Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Podsumowanie

Mycobacterium tuberculosis wykazuje zwiększoną produkcję i uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w odpowiedzi na warunki niskiego poziomu żelaza. Praca ta szczegółowo opisuje protokół generowania warunków o niskiej zawartości żelaza oraz metody oczyszczania i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków uwalnianych w odpowiedzi na niedobór żelaza.

Streszczenie

Prątki, w tym Mycobacterium tuberculosis (Mtb), czynnik wywołujący gruźlicę u ludzi, naturalnie uwalniają pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) zawierające immunologicznie aktywne cząsteczki. Wiedza na temat molekularnych mechanizmów biogenezy pęcherzyków, zawartości pęcherzyków i ich funkcji na granicy faz patogen-gospodarz jest bardzo ograniczona. Odpowiedź na te pytania wymaga rygorystycznych procedur izolacji, oczyszczania i walidacji pojazdów elektrycznych. Wcześniej stwierdzono, że produkcja pęcherzyków jest zwiększona, gdy M. tuberculosis był narażony na ograniczenie żelaza, stan napotkany przez Mtb w środowisku gospodarza. Przedstawiono tutaj kompletny i szczegółowy protokół izolacji i oczyszczania EV z prątków z niedoborem żelaza. Do walidacji oczyszczonych EV stosuje się metody ilościowe i jakościowe.

Wprowadzenie

Mykobakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (MEV) to nanocząstki związane z błoną, o rozmiarach 60−300 nm, naturalnie uwalniane przez szybko i wolno rosnące prątki¹. MEV uwalniane przez chorobotwórcze prątki stanowią mechanizm interakcji z gospodarzem za pośrednictwem immunologicznie aktywnych białek, lipidów i glikolipidów wydzielanych w skoncentrowany i chroniony sposób^2,3,4. Aby scharakteryzować MEV i zrozumieć ich biogenezę i funkcje, kluczowe znaczenie mają ścisłe i skuteczne metody oczyszczania i walidacji pęcherzyków. Do tej pory MEV zostały wyizolowane z filtratów hodowlanych prątków hodowanych w pożywce bogatej w żelazo^1,5,6,7,8.

Jednak poprzednie prace wykazały, że ograniczenie żelaza znacznie stymuluje uwalnianie pęcherzyków w Mtb, prawdopodobnie do wychwytywania żelaza przez mykobaktynę, siderofor wydzielany w MEVs⁹. Chociaż opisano procedury izolacji MEV od Mtb hodowanego w pożywce o wysokiej zawartości żelaza, nie zgłoszono skutecznej metodologii otrzymywania MEV z kultur o niskiej zawartości żelaza. Dlatego celem tej metody jest wyizolowanie, oczyszczenie i ilościowe określenie MEV uzyskanych z kultur o niskiej zawartości żelaza, tak aby można je było wykorzystać do testów biochemicznych i funkcjonalnych oraz do analizy genetycznych uwarunkowań produkcji pęcherzyków u prątków.

Protokół

1. Przygotowanie zdefiniowanego podłoża zubożonego w żelazo

1. Przygotować 1 l minimalnej pożywki (MM), rozpuszczając 5 g KH₂PO₄, 5 g L-asparaginy, 20 ml glicerolu i 2 g dekstrozy w 900 ml wody dejonizowanej w plastikowym pojemniku. Unikaj szkła, aby zapobiec zanieczyszczeniu żelazem. Doprowadzić pH do 6,8 za pomocą 5 N NaOH, a objętość do 1 l za pomocą wody.
2. Dodać 50 g żywicy chelatującej metale (MCR) i delikatnie mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego przez 24 godziny w temperaturze 4 °C. Wysterylizować i usunąć MCR przez filtrację przez jednostkę filtrującą 0,22 μm z plastikowym zbiornikiem. Aby przyspieszyć filtrację i zapobiec zatykaniu się filtra, pozostaw żywicę na około 30 minut przed filtracją.
   nuta: Pożywka ta zawiera mniej niż 2 μM resztkowego żelaza, co określono za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej.
3. Uzupełnij MM 0,5 mg/l ZnCl₂, 40 mg/l_MgSO4 i 0,1 mg/L_MnSO4. Oddzielnie przygotuj skoncentrowane zapasy (1,000x) każdego z metalowych suplementów w wodzie dejonizowanej i sterylizuj przez filtrację przed suplementacją MM. MM zubożony w żelazo, uzupełniony metalem będzie tutaj określany jako MM o niskiej zawartości żelaza (LIMM).
4. Z 50 mM zapasu FeCl₃ rozpuszczonego w 10 mM HCl, dodaj 1 ml do 1 l LIMM (50 μM stężenie końcowe), aby otrzymać MM o wysokiej zawartości żelaza (HIMM).

2. Hodowla prątków w warunkach ograniczonych żelazem

1. Rozmrozić 50 μl zamrożonego 15% glicerolu Mtb i ułożyć na płytce agarowej uzupełnionej 10% wzbogaceniem ADN (5 g/L albuminy, 2 g/L dekstrozy i 0,85 g/L chlorku sodu, 0,2% glicerolu i 0,05% Tween-80)¹⁰. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C aż do momentu, gdy pojawią się kolonie.
2. Zaszczepij pojedynczą kolonię Mtb¹⁰ w 2 ml pożywki bulionowej mykobakteryjnej (tabela materiałów) uzupełnionej wzbogaceniem ADN. Inkubować z mieszaniem w temperaturze 37 °C.
3. Niech kultura Mtb urośnie do późnej fazy logarytmicznej (OD₅₄₀ wynosi ~0,8). Aby to sprawdzić, zmierz OD₅₄₀ za pomocą spektrofotometru.
4. Rozprowadzić 200 μl późnej kultury logarytmicznej na płytkach agarowych prątków (tabela materiałów) uzupełnionych 0,2% glicerolu, 0,05% Tween-80 i ADN. Zaszczepić co najmniej 5 płytek. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C do momentu, gdy rozwój bakterii będzie widoczny w postaci zlewającej się warstwy. Zajmuje to ~1 tydzień dla Mtb.
5. Zwilż sterylny bawełniany wacik w LIMM. Użyj tego wacika, aby zebrać bakterie z płytek agarowych i zaszczepić 100 ml LIMM, aby przygotować skoncentrowaną zawiesinę bakteryjną o OD₅₄₀ ~1,0.
6. Rozcieńczyć tę zawiesinę 10 razy do objętości 1 litra za pomocą LIMM i podzielić ją na dwie sterylne plastikowe butelki o pojemności 2 litrów, z których każda zawiera 500 ml kultury.
7. Wyjmij 2 ml kultury i przenieś ją do probówki hodowlanej o pojemności 5 ml. Dodać 10 μl tyloksapolu 10% obj.
8. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w temperaturze 14 dni.

3. Kolekcja MEV

1. Zmierzyć OD₅₄₀ w 2 ml kultury w momencie pobierania. Wykonać seryjne rozcieńczenia kultury w stosunku 1:10 i podać 100 μl każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych z ADN i 0,05% Tween-80.
2. Przenieść kulturę do pięciu stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 225 ml i wirować przy 2,850 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.
3. Zebrać supernatant hodowli za pomocą pipety o pojemności 50 ml i przefiltrować, wysterylizować przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.

4. Izolacja MEV

1. Przenieść filtrat hodowlany do systemu ultrafiltracji z mieszanymi komórkami umieszczonego w temperaturze 4 °C i przefiltrować koncentrat przy <50 psi przez membranę odcinającą 100 kDa do ~50 ml.
2. Odwirować zagęszczony filtrat kulturowy o sile 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.
3. Odwirować filtrat kulturowy w probówkach ultrawirówek z poliwęglanu o sile 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
4. Zawiesić błoniaste granulki w objętości łącznie 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez delikatne pipetowanie.
5. Zmieszać 0,5 ml zawiesiny osadów otrzymanej w kroku 4.4 z 1,5 ml 60% roztworu jodiksanolu, uzyskując końcowe stężenie jodiksanolu wynoszące 45% wag./obj. Dozować tę mieszaninę na dno cienkościennej probówki ultrawirówki z polipropylenu o wymiarach 13 mm x 51 mm.
6. Na zawiesinę MEV-jodixanol 45% nałożyć 1 ml roztworów jodiksanolu o stężeniu 1 ml roztworów 40%, 35%, 30%, 25% i 20% (obj. w PBS) oraz 1 ml PBS na górze.
7. Wirować przy 100 000 x g przez 18 godzin w temperaturze 4 °C.
8. Zbierz 1 ml frakcje gradientu gęstości, zaczynając od góry, za pomocą strzykawki Hamilton o pojemności 1 ml.
9. Rozcieńczyć każdą zebraną frakcję do 20 ml za pomocą PBS i odwirować przy 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
10. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 0,5 ml PBS. Przechowywać ten granulat w temperaturze 4 °C.

5. Kwantyfikacja MEV

1. Zmierz stężenie białka w każdej frakcji za pomocą testu Bradforda (tabela materiałów), postępując zgodnie z wytycznymi producenta.
2. Wykonaj analizę lipidów błonowych.
   1. Inkubować 10 μl każdej frakcji gradientowej za pomocą fluorescencyjnej sondy membranowej 1-(4-trimetyloamoniomfenylo)-6-fenylo-1,3,5-heksatrien-p-toluenosulfonianu (TMA-DPH) przy końcowym stężeniu 1 μg/ml w końcowej objętości 50 μl PBS w 96 dołkach czarnych.
   2. Inkubować płytki w temperaturze 33 °C przez 20 minut.
   3. Zmierzyć fluorescencję przy wzbudzeniu 360 nm i emisji 430 nm.

6. Analiza jakościowa MEV

1. Wykonaj elektroforezę białek.
   1. Zmieszać około 1 μg próbek MEV w 16 μl z 4 μl 5 razy więcej buforu do ładowania próbki (10% w/v SDS, 10% mM ditiotreitol, 20% v/v glicerolu 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% w/v błękitu bromofenolowego) i podgrzewać próbki w buforze próbki w temperaturze 85 °C przez 5 min.
   2. Załaduj 10% Tris/Glycine SDS-poliakryloamid żel¹¹ i uruchom z napięciem 10 V/cm w buforze do pracy (25 mM zasada Tris, 190 mM glicyna, 0,1% SDS), aż niebieski przód barwnika dotrze do dna żelu.
   3. Zabarwić żel ultrawrażliwym roztworem do barwienia białek (tabela materiałów).
2. Wykonaj plamę punktową.
   1. Załadować 2 μl zawiesiny MEV o stężeniu około 0,5 μg/μl i dwukrotnie seryjnie rozcieńczyć na membranie nitrocelulozowej i poddać procesowi do uzyskania kropli punktowej zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Użyj surowicy odpornościowej wyhodowanej u myszy przeciwko preparatowi MEV w rozcieńczeniu 1:5 000 jako przeciwciało pierwszorzędowe i koziego anty-mysiego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:10 000 jako przeciwciała drugorzędowego. Wykrywanie kompleksów antygen-przeciwciało za pomocą odpowiedniego substratu HRP, odczynnika do wykrywania blottingu i systemu obrazowania.
3. Wykonaj barwienie ujemne i mikroskopię elektronową.
   1. Związać 250 μl MEV z 2% aldehydem glutarowym w 0,1 M kakodylanu w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i inkubować przez noc w 4% formaldehydzie, 1% aldehydzie glutarowym i 0,1% PBS.
   2. Utrwalone próbki należy barwić 2% tetratlenkiem osmu przez 90 minut.
   3. Seryjnie odwodnić próbkę w etanolu i zatopić w żywicy epoksydowej Spurr.
   4. Obserwuj MEV pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

Wyniki

MEV zostały oczyszczone przez różnicową sedymentację w gradiencie gęstości (Rysunek 1, Rysunek 2). W opisanych warunkach MEV rozdzielały się głównie we frakcji gradientowej 3 (F3), która odpowiada 25% jodiksanolu. Wniosek ten opiera się na wykryciu białka, lipidów błonowych, mikroskopowej wizualizacji nienaruszonych MEV, rozkładzie wielkości nanocząstek i dodatniej reaktywności za pomocą surowicy przeciwpęcherzykowej (Rysunek 2, ...

Dyskusja

Opracowano wiele metod oczyszczania egzosomów pochodzących z komórek eukariotycznych¹². Z drugiej strony istnieją ograniczone informacje na temat skutecznych metod oczyszczania EV pochodzących z bakterii⁷. Skuteczna izolacja EV pochodzących z Mtb musi uwzględniać nieodłączne trudności w hodowli tego chorobotwórczego prątka. Mtb ma długi czas podziału (~24 h) i powinien być traktowany w warunkach trzeciego poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3). Dlatego ważne jest, aby...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórka mieszająca Amicon Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell System ultrafiltracji
BD Polipropylen 225 mL probówki stożkowe	Fisher	05-538-61	Stożkowe probówki wirówkowe
Membrana ultrafiltracyjna odcinająca Biomax 100 kDa	EMD Milipore	PBHK07610	Membrana ultrafiltracyjna
Żywica Chelex-100	Bio-Rad	142-2842	Metal żywica chelatująca
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mykobakteryjne płytki agarowe
Middlebrook 7H9 Bulion	BD Difco	271310	Pożywka bulionowa mykobakteryjna
Membrana do bibułowania nitrocelulozowego	GE Healthcare	10600001	Membrana do bibułowania
Optiprep	Sigma	D1556	jodixanolu
poliwęglanu Rurki 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Probówki do ultra wirówek z poliwęglanu 25 mm x 89 mm
Cienkościenna rurka wirówkowa z polipropylenu 13 mm x 15 mm	Beckman Coulter	344059	Polipropylenowa cienkościenna rurka wirówkowa 13 mm x 15 mm
Barwnik do oznaczania białek	BioRad	5000006	Bradford Barwienie białek
SYPRO Rubinowe	sondy molekularne	S12000	Ultraczułe barwienie białkowe
TMA-DPH	Sondy molekularne	T204	1-(4-trimetyloamoniomfenylo)-6-fenylo-1,3,5-heksatrien p-toluenosulfonian
Termosy	CellPro	V50022	Jednostka filtrująca