Artykuł metodologiczny

Chlorek winylu i dieta wysokotłuszczowa jako model interakcji środowiska i otyłości

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60351

⸱

12 stycznia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 2Hepatobiology and Toxicology Program, University of Louisville, 3Department of Physiology and Pharmacology, West Virginia University, 4Center for Inhalation Toxicology, West Virginia University, 5Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh, 6Pittsburgh Liver Research Center, University of Pittsburgh, 7Department of Medicine, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu było opracowanie mysiego modelu ekspozycji na toksyczne substancje o niskim poziomie, które nie powodują jawnego uszkodzenia wątroby, ale raczej pogłębiają istniejące wcześniej uszkodzenia wątroby. Ten paradygmat lepiej podsumowuje narażenie ludzi i subtelne zmiany, które zachodzą po ekspozycji na stężenia toksyczne, które są uważane za bezpieczne.

Streszczenie

Chlorek winylu (VC), obfite zanieczyszczenie środowiska, powoduje stłuszczeniowe zapalenie wątroby na wysokim poziomie, ale jest uważany za bezpieczny na niższych poziomach. Chociaż w kilku badaniach badano rolę VC jako bezpośredniego hepatotoksycznego, koncepcja, że VC modyfikuje wrażliwość wątroby na inne czynniki, takie jak niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) spowodowana dietą wysokotłuszczową (HFD), jest nowa. Protokół ten opisuje paradygmat ekspozycji w celu oceny skutków przewlekłej ekspozycji na VC na niskim poziomie. Myszy są aklimatyzowane do diety niskotłuszczowej lub wysokotłuszczowej na tydzień przed rozpoczęciem ekspozycji inhalacyjnej i pozostają na tych dietach przez cały czas trwania eksperymentu. Myszy są narażone na VC (poziom sub-OSHA: <1 ppm) lub powietrze w pomieszczeniu w komorach inhalacyjnych przez 6 godzin dziennie, 5 dni w tygodniu, przez okres do 12 tygodni. Zwierzęta są monitorowane co tydzień pod kątem przyrostu masy ciała i spożycia pokarmu. Ten model ekspozycji na VC nie powoduje jawnego uszkodzenia wątroby przy samej inhalacji VC. Jednak połączenie VC i HFD znacznie nasila choroby wątroby. Techniczną zaletą tego modelu współekspozycji jest ekspozycja całego ciała, bez ograniczeń. Co więcej, warunki te bardziej przypominają bardzo powszechną sytuację u ludzi, w której łączne narażenie na VC leży u podstaw niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby, a zatem wspierają nową hipotezę, że VC jest środowiskowym czynnikiem ryzyka rozwoju uszkodzenia wątroby jako powikłania otyłości (tj. NAFLD). Praca ta podważa paradygmat, zgodnie z którym obecne limity narażenia na VC (zawodowe i środowiskowe) są bezpieczne. Zastosowanie tego modelu może rzucić nowe światło i zastanowić się nad ryzykiem związanym z ekspozycją na VC. Ten model uszkodzenia wątroby wywołanego przez toksyny może być stosowany do innych lotnych związków organicznych oraz do badania innych interakcji, które mogą wpływać na wątrobę i inne układy narządów.

Wprowadzenie

Liczne substancje toksyczne są obecne w powietrzu, którym oddychamy, na bardzo niskim poziomie. Chlorek winylu (VC) jest gazem monomerycznym używanym przez przemysł do tworzenia wyrobów z tworzyw sztucznych z polichlorku winylu (PVC)1. Jest to powszechny środowiskowy środek hepatotoksyczny, znany czynnik rakotwórczy i zajmuje #4 miejsce na liście priorytetów substancji niebezpiecznych ATSDR2. Aby lepiej zrozumieć toksyczny wpływ na zdrowie ludzi i interakcje z istniejącymi chorobami współistniejącymi, kluczowe znaczenie ma ustanowienie modeli narażenia, które naśladują narażenie ludzi. Głównym zainteresowaniem tej grupy jest badanie wpływu przewlekłej ekspozycji na VC w niskich stężeniach na wątrobę. VC wywiera swój główny wpływ na wątrobę, gdzie, jak wykazano (w wysokich stężeniach), powoduje stłuszczenie i toksyczne stłuszczeniowe zapalenie wątroby (TASH) z martwicą, zwłóknieniem, marskością wątroby3,4, a także rak wątrobowokomórkowy (HCC) i skądinąd niezwykle rzadki naczyniakomięsak krwionośny wątroby5. TASH prawdopodobnie istnieje w populacji od dziesięcioleci, ale pozostał niescharakteryzowany i niedoceniany przez badaczy4,6. W wyniku badań wykazujących bezpośrednie obawy związane z toksycznością narażenia na VC, Administracja Bezpieczeństwa i Zdrowia w Pracy (OSHA) obniżyła dopuszczalny próg narażenia do 1 ppm w ciągu 8 godzin dnia pracy7. Chociaż próg ekspozycji został obniżony, wpływ tego stężenia VC na zdrowie ludzi jest niejasny7. Ponadto wpływ ekspozycji na VC na istniejące choroby współistniejące, takie jak choroby wątroby, jest w dużej mierze nieznany8. Ta luka w wiedzy jest szczególnie ważna dzisiaj ze względu na rosnące globalne rozpowszechnienie niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NALFD)4,6,7,9,10,11,12. Co ważne, ostatnio wykazano, że VC jest niezależnym czynnikiem ryzyka chorób wątroby z innych przyczyn13. Celem tego protokołu było zatem opracowanie odpowiedniego modelu inhalacji dla narażenia na lotny toksyczny czynnik środowiskowy, VC w kontekście podstawowego uszkodzenia wątroby, aby naśladować narażenie ludzi i zidentyfikować potencjalne, nowe mechanizmy uszkodzenia wątroby wywołanego przez VC lub wzmocnionego VC.

Główną drogą narażenia na wiele toksyn i zanieczyszczeń środowiskowych jest wdychanie. Po wdychaniu związek może dostać się do krążenia ogólnoustrojowego przez płuca, przemieszczać się do wątroby i zostać metabolicznie aktywowany przez enzymy wątrobowe przed wydaleniem14,15,16. Często to właśnie te aktywne metabolity powodują toksyczność i uszkodzenia w organizmie. Poprzednie badania przeprowadzone przez tę i inne grupy wykorzystywały metabolity VC jako substytuty ekspozycji na VC gas17,18. Inne grupy korzystały z modeli inhalacyjnych VC; Jednak ekstremalnie wysokie poziomy ekspozycji (>50 ppm) zostały wdrożone w celu wywołania ostrej toksyczności, ciężkiego uszkodzenia wątroby i rozwoju nowotworu19. Chociaż badania te dostarczyły kluczowych informacji i mechanizmów rakotwórczości indukowanej przez VC, nie podsumowują subtelnych skutków i złożonych interakcji z innymi czynnikami przyczyniającymi się do ich powstania, a zatem są mniej istotne dla narażenia ludzi.

Model inhalacji VC plus diety wysokotłuszczowej (HFD) opisany tutaj (zobacz Rysunek 1 dla osi czasu), jest pierwszym modelem przewlekłej, niskiej dawki VC (tj. stężenie poniżej OSHA), w którym myszy są narażone na działanie substancji toksycznej w warunkach, które znacznie bardziej naśladują ekspozycję człowieka. Rzeczywiście, dane z tego modelu podsumowały wyniki zaobserwowane u ludzi narażonych na VC, takie jak wpływ na szlaki metaboliczne20, stres oksydacyjny i dysfunkcja mitochondriów4. Inne mysie modele inhalacji, takie jak modele tylko z głową i nosem21, wymagają, aby zwierzę było skrępowane, co powoduje u zwierzęcia stres. W tym przypadku ta metoda ekspozycji całego ciała nie wymaga wstrzykiwania ani niepotrzebnego stresu u zwierząt. Zwierzęta mają dostęp ad libitum do pożywienia i wody i są umieszczane w większej komorze inhalacyjnej na określoną liczbę godzin dziennie i dni w tygodniu. Co więcej, koncepcja, że VC modyfikuje wrażliwość na inny hepatotoksyczny substancję, jest nowym odkryciem, po raz pierwszy zademonstrowanym przez tę grupę12 i ma implikacje dla ekspozycji na VC w stężeniach znacznie niższych niż te, które są potrzebne do bezpośredniej hepatotoksyczności.

Ta metoda narażenia na wdychanie może być używana do naśladowania ekspozycji na różne toksyczne substancje gazowe, w tym inne lotne związki organiczne, obecne w naszym środowisku. Rzeczywiście, lotne związki organiczne stanowią dużą grupę toksyn środowiskowych i są bardziej rozpowszechnione na obszarach uprzemysłowionych, co powoduje, że niektóre populacje są bardziej narażone na przewlekłe narażenie22. Protokół ten może być modyfikowany w celu dopasowania do różnych pytań eksperymentalnych. Czas trwania i stężenie podawanego związku mogą być różne. Chociaż początkowo opracowany do określania uszkodzeń wątroby, inne układy narządów mogą być i były badane za pomocą tego modelu23. Badacze, którzy chcą badać przewlekłe narażenie zwierząt, ale chcą zminimalizować stres zwierząt, powinni rozważyć zastosowanie tego modelu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach/VC zostały zatwierdzone przez Departament Zdrowia Środowiskowego, Stowarzyszenie Bezpieczeństwa Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, a procedury zostały zatwierdzone przez lokalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

1. Przygotowanie do eksperymentu i aklimatyzacja do oczyszczonych, eksperymentalnych diet

  1. Określ całkowitą liczbę myszy C56Bl / 6J (minimalnie 6-8 myszy na grupę).
    UWAGA: Zwierzęta z każdej grupy żywieniowej zostaną dalej podzielone na grupy narażenia. Planując badanie, należy pamiętać o uwzględnieniu całkowitej liczby potrzebnych zwierząt.
  2. Zidentyfikuj i zważ zwierzęta. Zapisz te dane.
  3. Zmień dietę ze zwykłej karmy na oczyszczoną dietę niskotłuszczową (LFD) lub wysokotłuszczową (HFD) na tydzień przed rozpoczęciem eksperymentów inhalacyjnych, aby przyzwyczaić myszy do nowej diety (patrz Rysunek 1 dla osi czasu).
  4. Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum. Monitoruj spożycie pokarmu poprzez ważenie i rejestrowanie pokarmu, który ma być podawany w klatce, oraz ważenie i rejestrowanie pozostałej części pokarmu w każdym dniu karmienia. Jeśli trzymasz 4 myszy w klatce, dostarczaj ~50 g jedzenia dwa razy w tygodniu. Jeśli trzymasz 5 myszy w klatce, dostarczaj ~60 g jedzenia dwa razy w tygodniu.
    UWAGA: Podczas karmienia oczyszczoną dietą należy codziennie sprawdzać ilość pokarmu, aby upewnić się, że myszy mają wystarczającą ilość granulek. Jeśli nie ma wystarczającej ilości granulek, myszy mają tendencję do "gromadzenia" pożywienia i zwiększania spożycia. Co więcej, zwłaszcza HFD ma tendencję do kruszenia się znacznie bardziej niż LFD, powodując podobny efekt.
  5. Monitoruj zwierzęta przez cały czas trwania eksperymentu, aby zapewnić utrzymanie zdrowia zwierząt.
    UWAGA: Tygodniowy przyrost masy ciała i spożycie pokarmu, wraz z monitorowaniem metabolizmu, można przeprowadzić, aby uzyskać wskaźnik ogólnego stanu zdrowia zwierząt.

2. System narażenia na inhalację chlorku winylu

UWAGA: Na rynku dostępnych jest wiele systemów ekspozycji inhalacyjnej, od "tylko nosa" do "całego ciała" i od systemów ręcznych do automatycznych. Dane wcześniej opublikowane przez tę grupę pochodziły z systemu manualnego obejmującego całe ciało12,23,24. Schemat opisujący zautomatyzowany system narażenia inhalacyjnego jest pokazany na Rysunek 2.

  1. Upewnij się, że powietrze rozcieńczające zarówno w komorze doświadczalnej, jak i kontrolnej jest powietrzem o wysokiej wydajności (HEPA) i węglem aktywnym, przefiltrowanym, wysuszonym i regulowanym ciśnieniem przed wejściem do odpowiednich urządzeń do pomiaru przepływu (regulator przepływu masowego [MFC] – komora doświadczalna, rotametr – komora kontrolna).
    UWAGA: W komorze kontrolnej rotametr reguluje przepływ powietrza do myszy. Powietrze dostaje się do górnej części komory, przechodzi przez myszy, a następnie jest wydmuchiwane pod myszami i przepuszczane przez filtr HEPA przed wejściem do okapu chemicznego. W komorze mierzona jest temperatura i wilgotność względna (RH). W komorze doświadczalnej powietrze rozcieńczalnika miesza się z powietrzem ze zbiornika VC. Oba przepływy są regulowane za pomocą MFC. Stosunek tych dwóch mieszanin określa stężenie VC w komorze doświadczalnej. VC wchodzi do górnej części komory ekspozycyjnej przez dyspergator z siedmioma dyszami skierowanymi w różnych kierunkach. VC przechodzi obok myszy, a następnie jest wyczerpywany przez 12 oddzielnych portów, które są umieszczone pod stojakiem na klatkę. Wykazano, że ta konstrukcja komory zapewnia jednorodne stężenia toksycznych 25.
  2. Upewnij się, że ciśnienie, temperatura i wilgotność względna są monitorowane z wnętrza komory doświadczalnej i kontrolnej.
  3. Upewnij się, że wylot z komory jest przepuszczany przez filtr HEPA, sondę CO2 i filtr z węglem aktywnym przed wejściem do obszaru wydechu okapu chemicznego oraz że poziom CO2 jest monitorowany, aby upewnić się, że myszy otrzymują akceptowalną wentylację.
  4. Użyj niestandardowego oprogramowania do zmiany, monitorowania i rejestrowania zmiennych środowiskowych podczas narażenia inhalacyjnego.
    UWAGA: Jeśli używany jest system ręczny, zmienne opisane w krokach 2.1−2.4 powinny być monitorowane i kalibrowane, w razie potrzeby regularnie przez cały okres ekspozycji.

3. Przygotowanie do ekspozycji

  1. Wyłącz wszystkie przepływy powietrza w komorze doświadczalnej i kontrolnej dla bezpieczeństwa techników.
  2. Dla każdej komory otwórz drzwi komory i umieść chłonny materiał ściółkowy (chłonną stroną do góry) na wierzchu miski na odchody. Zwilż materiał chłonny, aby zapewnić komfortowy poziom wilgotności (40−60% wilgotności względnej) przez cały okres ekspozycji.
  3. Ustaw żądany poziom ekspozycji VC w komorze. W przypadku stężeń granicznych sub-OSHA należy użyć 0,85 ppm VC. Użyj zarządzanego programowo, opartego na detektorze sterowania sprzężeniem zwrotnym dostarczania VC do komory lub użyj ręcznej regulacji systemu.
    UWAGA: To drugie podejście wymaga znajomości objętości komory, częstotliwości odświeżania komory, przepływu powietrza i szybkości dostarczania gazu VC z zapasu; obliczenia te muszą być następnie zweryfikowane i skalibrowane poprzez pomiary stężeń VC w komorze w stanie ustalonym12,24. Najpowszechniejszą techniką pomiaru VC w komorze jest chromatografia gazowa analizy próbki powietrza12,24. Korzyści płynące z podejścia opartego na oprogramowaniu w zakresie dokładności i precyzji dostarczania VC są oczywiste. Wykazano jednak, że podejście ręczne jest również dokładne i spójne12,24.
    UWAGA: VC jest znanym substancją toksyczną i rakotwórczą w wysokich stężeniach. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i obchodzić się z gazem podczas włączania i wyłączania komór.

4. Klatka ekspozycyjna i przygotowanie zwierząt

  1. Wyjąć myszy z ich komór inhalacyjnych i umieścić je w indywidualnych klatkach stojaka na klatkę w komorze inhalacyjnej (jeden stojak na klatkę dla myszy kontrolnych, jeden dla myszy narażonych). Codziennie losowo umieszczaj każdą mysz w stojaku na klatkę, aby upewnić się, że każda mysz jest jednorodnie wystawiona w komorze ekspozycyjnej. Zaznacz numer każdego zwierzęcia i pozycję umieszczenia w klatce w zeszycie laboratoryjnym.
  2. Umieść każdy stojak na klatkę w odpowiedniej komorze i zamknij drzwi komory.

5. Przeprowadzanie ekspozycji

  1. Upewnij się, że zawór zbiornika gazu VC jest w pozycji otwartej. Upewnij się, że przepływ rozcieńczalnika do komory doświadczalnej jest ustawiony na 25 l/min.
  2. Uruchomić przepływ rozcieńczalnika w komorze doświadczalnej. Upewnij się, że rotametr w komorze kontrolnej jest ustawiony na 25 l/min.
  3. Upewnij się, że wszystkie czujniki (przepływu, temperatury, wilgotności, ciśnienia w komorze, poziomu CO2 ) działają prawidłowo i wyświetlają oczekiwane wyniki zarówno w komorze doświadczalnej, jak i kontrolnej.
    UWAGA: Przepływ VC jest obliczany i ustawiany na podstawie przepływu rozcieńczalnika i pożądanego stężenia VC.
  4. Upewnij się, że przez cały czas ekspozycji, w komorze doświadczalnej, czas ekspozycji, przepływ rozcieńczalnika, przepływ VC, temperatura, wilgotność, ciśnienie w komorze, poziom CO2 i teoretyczne stężenie VC są wyświetlane, przedstawiane na wykresach i rejestrowane. Upewnij się, że temperatura i wilgotność w komorze kontrolnej są również wyświetlane, przedstawiane na wykresach i rejestrowane.
    UWAGA: Jeśli używany jest system ręczny, przepływ VC powinien być sprawdzany i regulowany, w razie potrzeby, przez cały okres ekspozycji.
  5. Jeśli podczas ekspozycji wystąpią jakiekolwiek problemy, ustaw przepływ VC na zero i zwiększ przepływ rozcieńczalnika do maksymalnej wartości, aby szybko oczyścić komorę.
  6. Po osiągnięciu czasu naświetlania (tj. 6 godzin/dzień) oprogramowanie automatycznie wyłącza przepływ VC. Następnie rozpoczyna się 15-minutowy zegar bezpieczeństwa na czas po upływie czasu, w którym komora doświadczalna może usunąć VC. Gdy usunięcie zwierząt będzie bezpieczne, kliknij przycisk OK w oknie dialogowym. System przestanie rejestrować pomiary do pliku, a ekspozycja dobiegnie końca.
    UWAGA: Jeśli używany jest system ręczny, użytkownik musi ręcznie wyłączyć przepływ VC na koniec czasu trwania ekspozycji i należy obliczyć czas zezwolenia VC na koniec ekspozycji.

6. Po ekspozycji

  1. Przekręcić kurek na zaworze zbiornika gazu VC do pozycji zamkniętej i wyłączyć wszystkie przepływy powietrza w komorze ekspozycyjnej. Obracaj rotametrem, aż przez komorę kontrolną nie przepływa przepływ powietrza.
  2. Zdejmij drzwi z każdej komory, aby zapewnić myszom wentylację. Wyjmij stojaki na klatki z komór. Pod maską wyjmij myszy z klatek ekspozycyjnych i umieść je z powrotem w klatkach mieszkalnych. Przetransportuj wszystkie myszy z powrotem do ich pomieszczenia w celu zakwaterowania na noc w zwykłych klatkach.
  3. Wyrzuć wszelkie odpady z miski na odchody do zatwierdzonego przez Departament Zdrowia i Bezpieczeństwa Środowiskowego (DEHS) pojemnika na zagrożenia biologiczne, ponieważ mogą one zostać uznane za zagrożenie chemiczne przez instytucjonalne służby zdrowia środowiskowego. Wyczyść drzwi komory, miskę na odchody, stojak na klatkę ekspozycyjną i komorę ekspozycyjną dla systemów eksperymentalnych i kontrolnych.

7. Walidacja stężenia VC w komorach podczas ekspozycji

  1. Przeprowadzić pomiar stężenia VC w komorze doświadczalnej w połowie każdej ekspozycji (3 godziny).
  2. Rozbij szklane końcówki rurki detektora VC i rurki do obróbki wstępnej. Podłącz końcówkę wylotową rurki detektora VC do pompy rurki detektora. Podłącz końcówkę wlotową rurki detektora VC do końcówki wylotowej rurki do obróbki wstępnej za pomocą krótkiego kawałka rurki. Przymocuj krótki kawałek rurki do wlewu rurki do obróbki wstępnej.
  3. Wyjmij zatyczkę z jednego z portów do pobierania próbek, który znajduje się w pobliżu strefy oddychania myszy. Podłączyć rurkę od końca przepływowego rurki do obróbki wstępnej do portu pobierania próbek.
  4. Z pozycji całkowicie wysuniętej wysunąć uchwyt na tłoku pompy rurki detektora do pozycji całkowicie wysuniętej. Spowoduje to wciągnięcie 100 ml próbki gazu z komory do rurki detekcyjnej VC w ciągu 90 sekund. Po odczekaniu 90 s wciśnij uchwyt z powrotem.
  5. Powtórz krok 7.4 jeszcze trzy razy, aby do rurki detektora VC zostało wciągnięte łącznie 400 ml.
  6. Wyjmij rurkę z portu pobierania próbek komory i ponownie włóż wtyczkę do portu. Sprawdź zmianę koloru rurki detektora VC, aby ustalić stężenie VC w komorze.
  7. Zapisz odczyt rurki detektora VC w notatniku laboratoryjnym i porównaj z wartością teoretyczną. Rurkę detekcyjną VC i probówkę do obróbki wstępnej należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika.

8. Zakończenie eksperymentu z narażeniem inhalacyjnym

UWAGA: Po pożądanym punkcie czasowym ekspozycji, na przykład 6, 8 i/lub 12 tygodni po rozpoczęciu ekspozycji inhalacyjnej, eksperymenty są przerywane, a zwierzęta są poddawane eutanazji (zobacz Rysunek 1 dla osi czasu).

  1. Pościć myszy 4 godziny przed czasem eutanazji.
    UWAGA: Ta procedura umożliwia określenie poziomu glukozy i insuliny we krwi na czczo do analizy metabolicznej.
  2. Stosuj podejście eutanazyjne zgodne z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych (AVMA), takie jak znieczulenie, a następnie wykrwawienie.
  3. Ketaminę/ksylazynę (100/15 mg/kg) należy podawać każdej myszy we wstrzyknięciu dootrzewnowym w celu wywołania znieczulenia.
    UWAGA: Unikaj pentobarbitalu sodu jako środka znieczulającego przed eutanazją, ponieważ narażenie na chlorek winylu może osłabić jego skuteczność.
  4. Pobrać krew z żyły głównej dolnej do roztworu cytrynianu sodu (ostatecznie, 0,38%), aby zapobiec krzepnięciu krwi i zachować próbkę.
  5. Usuń wątrobę i/lub inny pożądany narząd. Wypreparuj wątrobę i zamroź części w ciekłym azocie, zanurz w zamrożonej pożywce i utrwal w 10% buforowanej formalinie do histologii.
  6. Oddzielić osocze od krwi przez odwirowanie i przenieść osocze cytryniane do odpowiedniej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebne do analizy.
  7. Aby ocenić histologiczne wskaźniki uszkodzenia wątroby, należy wykonać barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) za pomocą 5 μM formalinowych skrawków wątroby zatopionych w parafinie i uzyskać obrazy za pomocą mikroskopu jasnego pola.
  8. Aby uzyskać poziomy aminotransferaz w osoczu, należy wykonać zarówno testy kinetyczne aminotransferazy alaninowej (ALT), jak i aminotransferazy asparaginianowej (AST) na osoczu cytrynianowym, korzystając z dostępnych na rynku zestawów.
    UWAGA: W celu kontroli jakości aminotransferazy osocza dla myszy C57Bl / 6J powinny znajdować się w normalnym zakresie (35−45 IU / L) dla grupy LFD + VC, podczas gdy wartości powinny być podwyższone (~ 150 IU / L) dla grupy HFD + VC (Rysunek 3C).

Wyniki

W trakcie eksperymentu tygodniowo monitorowano masę ciała zwierząt oraz spożycie pokarmu, aby zapewnić zdrowie zwierząt i ocenić metabolizm in vivo. Rysunek 3A przedstawia masę ciała i spożycie pokarmu w ciągu 12-tygodniowego eksperymentu. Masę ciała mierzono raz w tygodniu, a spożycie pokarmu dwukrotnie w tygodniu dla wszystkich grup. Wszystkie myszy zwiększyły masę ciała w trakcie badania. Chociaż, zgodnie z oczekiwaniami, myszy w grupach HFD zwiększyły masę ciała bardziej niż myszy w grupach LFD, myszy poddane działaniu VC nie zyskały na wadze bardziej niż myszy w odpowiedniej grupie kontrolnej. Spożycie pokarmu nie różniło się między wszystkimi grupami12,24.

Rysunek 3B przedstawia reprezentatywne mikrofotografie przekrojów wątroby barwionych H&E w celu analizy ogólnej morfologii. W grupie LFD podanie VC nie wywołało wyraźnych zmian patologicznych. Karmienie dietą HFD znacząco zwiększyło stopień steatozy (gromadzenia tłuszczu), a ekspozycja na VC nasiliła ten efekt. Ponadto ekspozycja na VC w grupie HFD doprowadziła do powstania niektórych ognisk zapalnych12,24.

Poziomy transaminaz osocza (ALT i AST) mierzono jako wskaźniki uszkodzenia wątroby, a podwyższony poziom transaminaz świadczy o uszkodzeniu tego narządu. W grupie LFD VC nie zwiększył poziomu transaminaz. Sam HFD nieznacznie zwiększył poziomy transaminaz, a co istotne, VC znacznie nasilił ten efekt (Rycina 3C)12,24.

Obliczono stosunki masy wątroby do masy ciała dla każdej grupy. HFD istotnie zwiększył stosunek masy wątroby do masy ciała. Jednakże VC nie zwiększył istotnie tego efektu (Rysunek 3D)12.

Harmonogram eksperymentu dietetycznego, dieta wysokotłuszczowa (HFD), ekspozycja na wdychanie lotnych związków (VC), 12 tygodni.
Rysunek 1: Przegląd procedury modelu inhalacyjnego. Myszy karmiono odpowiednio dietą niskotłuszczową (13% tłuszczów nasyconych) lub wysokotłuszczową (42% tłuszczów nasyconych) ad libitum przez 1 tydzień w celu aklimatyzacji do oczyszczonej diety. Po jednym tygodniu myszy włączono do schematu inhalacyjnego. W tym celu myszy umieszczono w nowoczesnych komorach inhalacyjnych całego ciała w celu ekspozycji na stężenie VC poniżej poziomu OSHA wynoszące <1 ppm (0,85 ppm ± 0,1 ppm) lub powietrze pokojowe (kontrola) przez 6 h/dobę, 5 dni/tydzień, przez 12 tygodni. Podczas procedury inhalacyjnej myszy miały swobodny dostęp do pożywienia i wody. W 12. tygodniu myszy zostały poddane eutanazji rano. Model ten można rozszerzyć na dłuższe okresy przewlekłej ekspozycji. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat układu narażenia na chlorek winylu z komorami kontrolną i eksperymentalną, przepływem powietrza i systemami monitorowania.
Rysunek 2: Projekt komory inhalacyjnej. Przedstawiono schemat zautomatyzowanego systemu narażenia inhalacyjnego, który zapewnia jednorodne stężenia toksykantu. Dedykowane oprogramowanie pozwala użytkownikowi zmieniać, monitorować i rejestrować zmienne środowiskowe podczas ekspozycji inhalacyjnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Badanie diety myszy; wykresy, histologia i wykresy pudełkowe; masa ciała, analiza wątroby i transaminaz.
Rycina 3: Chlorek winylu sam w sobie nie powoduje wyraźnego uszkodzenia wątroby, lecz nasila dietozależną chorobę wątroby. (A) Masa ciała i spożycie pokarmu były monitorowane co tydzień. (B) Przedstawiono reprezentatywne mikrofotografie ogólnej morfologii wątroby po barwieniu H&E (powiększenie = 200x). (C) Pod koniec okresu ekspozycji pobrano osocze cytrynianowe i przeanalizowano aktywność enzymatyczną transaminaz jako wskaźnik uszkodzenia wątroby. (D) Masę wątroby określono w różnych punktach czasowych eksperymentu i porównano z całkowitą masą ciała. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM.a, p < 0.05 w porównaniu do odpowiedniej grupy kontrolnej LFD;b, p < 0.05 w porównaniu do braku VC. Liczebność próby w grupie n = 8−10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Ten model NAFLD wzmocnionej VC jest nowatorską metodą oceny wpływu ekspozycji na VC poniżej limitu OSHA w paradygmacie inhalacji całego ciała. Model ten pozwala badaczom badać subhepatotoksyczne i uczulające działanie przez niskie poziomy samego VC. Rzeczywiście, ten model jednoczesnej ekspozycji osiąga zwiększone uszkodzenie wątroby, zwiększenie stężenia AlAT i AspAT w osoczu oraz umiarkowany stan zapalny, jednocześnie w dużej mierze nie wpływając na inne układy narządów, takie jak serce, w tym stężeniu23. Ten przewlekły model wymaga komór inhalacyjnych całego ciała, ale minimalizuje stres i stężenia ekspozycji. Chociaż przedstawiony tutaj protokół jest podejściem opartym na oprogramowaniu, nasze doświadczenie pokazuje, że podejście ręczne jest również dokładną i spójną metodą ekspozycji12,24. Co więcej, można go łatwo zastosować w wielu obszarach badawczych, w tym w innych uszkodzeniach narządów23 spowodowanych narażeniem na lotne związki organiczne22. Warto zauważyć, że model ten może bardziej przypominać patogenezę jednoczesnego narażenia ludzi na chemikalia środowiskowe i chorobypodstawowe5.

Aby uzyskać podobne wyniki, należy wykonać pewne krytyczne etapy optymalizacji protokołu. Na przykład badacze muszą ustalić, że stężenie VC lub innego toksycznego środka w komorach mieści się w pożądanym zakresie narażenia (tj. poziom niski, sub-OSHA lub poziom ostry). Optymalizacja tego etapu komory inhalacyjnej ma kluczowe znaczenie dla udanego modelu narażenia ludzi, który jest przedmiotem zainteresowania. Po drugie, dostosowanie czasu ekspozycji na dzień i czasu trwania eksperymentu może być również modyfikowane. Zgodnie z zainteresowaniami tej grupy osiągnięto ustawienie narażenia zawodowego, a także zbadano dodatkowy parametr diety. Jednak za pomocą tego protokołu można również modelować narażenia środowiskowe i ostre.

Praca ta podważa paradygmat, zgodnie z którym obecne limity narażenia na VC (zawodowe i środowiskowe) są bezpieczne. Rzeczywiście, chociaż obecny limit ekspozycji OSHA na VC wynosi 1 ppm, model ten udowodnił, że stężenia VC poniżej tego limitu są wystarczające, aby zwiększyć uszkodzenie wątroby spowodowane przez HFD u myszy. Protokół ten pozwala badaczom na zbadanie i scharakteryzowanie nowego paradygmatu narażenia na substancje toksyczne oraz modelowanie TASH.

Jest to pierwszy model przewlekłej ekspozycji na niskie dawki VC. W poprzednich pracach stosowano bardzo wysokie stężenia w bolusie, ostre narażenie lub aktywne metabolity jako substytuty ekspozycji na VC. Wszystkie te podejścia zmniejszają znaczenie wyników dla narażenia ludzi. W związku z tym ten nowatorski model interakcji TASH-NAFLD stanowi niezbędną platformę dla badaczy do badania złożonych interakcji ekspozycji na VC niskiego poziomu.

Ten model uszkodzenia wątroby wywołanego przez toksyny może być stosowany do innych lotnych związków organicznych, a także do badania innych interakcji, które mogą wpływać na wątrobę i inne układy narządów 8,22,23. Co więcej, model ten był i może być dalej wykorzystywany do badania terapii interwencyjnych i dogłębnych badań mechanistycznych nad sposobem działania tego powszechnego czynnika toksycznego24. Ponieważ VC jest znanym czynnikiem rakotwórczym 26,27,28, ten paradygmat ekspozycji może być również zmodyfikowany na potrzeby badania raka wywołanego przez VC. Inne choroby współistniejące, takie jak alkoholowa choroba wątroby, mogą być również wzmocnione przez jednoczesną ekspozycję na VC. Dodatkowo interesujące byłoby zbadanie różnych rodzajów tłuszczów, takich jak tłuszcze wielonienasycone18,29,30 lub różne rodzaje węglowodanów31 i ich jednoczesna ekspozycja z VC w tym modelu. Rzeczywiście, wiadomo, że wszystkie te czynniki mają zróżnicowany wpływ na rozwój uszkodzenia wątroby i mogą odgrywać rolę w chorobie wątroby wywołanej VC.

Podsumowując, jest to nowatorski model inhalacyjny uszkodzenia wątroby wywołanego toksynami środowiskowymi i ustanawia paradygmat narażenia na przewlekłe narażenie na VC na niskim poziomie. Stężenie VC stosowane w tym modelu jest samo w sobie subhepatotoksyczne, podczas gdy zwiększa uszkodzenie wątroby spowodowane przez inny czynnik (HFD) u myszy. Model ten pozwoli badaczom na badanie mechanizmów i interwencji w przypadku przewlekłej toksyczności VC i może być pomocny w badaniach translacyjnych z udziałem ludzi narażonych i o najwyższym ryzyku ekspozycji.

Oświadczenia

WT Goldsmith ma udziały finansowe w IEStechno, które jest szablonem dla opisywanego systemu. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane z nagród National Institutes of Health (K01 DK096042 i R03 DK107912) dla Juliane Beier. Badania były również wspierane przez Institutional Development Award (IDeA) przyznawaną przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu nr P20GM113226 oraz National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism of the National Institutes of Health w ramach grantu nr P50AA024337. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki ALT/ASTMyszy Thermo FisherTR70121, TR71121
C57Bl/6JBadania nazwierzętach prowadzone 000664 Jackson Laboratory muszą być zgodne ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi i dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz muszą zostać sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednie rządowe i instytucjonalne komitety ds. opieki i użytkowania zwierząt
. Ponieważ jest to badanie przewlekłe, zalecamy użycie samców lub samic myszy w wieku 4-6 tygodni.
Monitor CO2IEStechnoEx-Sens
EosinSigmaE6003
HematoxylinSigmaHHS16
System komór do ekspozycji inhalacyjnejIEStechnoGasExpoSystem komór do ekspozycji inhalacyjnej zawiera niestandardowe oprogramowanie, interfejs i koncentratory kontrolera
Tłuszcze nasycone (13%) dieta kontrolnaTeklad DietsTD.120336
Dieta z tłuszczami nasyconymi (42%)Teklad DietsTD.07511
Cytrynian soduSigma71497
Chlorek winyluMATHESON TRI-GASSeria 3590-CGA*Z gazem należy obchodzić się ostrożnie

Bibliografia

  1. Sass, J. B., Castleman, B., Wallinga, D. Vinyl chloride: a case study of data suppression and misrepresentation. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 809-812 (2005).
  2. ATSDR. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR): Toxicological profile for Vinyl Chloride. , (2006).
  3. Wahlang, B., et al. Toxicant-associated steatohepatitis. Toxicologic Pathology. 41 (2), 343-360 (2013).
  4. Cave, M., et al. Toxicant-associated steatohepatitis in vinyl chloride workers. Hepatology. 51 (2), 474-481 (2010).
  5. Cave, M., Falkner, K. C., McClain, C. J. Occupational and Environmental Hepatotoxicity. Zakim and Boyer's Hepatology. Boyer, D. T., Manns, M. P., Sanyal, A. J. , Saunders. Philadelphia, PA. 476-492 (2012).
  6. Tamburro, C. H., Makk, L., Popper, H. Early hepatic histologic alterations among chemical (vinyl monomer) workers. Hepatology. 4 (3), 413-418 (1984).
  7. EPA. Toxicological review of vinyl chloride in support of summary information on the Integrated Risk Information System. EPA. , (2000).
  8. Lang, A. L., Beier, J. I. Interaction of volatile organic compounds and underlying liver disease: a new paradigm for risk. Biological Chemistry. 399 (11), 1237-1248 (2018).
  9. Abplanalp, W., et al. Benzene exposure is associated with cardiovascular disease risk. PLoS ONE. 12 (9), 0183602(2017).
  10. Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
  11. Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - A global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
  12. Lang, A. L., et al. Vinyl chloride dysregulates metabolic homeostasis and enhances diet-induced liver injury in mice. Hepatology Communications. 2 (3), 270-284 (2018).
  13. Lotti, M. Do occupational exposures to vinyl chloride cause hepatocellular carcinoma and cirrhosis. Liver International. 37 (5), 630-633 (2017).
  14. Antweiler, H. Studies on the metabolism of vinyl chloride. Environmental Health Perspectives. 17, 217-219 (1976).
  15. Bolt, H. M. Metabolic activation of vinyl chloride, formation of nucleic acid adducts and relevance to carcinogenesis. IARC Scientific Publications. (70), 261-268 (1986).
  16. Guengerich, F. P., Crawford, W. M., Watanabe, P. G. Activation of vinyl chloride to covalently bound metabolites: roles of 2-chloroethylene oxide and 2-chloroacetaldehyde. Biochemistry. 18 (23), 5177-5182 (1979).
  17. Anders, L. C., et al. Vinyl Chloride Metabolites Potentiate Inflammatory Liver Injury Caused by LPS in Mice. Toxicological Sciences. 151 (2), 312-323 (2016).
  18. Anders, L. C., et al. Role of dietary fatty acids in liver injury caused by vinyl chloride metabolites in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 311, 34-41 (2016).
  19. Morinello, E. J., Koc, H., Ranasinghe, A., Swenberg, J. A. Differential induction of N(2),3-ethenoguanine in rat brain and liver after exposure to vinyl chloride. Cancer Research. 62 (2), 5183-5188 (2002).
  20. Guardiola, J. J., et al. Occupational exposures at a polyvinyl chloride production facility are associated with significant changes to the plasma metabolome. Toxicology and Applied Pharmacology. 313, 47-56 (2016).
  21. Chen, L. C., Lippmann, M. Inhalation toxicology methods: the generation and characterization of exposure atmospheres and inhalational exposures. Current Protocols in Toxicology. 63 (1), 1-24 (2015).
  22. Wahlang, B., et al. Mechanisms of Environmental Contributions to Fatty Liver Disease. Current Environmental Health Reports. 6 (3), 80-94 (2019).
  23. Liang, Y., et al. Exposure to Vinyl Chloride and Its Influence on Western Diet-Induced Cardiac Remodeling. Chemical Research in Toxicology. 31 (6), 482-493 (2018).
  24. Chen, L., Lang, A. L., Poff, G. D., Ding, W. X., Beier, J. I. Vinyl chloride-induced interaction of nonalcoholic and toxicant-associated steatohepatitis: Protection by the ALDH2 activator Alda-1. Redox Biology. 24, 101205(2019).
  25. Goldsmith, W. T., et al. A computer-controlled whole-body inhalation exposure system for the oil dispersant COREXIT EC9500A. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A. 74 (21), 1368-1380 (2011).
  26. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. International Agency for Research on Cancer. , Lyon, France. (2008).
  27. IARC. Chemical agents and related occupations. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 100, Pt F 9(2012).
  28. Fedeli, U., et al. Mortality from liver angiosarcoma, hepatocellular carcinoma, and cirrhosis among vinyl chloride workers. American Journal of Industrial Medicine. 62 (1), 14-20 (2019).
  29. Kirpich, I. A., et al. Ethanol and dietary unsaturated fat (corn oil/linoleic acid enriched) cause intestinal inflammation and impaired intestinal barrier defense in mice chronically fed alcohol. Alcohol. 47 (3), 257-264 (2013).
  30. Kirpich, I. A., et al. Saturated and Unsaturated Dietary Fats Differentially Modulate Ethanol-Induced Changes in Gut Microbiome and Metabolome in a Mouse Model of Alcoholic Liver Disease. American Journal of Pathology. 186 (4), 765-776 (2016).
  31. Spruss, A., Bergheim, I. Dietary fructose and intestinal barrier: potential risk factor in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (9), 657-662 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspozycja na chlorek winyluprotokół inhalacyjnymodel choroby wątrobytoksykant środowiskowyniealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątrobyekspozycja przewlekłamonitorowanie stanu zdrowia zwierzątekspozycja całego organizmu
Chlorek winylu i dieta wysokotłuszczowa jako model interakcji środowiska i otyłości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.