Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Summary

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Abstract

C. elegans to najlepszy system do systematycznej analizy specyfikacji losów komórek i zdarzeń morfogenetycznych podczas rozwoju embrionalnego. Jednym z wyzwań jest to, że embriogeneza rozwija się dynamicznie w okresie około 13 godzin; Ta półdniowa skala czasowa ograniczyła zakres eksperymentów, ograniczając liczbę embrionów, które można zobrazować. W tym miejscu opisujemy protokół o niskiej przepustowości, który pozwala na jednoczesne obrazowanie poklatkowe 3D rozwoju 80-100 zarodków w umiarkowanej rozdzielczości czasowej, z maksymalnie 14 różnych stanów, w jednym ciągu nocy. Protokół jest prosty i może być wdrożony przez każde laboratorium z dostępem do mikroskopu z możliwością odwiedzin punktowych. Użyteczność tego protokołu została zademonstrowana poprzez wykorzystanie go do zobrazowania dwóch niestandardowych szczepów eksprymujących markery fluorescencyjne zoptymalizowane pod kątem wizualizacji kluczowych aspektów specyfikacji listka zarodkowego i morfogenezy. Aby przeanalizować dane, zbudowano niestandardowy program, który przycina poszczególne zarodki z szerszego pola widzenia we wszystkich kanałach, krokach z i punktach czasowych oraz zapisuje sekwencje dla każdego zarodka w osobnym stosie tiff. Program, który zawiera przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika (GUI), usprawnia przetwarzanie danych poprzez izolację, wstępne przetwarzanie i jednolitą orientację poszczególnych zarodków w ramach przygotowań do wizualizacji lub automatycznej analizy. Dostarczane jest również makro ImageJ, które kompiluje indywidualne dane zarodków w wielopanelowy plik, który wyświetla projekcję fluorescencji o maksymalnej intensywności i obrazy jasnego pola dla każdego zarodka w każdym punkcie czasowym. Protokoły i narzędzia opisane w niniejszym dokumencie zostały zwalidowane poprzez wykorzystanie ich do scharakteryzowania rozwoju embrionalnego po wyeliminowaniu 40 wcześniej opisanych genów rozwojowych; Analiza ta uwidoczniła wcześniej opisane fenotypy rozwojowe i ujawniła nowe. Podsumowując, praca ta szczegółowo opisuje metodę obrazowania o niskiej przepustowości w połączeniu z programem do przycinania i narzędziem do wizualizacji ImageJ, które w połączeniu ze szczepami wykazującymi ekspresję informacyjnych markerów fluorescencyjnych znacznie przyspiesza eksperymenty mające na celu analizę rozwoju embrionalnego.

Introduction

Zarodek C. elegans jest ważnym systemem modelowym dla mechanistycznej biologii komórki i analizy specyfikacji losu komórki oraz wydarzeń morfogenetycznych napędzających rozwój embrionalny1^{,2,3,4,5,6,7,8,9}. Do tej pory wiele cech charakterystyki zarówno zdarzeń na poziomie komórkowym, jak i specyfikacji losu komórki w zarodku osiągnięto przy użyciu eksperymentów....

Protocol

1. Przygotowanie zarodków C. elegans do obrazowania półwysokoprzepustowego

UWAGA: Celem tej części protokołu jest załadowanie populacji częściowo zsynchronizowanych (stadium od 2 do 8 komórek) zarodków C. elegans, wypreparowanych z odpowiednich szczepów markerowych (Rysunek 2), do 384-dołkowej płytki ze szklanym dnem w celu obrazowania. Inne formaty płytek również mogą działać, ale preferowane są płytki 384-dołkowe, ponieważ mały rozmiar dołka ogranicza rozprzestrzenianie się zarodków do stosunkowo małego obszaru, co ułatwia identyfikację pól zawierających wiele zarodków do obraz....

Results

Znaczącym wyzwaniem w scharakteryzowaniu wpływu zaburzeń molekularnych na rozwój embrionalny C. elegans jest to, że zarodki potrzebują około 10 godzin, aby przejść od pierwszego rozszczepienia do końca wydłużenia pod kątem 20°¹⁶. Metoda półwysokoprzepustowa, w której duże kohorty zarodków mogą być jednocześnie obrazowane, jest przydatna w przypadku wydarzeń w tej skali czasowej, ponieważ umożliwia obrazowanie wielu stanów równolegle z wystarczającą wielkością zespołu dla każdego stanu, ab.......

Discussion

Praca ta opisuje zestaw narzędzi i metod, które zostały opracowane, aby umożliwić wysiłki na większą skalę w celu profilowania funkcji genów w rozwoju embrionalnym u C. elegans. Nasza metoda półwysokoprzepustowa umożliwia obrazowanie poklatkowe 3D rozwoju embrionalnego w rozdzielczości 20 minut dla 80–100 zarodków w jednym eksperymencie. Chociaż protokół ten można dostosować do stosowania z dowolnym pożądanym szczepem markerowym (szczepami), niniejsza praca pokazuje potencjał metody wykorzystującej dwa niestanda.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zespół rurki aspiratora	Drummond Scientific	2-000-000
Skalibrowana pipeta (25 ml)	Drummond Scientific	2-000-025
Oprogramowanie Cell Voyager	Yokogawa Electric Corp	CV1000
(15 ml)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Mikroskop	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Szkiełko depresyjne (3-dołkowe)	Erie Scientific	1520-006
Mikroskop preparacyjny	Nikon	SMZ-645
Wirówka Eppendorf 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab przygotowany	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM	Plates Lab Przygotowane	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
skalpela #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Szklane dno	Greiner Bio-One	781855
Chlorowodorek tetramizolu	Sigma Aldirch	T1512-10G
Pęseta, Dumont #3	Mikroskopia elektronowa Sciences	0109-3-PO
Obiektyw U-PlanApo (10 razy; 0,4 NA)	Olympus	1-U2B823
Obiektyw U-PlanApo (60 i razy; 1,35 NA)	Olympus	1-U2B832