Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka modeli organoidowych gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60364

⸱

14 stycznia 2020

 ,  , 
1Moores Cancer Center, University of California San Diego, 2Department of Surgery, Division of Surgical Oncology, University of California San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Hodowle organoidowe gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzące od pacjentów są szybko ustalonym trójwymiarowym modelem, który z dużą wiernością przedstawia przedziały komórek nowotworowych nabłonka, umożliwiając badania translacyjne nad tą śmiertelną złośliwością. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody tworzenia i rozmnażania organoidów, a także wykonywania odpowiednich testów biologicznych przy użyciu tych modeli.

Streszczenie

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z najbardziej śmiertelnych nowotworów złośliwych. Ostatnio opisano metody hodowli organoidów nowej generacji, umożliwiające trójwymiarowe (3D) modelowanie tej choroby. Modele organoidów pochodzących od pacjenta (PDO) można wyizolować zarówno z próbek chirurgicznych, jak i z małych biopsji i szybko tworzyć się w hodowli. Co ważne, modele organoidowe zachowują patogenne zmiany genetyczne wykryte w guzie pacjenta i pozwalają przewidzieć odpowiedź pacjenta na leczenie, umożliwiając w ten sposób badania translacyjne. W tym miejscu zapewniamy kompleksowe protokoły adaptacji przepływu pracy hodowli tkankowej do badania 3D, modeli organoidowych z wbudowanymi matrycami. Szczegółowo opisujemy metody i zagadnienia dotyczące izolowania i rozmnażania pierwotnych organoidów PDAC. Ponadto opisujemy, w jaki sposób przygotowywane i kontrolowane w laboratorium podłoża organoidowe na zamówienie. Na koniec opisujemy testy do dalszej charakterystyki modeli organoidowych, takich jak izolacja kwasów nukleinowych (DNA i RNA) oraz testowanie leków. Co ważne, przedstawiamy kluczowe kwestie dotyczące wdrożenia metodologii organoidów w laboratorium badawczym.

Wprowadzenie

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest śmiertelną chorobą charakteryzującą się późnym rozpoznaniem u większości pacjentów, brakiem skutecznych terapii i wynikającym z tego niskim 5-letnim wskaźnikiem całkowitego przeżycia, który utrzymuje się na poziomie niższym niż 10%1. Tylko u 20% pacjentów diagnozuje się zlokalizowaną chorobę nadającą się do leczniczej interwencji chirurgicznej2,3. Pozostali pacjenci są zazwyczaj leczeni kombinacją chemioterapeutyków, które są skuteczne u mniejszości pacjentów4,5. Aby sprostać tym pilnym potrzebom klinicznym, naukowcy aktywnie pracują nad strategiami wczesnego wykrywania i opracowywaniem skuteczniejszych terapii. Aby przyspieszyć kliniczne przełożenie ważnych odkryć, naukowcy wykorzystują genetycznie modyfikowane modele myszy, ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów, jednowarstwowe linie komórkowe, a ostatnio modele organoidowe6.

Trójwymiarowa kultura organoidów nabłonkowych wykorzystująca czynnik wzrostu i warunki bogate w ligand Wnt w celu stymulacji proliferacji nieprzekształconych komórek progenitorowych została po raz pierwszy opisana dla jelita myszy7 i szybko została przystosowana do normalnej tkanki trzustki ludzkiej8. Oprócz normalnej tkanki przewodowej, metodologia organoidów pozwala na izolację, ekspansję i badanie ludzkiego PDAC8. Co ważne, metoda ta wspiera tworzenie organoidów z próbek chirurgicznych, a także biopsje cienkoigłowe i gruboigłowe, co pozwala naukowcom badać wszystkie etapy choroby9,10. Co ciekawe, organoidy pochodzące od pacjentów podsumowują dobrze opisane podtypy transkryptomiczne nowotworów i mogą umożliwić rozwój platform medycyny precyzyjnej9,11.

Obecne protokoły organoidowe dla PDAC umożliwiają pomyślne rozszerzenie ponad 70% próbek pobranych od pacjentów wcześniej nieleczonych chemioterapią9. Poniżej przedstawiamy standardowe metody stosowane przez nasze laboratorium do izolowania, rozszerzania i charakteryzowania organoidów PDAC pochodzących od pacjentów. Inne metodologie organoidów PDAC zostały opisane12,13, ale nie przeprowadzono dokładnie porównania tych metod. Ponieważ technologia ta jest stosunkowo nowa i szybko się rozwija, spodziewamy się, że protokoły te będą nadal ewoluować i ulepszać; Jednak zasady postępowania z tkankami i hodowli organoidów będą nadal przydatne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie pobrania tkanek ludzkich do celów badawczych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez naszą Wewnętrzną Komisję Rewizyjną (IRB). Wszystkie poniższe protokoły są wykonywane w warunkach aseptycznych w środowisku laboratoryjnym hodowli tkankowych ssaków.

1. Przygotowanie mediów

  1. Kondycjonowane przygotowanie podłoża.
    UWAGA: Ludzkie podłoże organoidowe trzustki wymaga obfitych czynników wzrostu i składników odżywczych, a także suplementacji kondycjonowanych pożywek, aby zapewnić wystarczającą stymulację wzrostu dla ekspansji organoidów. Obie kondycjonowane pożywki opisane poniżej są przygotowywane z dostępnych na rynku linii komórkowych (patrz Tabela Materiałów). Pełne protokoły i materiały można znaleźć na stronach internetowych producentów.
    1. Wyprodukować pożywki kondycjonowane R-spondin1 zgodnie z protokołem producenta.
      1. Po pierwsze, rozpręż komórki 293T wykazujące ekspresję R-spondyny1 przy użyciu odpowiednich metod selekcji antybiotyków (Zeocyny) w obecności obfitej surowicy (10%). Podczas wytwarzania kondycjonowanej pożywki należy pobrać i zmyć selekcję antybiotyków i surowicę tak, aby w końcowej pożywce kondycjonowanej nie było antybiotyku i surowicy. Co ważne, kondycjonowane media muszą być wysterylizowane filtrem po pobraniu (0,2 μm), aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
      2. Kondycjonowane podłoża należy przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego użytku (w ciągu 6 miesięcy) lub w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania (ponad 6 miesięcy). Należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania.
    2. Wyprodukować pożywkę kondycjonowaną L-Wnt-3A zgodnie z protokołem producenta.
      1. Po pierwsze, rozkrzep komórki L-M(TK-) wykazujące ekspresję L-Wnt-3A przy użyciu odpowiednich metod selekcji antybiotyków (G-418) w obecności obfitej surowicy (10%). Podczas wytwarzania kondycjonowanych pożywek należy pobrać i zmyć wybór antybiotyków w taki sposób, aby w końcowym kondycjonowanym pożywce nie było żadnego antybiotyku; Utrzymuj jednak surowicę przez cały okres hodowli i kondycjonowania. Co ważne, zebrane kondycjonowane media muszą być sterylizowane filtrem (0,2 μm), aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
      2. Podzielone kondycjonowane podłoże należy przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego użytkowania lub -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania. Należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania.
    3. W celu kontroli jakości wykonaj test TOPFLASH w celu przetestowania aktywności Wnt R-spondin1 i pożywki kondycjonowanej L-Wnt-3A samodzielnie i w połączeniu zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem14.
  2. Przygotowanie podłoża podstawowego: Użyj podłoża podstawowego do przygotowania kompletnych pożywek organoidowych, a także etapów mycia do pracy z organoidami. Uzupełnij zaawansowany DMEM/F-12 o glutaminę w końcowym stężeniu 1x, HEPES (10 mM) i penicylinę/streptomycynę (100 U/ml). Przechowywać podłoże podstawowe w temperaturze 4 °C.
  3. Organoid Kompletne przygotowanie pożywki: Uzupełnij podłoża podstawowe pożywką kondycjonowaną R-spondyną1 o końcowym stężeniu 10% v/v, pożywką kondycjonowaną L-Wnt-3A o stężeniu końcowym 50% v/v, ludzkim EGF (50 ng/ml), ludzkim FGF (100 ng/ml), ludzką gastryną I (10 nM), mysią nogginą (100 ng/ml), A83-01 (500 nM), suplementem B27 (1x), Nikotynamid (10 mM), N-acetylocysteina (1,25 mM) i prymocyna (100 μg/ml).
    1. W przypadku pierwotnych izolacji organoidów, rozmrożonych kultur organoidów i kultur rozpoczynających się od pojedynczych komórek należy uwzględnić inhibitor kinazy Rho Y-27632 w końcowym stężeniu 10,5 μM.
    2. Przygotować kompletną pożywkę dla ludzkiego organoidu na lodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia w ciągu jednego miesiąca. Z tego powodu zalecamy świeże cotygodniowe przygotowywanie pożywki.

2. Izolacja organoidów PDAC

UWAGA: Rozmrozić roztwór ekstraktu z błony podstawnej (BME) (zredukowany czynnik wzrostu; patrz Tabela Materiałów) na lodzie w temperaturze 4 °C (lodówka lub chłodnia) przez co najmniej 12 godzin przed użyciem. Inkubować płytki do hodowli tkankowej do hodowli organoidów w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej 12 godzin przed użyciem.

  1. Zbierz i przetransportuj chirurgicznie usuniętą próbkę guza do badań w buforowanym roztworze do przechowywania, aby utrzymać żywotność tkanki. Stosować podłoże podstawowe lub dostępny w handlu roztwór do przechowywania tkanek.
  2. Przystąp do izolowania organoidów tak szybko, jak to możliwe po otrzymaniu próbki. Tkanka może być przechowywana w roztworze do przechowywania do 24 godzin po operacji i nadal daje organoidy.
  3. W laboratorium przenieś guz do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej i usuń roztwór do przechowywania.
  4. Podczas obchodzenia się z tkanką za pomocą metalowych kleszczy, zmiel guz skalpelem #10 na małe fragmenty o wielkości 1 mm3 lub mniejsze. Większe fragmenty będą trawione dłużej; Dlatego należy dążyć do generowania jednorodnych rozmiarów fragmentów tkanki. Jeśli tkanka jest już zdezagregowana lub składa się z fragmentów mniejszych niż 1 mm3, pomiń ten krok.
  5. Przenieść fragmenty tkanek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml podłoża podstawowego. Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 5 minut. Po wirowaniu ostrożnie usuń podłoże podstawne, aby uniknąć utraty fragmentów tkanki.
  6. Do probówki zawierającej fragmenty tkanek dodać 9 ml podłoża podstawowego i 1 ml 10x łagodnego roztworu kolagenazy/hialuronidazy. Aby uniknąć zlepiania się komórek podczas trawienia, należy uzupełnić ten roztwór 20 μl roztworu 10 mg/ml roztworu DNAzy I. Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę.
  7. Inkubować trawienie enzymatyczne w temperaturze 37 °C na nutatorze lub rotatorze. Aby zapewnić odpowiednie wymieszanie podczas trawienia, fragmenty tkanek muszą stale przemieszczać się przez roztwór.
    UWAGA: Czas tej enzymatycznej dysocjacji guza musi być określony empirycznie dla każdej próbki. Pomyślne trawienie guza charakteryzuje się zmniejszeniem wielkości fragmentów tkanki, aż do momentu, gdy nie są one wyraźnie widoczne gołym okiem. Jednocześnie zmętnienie roztworu będzie się zwiększać w miarę uwalniania mikroskopijnych fragmentów tkanki.
  8. Po 30 minutach wyjąć rurkę stożkową z inkubatora o temperaturze 37 °C i obserwować. Jeżeli fragmenty tkanki są nadal wyraźnie widoczne, należy kontynuować dysocjację w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu. Powtarzaj tę obserwację co 30 minut, aż większość lub wszystkie fragmenty tkanki zostaną zdysocjowane. W zależności od rygorystyczności mieszania, a także wielkości i ilości fragmentów guza, etap ten może zająć zaledwie 30 minut w przypadku małych próbek lub nawet 12 godzin w przypadku większych próbek guza.
  9. Po zakończeniu dysocjacji enzymatycznej odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu powinna być widoczna osadka komórkowa, a supernatant powinien być klarowny, co wskazuje, że wszystkie komórki zostały wydzielone z roztworu. Jeśli tak nie jest, powtórz wirowanie.
  10. Ostrożnie usunąć supernatant, aby uniknąć utraty osadu komórkowego. Natychmiast przemyć komórki 10 ml pożywki podstawowej, delikatnie mieszając probówki z inwersją. Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 5 minut. Ostrożnie usuń podłoże podstawowe, aby uniknąć utraty komórek i powtórz ten krok mycia jeszcze raz, w sumie dwa prania.
  11. Po drugim umyciu ostrożnie usuń wszystkie podłoże podstawowe i umieść probówkę na lodzie na 5 minut.
  12. W tym czasie umieścić porcję kompletnych pożywek organoidowych w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu wstępnego ogrzania.
  13. Wymieszaj osad komórkowy z lodowatym BME, utrzymując probówkę na lodzie. Gęstość wysiewu powinna być wysoka w celu izolacji organoidów. Do małego granulatu (objętość ~50 μL) użyj 200 μL BME, natomiast do dużego pelletu (objętość ~200 μL) użyj 800 μL BME. Wymieszaj komórki i BME na lodzie za pomocą pipety p200, aż roztwór stanie się jednorodny, unikając tworzenia się pęcherzyków w roztworze.
  14. Znajdź kopułę o pojemności 100 μl na środku dołka wstępnie podgrzanej płytki 12-dołkowej za pomocą pipety p200. Powtarzaj tę czynność, aż cały roztwór BME zostanie dozowany. Ostrożnie przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, aby żel BME zastygł.
  15. Po 10 minutach pobrać płytkę i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki organoidowej do dołka. Dozuj media z boku studni, aby uniknąć zakłóceń kopuły BME.
  16. Obserwuj fragmenty komórek za pomocą odwróconego mikroskopu kultur tkankowych za pomocą 4-krotnej soczewki w jasnym polu.
    UWAGA: Pojedyncze komórki i mikroskopijne fragmenty tkanek powinny być wyraźnie widoczne. Udana izolacja charakteryzuje się pojawieniem się więcej niż 10 organoidów po 24–48 godzinach; Kultura powinna zlewać się w ciągu jednego tygodnia. Ponieważ próbki guzów są niejednorodne, niektóre izolacje organoidów są trudniejsze, ponieważ tylko kilka organoidów rośnie na studzienkę, jak pokazano na Rysunek 1. W takim przypadku pozwól hodowli kontynuować do dwóch tygodni, aby zmaksymalizować liczbę komórek dostępnych do pasażowania. Aby uwzględnić zużycie pożywki i parowanie podczas hodowli, należy uzupełniać kultury 200 μl wstępnie podgrzanych kompletnych pożywek organoidowych co 5 dni.

3. Przekazywanie organoidów PDAC

  1. Pobrać płytkę z inkubatora do hodowli tkankowych. Za pomocą sterylnego podnośnika do komórek delikatnie podnieś kopułę BME tak, aby unosiła się w całym nośniku. Unikaj skrobania dna studzienki, aby nie usunąć żadnych komórek jednowarstwowych przyczepionych do plastiku, ponieważ są to zazwyczaj fibroblasty.
  2. Za pomocą pipety p1000 ostrożnie przenieś kopułę BME i pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Powtórz ten krok dla każdej studzienki zawierającej organoidy.
  3. Delikatnie umyj każdą studzienkę, która została zebrana, 1 ml zimnego podłoża podstawowego i przenieś do 15 ml probówki zawierającej organoidy.
  4. Dokładnie wymieszać roztwór i organoidy za pomocą pipety p1000 i odwirowywać w momencie 200 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu na dnie probówki pojawi się warstwa BME zawierająca organoidy w zawiesinie i osad organoidowy. Ostrożnie usunąć supernatant, unikając utraty warstwy BME/organoidu. Umieść rurkę na lodzie.
  5. Dodaj 10 ml lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek (CRS) do probówki i dokładnie wymieszaj przez odwrócenie. Spowoduje to depolimeryzację matryc białkowych zżelowanego BME w temperaturze 4 °C. Inkubować na lodzie przez 30 minut, mieszając co 3 minuty przez inwersję. Jeśli to możliwe, umieść probówkę na mieszaczu obrotowym w chłodni lub lodówce o temperaturze 4 °C na 30 minut.
  6. Po 30 minutach inkubacji wirować przy 200 x g przez 5 minut. Osad organoidowy powinien być widoczny, podczas gdy warstwa BME powinna zniknąć. Jeżeli warstwa BME jest zmniejszona, ale nadal widoczna, inkubować przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 4 °C z mieszaniem i powtórzyć wirowanie.
  7. Po depolimeryzacji BME należy usunąć CRS, pozostawiając osad organoidowy. Przemyć organoidy 10 ml pożywki podstawowej, mieszając z inwersją. Wirować w dół przy 200 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Umieścić probówkę z osadem organoidowym na lodzie na co najmniej 5 minut.
  8. Opcjonalnie, jeśli pożądane jest przygotowanie pojedynczej komórki, należy inkubować organoidy z 3 ml trypsyny uzupełnionej 30 μl roztworu 10 mg/ml DNAzy I, aby uniknąć zlepiania się komórek podczas trawienia.
    1. Inkubować reakcję enzymatyczną w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem inwersyjnym co 2 minuty przez maksymalnie 10 minut. Monitorować i potwierdzać pomyślną dysocjację pojedynczych komórek pod mikroskopem jasnego pola.
    2. Aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodaj 10 ml lodowatej pożywki podstawowej i odwirowuj w tempie 200 x g przez 5 minut.
    3. Przemyć komórki 10 ml pożywki podstawowej, mieszając z delikatną inwersją. Wirować przy 200 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i powtórzyć pranie jeszcze raz. Umieść probówkę z osadem komórkowym na lodzie na co najmniej 5 minut
      UWAGA: Zalecamy wykonywanie tego kroku co 3-5 pasaży podczas regularnej konserwacji organoidów w celu wytworzenia jednorodnej kultury z dużą liczbą organoidów.
  9. Dodaj lodowaty BME do osadu komórkowego i delikatnie mieszaj na lodzie, aż roztwór będzie jednorodny za pomocą pipety p200. Unikając powstawania pęcherzyków w mieszaninie, pipetuj pipetą w górę i w dół co najmniej 5–10 razy, umieszczając końcówkę pipety blisko dna probówki, aby pomóc w mechanicznym rozbiciu organoidów. Jako wskazówkę należy użyć 4-6 razy większej objętości osadu BME/komórki, tak aby stosunek rozszczepienia nie przekraczał 1:2 z jednego przejścia do drugiego.
  10. Za pomocą pipety p200 umieścić kopułę o pojemności 100 μl w środku dołka wstępnie podgrzanej płytki 12-dołkowej; powtarzać, aż cały roztwór BME zostanie dozowany. Ostrożnie przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, aby żel BME zastygł. Po 10 minutach pobrać płytkę i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki organoidowej do dołka. Dozuj media z boku studni, aby uniknąć zakłóceń kopuły BME.
  11. Organoidy powinny się zreformować i zacząć rosnąć w ciągu 24 godzin. Hodowle organoidów są zwykle pasażowane co 7-10 dni, w zależności od gęstości hodowli i proliferacji komórek. W razie potrzeby co 5 dni uzupełniać kultury 200 μl wstępnie podgrzanych kompletnych pożywek organoidowych, aby skompensować zubożenie czynnika wzrostu i parowanie.

4. Zamrażanie i rozmrażanie organoidów PDAC

  1. Aby zamrozić organoidy, przystąp do zbierania organoidów i depolimeryzacji BME, jak opisano w krokach 3.1–3.7.
  2. Do osadu komórkowego dodaj 1 ml pożywki do zamrażania, delikatnie wymieszaj i przenieś mieszaninę do wstępnie znakowanego kriowialu.
  3. Umieść kriowial w pojemniku do zamrażania, aby utrzymać bezpieczny stały spadek temperatury i umieść w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Po upływie 24 do 48 godzin przenieść zamrożone fiolki do zbiornika ciekłego azotu. Za pomocą tej metody organoidy można kriokonserwować przez miesiące lub lata.
  4. Aby rozmrozić organoidy, należy pobrać zamrożony kriowial z magazynu ciekłego azotu. Przetransportować zamrożoną fiolkę na suchym lodzie do pomieszczenia do hodowli tkankowych.
  5. Umieścić zamrożony kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu szybkiego rozmrożenia organoidów i przenieść zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml podłoża podstawowego ogrzanego do temperatury pokojowej.
  6. Wirować w dół przy 200 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Umieścić probówkę z osadem organoidowym na lodzie na co najmniej 5 minut.
  7. Przystąpić do ponownego zawieszenia w BME i umieszczenia organoidów na płytce zgodnie z opisem w krokach 3.9–3.11.
    UWAGA: Kultury organoidów powoli regenerują się po cyklu zamrażania/rozmrażania, dlatego kultury można hodować do dwóch tygodni przed pasażowaniem.

5. Charakterystyka organoidów PDAC

UWAGA: Charakterystyka organoidów powinna być przeprowadzona na ustalonej kulturze po kilku przejściach, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia przez typy komórek nienabłonkowych, takie jak fibroblasty i komórki odpornościowe.

  1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych z organoidów PDAC
    1. Organoidy płytkowe na 12-dołkowej płytce przeznaczonej do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Płytka nie więcej niż 100 μL BME na studzienkę. Aby uzyskać odpowiednią wydajność DNA/RNA, należy umieścić co najmniej 2-4 dołki na kulturę. Hoduj organoidy przez okres do 5 dni, aż kultury zbliżą się do zlewu, ale będą pozbawione nadmiernych resztek komórkowych, które gromadzą się w hodowlach długotrwałych.
    2. Wyjąć płytkę z inkubatora w temperaturze 37 °C i całkowicie usunąć wszelkie ślady kompletnej pożywki organoidowej, pozostawiając na płytce jedynie kopułę BME zawierającą organoidy.
    3. Dodać 900 μl kwaśnego odczynnika fenolowego (patrz tabela materiałów) do każdego dołka i dokładnie wymieszać za pomocą pipety p1000, aż roztwór stanie się jednorodny. BME zostanie całkowicie rozpuszczony w kwaśnym odczynniku fenolowym, a organoidy ulegną lizie po krótkiej 5 minutowej inkubacji.
      UWAGA: Kwaśny fenol jest niebezpieczną substancją chemiczną, która może powodować oparzenia chemiczne. Obchodź się z nimi ostrożnie, stosując odpowiednie zabezpieczenia i technikę.
    4. Przenieść jednorodny roztwór do probówki o pojemności 2 ml i dodać 200 μl chloroformu. Inkubować przez 5 minut i wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Przystąp do ekstrakcji RNA i DNA zgodnie z protokołem producenta. RNA można ekstrahować z fazy wodnej, podczas gdy DNA można ekstrahować z fazy interfazowej i organicznej. Po oczyszczeniu i określeniu ilościowym, RNA i DNA wyizolowane z różnych studzienek tej samej kultury można połączyć w celu zwiększenia wydajności.
      UWAGA: (1) Chociaż zdecydowanie zalecamy stosowanie tej metody ekstrakcji kwasów nukleinowych dla RNA, istnieje wiele dobrych metod izolowania DNA z hodowanych komórek. (2) Aby ustalić obecność komórek nowotworowych w hodowli organoidów, zalecamy sekwencjonowanie DNA przy użyciu preferowanej metody sekwencjonowania nowej generacji w celu identyfikacji mutacji w genach charakterystycznych PDAC (KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A).
  2. Farmakotypowanie organoidów PDAC
    1. Wyizolować pojedyncze komórki z organoidów, jak opisano powyżej w krokach 3.1–3.8. Aby zmaksymalizować liczbę komórek, zbierz co najmniej 10 zlewających się studzienek z 12-dołkowej płytki
    2. Ponownie zawiesić pojedyncze komórki w 1 ml kompletnej pożywki z ludzkich organoidów. Obecność małych skupisk komórek (~ 2–10 komórek) jest dopuszczalna, jednak większe skupiska komórek negatywnie wpłyną na dalszą analizę.
    3. Zliczaj komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i rejestruj żywotność komórek. Obliczyć całkowitą liczbę komórek i komórek żywotnych obecnych w zawiesinie o objętości 1 ml.
    4. Do testów terapeutycznych umieść 1,000 żywych komórek na dołku na płytce 384-dołkowej. Szacujemy, że do płytki 384-dołkowej użyjemy 400 000 żywych komórek (obliczonych na 400 dołków).
    5. Przygotować komórki do posiewu, mieszając na lodzie 800 μl BME z 7,2 ml kompletnej pożywki organoidowej zawierającej komórki. Przechowywać mieszaninę na lodzie i płytce 20 μl na dołek płytki 384-dołkowej. Użyj 12-kanałowej pipety i zbiornika umieszczonego na lodzie, aby skutecznie pokryć komórki. Aby uniknąć nadmiernego parowania z płyty, zewnętrzne studzienki mogą być używane jako zbiornik (60 μl PBS lub wody na studzienkę), ale doprowadzi to do utraty 76 studni doświadczalnych.
    6. Obracaj talerz w temperaturze 100 x g przez 1 minutę w wiadrze z huśtawką. Dzięki temu mała objętość 20 μl i organoidy mogą osiąść na dnie płytki.
    7. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, aby umożliwić utworzenie organoidów. Po 24 godzinach sprawdź obecność organoidów za pomocą mikroskopu jasnego pola.
    8. Przystąp do dozowania związków terapeutycznych rozpuszczonych w DMSO na płytkę za pomocą drukarki do leków lub równoważnego instrumentu. Przetestuj każdą dawkę leku w co najmniej trzykrotnych dołkach. Aby przeprowadzić skuteczną analizę dawka-odpowiedź, należy empirycznie określić zakres dawek dla każdego leku, zaczynając od niskiej, nieskutecznej dawki, a kończąc na wysokiej dawce, gdzie obserwuje się maksymalny efekt. Przykłady zakresów dawek dla związków chemioterapeutycznych zostały niedawno opublikowane9.
    9. Wystaw komórki na działanie związków leczniczych przez 3-5 dni.
    10. Opcjonalnie, na końcu testu, zobrazuj płytkę, aby ocenić efekt terapeutyczny na rozmiar, liczbę i morfologię organoidów.
    11. Ocenić żywotność przy użyciu 20 μl na studzienkę odczynnika żywotności komórek luminescencyjnych (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta. Luminometr będzie niezbędny do pozyskiwania danych oraz oprogramowanie do tworzenia wykresów do analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zilustrować trudności związane z izolacją organoidów z PDAC, przedstawiamy proces tworzenia hodowli organoidów pochodzących od pacjenta z małej, hipokomórkowej próbki guza. Po wstępnym wysiewie w każdej studzience widocznych było tylko kilka organoidów, co przedstawiono na Rysunku 1. Pozwolono organoidom na wzrost w ciągu 2 tygodni, a następnie przeprowadzono ich pasażowanie zgodnie z naszym protokołem w celu ustanowienia bardziej stabilnej hodowli, co pokazują reprezentatywne zdjęcia z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy aktualne protokoły izolacji, rozszerzania i charakteryzowania organoidów PDAC pochodzących od pacjenta. Nasz obecny wskaźnik sukcesu w tworzeniu hodowli organoidów wynosi ponad 70%; W związku z tym metody te nie zostały jeszcze udoskonalone i oczekuje się, że z czasem ulegną poprawie i ewolucji. Należy zwrócić uwagę na wielkość próby, ponieważ PDAC ma niską komórkowość nowotworową. W związku z tym małe próbki będą zawierały niewiele komórek nowotworowych i będą generować tylko garstkę organoid...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, członków laboratorium Lowy oraz UC San Diego Department of Surgery, Division of Surgical Oncology. AML jest hojnie wspierany przez NIH CA155620, nagrodę SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16) oraz darczyńców Funduszu na rzecz Leczenia Raka Trzustki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta 12-kanałowa (P20, P100 lub P200) z końcówkami
Płytki 12-dołkoweOlympus25-106
15 ml Probówki stożkowe LoBindEppendorfEP0030122208
15 ml Rotator i/lub nutator
37 ° C Inkubator CO2
C Łaźnia
384 dołkiCorning4588Ultra niska nasadka, i optycznie przezroczysta
A 83-01TOCRIS2939
ADV DMEMThermoFisher12634010
Bezzwierzęcy Rekombinowany ludzki EGFPeprotechAF-100-15
Automatyczny licznik
Suplement B27ThermoFisher17504044
Cell Recovery SolutionCorning354253Odczynnik, który depolimeryzuje ekstrakt z błony podstawnej w temperaturze 4 & stopni; C
CellTiterGlowPromegaG7570Odczynnik żywotności komórek luminescencyjnych
ChloroformSigmaC2432
Komputerowy
kriostor CS10StemCELL Tech07930Roztwór do zamrażania komórek
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) KomórkiTrevigen3710-001-K
DMEMATCC30-2002
DNase ISigmaD5025
Drukarka lekówTecanD300eJest to drukarka leków, której używamy w naszym laboratorium
ExcelDo analizy danych
Ekstra drobne kleszcze GraefeNarzędzia do nauki precyzyjnej11150-10
FBSThermoFisher16000044
G-418ThermoFisher10131035
Gastrin I (człowiek)TOCRIS3006
Delikatna kolagenaza/hialuronidazaSTEMCELL Tech7919
GlutaMAXThermoFisher35050061roztwór glutaminy
GraphPad PrismDo analizy danych
HEPESThermoFisher15140122
hodowli tkanek z przepływem laminarnym
Luminometr
L-Wnt-3A wyrażający komórkiATCCCRL-2647
MACS Roztwór do przechowywania tkanekMiltenyi biotec130-100-008
Matrigel MatrixCorning356230Ekstrakt z błony podstawnej (BME), zredukowany czynnik wzrostu
Mr. Mr. Frosty Zamrażanie PojemnikThermoFisher5100-0001
N-acetylocysteinaSigmaA9165
NikotynamidSigmaN0636
Pipeta p1000 z końcówkami
Pipeta P200 z końcówkami
PBSThermoFisher10010049
Penicylina/StreptomycynaThermoFisher15630080
primocinInvivoGenant-pm-2
Jednostki filtrujące o szybkim przepływie (0,2 i mikro; m)ThermoFisher121-0020
Rekombinowany człowiek FGF-10Peprotech100-26
Rekombinowany mysi NogginPeprotech250-38
Sterylne jednorazowe skalpele, #10 OstrzeVWR89176-380
Wirówka
tkankowych Naczynia do hodowli tkankowych 10 cmOlympus25-202
TRIZolThermoFisher15596018Kwaśny roztwór fenolu
TrypLE ExpressThermoFisher12605010
Y-27632SigmaY0503
ZeocinThermoFisherR25001
37 °wodna komórekKaptur do do kultur

Bibliografia

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
  3. Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
  4. Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
  5. Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
  6. Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  9. Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  10. Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
  11. Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  13. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
  14. Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183(2014).
  15. Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
  16. Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
  17. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  18. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy pochodzenia pacjentaizolacja organoid wekstrakt z b ony podstawnejroztw r do odzyskiwania kom rekdysocjacja do pojedynczych kom rekprotok testowania lek wizolacja kwas w nukleinowychcharakterystyka organoid wtest lek w cytotoksycznych

Powiązane artykuły