System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

Elektrofizjologia i metody wstrzykiwania leków są szeroko stosowane w neurobiologii do badania aktywności i zachowania neuronów, in vivo, u gryzoni i naczelnych. W ciągu ostatnich trzech dekad ulepszenia wczesnych modeli iniekcji pozwoliły na bardziej precyzyjną i mniej inwazyjną technikę oraz jednoczesne rejestrowanie i wstrzykiwanie leku w określone miejsca w mózgu^1,2,3. W szczególności w przypadku naczelnych zdolność do precyzyjnego dostarczania małych objętości przy minimalnym uszkodzeniu tkanek ma kluczowe znaczenie, jeśli technika ta ma być wykorzystana do badania zaawansowanych funkcji poznawczych, które wymagają wysoko wyszkolonych zwierząt. Ostatnie osiągnięcia obejmują przewlekłe pomiary elektrofizjologiczne i chemiczne w połączeniu ze stymulacją za pomocą wszczepionych sond⁴, a niedawno pilotażowo przeprowadzono połączone rejestrowanie i mikroprzepływowe dostarczanie leków u gryzoni⁵. Opisany tutaj system wstrzykiwania umożliwia elektrofizjologiczną rejestrację, stymulację i precyzyjne dostarczanie leków, i został już z powodzeniem wdrożony w wielu laboratoriach naczelnych^6,7,8.

Rosnąca dostępność delikatnych, wyspecjalizowanych czujników, takich jak nanosensors^9,10 z aplikacjami neurologicznymi, wymaga niezawodnej metody przeprowadzania sondy przez oponę twardą bez uszkadzania delikatnych urządzeń w nanoskali lub końcówek mikroelektrod.

Zaprojektowaliśmy system mikroiniekcji, który pokonuje techniczne wyzwania związane z łączeniem tych metod za pomocą łatwo dostępnych, tanich komponentów i ułatwia dwie główne funkcje: (i) Możliwość umieszczenia delikatnej sondy eksperymentalnej, takiej jak mikroelektroda lub nanoczujnik, przez oponę twardą i tkankę nerwową, chronioną przed jakimkolwiek uszkodzeniem. Funkcjonalność ta pozwala na umieszczenie sondy eksperymentalnej w docelowych miejscach, dostarczanej za pomocą kaniuli jako przewodnika przez tkankę nerwową. (ii) Umiejętność użycia mikroelektrody do wykonywania eksperymentów łączących zapisy elektrofizjologiczne i stymulację elektryczną z wstrzykiwaniem leków.

Nasz system wykorzystuje rurkę prowadzącą do penetracji opony twardej, wraz z kaniulą, która służy zarówno do dostarczania leków (podczas korzystania z systemu do mikroinfuzji), jak i zapewnia dodatkową ochronę mikroelektrody lub nanosensora (zarówno podczas przechodzenia przez oponę twardą, jak i tkankę nerwową). System ten można łatwo zbudować z powszechnie dostępnych na rynku komponentów, które są niedrogie i łatwe do znalezienia. Minimalizujemy uszkodzenia spowodowane penetracją poprzez zastosowanie kaniuli o małej średnicy (średnica zewnętrzna OD = 235 μm, średnica wewnętrzna ID = 108 μm).

Tutaj prezentujemy instrukcje krok po kroku dotyczące budowy mikrowtrysku i konfiguracji systemu mikroprzepływowego. Wyjaśniamy, jakie kroki należy wykonać, aby można było użyć mikroiniektora, niezależnie lub w połączeniu z systemem mikroprzepływowym do wstrzykiwania leków. Podobne podejście można zastosować do każdej delikatnej sondy eksperymentalnej, takiej jak nanosensor^9,10. Sonda może być ładowana do kaniuli od przodu lub do tyłu (w zależności od konstrukcji) i będzie chroniona przed uszkodzeniem podczas penetracji opony twardej i tkanki nerwowej. Podajemy przykładowe dane z eksperymentu in vivo na naczelnych innych niż ludzie, w którym użyliśmy mikroelektrody wolframowej do przeprowadzenia stymulacji elektrycznej, a następnie wstrzyknęliśmy muscymol w przednie pole oka (FEF), podczas gdy zwierzę wykonywało zadanie sakkady sterowanej pamięcią (MGS).

Procedury eksperymentalne były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz wytycznymi i zasadami Society for Neuroscience. Protokoły procedur eksperymentalnych i behawioralnych zostały zatwierdzone przez University of Utah Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Budowa mikroiniektoru do stymulacji i rejestracji (Rysunek 1a)

1. Zmierz długość kaniuli i sondy (w tym przykładzie nanoczujnika). Sonda musi być dłuższa od kaniuli o długość, na jaką ma wystawać z końcówki kaniuli (w zależności od konstrukcji sondy) plus około 2 cm.
2. Pod lupą lub mikroskopem (powiększenie ~10x) załaduj sondę do kaniuli; jeśli to możliwe, preferowane jest ładowanie wsteczne, aby chronić końcówkę sondy.
   nuta: Ten krok, wykonywany ręcznie, jest wyzwaniem. Zaleca się ćwiczenie z mikroelektrodą pod szkłem powiększającym przed próbą z rzeczywistą sondą eksperymentalną.
3. Przełóż kaniulę (zawierającą sondę) przez górną tulejkę, złącze T i dolną tulejkę.
   1. Jeśli sonda jest tylko pojedynczym przewodem bez żadnych namocowań, załaduj ją z powrotem do kaniuli i włóż zespół do trójnika od dolnej tulejki. Górna część kaniuli (płaska strona końcowa) powinna być umieszczona pośrodku złącza T, w dolnej, ale nie górnej skuwce. Sonda doświadczalna lub bioczujnik powinny wystawać ponad górną część górnej tulejki.
      nuta: Tulejki wykonane na zamówienie można również wykonać, wiercąc otwór w zaślepkach tulejek za pomocą mikrowierteł, przy czym rozmiar otworu zależy od średnicy potrzebnej do dokręcenia kaniuli do złącza T.
4. Użyj klucza do tulejek, aby dokręcić tuleje na górze i na dole trójnika. Nie dokręcaj zbyt mocno. Można dodać mały kawałek rurki, aby wzmocnić podparcie elektrody w górnej tulejce.
5. złote piny do każdego z zacisków sondy (sygnał, masa itp.), zgodnie ze specyfikacją sondy.
6. Dostosuj względne położenie sondy i kaniuli. Zmierz odległość, na jaką sonda wystaje z kaniuli pod powiększeniem i wyreguluj ręcznie od górnego końca (sonda może swobodnie przesuwać się w tulejach).
7. Dodaj klej epoksydowy między złotymi kołkami a górną skuwką, aby przymocować sondę do tulejki.
8. Odkręć górną tuleję, aby schować sondę wewnątrz kaniuli. Potwierdź wzrokowo, że sonda znajduje się całkowicie w kaniuli w powiększeniu.
9. Podłącz wtryskiwacz do mikronapędu.

2. Budowa mikroiniektoru do infuzji leków (Rysunek 1b)

1. Przymocuj "nieskośny" lub płaski koniec kaniuli do dolnej części złącza T za pomocą tulejki. Użyj klucza do tulejki, aby dokręcić tuleję.
2. Przymocuj mały kawałek rurki kapilarnej (~ 1,5 cm) do górnej części złącza T, przepuszczając go przez standardową tulejkę. Dokręć kluczem do tulejek.
3. Załaduj mikroelektrodę z powrotem przez rurkę kapilarną, złącze T, kaniulę i odpowiednie tulejki.
4. Upewnij się, że tylny koniec elektrody wystaje mniej niż 1 cm z tyłu rurki kapilarnej, a końcówka elektrody wystaje z kaniuli w żądanej odległości od spodu. Położenie elektrody można regulować ręcznie od góry.
5. złoty pin do końcówki mikroelektrody.
6. Dodaj klej epoksydowy między złotą szpilką a górną skuwką, aby przymocować mikroelektrodę do tulejki.
7. Odkręć górną tuleję, aby schować sondę do wnętrza kaniuli. Potwierdź wzrokowo, że mikroelektroda jest całkowicie schowana w kaniuli.

3. Budowa obwodu mikroprzepływowego (Rysunek 2)

1. Umieść płytkę do krojenia chleba na stabilnej powierzchni. Umieść dwa zawory trójdrogowe równolegle do najdłuższych boków płytki stykowej, około 6 cali. osobno z jednym portem (tym, który jest zawsze otwarty) skierowanym do siebie. Użyj, aby przymocować zawory do płytki stykowej.
2. Umieść linijkę obok zaworów (aby mierzyć i śledzić ruch płynów wewnątrz rurki kapilarnej).
3. Załaduj mieszaninę oleju o niskiej lepkości w stosunku 1:1 i barwnika spożywczego (markera) do gazoszczelnej strzykawki i umieść w pompie Marker. Wytnij jeden kawałek rurki kapilarnej i użyj standardowych tulejek i złączy Luer-lock, aby podłączyć strzykawkę do jednego z portów na zaworze wejściowym. To jest "linia znacznika".
4. Wytnij krótki kawałek rurki kapilarnej na "linię linijki". Użyj standardowych tulejek, aby dokręcić do portów czołowych zaworów.
5. Wytnij dwa dłuższe kawałki rurki kapilarnej, aby połączyć zawór wyjściowy z mikrowtryskiwaczem i podłączyć pompę leku do zaworu wejściowego (użyj standardowych tulejek).
   nuta: Długość tych dwóch przewodów zależy od konfiguracji doświadczalnej, jedna musi być wystarczająco długa, aby sięgać od aparatu infuzyjnego do zwierzęcia, a druga od pompy leku do zaworu wejściowego. Użyj kamienia do rozłupywania, aby przeciąć rurkę kapilarną.

4. Montaż mikrowtrysku do Microdrive (Rysunek 3)

1. Upewnij się, że mikroelektroda/sonda eksperymentalna jest schowana w kaniuli przed montażem.
   nuta: Rura prowadząca powinna znajdować się na swoim miejscu w mikronapędzie.
2. Podłącz specjalnie wykonany adapter do mikrowtrysku.
3. Załaduj mikrowtryskiwacz od góry przez rurkę prowadzącą i przymocuj go do adaptera za pomocą.
4. Zmierz położenie (głębokość) mikronapędu, na którym mikroiniekcja wystaje z rurki prowadzącej, a następnie wsuń ją o ~1 cm, aby przygotować się do włożenia.
5. W przypadku eksperymentów z mikroinfuzją należy podłączyć "linię mózgową" do nieużywanego otworu złącza T mikroiniekcji. Użyj standardowej tulejki i dokręć kluczem do tulejek.

5. Płukanie i przygotowanie układu mikroprzepływowego

1. Umieścić mikronapęd z mikrowtryskiwaczem nad zlewką na odpady.
2. Załadować chlorheksydynę (np. nolvasan; rozpuszczoną w stężeniu 20 g/l) do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 1 ml i umieścić ją w pompie lekowej. Obróć kierunek przepływu zaworów tak, aby płyn przepływał z pompy leku przez zawór do przewodu zaworu i na zewnątrz "linii mózgu".
3. Przepłukać obwód chlorheksydyną przy niskim natężeniu przepływu (50-200 μl/min) przez co najmniej 10 minut. Powtórz kroki od 5.2 do 5.3 sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie powietrzem.
   nuta: Na tym etapie ważne jest, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. Delikatnie nałóż niestrzępiące się chusteczki na skrzyżowaniach, aby odsłonić wszelkie wycieki płynu przez tulejki.
4. Załaduj lek do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 500 μl, spręż powietrze, a następnie umieść w pompie leku. Przepływać z prędkością 50 μl/min, aż z mikroiniekcji wypłynie kilka kropel.
5. Namoczyć rurkę prowadzącą w chlorheksydynie (rozpuszczonej w stężeniu 20 g/l) przez 15 minut.
6. Obróć kierunek zaworu wyjściowego w kierunku "linii płukania". Przesuwaj pompę markera, aż na linii linijki pojawi się wyraźna krawędź koloru i oleju. Upewnij się, że między lekiem a kolorem zawsze znajduje się olej, aby nie zmieszać dwóch rozpuszczalnych w wodzie materiałów i nie stracić ostrej krawędzi między nimi. Zaznacz pozycję początkową tej linii oleju/barwnika (za pomocą kawałka taśmy lub markera).
7. Obróć kierunek zaworu wyjściowego w kierunku linii mózgu.

6. Przeprowadzanie nagrań lub eksperymentu infuzyjnego

UWAGA: Etapy postępowania ze zwierzętami będą się różnić w zależności od laboratorium i eksperymentu. Następujące kroki należy wykonać po wykonaniu niezbędnego ustawienia chirurgicznego i przygotowania do odsłonięcia opony twardej. Po eksperymencie wszystkie niezbędne kroki po zabiegu muszą zostać wykonane zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.

1. Podłącz mikronapęd do komory nagrywania. Opuść rurkę prowadzącą, aby przebić oponę twardą.
   nuta: Rurka prowadząca nie powinna wnikać dalej niż opona twarda, aby uniknąć uszkodzenia kory.
2. Opuścić mikrowstrzyknięcie do około 2 mm powyżej miejsca zapisu/wstrzyknięcia do mózgu.
3. Dokręć górną tulejkę (wystającą mikroelektrodę/biosensor) i podłącz złote piny do systemu nagrywania. Kontynuuj przesuwanie mikroiniekcji do miejsca docelowego.
   nuta: Pamiętaj, aby w obliczeniach uwzględnić odległość, na jaką mikroelektroda wychodzi poza kaniulę.
4. W przypadku eksperymentów infuzyjnych użyj ręcznej pompki mikrostrzykawkowej, aby przesunąć kolumnę oleju o 1 cm co 3 minuty (~60 nL/min). Po zainfuzji żądanej objętości przełącz zawór wyjściowy w kierunku przewodu spłukującego.
   nuta: Objętość podawanej infuzji będzie się różnić w zależności od gatunku modelu i docelowego obszaru mózgu. Szybszy przepływ może uszkodzić tkankę nerwową.
5. Po zakończeniu eksperymentów wsuń mikroiniekcję w rurkę prowadzącą (pozostaw sondę wysuniętą). Następnie wyjmij mikronapęd w celu przepłukania. Przepłukać układ mikroprzepływowy zgodnie z opisem w krokach 5.1-5.5. aby przygotować się do ponownego użycia.
   nuta: Z naszego doświadczenia wynika, że mikroiniekcja wystarczy na kilka zastosowań, jeśli zachowa się odpowiednią ostrożność. Jakość zapisu elektrofizjologicznego spada szybciej niż zdolność do iniekcji.

Przeprowadziliśmy wstrzyknięcie agonisty GABAa (muscimolu) w celu odwracalnej dezaktywacji przedniego pola oka (FEF), podczas gdy zwierzę wykonało zadanie sakkady sterowanej pamięcią11. W tym zadaniu zwierzę fiksuje się i prezentowany jest peryferyjny cel wizualny. Zwierzę utrzymuje fiksację, zapamiętując docelowe miejsce, a gdy punkt fiksacji zniknie, wykonuje sakkadowy ruch gałek ocznych do zapamiętanego miejsca, aby otrzymać nagrodę. Mikroiniektor został zbudowany zgodnie z instrukcją w Rysunek 1b. Objętość infuzji w przykładowym eksperymencie wynosiła 850 nL. Wydajność behawioralna w zadaniu sakady sterowanej pamięcią (MGS) w różnych miejscach i czasie w stosunku do infuzji muscymolu jest pokazana na Rysunek 4. Największe deficyty wydajności obserwowano po 2 do 3 godzinach od infuzji.

Rysunek 1: Wytwarzanie mikrowtrysku krok po kroku. a) Konfiguracja do użytku niezależnego od układu mikroprzepływowego. Kaniula i sonda są mierzone w celu potwierdzenia, że końcówka sondy może być wysunięta na żądaną długość (np. 150 μm). Sonda jest ładowana od przodu do kaniuli. Kaniula jest przepuszczana przez złącze T i mocowana od spodu, z płaskim końcem pośrodku złącza T; Tylny koniec sondy przechodzi przez górną tulejkę. Mikrowtryskiwanie jest finalizowane poprzez przylutowanie złotych pinów na każdym z końcówek sondy i dodanie kleju między nimi a górną tuleją w celu zapewnienia stabilności. Podłączenie do systemu akwizycji zależy od konstrukcji sondy. W tym przykładzie nasza sonda jest nanoczujnikiem z trzema wyprowadzeniami. (b) Konfiguracja do użytku z układem mikroprzepływowym. Aby połączyć mikrowtrysk z układem mikroprzepływowym, w górnej części trójnika stosuje się kawałek rurki kapilarnej. Sonda może być ładowana od przodu lub od tyłu. Przewód mikroprzepływowy jest następnie podłączany do trzeciego otworu złącza T. W tym przykładzie użyliśmy mikroelektrody. Zobacz powiększone zdjęcie końcówki kaniuli, w której wystawała mikroelektroda poprzez zaciśnięcie górnej tulejki. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z listą przedmiotów używanych w budownictwie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Układ mikroprzepływowy. Konfiguracja z dwoma zaworami umożliwia kontrolę kierunku przepływu w kierunku mikrowtryskiwacza lub w kierunku przewodu płuczącego w celu rozwiązywania problemów. Obwód opiera się na dwóch zaworach 3-portowych połączonych za pomocą rurki kapilarnej i standardowych tulejek. Strzykawki gazoszczelne służą do przenoszenia i wstrzykiwania leku infuzyjnego i markera. Programowalna pompa strzykawkowa pozwala na automatyczne płukanie układu i ładowanie leku. Ręczna pompa mikrostrzykawkowa pozwala na kontrolowane wstrzykiwanie i wizualizację. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Montaż mikrowtryskiwacza do mikronapędu hydraulicznego z wydajnością wtrysku i bez niej. Krok 4.1: Dedykowany adapter pozwala na zamocowanie mikrowtryskiwacza do mikronapędu. Pojedyncza śruba mocuje adapter do mikronapędu; Dwie mocują mikrowtryskiwacz do adaptera. Górna tulejka powinna być odkręcona o co najmniej 2 obroty w celu ochrony końcówki mikroelektrody/sondy doświadczalnej podczas ładowania mikroiniektoru do rurki prowadzącej mikronapędu. Krok 4.3: Włóż mikroiniektor do rurki prowadzącej od góry. Krok 4.4: Jeśli wykonujesz mikroinfuzję, podłącz przewód leku do trzeciego otworu złącza T za pomocą plastikowej tulejki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Zadanie sakkady sterowanej pamięcią podczas infuzji muscymolu w FEF. (a) Mikroiniektor umieszczono w prawej półkuli, w obszarze FEF. (b) Wydajność behawioralna podczas zadania MGS, w którym osiem celów jest rozmieszczonych obwodowo. Przeprowadziliśmy 4 bloki zadania MGS, przed i trzykrotnie po iniekcji. Wykres biegunowy pokazuje wydajność (mimośród) w każdym z tych momentów (kolor), dla różnych lokalizacji względem punktu fiksacji (kąt na wykresie biegunowym). Wydajność wyraźnie spadła w lewej półpolu widzenia 2 h po wstrzyknięciu (niebieski ślad, lewa połowa wykresu biegunowego). (c) Ślady sakkady dla 8 miejsc pamięci obwodowej przed (po lewej) i po wstrzyknięciu muscymolu do FEF (po prawej, 1 i 3 godziny po infuzji). Dokładność sakkad w lewej półkuli wzrokowej (lewa połowa wykresów biegunowych) zmniejszyła się po wstrzyknięciu muscymolu. Skala w stopniach kąta widzenia (dva). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Żaden.