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami5,7. Krótki opis znajduje się poniżej.
    1. Mielenie i enzymatyczne trawienie tkanki prostaty w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki. W tym eksperymencie 1 ml kolagenazy typu II o stężeniu 5 mg/ml w ADMEM/F12 użyto do trawienia 50 mg tkanki prostaty.
    2. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut, policzyć komórki, ponownie zawiesić je w matrycy błony podstawnej i płytkować w odpowiedniej gęstości5,7 w kopułach matrycy na wstępnie ogrzanych płytkach hodowli organoidów (metoda posiewu jest pokazana w Rysunek 1A).
    3. Pozwól kopułom zestalić się i dodaj media na wierzchołki kopuł, tak aby były całkowicie pokryte.
  2. Hoduj organoidy do pożądanej ilości do dalszych zastosowań. Numer komórki można określić za pomocą standardowych metod liczenia. Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat gęstości, zapoznaj się z sekcją protokołu dotyczącą poszczególnych aplikacji.
  3. Za pomocą pipety P1000 pobrać pożywkę i pipetować w górę iw dół, aby przerwać. Gdy matryca błony podstawnej zostanie całkowicie przerwana, przenieś zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Nie umieszczaj więcej niż 10 kopułek na pojedynczą stożkową probówkę o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
  4. Odciągnąć sklarowany osad i przemyć osad komórkowy 5 ml PBS. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
  5. Odciągnąć sklarat nad osadem i ponownie zawiesić osad w 4 ml trypsyny zastępczej. Trawić przez 5-10 minut, wstrząsając w temperaturze 37 °C. Dodać równą objętość pożywki organoidowej + 10% FBS, aby zahamować wymianę trypsyny. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
  6. Odciągnąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml PBS.
  7. Przefiltruj zawiesinę za pomocą filtra 40 μm, aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową. Określ ilościowo liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub równoważnego urządzenia zliczającego.
    UWAGA: Jeśli uzyskanie żywotnych pojedynczych komórek jest trudne, użyj sortowania przepływowego, aby uzyskać roztwór z pojedynczą komórką.

3. Ocena zdolności do tworzenia organoidów

UWAGA: Aby określić procent komórek, które mogą wytworzyć organoid, można przeprowadzić test wysiewu jako wskaźnik zastępczy dla potencjału macierzystego/progenitorowego. Zdolność tworzenia organoidów jest również ważna dla określenia liczby wysiewu komórek dla testów żywotności.

  1. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową otrzymaną w kroku 2,7 do 100 komórek na 10 μl zawiesiny przy użyciu pożywki organoidowej zawierającej inhibitor 10 μM kinazy Rho Y-27632.
  2. Przenieś 1 100 komórek (110 μl zawiesiny) do nowej stożkowej probówki.
  3. Dodać 285 μl macierzy błony podstawnej i ponownie zawiesić komórki. Spowoduje to ~70% stężenie matrycy.
    UWAGA: Rozcieńczenie macierzy błony podstawnej podczas siewu znacznie zmniejsza różnice w wielkości kopuły, spowodowane lepkością matrycy białkowej.
  4. Komórki nasienne w 35 μl kopuł matrycy na wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytce, co daje 200 komórek / dołek. Płytka 3-5 powtórzeń na próbkę (patrz również metoda powlekania w Rysunek 1A i krok 2.1.2).
  5. Aby upewnić się, że komórki pozostaną w kopule matrycy, odwróć płytkę i umieść ją w inkubatorze komórkowym w celu zestalenia macierzy błony podstawnej.
  6. Po 10 minutach wyjąć płytkę z inkubatora i dodać pożywkę zawierającą inhibitor kinazy Rho.
  7. Odświeżaj podłoże co 2 dni. Po 7 dniach określ ilościowo liczbę organoidów. Inhibitor kinazy Rho należy przechowywać w pożywce przez cały czas trwania eksperymentu.
  8. Policz liczbę organoidów ustalonych na kopułę i oblicz procent organoidów utworzonych z całkowitej liczby posianych komórek (200 komórek).
    UWAGA: Wskaźniki tworzenia organoidów wahają się od 3% do 60% w zależności od typu komórki i genotypu.

4. Określanie reakcji farmakologicznych organoidów

  1. Kontynuując od kroku 2.7, zasiej 1 000-10 000 komórek w kopule matrycy. Użyj wydajności tworzenia organoidów i szybkości wzrostu jako wskaźnika zastępczego do określenia ostatecznej liczby komórek.
    UWAGA: Zalecane numery komórek podano w Tabeli 1. Użyj od trzech do pięciu powtórzeń na warunek na analizę. Użyj końcowego stężenia 70% matrycy membrany podstawnej, aby zmniejszyć błędy pipetowania spowodowane lepkością.
  2. Zasiać 35 μl kopuł matrycy w 24-dołkowej płytce i pozwolić kopułkom zestalić się, jak to zrobiono w sekcji 3 (patrz również metoda powlekania w Rysunek 1A i krok 2.1.2). Dodać pożywkę zawierającą inhibitor kinazy Rho i lek z wyboru. Metodę tę można zastosować do wszystkich leków, ale w tym protokole na przykład stosuje się antyandrogen drugiej generacji o stężeniu 10 μM. Aby określić połowę maksymalnego stężenia hamującego (IC50), należy wykonać przyrost log10, a jako kontrolę użyć nośnika, w którym lek został rozpuszczony.
  3. Odświeżaj pożywkę co dwa lub trzy dni i analizuj organoidy w 7 dniu, aby określić odpowiedź farmakologiczną leku. Punkty czasowe mogą się różnić w zależności od wyboru eksperymentu i leku.
    UWAGA: Organoidy nie muszą być trypsynizowane, aby wykonać te testy.
  4. Aby utrzymać organoidy w stanie nienaruszonym, za pomocą pipety P1000 należy pobrać pożywkę i pipetę w górę iw dół, aby rozbić matrycę błony podstawnej.
  5. Gdy matryca błony podstawnej zostanie całkowicie przerwana, przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Nie przenoś więcej niż 10 kopułek matrycowych na probówkę stożkową o pojemności 15 ml.
  6. Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Odciągnąć sklarowany osad i przemyć 5 ml PBS.
  7. Zawiesić organoidy w 1 ml PBS i rozbić organoidy za pomocą rozcierania i szklanej pipety Pasteura.
  8. Określ ilościowo liczbę fragmentów organoidów. Powtórzenia nasion 5 zawierające 100 fragmentów organoidów, jak opisano w kroku 2.1.2.
  9. Przeprowadzić test żywotności komórek zgodnie z opisem poniżej w sekcji 7.

5. Izolacja RNA z organoidów

UWAGA: Komercyjnie dostępne metody oparte na kolumnach dają dobrą ilość i jakość RNA. Aby zapewnić dobrą ilość RNA, należy użyć co najmniej jednej kopuły na próbkę; Zaleca się jednak użycie trzech kopuł, które można wysiać w jednym dołku na 12-dołkowej płytce.

  1. Dodaj ß-merkaptoetanol (1%) do buforu do lizy glutationu w zestawie do izolacji RNA.
  2. Pobrać pożywkę z kopuł błony podstawnej zawierających organoidy i dodać 750 μl tego buforu. Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety P1000. Sprawdź, czy cała matryca błony podstawnej została rozpuszczona.
  3. Dodać 750 μl 70% etanolu i wymieszać pipetując. Następnie przenieść 700 μl mieszaniny do kolumny, odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę i powtórzyć z pozostałą częścią lizatu.
  4. Wykonać płukanie i obróbkę DNazy na kolumnie zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować RNA w 30-50 μl wody wolnej od RNAzy.
  5. Zmierzyć stężenia za pomocą fluorometru przy OD = 260 nm i 280 nm i przechowywać w temperaturze -80 °C lub kontynuować dalsze aplikacje.

6. Izolacja białek z organoidów

UWAGA: Do izolacji białek przygotuj standardowy bufor RIPA zawierający inhibitory fosfatazy i proteazy (Tabela materiałów). Zaleca się użycie co najmniej trzech kopuł, które można wysiać w jednej 12 studzienkach.

  1. Za pomocą pipety P1000 pobrać pożywkę z komórki z kopułami błony podstawnej zawierającymi organoidy i pipetą w górę iw dół, aby rozbić macierz błony podstawnej.
  2. Po całkowitym rozerwaniu zawiesinę przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
  3. Odciągnąć sklarowany osad i przemyć 5 ml lodowatego PBS. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
  4. Odciągnąć sklarat nad osadem i ponownie zawiesić osad w 4 ml trypsyny zastępczej. Trawić przez 5-10 minut, wstrząsając w temperaturze 37 °C.
  5. Dodaj równą objętość pożywki organoidowej + 10% FCS, aby zahamować wymianę trypsyny. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    UWAGA: Po odwirowaniu w granulce nie powinna być widoczna matryca membrany podstawnej.
  6. Odciągnąć sklarowany osad i przemyć 5 ml lodowatego PBS. Odciągnąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 300 μl buforu do lizy za pomocą pipety P1000, a następnie przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  7. Inkubować na lodzie przez 10 minut, a następnie sonikować 2x przez 30 s każdy w schłodzonej wodzie o temperaturze 4 °C. Umieścić probówkę z powrotem na lodzie i przeprowadzić kwantyfikację białka przy użyciu standardowych metod.
  8. Denaturacja białka przez dodanie dodecylosiarczanu sodu (SDS) zawierającego barwnik nasycający i gotować przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C lub kontynuować dalsze aplikacje.

7. Test żywotności komórek za pomocą organoidów

UWAGA: Żywotność komórek można ocenić za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oznaczania żywotności komórek i luminometru. Przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta. Zaleca się pięć powtórzeń na warunek: jedna kontrpróba składająca się z jednej kopuły z matrycą membrany podstawnej o pojemności 35 μl w jednym dołku na płytce 24-dołkowej.

  1. Odciągnij pożywkę z kultury organoidów, uważając, aby pozostawić kopuły matrycy nienaruszone.
  2. Dodaj 65 μl PBS i pipetuj w górę iw dół, aby rozbić kopułę matrycy.
  3. Dodać 100 μl buforu zestawu do oznaczania żywotności komórek i ponownie zawiesić przez pipetowanie.
  4. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut z wytrząsaniem.
  5. Przenieść 100 μl mieszaniny na nieprzezroczystą płytkę odpowiednią dla luminometru i wykonać odczyt zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi zestawu do oznaczania żywotności komórek.

8. Przygotowanie organoidów do ksenoprzeszczepu

UWAGA: Organoidy są również podatne na szczepienie podskórne zarówno u zwierząt z obniżoną odpornością, jak i u myszy izogenicznych. Aby zapewnić możliwość odróżnienia wstrzykniętych organoidów in vivo, należy oznaczyć organoidy konstytutywnie wyrażającym fluorofor5. Zaleca się przeprowadzenie eksperymentu pilotażowego w celu szczepienia przy użyciu 5 x 105 komórek do 2 x 106 komórek na wstrzyknięcie, z przyrostami 5 x 106 komórek, ponieważ skuteczność szczepienia różni się w zależności od linii organoidów.

  1. Za pomocą pipety P1000 pobrać pożywkę i pipetować w górę iw dół, aby rozbić matrycę membrany podstawnej. Po całkowitym rozerwaniu zawiesinę przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    UWAGA: Nie przenoś więcej niż 10 kopułek matrycowych na probówkę stożkową o pojemności 15 ml.
  2. Odciągnąć sklarowany osad i przemyć 5 ml PBS. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
  3. Odciągnąć sklarat nad osadem i ponownie zawiesić osad w 4 ml trypsyny zastępczej. Trawić przez 5-10 minut, wstrząsając w temperaturze 37 °C.
  4. Dodaj równą objętość pożywki organoidowej + 10% FBS, aby zahamować wymianę trypsyny. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
  5. Odciągnąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml PBS. Przefiltruj zawiesinę za pomocą filtra 40 μm, aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową. Określ ilościowo komórki przy użyciu standardowych metod.
  6. Odwirować i ponownie zawiesić komórki w inhibitorze PBS + Rho do stężenia 2 x 106 komórek na 100 μl (patrz Tabela 2 dla stężeń komórek i bezwzględnej liczby komórek potrzebnych dla różnych stężeń). Użyj równej objętości matrycy błony podstawnej, aby wytworzyć zawiesinę 1:1. Umieścić zawiesinę na lodzie.
  7. Wstrzykuj komórki zgodnie ze standardowymi protokołami i monitoruj wzrost ksenoprzeszczepu przy użyciu standardowych metod8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wydajność wysiewu
Zdolność do tworzenia organoidów jest determinowana przez fenotyp i genotyp. Komórki podstawowe prostaty typu dzikiego (WT) wykazały wyższą zdolność do tworzenia organoidów (30%-40%) w porównaniu z komórkami luminalnymi (3%) (Rysunek 1A). Po ustanowieniu organoidów zdolność ta gwałtownie wzrosła. Zazwyczaj 25%-30% komórek pochodzących z organoidu WT może utworzyć nowy organoid (Rysun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw oporności na antyandrogeny i odkrycie potencjalnych podatności terapeutycznych wymaga testowania odpowiedzi farmakologicznych w systemach modelowych naśladujących raka prostaty. Poniżej opisano szczegółowy protokół wiarygodnej analizy odpowiedzi farmakologicznych w genetycznie modyfikowanych organoidach prostaty pochodzących od pacjentów oraz przygotowania tych próbek organoidów do dalszych zastosowań.

W tym protokole istnieją dwa krytyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

C.L.S. zasiada w zarządzie Novartis; jest współzałożycielem ORIC Pharmaceuticals i współtwórcą enzalutamidu i apalutamidu; jest doradcą naukowym w firmach Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra i PMV; i jest współzałożycielem firmy Seragon, zakupionej przez Genentech/Roche w 2014 roku. W.R.K. jest współwynalazcą i posiadaczem patentu na technologię organoidów.

Podziękowania

K.P. jest wspierany przez NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. jest obsługiwany przez HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; oraz Starr Cancer Consortium. W.R.K. jest wspierany przez Holenderską Fundację Walki z Rakiem/KWF Buit 2015-7545 oraz Fundację Raka Prostaty PCF 17YOUN10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A83-01Tocris2939Składnik pożywki organoidowej: Stężenie końcowe 200 nM
ADMEM/F12Technologie Gibco/Life12634028Składnik pożywki organoidowej
B27Gibco/Life technologies17504-044Składnik pożywki organoidowej
Płytki do hodowli komórkowychFisher657185
Miano komórek GloPromegaG7571
DHTSigma-AldrichD-073Składnik pożywki organoidowej: Stężenie końcowe 1 nM
DMSOFisherBP231-100
EGFPeprotech315-09Składnik pożywki organoidowej: Stężenie końcowe 50 ng/ml dla myszy, 5 ng/nl dla człowieka
FGF10Peprotech100-26Składnik organoidów specyficznych dla człowieka: Stężenie końcowe 10 ng/ ml
FGF2Peprotech100-18BSkładnik organoidowy specyficzny dla człowieka: Stężenie końcowe 5 ng/ml
GlutamaxGibco/Life technologies35050079Składnik pożywki organoidowej
HEPESWYPRODUKOWANE WE WŁASNYMN/ASkładnik pożywki organoidowej: Stężenie końcowe 10 mM
Matrigel (zredukowany czynnik wzrostu i Bez czerwieni fenolowej)CorningCB-40230CSkładnik pożywki organoidowej
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165Składnik pożywki organoidowej: Stężenie końcowe 1,25 mM
NikotynamidSigma-AldrichN0636Składnik pożywki organoidowej specyficznej dla człowieka: Stężenie końcowe 10 mM
NOGGINPeprotech lub stabilne transfekowane komórki 293t z konstruktem Noggin (Karthaus i wsp. 2014)120-10CSkładnik pożywki organoidowej: Stężenie końcowe 10% kondycjonowana pożywka lub 100 ng / ml
Penicylina / StreptawidynaGemini Bio-Products400-109Składnik organoidowy
Inhibitory fospatazyMerck Millipore524629
Prostaglandyna E2Tocris3632464
Inhibitory proteazyMerck Millipore539131
R-SPONDINPeprotech lub stabilne transfekowane komórki 293t z konstruktem R-Spondin1 (Karthaus i wsp. 2014)120-38Składnik pożywki organoidowej: Stężenie końcowe Pożywka kondycjonowana 10% lub 500 ng/ml
Bufor RIPAMerck20-188
RNA-easy minikitQiagen74104
SB202190Sigma-Aldrich152121-30-7Składnik organoidu specyficzny dla człowieka: Stężenie końcowe 10 μ M
TryplEThermoFisher12605036
Y-27632SelleckchemS1049Składnik pożywki organoidowej: Stężenie końcowe 10 μ M
ZAKRESIE

Bibliografia

  1. Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454(2015).
  2. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  3. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  4. Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
  5. Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  6. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  7. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  8. Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
  9. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  10. Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
  11. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404(2018).
  12. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  13. Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891(2019).
  14. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  15. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  18. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  19. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  20. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  21. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  22. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla organoid wodpowied farmakologicznaanaliza genotypuleczenie lekamitest ywotno ciizolacja bia ekizolacja RNAbadanie ksenoprzeszczep wCRISPR Cas9
Hodowle organoidów prostaty jako narzędzia do translacji genotypów i profili mutacji na odpowiedzi farmakologiczne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.