Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
C. elegans to najlepszy system do systematycznej analizy specyfikacji losów komórek i zdarzeń morfogenetycznych podczas rozwoju embrionalnego. Jednym z wyzwań jest to, że embriogeneza rozwija się dynamicznie w okresie około 13 godzin; Ta półdniowa skala czasowa ograniczyła zakres eksperymentów, ograniczając liczbę embrionów, które można zobrazować. W tym miejscu opisujemy protokół o niskiej przepustowości, który pozwala na jednoczesne obrazowanie poklatkowe 3D rozwoju 80-100 zarodków w umiarkowanej rozdzielczości czasowej, z maksymalnie 14 różnych stanów, w jednym ciągu nocy. Protokół jest prosty i może być wdrożony przez każde laboratorium z dostępem do mikroskopu z możliwością odwiedzin punktowych. Użyteczność tego protokołu została zademonstrowana poprzez wykorzystanie go do zobrazowania dwóch niestandardowych szczepów eksprymujących markery fluorescencyjne zoptymalizowane pod kątem wizualizacji kluczowych aspektów specyfikacji listka zarodkowego i morfogenezy. Aby przeanalizować dane, zbudowano niestandardowy program, który przycina poszczególne zarodki z szerszego pola widzenia we wszystkich kanałach, krokach z i punktach czasowych oraz zapisuje sekwencje dla każdego zarodka w osobnym stosie tiff. Program, który zawiera przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika (GUI), usprawnia przetwarzanie danych poprzez izolację, wstępne przetwarzanie i jednolitą orientację poszczególnych zarodków w ramach przygotowań do wizualizacji lub automatycznej analizy. Dostarczane jest również makro ImageJ, które kompiluje indywidualne dane zarodków w wielopanelowy plik, który wyświetla projekcję fluorescencji o maksymalnej intensywności i obrazy jasnego pola dla każdego zarodka w każdym punkcie czasowym. Protokoły i narzędzia opisane w niniejszym dokumencie zostały zwalidowane poprzez wykorzystanie ich do scharakteryzowania rozwoju embrionalnego po wyeliminowaniu 40 wcześniej opisanych genów rozwojowych; Analiza ta uwidoczniła wcześniej opisane fenotypy rozwojowe i ujawniła nowe. Podsumowując, praca ta szczegółowo opisuje metodę obrazowania o niskiej przepustowości w połączeniu z programem do przycinania i narzędziem do wizualizacji ImageJ, które w połączeniu ze szczepami wykazującymi ekspresję informacyjnych markerów fluorescencyjnych znacznie przyspiesza eksperymenty mające na celu analizę rozwoju embrionalnego.
Wprowadzenie
Zarodek C. elegans jest ważnym systemem modelowym dla mechanistycznej biologii komórki i analizy specyfikacji losu komórki oraz wydarzeń morfogenetycznych napędzających rozwój embrionalny1,2,3,4,5,6,7,8,9. Do tej pory wiele cech charakterystyki zarówno zdarzeń na poziomie komórkowym, jak i specyfikacji losu komórki w zarodku osiągnięto przy użyciu eksperymentów obrazowania w stosunkowo wysokiej rozdzielczości czasowej pojedynczo (tj. akwizycji co 10-100 s) zarodków wykazujących ekspresję markerów fluorescencyjnych. Chociaż podejście to dobrze nadaje się do zdarzeń rzędu sekund do dziesiątek minut, staje się technicznie ograniczające dla charakteryzowania dłuższych procesów, rzędu godzin do dni. Rozwój zarodka od pierwszego rozszczepienia do końca wydłużenia trwa około 10 godzin. W tej skali czasowej metody o niskiej przepustowości, które pozwoliłyby na jednoczesne obrazowanie w niższej rozdzielczości czasowej (tj. akwizycja w odstępach czasowych 5–20 minut) większych kohort zarodków z różnych warunków, otworzyłyby nowy zakres eksperymentów; Na przykład umożliwienie systematycznych badań przesiewowych na dużą skalę i analizy wystarczającej liczby zarodków w celu porównania konsekwencji zaburzeń molekularnych.
Tutaj opisujemy metodę monitorowania embriogenezy C. elegans o średniej przepustowości, która umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D rozwoju 80-100 zarodków, z maksymalnie 14 różnych stanów, w ciągu jednej nocy. Protokół jest prosty do wdrożenia i może być przeprowadzony przez każde laboratorium z dostępem do mikroskopu z możliwością wizyty punktowej. Główne kroki w tym protokole są opisane w Rysunek 1. Krótko mówiąc, zarodki są preparowane od ciężarnych dorosłych osobników wykazujących ekspresję markerów fluorescencyjnych będących przedmiotem zainteresowania i przenoszone są młode zarodki (stadium 2-8 komórek) do studzienek na płytce 384-dołkowej w celu obrazowania. W tym formacie, stosunkowo mały rozmiar studzienki kieruje zarodki do wąskiego obszaru, co ułatwia identyfikację pól zawierających wiele zarodków do obrazowania poklatkowego. Aby utrzymać z grubsza synchroniczny rozwój w całej kohorcie zarodków, sekcje przeprowadza się w schłodzonych pożywkach, a płytka jest utrzymywana na lodzie, co zapobiega znacznemu rozwojowi w godzinnym oknie czasowym sekcji. Płytka jest przenoszona do mikroskopu, a zarodki są filmowane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze przez noc, w odstępach 20-minutowych, przy użyciu soczewki 1,35 NA z 60-krotnym zanurzeniem w olejku, aby zebrać pełny zakres z w krokach co 2 μm. Pięćdziesiąt pól, z których każde zawiera od 1 do 5 zarodków, jest obrazowanych w ciągu jednej nocy. W zależności od pożądanego eksperymentu, rozdzielczość czasowa może być zwiększona (na przykład obrazowanie w odstępach 5–10 minut) poprzez proporcjonalne zmniejszenie liczby obrazowanych pól.
Dzięki temu protokołowi, nawet pojedynczy nocny bieg generuje znaczną ilość danych (80-100 embrionów rozrzuconych na 50 polach), a większe eksperymenty mogą szybko stać się niemożliwe do przeprowadzenia w odniesieniu do analizy danych. Aby ułatwić przetwarzanie, wizualizację i usprawnić analizę tych danych, zbudowano program do wycinania i orientowania zarodków oraz wykonywania etapów wstępnego przetwarzania (opcjonalnie), a także makro ImageJ, które kompiluje dane w celu uproszczenia przeglądania. Programy te mogą być używane do przetwarzania obrazów zebranych przy użyciu konwencjonalnych metod, ponieważ są niezależne od metody obrazowania i wymagają tylko jednej płaszczyzny jasnego pola. Pierwszy program pobiera pole 4D zawierające wiele zarodków (opcja GUI lub kod źródłowy embryoCrop.py) lub wiele pól 4D zawierających wiele zarodków (screenCrop.py), ściśle przycina zarodki i orientuje je w konfiguracji przednio-tylnej. Programy te dają również użytkownikom możliwość wykonywania odejmowania tła, korekcji dryfu i korekcji tłumienia. Powstałe pliki są jednolicie wstępnie przetworzonymi, ciasno przyciętymi stosami tiff dla każdego zarodka, które można dostosować do automatycznej analizy obrazu. Aby ułatwić przeglądanie wszystkich zarodków dla każdego schorzenia, napisano makro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), które gromadzi wszystkie zarodki z danego stanu w jeden stos TIFF i układa obrazy w jasnym polu i nakładki kolorów projekcji o maksymalnej intensywności (RGB), obok siebie, dla każdego zarodka. Metody te zostały zweryfikowane poprzez wykorzystanie ich do scharakteryzowania rozwoju embrionalnego po wyeliminowaniu 40 wcześniej opisanych genów rozwojowych w parze specjalnie zbudowanych szczepów eksprymujących markery fluorescencyjne zoptymalizowane pod kątem wizualizacji kluczowych aspektów specyfikacji listka zarodkowego i morfogenezy10,11. Protokół obrazowania zarodków o wysokiej przepustowości i narzędzia do przetwarzania obrazów umożliwią eksperymenty z większą liczbą próbek i zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe mające na celu zrozumienie procesów rozwojowych. Ponadto szczepy te zapewnią również skuteczny sposób badania wpływu zaburzeń molekularnych na embriogenezę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie zarodków C. elegans do obrazowania półwysokoprzepustowego
UWAGA: Celem tej części protokołu jest załadowanie populacji częściowo zsynchronizowanych (stadium od 2 do 8 komórek) zarodków C. elegans, wypreparowanych z odpowiednich szczepów markerowych (Rysunek 2), do 384-dołkowej płytki ze szklanym dnem w celu obrazowania. Inne formaty płytek również mogą działać, ale preferowane są płytki 384-dołkowe, ponieważ mały rozmiar dołka ogranicza rozprzestrzenianie się zarodków do stosunkowo małego obszaru, co ułatwia identyfikację pól zawierających wiele zarodków do obrazowania poklatkowego. Zgrubna synchronizacja zarodków zapewnia, że pełny przebieg rozwoju jest uchwycony dla każdego z zarodków na polu.
- Przygotuj 5–10 ml 0,1 mg/ml roztworu środka znieczulającego chlorowodorek tetramizolu (TMHC) rozpuszczonego w lodowatym podłożu M9 (0,45 M Na2HPO4∙7H2O, 0,11 M KH2PO4, 0,04 M NaCl, 0,09 M NH4Cl) do użycia podczas sekcji i obrazowania. Pożywka ta zawiera środek znieczulający, aby zapewnić, że poruszające się wyklute larwy nie zakłócają obrazowania zarodków we wcześniejszych stadiach rozwoju.
nuta: Jeśli używasz narzędzi do przycinania i wizualizacji do analizy danych uzyskanych przy użyciu standardowych metod montażu podkładek agarozowych, przejdź od razu do sekcji 3 poniżej. - Porcję 70 μl przygotowanego roztworu rozmieścić w osobnych studzienkach 384-dołkowej płytki ze szklanym dnem z jednym dołkiem dla każdego stanu; ominąć dwa zewnętrzne rzędy płytki, aby zapobiec efektom krawędziowym.
nuta: Przydatne jest maskowanie otaczających studzienek za pomocą samoprzylepnej folii płytkowej PCR (patrz przykład w Rysunek 1D), co pozwala zachować sąsiednie studnie do przyszłych eksperymentów i ułatwia zlokalizowanie odpowiednich studzienek pod mikroskopem preparacyjnym. Po podaniu roztworu należy trzymać płytkę i pozostały roztwór na lodzie przez cały czas trwania sekcji. - Wygeneruj pipety ustne do przenoszenia zarodków ze szkiełka depresyjnego (gdzie cięte są graitowane hermafrodyty) do studzienek. Przeciągnij pipety kapilarne (pipety kalibrowane 25 μl) nad płomieniem i rozbij, aby uzyskać cienką zwężającą się końcówkę (Rysunek 1D). Jedna pipeta jest potrzebna na warunek, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu; Po użyciu wyrzuć pipetę.
- Użyj cienkiej pęsety, aby przenieść ~10 ciężarnych dorosłych pod lunetą sekcyjną do 150 μl lodowatego roztworu TMHC podawanego na szkiełku depresyjnym dla każdego stanu. Za pomocą pęsety i skalpela wypreparuj robaki, aby uwolnić zarodki.
- Załaduj wyciągniętą pipetę kapilarną do nasadki aspiratora dołączonej do pipet i pipety ustnej, aby przenieść wszystkie zarodki w stadium od 2 do 8 komórek do indywidualnego dołka przygotowanej płytki (Rysunek 1D). Unikaj przenoszenia zarodków w późnym stadium rozwoju i resztek preparacyjnych. Zbadaj pod lunetą preparacyjną i jeśli obecne są skupiska zarodków, pipeć ustami w górę iw dół lub postukaj w kępy zarodków końcówką pipety, aby się rozproszyły.
nuta: Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, wyczyść sprzęt do preparacji i używaj świeżej pipety do ust podczas przemieszczania się między warunkami. Przechowywać płytkę na lodzie między sekcjami. - Po wypreparowaniu robaków ze wszystkich stanów i umieszczeniu zarodków w odpowiednim dołku, należy obracać płytkę 384-dołkową przez 1 minutę przy 600 x g, aby osadzić zarodki.
- Przetrzyj spód płytki chusteczką nasączoną etanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości i umieść płytkę w mikroskopie konfokalnym wyposażonym w uchwyt na płytkę w środowisku o kontrolowanej temperaturze.
nuta: Poniższe kroki szczegółowo opisują tę metodę przy użyciu konfiguracji laboratorium; Proszę zmodyfikować warunki pozyskania w celu dostosowania ich do potrzeb i wyposażenia eksperymentalnego. W tym przypadku zastosowano skaner konfokalny wyposażony w podwójny wirujący dysk Nipkow wzmocniony mikrosoczewkami, kamerę EM-CCD o rozdzielczości 512 x 512, wysoce precyzyjny automatyczny stolik XY (oznaczona rozdzielczość 0,1 μm) i zmotoryzowane sterowanie osią Z (oznaczona rozdzielczość 0,1 μm). System ten jest przechowywany w pomieszczeniu o temperaturze 16 °C, które utrzymuje temperaturę mikroskopu w zakresie od 21 do 23 °C podczas nocnego obrazowania. - Aby zidentyfikować pola z odpowiednimi zarodkami, należy wykonać wstępny skan każdego dołka za pomocą obiektywu 10x 0,4 NA i odpowiedniego oprogramowania do obrazowania. Najbardziej optymalne pola będą zawierały więcej niż jeden zarodek we wczesnym stadium, który znajduje się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co inne zarodki i w idealnym przypadku będą miały minimalny kontakt między sąsiednimi zarodkami. Zaznacz pozycje odpowiednich regionów.
- Aby wybrać pola obrazowania, przełącz się na obiektyw 60x i dostosuj płaszczyznę ogniskową przy każdej wizycie punktowej, aby odpowiednio przeciąć zarodki. Obrazowane są 1-4 pola na studzienkę, co daje w sumie 50 pól w 14 dołkach, a każde pole może zawierać od jednego do pięciu zarodków. Ogółem z każdego stanu wybiera się od 4 do 15 zarodków do obrazowania w wysokiej rozdzielczości.
nuta: Kluczową zmienną na tym etapie jest użycie wystarczającej ilości oleju; Umieść olej na celu, odwiedzając punkty w każdym odwiercie, aby rozprowadzić ropę po powierzchni wszystkich studni, a następnie nałóż dodatkową kroplę oleju na cel przed wyborem pól. - Zobrazuj wybrane pola za pomocą obiektywu 60x 1,35 NA, aby uzyskać 18 sekcji z w odstępach 2 μm co 20 minut przez 10 godzin. Warunki obrazowania z wykorzystaniem listka zarodkowego i szczepów reporterowych morfogenezy są następujące: jasne pole, 90% mocy, 25 ms, 20% wzmocnienia; 488 nm, 100% mocy, 200 ms, 60% wzmocnienia; 568 nm, 45% mocy, 150 ms, 60% wzmocnienia.
- Po zakończeniu obrazowania oceń śmiertelność zarodka, wykonując skan całego jasnego pola w małym powiększeniu (obiektyw 10x 0,4 NA) ~ 20–24 godziny po rozpoczęciu obrazowania nocnego.
2. Punktacja śmiertelności zarodka
- Korzystając z 10-krotnie zeskanowanych pól, oceń letalność zarodków i wady larwalne, licząc wyklute robaki i niewyklute zarodki dla każdej studzienki.
- Oznacz niewyklute zarodki jako śmiertelne embrionalne. Z liczenia śmiertelności należy wykluczyć zatrzymane zarodki w stadium od jednego do czterech komórek, ponieważ młode wypreparowane zarodki czasami nie są w stanie ukończyć tworzenia skorupki jaja (jeśli mejoza II nie jest jeszcze kompletna), a defekty przepuszczalności mogą prowadzić do powikłań osmotycznych podczas pierwszych dwóch podziałów.
- Oznacz częściowo wyklute lub w pełni wyklute robaki z morfologią ciała lub wadami behawioralnymi, takimi jak przysadziste lub sparaliżowane, jako "nienormalne larwy".
3. Automatyczne przycinanie (Rysunek 3A)
UWAGA: Oprogramowanie znajduje się w dwóch lokalizacjach: (1) Zenodo zawiera przyjazną dla użytkownika wersję oprogramowania12, która nie wymaga żadnej wiedzy programistycznej. (2) Github zawiera kod źródłowy naszego oprogramowania embryoCropUI.py i screenCrop.py13, które wymagają biegłości w Pythonie. Szczegółową instrukcję pobierania i obsługi obu wersji programu można znaleźć poniżej.
- Automatyczne przycinanie za pomocą wersji wykonywalnej embryoCropUI (wersja przyjazna dla użytkownika)
- Aby skorzystać z programu embryoCropUI, najpierw pobierz program ze strony Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
- Pobierz wersję programu w formacie MacOS lub Windows (pamiętaj, że wersja MacOS wymaga systemu MacOS X10.11 lub nowszego).
- Pobierz plik z instrukcją (GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx), który zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące testowania i korzystania z programu embryoCropUI.
- Pobierz test_files.zip, aby sprawdzić, czy program działa poprawnie na platformie (patrz instrukcja).
- Po pobraniu rozpakuj i przejdź do pliku wykonywalnego embryoCropUI (...\embryoCropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe) lub (...\embryoCropUI\_MacOS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe). Kliknij dwukrotnie, aby uruchomić (lub wybrać terminal "otwórz za pomocą") i uruchomić plik wykonywalny embryoCropUI.
- Plik wykonywalny GUI przycina jedno pole widzenia 4D na raz. W lewym górnym rogu wybierz przycisk otwierania, aby załadować określone pole do przycięcia (multi-tiff). W przypadku kadrowania serii TIFF z wieloma wymiarami (np. z, czas, kanał) załaduj tylko pierwszy obraz z serii w folderze (jedna seria TIFF na folder).
- Po załadowaniu obrazów określ następujące informacje: liczba wycinków z-, (Z), liczba punktów czasowych (T), liczba kanałów (C), kanał odpowiadający DIC lub jasnemu polu (pierwszy = 1, drugi = 2 itd.).
- Wybierz dodatkowe przetwarzanie, które ma być uruchamiane na obrazach. Program oferuje korekcję dryfu, odejmowanie tła i korekcję tłumienia.
- Określ parametry dla opcji Odejmowanie tła i Korekcja tłumienia, aby kierować pracami przetwarzania w wierszu polecenia graficznego interfejsu użytkownika. W przypadku odejmowania tła zdefiniuj największy rozmiar obiektu, aby odzwierciedlić rozmiar znaczącego sygnału; Ten rozmiar obiektu nie powinien być traktowany jako tło i musi być wartością liczby nieparzystej. Wprowadź wartość z zakresu od 0 do 1 w celu korekcji tłumienia. Wartość Korekcja tłumienia odzwierciedla procent pierwotnej intensywności, która pozostaje na najdalszej głębokości obrazowanego obiektu.
nuta: Odejmowanie tła i korekcja tłumienia muszą być uruchamiane razem. - Określ kolejność zbierania obrazów (np. channel-z-time (czt) lub z-channel-time (zct)).
- Określ liczbę mikronów na piksel dla obrazów w zależności od używanej kamery.
nuta: Słabe kadrowanie obrazu wystąpi, jeśli rozmiar piksela nie jest prawidłowo zdefiniowany. - Wybierz pozycję Uruchom w lewym dolnym rogu. Nowy podfolder oznaczony jako "crop" zostanie utworzony w tej samej ścieżce, co nieprzycięty folder; Przycięte wersje zostaną zapisane w tej lokalizacji. W zależności od rozmiaru pliku przycinanie powinno zakończyć się w ciągu kilku sekund do kilku minut.
- Aby skorzystać z programu embryoCropUI, najpierw pobierz program ze strony Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
- Automatyczne przycinanie za pomocą screenCrop.py (wersja wsadowa alternatywna dla GUI embryoCrop opisanego powyżej; Tylko użytkownicy znający Pythona)10,13
- Aby skorzystać z screenCrop.py, wersji oprogramowania Python do przycinania większych zestawów danych w formacie wsadowym, sklonuj lub pobierz kod źródłowy z Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
- Przeczytaj instrukcje dotyczące konfiguracji odpowiedniego środowiska wirtualnego i postępuj zgodnie z opisanym systemem nazewnictwa plików; oba są szczegółowo opisane w pliku README w repozytorium Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
- Po prawidłowym ustaleniu zmiennych środowiskowych i konwencji nazewnictwa otwórz parameters.py i screenCrop.py w wybranym edytorze.
- Aby zmodyfikować regulowane parametry bez dotykania kodu źródłowego, edytuj plik parameters.py.
UWAGA: możliwa jest również bezpośrednia zmiana parametrów w nagłówku screenCrop.py.- Jeśli używasz pliku konfiguracyjnego parameters.py, zmień ustawienie use_configure na True. Jeśli korzystasz z edycji bezpośredniej w screenCrop.py, pozostaw ustawienie use_configure na wartość Fałsz.
- Znajdź następujące informacje w pliku parameters.py i wprowadź modyfikacje, aby dopasować je do żądanych parametrów obrazowania i struktury pliku:
- loadFolder (wiersz 9): Zmień na dysk, na którym przechowywane są pliki (np. Z:/, D:// itp.)
- data (wiersz 7): Przejście do folderu zawierającego pliki dotyczące sesji obrazowania. Jest to określane jako "Nazwa folderu eksperymentu" w pliku śledzenia CSV (zobacz instrukcje).
- trackingFile (wiersz 11): zmień ścieżkę do pliku CSV, w którym są przechowywane informacje o eksperymencie.
- z (linia 13): Ustaw jako liczbę płaszczyzn z.
- nT (linia14): Ustaw jako liczbę punktów czasowych.
- nWells (wiersz 19): Ustaw jako liczbę używanych studzienek.
- pointVisits (wiersz 20): Ustaw jako maksymalną liczbę wizyt w punktach (na studnię).
- W wierszu 10 znajdź lokalizację aktualnie zajmowaną przez "CV1000/" i wprowadź zewnętrzny folder używany w ścieżce do pliku. Aby uniknąć problemów, użyj następującej konwencji: 'XXXXXXX/'.
- W wierszu 12 wprowadź prawidłową ścieżkę pliku do przechowywania danych o współczynniku proporcji dla przyciętych danych.
- W wierszach 15, 16, 17 i 18 wprowadź wartość Prawda/Fałsz, aby sprawdzić, czy obrazy są poddawane następującemu przetwarzaniu:
- Wprowadź wartość True lub False dla korekcji dryftu w wierszu 15.
- Wprowadź wartość Prawda lub Fałsz dla odejmowania tła w wierszu 16. Rozmiar elementu musi być empirycznie określony dla różnych szczepów znaczników i rozmiarów pikseli. W podanej konfiguracji rozmiar cechy został zdefiniowany jako 41 dla szczepu listka zarodkowego i 201 dla szczepu morfogenezy. Odejmowanie tła musi być wykonywane w połączeniu z korekcją tłumienia.
- Wprowadź wartość Prawda lub Fałsz dla korekcji tłumienia w wierszu 17.
- Wprowadź wartość Prawda lub Fałsz dla przedniej rotacji tylnej w wierszu 18.
- Po wprowadzeniu wszystkich zmian można rozpocząć przycinanie. Aby to zrobić, przełącz się na screenCrop.py i wybierz ikonę odtwarzania na pasku narzędzi, z menu rozwijanego wybierz Uruchom jako > Python Uruchom.
- Ponieważ przycinanie może potrwać kilka godzin w przypadku dużego zestawu danych (50 wizyt punktowych, 18 kroków z, 3 kanały, 31 punktów czasowych), śledź postęp przycinania w oknie konsoli. Po zakończeniu przycinania w małym oknie pojawią się podglądy przyciętych obrazów przed zapisaniem. Dla każdego obrazu dostępne są 3 opcje:
- Zapisz: Naciśnij spację, aby zapisać obraz, jeśli obraz jest prawidłowo przycięty bez obcięcia obszarów zainteresowania.
- X: Naciśnij X, jeśli obraz wydaje się mieć obcięte obszary zainteresowania; obraz zostanie zapisany ze znakiem X przed nazwą, aby oddzielić go od innych obrazów.
- Usuń: Naciśnij D, aby usunąć przycięty obraz, jeśli obraz nie jest prawidłowo przycięty lub zarodek nie jest zadowalający.
UWAGA: Obrazy zostaną zapisane w podfolderze o nazwie "Przycięte" w folderze ładowania (zdefiniowanym w wierszu 9 programu).
4. Wizualizacja (Rysunek 4)
UWAGA: OpenandCombine_embsV2.ijm10,12 to makro ImageJ, które skonstruuje łatwy do wyświetlenia plik tiff ze wszystkich obrazów dla określonego szczepu i stanu. Wymagana jest instalacja FIJI/ImageJ14,15. To makro działa zgodnie z naszą strukturą plików; Będzie musiał zostać zmodyfikowany, aby działał z innymi strukturami plików. Przewodnik po prawidłowej strukturze plików oraz szczegółowy opis ważnych kwestii znajduje się na końcu pliku GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx w repozytorium Zenodo. Prosimy o dokładne zapoznanie się z tymi instrukcjami przed przystąpieniem do tworzenia obrazów, aby prawidłowo nazwać i ustrukturyzować pliki, aby jak najlepiej współpracowały z tym makrem. Dla porównania, nasza struktura lokalizacji plików wygląda następująco:
Z:\cropped\Target\Strain\Emb#\Target_Emb#_15 Cyfrowy unikalny identyfikator _W##F#_T##_Z##_C#.tif
np. Z:\przycięty\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif
- Pobierz OpenandCombine_embsV2 i GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx z Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
- Przygotuj następujące informacje:
-Lokalizacja, w której przechowywane są foldery obrazów (po przycięciu).
-Nazwy folderów obrazów dla określonych warunków, które mają być przetwarzane (tj. EMBD0002). Jest to określane jako "Cel" w powyższym przykładzie
-15-cyfrowy unikalny identyfikator alfanumeryczny, który jest specyficzny dla danego eksperymentu nocnego - ten identyfikator to nazwa folderu akwizycji danych (tj. 20140402T140154), a unikalny identyfikator jest osadzony w indywidualnej nazwie pliku tiff (EMBD0002_Emb1_20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) dla każdego zarodka zobrazowanego w tym dniu. Makro używa tego identyfikatora do sprawdzania zarodków nabytych w tym samym dniu i może łączyć powtarzające się warunki, z oddzielnymi datami, w osobne pliki ImageJ. - Otwórz program ImageJ, a następnie przeciągnij i upuść plik makra OpenandCombine_embsV2.ijm na pasek ImageJ lub otwórz makro bezpośrednio.
- Po otwarciu makra zlokalizuj wiersze 3 i 4. Wprowadź informacje zebrane w (sekcja 4.2) zgodnie z następującymi krokami:
- W wierszu 3 (RNAL) wprowadź nazwę docelową obrazów, które mają zostać przetworzone. Wprowadź każdy cel w następującej strukturze: newArray("XXXXXXXX/"); Dołącz cytaty. Aby uruchomić wiele warunków jednocześnie, oddziel je przecinkami i zachowaj wszystkie nazwy docelowe w nawiasach (np. newArray("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
- W wierszu 4 (data) wprowadź 15-cyfrowy unikatowy identyfikator alfanumeryczny w cudzysłowach, na przykład newArray("20140402T140154").
- Naciśnij przycisk Uruchom w lewym dolnym rogu okna makra. Pojawi się okno, w którym pojawi się monit o przejście do zewnętrznego folderu zawierającego foldery z przyciętymi obrazami (określone w 4.4.1).
- Po wybraniu pojawi się kolejne okno, które pozwoli na określenie parametrów obrazowania.
- Wprowadź liczbę kanałów, liczbę plasterków Z, rozmiar czcionki tekstu używanego do oznaczania skompilowanych obrazów oraz kolor każdego z kanałów.
- Sprawdź włączanie/wyłączanie automatycznego kontrastu we wszystkich kanałach.
- Po określeniu wszystkich parametrów kliknij przycisk OK u dołu okna. Rozpocznie się składanie pliku kompozytowego; Zajmie to kilka minut na warunek.
- Po zakończeniu przejrzyj pliki, które pozostały otwarte, jeśli chcesz. Można je zamknąć bez zapisywania, ponieważ makro już zapisało pliki w nowo utworzonym folderze, który ma następującą nazwę: nazwa folderu zewnętrznego (określona w monicie w sekcji 4.5) + "-fiji-processed-output" (tj. Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Znaczącym wyzwaniem w charakteryzacji wpływu zaburzeń molekularnych na rozwój embrionalny C. elegans jest fakt, że embriony potrzebują około 10 h, aby przejść od pierwszego podziału do końca elongacji w temperaturze 20°C16. Metoda półwysokoprzepustowa, w której można jednocześnie obrazować duże grupy embrionów, jest przydatna w przypadku zdarzeń o takiej skali czasowej, ponieważ umożliwia równoległe obrazowanie wielu warunków przy zachowaniu wystarczającej liczebności próby dla każdego z ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Praca ta opisuje zestaw narzędzi i metod, które zostały opracowane, aby umożliwić wysiłki na większą skalę w celu profilowania funkcji genów w rozwoju embrionalnym u C. elegans. Nasza metoda półwysokoprzepustowa umożliwia obrazowanie poklatkowe 3D rozwoju embrionalnego w rozdzielczości 20 minut dla 80–100 zarodków w jednym eksperymencie. Chociaż protokół ten można dostosować do stosowania z dowolnym pożądanym szczepem markerowym (szczepami), niniejsza praca pokazuje potencjał metody wykorzystującej dwa niestanda...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
S.D.O. był wspierany przez sponsorowaną przez National Institute of General Medical Sciences nagrodę University of California San Diego Institutional Research and Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. i K.O. byli wspierani przez Ludwig Institute for Cancer Research, który również zapewnił im fundusze na badania wykorzystane do wsparcia tej pracy. Jesteśmy wdzięczni Andrew Chisholmowi za jego rady we wczesnych fazach tego projektu, Ronaldowi Biggsowi za wkład w ten projekt po początkowej fazie rozwoju metody, a także Dave'owi Jenkinsowi i Andy'emu Shiau za wsparcie i dostęp do systemu obrazowania o wysokiej zawartości grupy Small Molecule Discovery.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zespół rurki aspiratora | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Skalibrowana pipeta (25 ml) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Oprogramowanie Cell Voyager | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| (15 ml) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Mikroskop | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Szkiełko depresyjne (3-dołkowe) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Mikroskop preparacyjny | Nikon | SMZ-645 | |
| Wirówka Eppendorf 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab przygotowany | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Probówka do mikrowirówek (1,5 ml) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM | Plates Lab Przygotowane | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| skalpela #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Szklane dno | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Chlorowodorek tetramizolu | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Pęseta, Dumont #3 | Mikroskopia elektronowa Sciences | 0109-3-PO | |
| Obiektyw U-PlanApo (10 razy; 0,4 NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| Obiektyw U-PlanApo (60 i razy; 1,35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
Bibliografia
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948(2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
- Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Zenodo. , (2018).
- Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848(2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861(2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
