Artykuł metodologiczny

Przeszczep inżynierii tkankowej do obwodowej rekonstrukcji przełyku u szczurów

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60349

⸱

10 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Seoul National University, College of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Inje University, Gimhae, 3Department of Nature-Inspired Nanoconvergence Systems, Korea Institute of Machinery and Materials

W tym artykule

Podsumowanie

Rekonstrukcja przełyku jest wymagającą procedurą, a opracowanie inżynierii tkankowej przełyku, która umożliwia regenerację błony śluzowej i mięśni przełyku i która może być wszczepiona jako sztuczny przeszczep, jest konieczna. Tutaj przedstawiamy nasz protokół generowania sztucznego przełyku, w tym produkcję rusztowań, hodowlę bioreaktorów i różne techniki chirurgiczne.

Streszczenie

Użycie biokompatybilnych materiałów do obwodowej rekonstrukcji przełyku jest technicznie trudnym zadaniem u szczurów i wymaga optymalnej techniki implantacji ze wsparciem żywieniowym. W ostatnim czasie podjęto wiele prób inżynierii tkankowej przełyku, ale wskaźnik sukcesu był ograniczony ze względu na trudności we wczesnej epitelizacji w szczególnym środowisku perystaltyki. W tym miejscu opracowaliśmy sztuczny przełyk, który może poprawić regenerację błony śluzowej przełyku i warstw mięśniowych dzięki dwuwarstwowemu rusztowaniu rurowemu, systemowi bioreaktora opartemu na mezenchymalnych komórkach macierzystych oraz technice karmienia bypassami ze zmodyfikowaną gastrostomią. Rusztowanie wykonane jest z nanowłókien poliuretanowych (PU) w kształcie cylindrycznym z trójwymiarową (3D) drukowaną nicią polikaprolaktonu owiniętą wokół zewnętrznej ściany. Przed przeszczepem mezenchymalne komórki macierzyste pochodzenia ludzkiego zostały wysiane w świetle rusztowania, a następnie przeprowadzono hodowlę w bioreaktorze w celu zwiększenia reaktywności komórkowej. Poprawiliśmy przeżywalność przeszczepu, stosując zespolenie chirurgiczne i pokrywając wszczepioną protezę płatem tarczycy, a następnie tymczasowe żywienie gastrostomii nieustnej. Przeszczepy te były w stanie podsumować wyniki początkowej epitelializacji i regeneracji mięśni wokół wszczepionych miejsc, jak wykazano w analizie histologicznej. Ponadto zaobserwowano zwiększenie włókien elastyny i neowaskularyzację na obrzeżach przeszczepu. W związku z tym model ten stanowi potencjalną nową technikę rekonstrukcji obwodowej przełyku.

Wprowadzenie

Leczenie zaburzeń przełyku, takich jak wrodzone wady rozwojowe i raki przełyku, może prowadzić do utraty segmentu strukturalnego przełyku. W większości przypadków wykonano autologiczne przeszczepy zastępcze, takie jak przewody podciągające żołądek lub wstawki jelita grubego1,2. Jednak te wymiany przełyku wiążą się z różnymi powikłaniami chirurgicznymi i ryzykiem reoperacji3. W związku z tym zastosowanie rusztowań przełyku wykorzystujących inżynierię tkankową, naśladujących natywny przełyk, może być obiecującą alternatywną strategią regeneracji utraconych tkanek4,5,6.

Chociaż przełyk stworzony w oparciu o inżynierię tkankową potencjalnie stanowi alternatywę dla obecnego leczenia wad przełyku, istnieją znaczne bariery dla jego zastosowania in vivo. Pooperacyjny nieszczelność zespolenia i martwica wszczepionego rusztowania przełyku nieuchronnie prowadzą do śmiertelnego zakażenia otaczającej przestrzeni aseptycznej, takiej jak śródpiersie7. Dlatego niezwykle ważne jest, aby nie dopuścić do zanieczyszczenia raną i nosowo-żołądkową pokarmem lub śliną. Należy rozważyć zastosowanie gastrostomii lub żywienia dożylnego do momentu zakończenia pierwotnego gojenia się rany. Do tej pory inżynieria tkankowa przełyku była przeprowadzana na dużych modelach zwierzęcych, ponieważ duże zwierzęta mogą być karmione tylko przez dożylne hiperalimentacje przez 2-4 tygodnie po wszczepieniu rusztowania8. Jednak taki niedoustny model żywienia nie został ustalony dla wczesnego przeżycia po przeszczepieniu przełyku u małych zwierząt. Dzieje się tak, ponieważ zwierzęta były niezwykle aktywne i niekontrolowane, więc nie mogły utrzymać rurki do karmienia w żołądku przez dłuższy czas. Z tego powodu odnotowano niewiele przypadków udanego przeszczepu przełyku u małych zwierząt.

Ze względu na warunki inżynierii tkankowej przełyku, zaprojektowaliśmy dwuwarstwowe rusztowanie rurowe składające się z elektroprzędzonych nanowłókien (warstwa wewnętrzna; Rysunek 1A) i pasmo wydrukowane w 3D (warstwa zewnętrzna; Ryc. 1B) w tym zmodyfikowana technika gastrostomii. Wewnętrzne nanowłókno wykonane jest z PU, niedegradowalnego polimeru i zapobiega wyciekaniu jedzenia i śliny. Zewnętrzne nici drukowane w 3D są wykonane z biodegradowalnego polikaprolaktonu (PCL), który może zapewnić elastyczność mechaniczną i dostosować się do ruchu perystaltycznego. Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (hAD-MSC) zostały wysiane na wewnętrznej warstwie rusztowania, aby ułatwić ponowną epitelizację. Struktura nanowłókien może ułatwić początkową regenerację błony śluzowej, zapewniając strukturalne środowisko macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do migracji komórek.

Zwiększyliśmy również przeżywalność i bioaktywność zaszczepionych komórek poprzez hodowlę w bioreaktorze. Wszczepione rusztowanie zostało pokryte płatkiem tarczycy, aby umożliwić bardziej stabilną regenerację błony śluzowej przełyku i warstwy mięśniowej. W tym raporcie opisujemy protokoły technik inżynierii tkanek przełyku, w tym produkcję rusztowań, hodowlę bioreaktorów opartych na mezenchymalnych komórkach macierzystych, technikę żywienia bypassowego ze zmodyfikowaną gastrostomią oraz zmodyfikowaną technikę zespolenia chirurgicznego do obwodowej rekonstrukcji przełyku w modelu szczurzym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC nr 17-0164-S1A0) Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego w Seulu.

1. Produkcja rusztowań

UWAGA: Dwuwarstwowe rusztowania przełyku są produkowane przez połączenie elektroprzędzenia i druku 3D. Wewnętrzna membrana rusztowania rurowego została wykonana z elektroprzędzalnego poliuretanu (PU) z obracającymi się trzpieniami ze stali nierdzewnej, jak kolektory9.

  1. Do przygotowania rurkowych nanowłókien PU należy przygotować 20% (w/v) roztwór polimeru PU, mieszając z N,N-dimetyloformamidem (DMF) przez 8 godzin w temperaturze pokojowej.
  2. Umieścić roztwór PU na strzykawce za pomocą metalowej igły (22 G) i elektrowirować na obracających się trzpieniach ze stali nierdzewnej (średnica = 2 mm) w odległości 30 cm między końcówką igły a obracającym się kolektorem.
    UWAGA: Zasilacz jest ustawiony na prąd stały wysokiego napięcia o potencjale 15 kV. Szybkość podawania roztworu ustala się na 0,5 ml/h za pomocą pompy strzykawkowej.
  3. Wykonaj rurową warstwę nanowłókien na powierzchni trzpienia obracającego się z prędkością 3,14 m/s.
  4. Wysuszyć nanowłókno PU w piecu próżniowym w temperaturze 40 °C przez noc, aby całkowicie usunąć resztki rozpuszczalnika.
    UWAGA: Wydrukowana w 3D zewnętrzna ściana rusztowania przełyku jest przygotowywana przy użyciu systemu szybkiego prototypowania. Sprzęt do drukowania 3D składa się z dozownika, dyszy, regulatora kompresji/ciepła, 3-osiowego stopnia konwersji i systemu oprogramowania.
  5. Granulki PCL rozpuszcza się w temperaturze 100 °C w cylindrze grzewczym, a następnie drukuje na powierzchni nanowłókien pod wysokim ciśnieniem (7 barów) pod kontrolą systemu bioplottingu. Rozmiar dyszy wynosi 300 μm, a odległość pasm wynosi 700 μm.
  6. Po zdjęciu dwuwarstwowego rusztowania z trzpienia sterylizować, mocząc w 70% etanolu w świetle ultrafioletowym.
    UWAGA: Bardziej szczegółowa charakterystyka rusztowania została opisana w poprzednich badaniach10.

2. Wysiewanie komórek na szczepach i uprawa w bioreaktorze

UWAGA: Mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) pochodzące z ludzkiej tkanki tłuszczowej zakupione od firmy zostały użyte bez modyfikacji.

  1. Przed przeszczepem komórek wysterylizuj wydrukowane w 3D rusztowanie przełyku przez 1 godzinę w świetle ultrafioletowym, zwilż je przez 10 minut etanolem i umyj 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  2. Hodowla i namnażanie hMSC w pożywce wzrostowej (podłoże podstawowe/suplement wzrostu). Dwuwarstwowe rusztowania rurowe przeniesiono na nieprzylegające 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych.
  3. Aby przymocować komórki do wewnętrznej powierzchni rusztowania, delikatnie dodaj zawiesinę hMSC o gęstości 1 x 106 komórek/ml w macierzy błony podstawnej zawierającej pożywkę wzrostową.
  4. Zawiesinę matrycy błony podstawnej równomiernie osadzić na wewnętrznej powierzchni dwuwarstwowego rusztowania rurowego.
  5. Mocno przymocuj rusztowanie rurowe z nasionami hMSC do akrylowego uchwytu w komorze hodowlanej bioreaktora za pomocą systemu bioreaktora z przepływem pulsacyjnym.
    UWAGA: Specjalnie zaprojektowany system bioreaktora składa się z pompy, pułapki bąbelkowej, komory przepływowej, manometru, zaworu sterującego i zbiornika medium. Stosując naprężenie ścinające w komorze hodowlanej, należy pozostawić czas odpoczynku 1-2 min11.
  6. Dodaj pożywkę wzrostową do komory hodowlanej i zastosuj naprężenie ścinające 0,1 dyn/cm2 wywołane przepływem w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO210.
    UWAGA: Wartość naprężenia ścinającego wywołanego przepływem została obliczona poprzez symulację perystaltyki tkanki przełyku pochodzącej z ludzkiego ciała z poprzednich badań10.
  7. Określ odpowiedzi komórek na wewnętrznych powierzchniach dwuwarstwowych rusztowań rurowych bez hodowli w bioreaktorze po 5 dniach za pomocą zestawu do oznaczania żywotności ALIVE/DEAD zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopii konfokalnej za pomocą narzędzia Z-stack.
  8. Trzeciego dnia obserwuj morfologię powierzchni rusztowania rurowego wysiewanego przez hMSC za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM).
    1. Namocuj rusztowanie, które było inkubowane z hMSC z 2,5% aldehydem glutarowym i OsO4 przez 24 godziny i odwodnić etanolem.
    2. Pokryj utrwalone hMSC platyną za pomocą napylarki w warunkach atmosferycznych argonu i uzyskaj obrazy SEM przy napięciu przyspieszającym 25 kV.

3. Przygotowanie chirurgiczne do chirurgii zwierząt

UWAGA: Preparaty chirurgiczne są stosowane zarówno przed gastrostomią, jak i przeszczepem przełyku.

  1. Ustaw sterylne narzędzia chirurgiczne: ostrze skalpela, retraktor Weitlanera, uchwyt na mikroigły, kleszczyki do mikroszwów, kleszczyki do mikrotkanek, mikronożyczki, uchwyt igły Mayo-Hegar, nożyczki operacyjne, nożyczki do tęczówki, kleszcze opatrunkowe, kleszczyki do tkanek, kleszcze do odłamków, kleszcze do tęczówki, strzykawka 5 ml (igła 21 G), strzykawka 10 ml (igła 22 G), szew poliamidowy 9-0, szew poliglaktynowy 4-0.
  2. Znieczulić zwierzę za pomocą domięśniowego wstrzyknięcia tiletaminy/zolazepamu (dawka 50 mg/g) i 2% chlorowodorku ksylazyny (dawka 2 mg/kg).
    UWAGA: Dorosłe szczury Sprague-Dawley (SD) o wadze 398-420 g wykorzystano do przeszczepu przełyku.
  3. Przed przeniesieniem na obłożnik chirurgiczny należy sprawdzić odpowiedni stan znieczulenia zwierzęcia, szczypiąc ogon kleszczami.
  4. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na sterylnej serwicie i za pomocą maszynki do strzyżenia usuń włosy z szyi (w przypadku przeszczepu przełyku) lub brzucha (w przypadku gastrostomii). Następnie wyszoruj miejsce operowane betadyną i 70% etanolem.
  5. Przed nacięciem wstrzyknąć podskórnie środek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) w celu złagodzenia bólu.

4. Operacja gastrostomii z użyciem rurki T u szczurów

UWAGA: Zmodyfikowana gastrostomia została przeprowadzona u wszystkich zwierząt doświadczalnych, aby umożliwić tymczasowe obejście niedoustnego karmienia przez sondę (n = 5).

  1. Niech szczury poszczą dzień przed operacją. Przygotować operację jak w punkcie 3.
  2. Odsłoń żołądek przez nacięcie w linii środkowej skóry i mięśni brzucha znieczulonych szczurów.
  3. Za pomocą ostrza skalpela wykonać otwór o średnicy 3 mm w przedniej ścianie żołądka.
  4. Włóż końcówkę silikonowej rurki T do miejsca uszkodzenia, aby przymocować ją do ściany żołądka.
  5. Zszyj prawidłowo, aby rurka T nie odczepiła się od ściany żołądka.
  6. Wyjmij dystalny koniec wszczepionej rurki T przez tunel podskórny do tylnej części szyi.
  7. Włożyć nasadkę heparyny do końca rurki T, aby zapobiec cofaniu się treści żołądka.
    UWAGA: Użyj angiocewnika, aby połączyć koniec rurki T z nasadką heparyny.
  8. Zszyj wszystkie warstwy powłoki brzusznej i skóry za pomocą szwów poliglaktynowych 4-0.
  9. Trzymaj wszystkie szczury doświadczalne oddzielnie w klatce metabolicznej po zakończeniu gastrostomii.

5. Przeszczep przełyku

UWAGA: Przeszczep przełyku dwuwarstwowego rusztowania rurowego jest wykonywany 1 tydzień po gastrostomii (n = 5). Przed przeszczepem należy zaszczepić hMSC (gęstość komórek: 1 x 106 komórek/ml w macierzy błony podstawnej) w wewnętrznej ścianie każdego rusztowania i inkubować przez 3 dni w systemie bioreaktora. Procedura chirurgiczna jest następująca.

  1. Usuń włosy na szyi zwierząt modelowych i wykonaj standardowe obłożenie pola operacyjnego w celu przeprowadzenia operacji aseptycznej.
    UWAGA: Zaleca się stworzenie dużego obszaru golenia, aby utrzymać operację asceptyczną u zwierzęcia.
  2. Po przednim środkowym nacięciu szyi należy oddzielić mięśnie paska i odsłonić strukturę tchawiczo-przełykową.
  3. Tępo wypreparuj nerw błędny z przełyku przed wycięciem segmentu, w przeciwnym razie oddychanie zwierzęcia jest upośledzone.
  4. W powiększeniu odizoluj lewą stronę przełyku od tchawicy i ostrożnie oddziel górną część od tarczycy.
  5. Stworzyć ubytek o długości 5 mm na pełnym obwodzie zawierający wszystkie warstwy przełyku za pomocą nożyczek chirurgicznych.
    UWAGA: Przed przeszczepem przełyku należy przeciąć przygotowane rusztowania za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby dopasować je do długości miejsca przeszczepu.
  6. Pod mikroskopem wykonać mikrozespolenia na obu końcach dystalnego ubytku przełyku za pomocą nici do szwów 9-0. Umieść pierwszy szew między prawym dolno-tylnym brzegiem górnej resztki przełyku a rusztowaniem. Kontynuuj szycie od prawej do lewej między pozostałością górnego przełyku a rusztowaniem. Zespolenie rusztowania należy wykonać w taki sam sposób, jak górny brzeg pozostałości dolnego przełyku.
    UWAGA: Wykonaj zespolenie mikronaczyniowe stosowane w chirurgii klinicznej do przeszczepu przełyku. Praca z mikroskopem w celu precyzyjnego, wodoszczelnego zszycia miejsca implantu.
  7. Następnie należy położyć otaczający płat tarczycy na miejscu przeszczepu, aby zapewnić stabilne utrzymanie i naczyniowe zaopatrzenie przeszczepów.
  8. Po przeszczepie zszyj podskórnie mięśnie i tkankę skórną szwem 4-0 vicryl.
  9. Trzymaj wszystkie szczury doświadczalne pojedynczo w klatkach metabolicznych.

6. Zabiegi pooperacyjne

UWAGA: Zabiegi pooperacyjne są wykonywane zarówno po przeszczepie gastrostomii, jak i przełyku.

  1. Po zamknięciu rany brzusznej umieść szczury w indywidualnych klatkach metabolicznych i umieść klatki na urządzeniach grzewczych na podczerwień, aby zapobiec hipotermii.
  2. Monitoruj zwierzęta, dopóki nie osiągną i nie utrzymają pozycji leżącej mostka (tj. leżenia wyprostowanego na klatce piersiowej).
  3. Aby zminimalizować stan zapalny w miejscu operacji, należy podawać szczurom antybiotyk gentamycynę (20 mg/kg) dziennie.
  4. Karmienie doustne płynem należy rozpocząć w trzeciej dobie po operacji, aż do punktu końcowego badania. Podawaj całą formułę odżywczą (20,6 g/100 ml [g%] węglowodanów, 3,8 g białka, 0,2 g tłuszczu) przez nasadkę z heparyną 3 razy dziennie, począwszy od następnego dnia po zabiegu.
  5. Codziennie sprawdzaj wygląd i masę ciała zwierząt. Sprawdź, aby poradzić sobie z zachowaniem, takim jak samookaleczające się miejsce nacięcia lub opór przed wlotem rurki, a także różne powikłania chirurgiczne. Gdy masa ciała modeli szczurzych gwałtownie spada o 20% lub więcej, należy przeprowadzić eutanazję przez wdychanie CO2 .

7. Histologia i immunohistochemia

UWAGA: Do analizy histologicznej, cała tkanka przełyku zwierząt poddanych eutanazji jest pobierana za pomocą nożyczek chirurgicznych. Barwienie hematoksyliną i eozyną oraz barwienie trichromem Massona przeprowadzono przy użyciu standardowych technik histologicznych. Immunohistochemię przeprowadzono zgodnie z następującym protokołem.

  1. Napraw cały przełyk zawierający przeszczepione miejsca w 4% paraformaldehydzie. Utwórz blok parafinowy i wytnij odcinki o grubości 4 μm.
  2. Odparafinować skrawki tkanek i odwodnić je w serii etanolowej. Zanurz szkiełka tkankowe w buforze cytrynianowym i podgrzewaj przez 10 minut w kuchence mikrofalowej. Schłodzić komórki zimnym PBS przez 20 min. Zanurz w 3% nadtlenku wodoru na 6 min i myj PBS przez 10 min.
  3. Inkubować w 3% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych reakcji skrawków tkanki.
  4. Przemyć 3x PBS przez 5 min. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko Desminie (rozcieńczonej do 1:200), keratynie 13 (rozcieńczonej do 1:100) i czynnikowi von Willebranda (vWF; rozcieńczonym do 1:100) przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Myć 3x PBS przez 15 min. Inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym w stężeniu 1:500 dla Desminy i Keratyny 13 w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie PBS przez 10 min.
    UWAGA: Wycinki tkanek dla vWF inkubowano przy użyciu zestawu sprzężonego z peroksydazą chrzanową (patrz Tabela materiałów), a następnie wizualizowano za pomocą 3,3'-diaminobenzydyny (DAB).
  6. Mocować za pomocą szklanego szkiełka nakrywkowego i 4',6-diamidyno-2-fenolindolu (DAPI) zawierającego podłoże montażowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat ideowy procesu produkcji dwuwarstwowego rusztowania rurowego PU-PCL. Roztwór PU został elektroprzędzony z igły o wadze 18 G w celu uzyskania cylindrycznej struktury wewnętrznej o grubości 200 μm. Następnie stopiony PCL został wydrukowany na zewnętrznej ściance nanowłókna PU w regularnych odstępach czasu. Morfologię powierzchni wewnętrznej i zewnętrznej ścian ukończonego rusztowania rurowego można zobaczyć na obrazach ze skaningow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istniejące badania na zwierzętach nad sztucznym przełykiem są nadal ograniczone przez kilka krytycznych czynników. Idealne sztuczne rusztowanie przełyku powinno być biokompatybilne i mieć doskonałe właściwości fizyczne. Powinien być w stanie zregenerować nabłonek błony śluzowej we wczesnym okresie pooperacyjnym, aby zapobiec nieszczelności zespolenia. Regeneracja wewnętrznych okrężnych i zewnętrznych podłużnych warstw mięśniowych jest również ważna dla perystaltyki funkcjonalnej12,13

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

System bioreaktora zaprojektowany na potrzeby tego badania został skomercjalizowany (numer modelu: ACBF-100).

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Projekt Badawczo-Rozwojowy Koreańskiej Technologii Zdrowotnej za pośrednictwem Koreańskiego Instytutu Rozwoju Przemysłu Medycznego (KHIDI), finansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (numer grantu: HI16C0362) oraz Program Badań Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2017R1C1B2011132). Próbki biologiczne i dane wykorzystane w tym badaniu zostały dostarczone przez Biobank Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego w Seulu, członka Korea Biobank Network.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klatka metabolicznaTEUNGDO BIO & PLANTJD-C-66
Zoletil (dawka 50 mg/g)Virbac1000000188
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200-056
1 ml StrzykawkaBD309659
2% chlorowodorek ksylazyny (Rumpun)ByelyQ-0615-035
4% paraformaldehydBIOSOLUTIONBP031
4-0 VicrylETHICONW9443
9-0 VicrylETHICONW2813
Antybiotyk gentamycyna (Septopal).Septopal0409-1207-03
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma5470
Bufor cytrynianowy, ph6.0, 10XSigmaC9999
ZESTAW SUBSTRATÓW PEROKSYDAZY DO DABVECTORSK4100
DesminSanta Cruzsc-23879
Elastyczny zestaw do barwieniaScyTeKETS-1
EtanolMerck100983
EtanolMerck64-17-5
Serun bydlęcy płodu (FBS)Gibco16000-044
Aldehyd glutarowySigma354400
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) ThermoFisherA-11001
Czapka heparynyHyupsung MedicalHS-T-05
hMSC (STEMPRO) / pożywka wzrostowa
(MesenPRO RSTM)		InvitrogenR7788-110
Zestaw sprzężony z peroksydazą chrzanową (Vectastain)VECTORPK7800
Nadtlenek wodoruJUNSEI7722-84-1
Keratyna13NovusNBP1-97797
ŻYWY/MARTWY Zestaw do oznaczania żywotnościSondy molekularneL3224
MatrigelCorning354262
N,N-dimetyloformamid (DMF)Sigma227056
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych Noadherent
.		Corning3738
OsO4SigmaO5500
szalka PetriegoEppendorf3072115
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco10010-023
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10XBIOSOLUTIONBP007a
(PCL)Sigma440744
Polimer poliuretanowy (PU+A2:A24)Lubrizol2363-80AE
ZasilaczNanoNCHV100
ProLong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPIInvitrogenP36931
RumpunBayerQ-0615-035
Silikonowa rurka TSewoon Medical2206-005
Maść do oczu TerramycinPfizer Pharmaceutical KoreaW01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)Virbac LaboratoriesQ-0042-058
Zestaw bejc trichromowychScyTeKTRM-1
von Willebrand Factor (vWF)Santa Cruzsc 14014
Polimer polikaprolaktonu

Bibliografia

  1. Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
  2. Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
  3. Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942(2017).
  4. Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
  5. Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
  6. La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123(2018).
  7. Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
  8. Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
  9. Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
  10. Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
  11. Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
  12. Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
  13. Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
  14. Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
  15. Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291(2017).
  16. Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sztucznie wyhodowany prze ykmezenchymalne kom rki macierzystehodowla w bioreaktorzedwuwarstwowy stelap at tarczycyumieszczenie drenu Tanaliza histologicznamikroskopia konfokalnabarwienie immunofluorescencyjne

Powiązane artykuły