Genotypowanie DNA mikrosatelitarnego i cytometria przepływowa Analizy ploidalne tkanek trzonowców bąblowcowych utrwalonych w formalinie

Podsumowanie

Pieprzyki bąblowce to nieprawidłowe ciąże ludzkie o niejednorodnej etiologii, które można sklasyfikować według ich cech morfologicznych i wkładu rodziców w genomy trzonowców. W tym miejscu szczegółowo opisano protokoły multipleksowego mikrosatelitarnego genotypowania DNA i cytometrii przepływowej tkanek trzonowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie, wraz z interpretacją i integracją wyników.

Streszczenie

Pieprzyk bąblowy (HM) to nieprawidłowa ciąża ludzka, charakteryzująca się nadmierną proliferacją trofoblastyczną i nieprawidłowym rozwojem embrionalnym. Istnieją dwa typy HM oparte na mikroskopowej ocenie morfologicznej, całkowite HM (CHM) i częściowe HM (PHM). Można je dalej podzielić na podstawie wkładu rodziców w genomy trzonowców. Taka charakterystyka HM, za pomocą analiz morfologii i genotypu, ma kluczowe znaczenie dla postępowania z pacjentem i dla podstawowego zrozumienia tej intrygującej patologii. Jest dobrze udokumentowane, że analiza morfologiczna HM podlega dużej zmienności między obserwatorami i sama w sobie nie jest wystarczająca do dokładnej klasyfikacji HM na CHM i PHM oraz odróżnienia ich od hydropowych poronień nietrzonowych. Analiza genotypowania jest najczęściej wykonywana na DNA i tkankach pochodzących z produktów zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, które mają jakość niższą niż optymalna i w konsekwencji mogą prowadzić do błędnych wniosków. W artykule przedstawiono szczegółowe protokoły genotypowania multipleksowego i analiz cytometrii przepływowej tkanek trzonowych FFPE, wraz z interpretacją wyników tych metod, ich rozwiązywaniem problemów oraz integracją z oceną morfologiczną, immunohistochemią^{p57 KIP2} i fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu uzyskania prawidłowej i solidnej diagnozy. W tym miejscu autorzy dzielą się metodami i wnioskami wyciągniętymi w ciągu ostatnich 10 lat z analizy około 400 produktów poczęcia.

Wprowadzenie

Pieprzyk bąblowy (HM) to nieprawidłowa ciąża u człowieka, charakteryzująca się nieprawidłowym rozwojem embrionalnym, nadmierną proliferacją trofoblastu i hydropowym zwyrodnieniem kosmków kosmówkowych (CV). Historycznie rzecz biorąc, HM był podzielony na dwa typy, kompletny HM (CHM) i częściowy HM (PHM) oparty tylko na ocenie morfologicznej¹. Wykazano jednak, że sama ocena morfologiczna nie jest wystarczająca do zaklasyfikowania HM do dwóch podtypów (CHM i PHM) i odróżnienia ich od poronień nietrzonowych^2,3,4.

Ponieważ CHM i PHM mają różne skłonności do nowotworów złośliwych, dlatego ważne jest dokładne określenie typu genotypowego HM, aby zapewnić odpowiednią obserwację i leczenie pacjentów. W związku z tym w ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano i rozwinięto kilka metodologii w celu zidentyfikowania wkładu rodzicielskiego w tkanki trzonowe i osiągnięcia prawidłowej klasyfikacji HM. Należą do nich analiza kariotypu, polimorfizm prążkowania chromosomów, typowanie serologiczne ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA), polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, zmienna liczba powtórzeń tandemowych, genotypowanie mikrosatelitarne, cytometria przepływowa i immunohistochemia p57^KIP2. Umożliwiło to dokładny podział poczęć HM na podstawie wkładu rodziców w ich genomy, w następujący sposób: CHM, które są diploidalnymi androgenami monospermicznymi lub diploidalnymi androgenami dyspermicznymi, oraz PHM, które są triploidalne, dispermiczne w 99% i monospermiczne w 1% przypadków^5,6,7,8. Co więcej, istnieje inny genotypowy typ HM, który pojawił się w ciągu ostatnich dwóch dekad, który jest diploidalny dwurodzicielski. Ta ostatnia choroba jest najczęściej nawracająca i może dotyczyć jednego członka rodziny (przypadki simpleksowe) lub co najmniej dwóch członków rodziny (przypadki rodzinne). Te diploidalne dwurodzicielskie pieprzyki są najczęściej spowodowane recesywnymi mutacjami w NLRP7 lub KHDC3L u pacjentów^9,10,11,12. Diploidalne oburodzicielskie HM u pacjentów z recesywnymi mutacjami NLRP7 może być zdiagnozowane jako CHM lub PHM na podstawie analizy morfologicznej i wydaje się, że jest to związane z ciężkością mutacji u pacjentów^13,14. Oprócz klasyfikacji HM według ich genotypów, wprowadzenie i zastosowanie kilku metod genotypowania pozwoliło na odróżnienie różnych jednostek trzonowych od poronień nietrzonowych, takich jak aneuploidalne diploidalne poczęcia dwurodzicielskie i inne rodzaje poczęć5^,15. Takie koncepcje mogą mieć pewną proliferację trofoblastów i nieprawidłową morfologię kosmków, które naśladują, do pewnego stopnia, niektóre cechy morfologiczne HM.

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowych protokołów do multipleksowego genotypowania i cytometrii przepływowej tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, a także kompleksowe analizy wyników tych metod i ich integracji z innymi metodami dla prawidłowej i rozstrzygającej diagnozy tkanek trzonowych.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez McGill Institutional Review Board. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu i na pobranie produktów poczęcia FFPE (POC) z różnych oddziałów patomorfologii.

UWAGA: Chociaż istnieje kilka metod genotypowania i określania ploidalności za pomocą cytometrii przepływowej, przedstawione tutaj protokoły opisują jedną metodę analizy przy użyciu jednej platformy dla każdej z nich.

1. Genotypowanie

1. Wybór najlepszego bloku FFPE
   1. Dla każdego produktu zapłodnienia FFPE (POC) należy przygotować skrawki barwione hematoksyną i eozyną (H&E) o grubości 4 μm, jak opisano w sekcjach 1.2 i 1.3, po jednym dla każdego dostępnego bloku, do oceny morfologicznej za pomocą mikroskopii.
   2. Korzystając ze szkiełek podstawowych i mikroskopu świetlnego, wybierz blok FFPE, który ma największą ilość kosmków kosmówkowych (CV) i, jeśli to możliwe, blok, który ma CV oddzielony od tkanek matczynych i nie zmieszany z nimi.
2. Cięcia
   1. Umieść wybrany klocek na lodzie na 15 minut, aby ułatwić cięcie.
   2. Dostosuj mikrotom, aby wyciąć odcinki o grubości 4 μm do mikroskopowej oceny morfologicznej i 10 μm do ekstrakcji DNA.
   3. Umieść zimny blok w mikrotomie i wytnij po jednym fragmencie z każdego bloku do barwienia H&E i 10−30 odcinków z wybranego bloku, w zależności od ilości CV w bloku, do ekstrakcji DNA.
      nuta: W przypadku bloków, które są pełne CV, do ekstrakcji DNA wystarczy 10 sekcji. Jeśli tylko około 10% bloku zawiera CV, podczas gdy reszta to tkanki matczyne, to potrzeba 20-30 sekcji, aby zapewnić wystarczającą ilość DNA.
   4. Za pomocą kleszczy przenieś każdą sekcję do łaźni wodnej o temperaturze 45 °C. Pobrać ołówkiem wycinek z łaźni wodnej za pomocą dodatnio naładowanego szkiełka (tabela materiałów), który jest uprzednio oznaczony numerem identyfikacyjnym próbki.
   5. Umieścić szkiełka zawierające sekcje w suszarce w temperaturze 65 °C, aby sekcje przylegały do szkiełek. Szkiełka do BHP należy przechowywać w piekarniku przez 25 minut. Szkiełka do ekstrakcji DNA należy przechowywać w piekarniku przez 20 minut
      nuta: Krótszy czas inkubacji sprawia, że tkanki nieco mniej przylegają do szkiełek, a co za tym idzie, ułatwia usuwanie tkanek matczynych.
3. Barwienie H&E
   1. Pozwól szkiełkom ostygnąć do temperatury pokojowej (10 min).
   2. Przygotowanie odczynnika
      1. Przygotować roztwór roboczy Eozyny Y (0,25%) zgodnie z Tabelą 1. Dobrze wymieszaj i przechowuj w temperaturze pokojowej.
      2. Przygotować roboczy roztwór hematoksyliny, rozcieńczając roztwór podstawowy hematoksyliny 5x w wodzie (tj. zmieszać 80 ml wody z 20 ml hematoksyliny).
         nuta: Zawiń podstawowy roztwór hematoksyliny w folię do przechowywania.
   3. Przygotuj słoiki do barwienia z odpowiednimi odczynnikami pod wyciągiem zgodnie z tabelą 2.
   4. Barwienie H&E należy wykonać, zanurzając szkiełka w odpowiednich słoikach do barwienia na odpowiedni okres czasu, zgodnie z tabelą 2.
   5. Zamontować sekcje 4 μm do analizy morfologicznej za pomocą podłoża montażowego, a szkiełko nakrywkowe za pomocą szkiełek nakrywkowych (tabela materiałów).
      nuta: Skrawki 10 μm do genotypowania nie powinny być szkiełkowane na nakrywce.
   6. Pozostaw sekcje 10 μm pod wyciągiem na co najmniej 3 godziny, aby toksyczne zapachy ksylenu zniknęły.
      ostrożność: Wszystkie etapy barwienia należy wykonać pod wyciągiem. Produkty ksylenowe muszą być zawsze trzymane pod maską, ponieważ zapachy ksylenu są toksyczne. Ponadto ksylen i hematoksylinę należy wyrzucić do specjalnych pojemników. Gdy pojemniki te są pełne, należy je wyrzucić zgodnie z zaleceniami organizacji ds. bezpieczeństwa laboratorium.

Odczynnik	ilość
Roztwór podstawowy eozyny Y (1%)	250 ml
80% etanolu	750 ml
Lodowaty kwas octowy (skoncentrowany)	5 ml

Tabela 1: Przygotowanie roztworu roboczego Eozyny Y (0,25%).

Użyty odczynnik (100 ml na pojemnik)	czas trwania
1) Ksylen	Czas trwania: 5 min
2) Ksylen	Czas trwania: 5 min
3) 100% etanol	Czas trwania: 2 min
4) 95% etanolu	Czas trwania: 2 min
5) 70% etanolu	Czas trwania: 2 min
6) 50% etanolu	Czas trwania: 2 min
7) Woda destylowana	Czas trwania: 5 min
8) Hematoksylina	Czas trwania: 4 min
9) Woda destylowana	Czas trwania: 5 min
10) Eozyna	1 min
11) 95% etanolu	Czas trwania: 5 min
12) 100% etanol	Czas trwania: 5 min
13) Ksylen	Czas trwania: 5 min
14) Ksylen	Czas trwania: 5 min

Tabela 2: Odczynniki i czas trwania protokołu barwienia H&E.

4. Izolacja CV
   1. Pod lekkim mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczyków i małych kawałków chusteczek papierowych zwilżonych wodą (Tabela materiałów), aby zeskrobać niechciane tkanki matczyne z wybarwionych H&E skrawków o grubości 10 μm.
      nuta: Ostatecznym celem jest pozostawienie na szkiełkach tylko CV lub błon płodowych (jeśli są obecne), a tym samym usunięcie wszystkich innych tkanek. Ten krok może wymagać dużo czasu i cierpliwości, w zależności od bloku, ponieważ wymaga skrupulatnej dbałości o szczegóły.
   2. Poproś drugą osobę, aby dokładnie sprawdziła szkiełka po czyszczeniu, aby upewnić się, że są wolne od tkanek matki.
   3. Zrób zdjęcia oczyszczonych szkiełek lub udokumentuj następujące elementy, które pomogą w interpretacji danych: 1) czy tkanka była trudna do czyszczenia, krwotoczna czy bardzo czysta, 2) liczbę użytych skrawków oraz 3) przybliżoną ilość oczyszczonych tkanek.
      UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przykład slajdu, który jest łatwy do czyszczenia. W przypadku bloku zawierającego mniej więcej taką ilość CV wystarczy 10 skrawków do ekstrakcji DNA. Slajd w Rysunek 2 ma bardzo mało CV, które są przemieszane z tkankami matki, co sprawia, że czyszczenie jest bardzo trudne i czasochłonne. W przypadku bloku zawierającego mniej więcej taką ilość CV potrzeba 30 skrawków do ekstrakcji DNA.
   4. Odbierz CV za pomocą małych, zwilżonych kawałków papierowych chusteczek. Za pomocą kleszczy oderwij mały kawałek z wilgotnych chusteczek papierowych i użyj go do zebrania CV.
   5. Umieść kawałki chusteczek papierowych z dołączonym CV w oznakowanej tubce o pojemności 1,5 ml.
   6. Zminimalizuj ilość chusteczek papierowych używanych na tym etapie, ponieważ zbyt duża ilość może zatkać kolumnę do ekstrakcji DNA, a w konsekwencji zmniejszyć końcową ilość pobranego DNA. Średnio staraj się używać mniej niż siedmiu małych chusteczek papierowych na próbkę. Jeśli nie jest to możliwe ze względu na obecność dużych ilości CV, należy podzielić próbkę na dwie probówki, aby ułatwić ekstrakcję.

Rysunek 1: Reprezentatywny slajd do genotypowania. U góry: Szkiełko, które należy "wyczyścić", aby uwolnić się od tkanek matki. Na dole: Ten sam slajd pokazany po oczyszczeniu i teraz nie zawiera nic poza CV do ekstrakcji DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywny slajd do genotypowania. U góry: Szkiełko, które należy "wyczyścić", aby uwolnić się od tkanek matki. Na dole: Ten sam slajd pokazany po oczyszczeniu i teraz nie zawiera nic poza CV do ekstrakcji DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Postępuj zgodnie z protokołem ekstrakcji DNA z zestawu FFPE (Tabela materiałów), aby przeprowadzić ekstrakcję DNA.
   nuta: Niektóre zestawy zalecają użycie 15-20 μl buforu elucyjnego do końcowej elucji. Z doświadczenia wynika, że elucja za pomocą 15 μl buforu elucyjnego działa dobrze w przypadku większości próbek. W razie potrzeby można przygotować rozcieńczenia z podstawowego DNA.

6. Kwantyfikacja DNA
   1. Za pomocą spektrofotometru laboratoryjnego załadować 1 μl DNA i zmierzyć absorbancję przy 260 nm w celu określenia ilościowego.
   2. Załaduj 1 μl DNA na 2% żel agarozowy i uruchom elektroforezę żelową pod napięciem 80−100 V w celu oceny jakościowej.
   3. Na podstawie wyników kroków 1.6.1 i 1.6.2 wybierz objętość DNA, która ma być użyta w amplifikacji łańcuchowej polimerazy (PCR) z krótkim powtórzeniem tandemowym (STR). Staraj się użyć co najmniej 1000 ng DNA w poniższej amplifikacji PCR.
      UWAGA: Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne przykłady żeli wraz ze stężeniami DNA (na podstawie wyników spektrofotometru) oraz objętością roztworu DNA, która jest zalecana dla poniższego multipleksowego testu STR PCR.

Rycina 3: Reprezentatywny żel do oznaczania ilościowego DNA. Uwzględniono stężenia każdego DNA, mierzone za pomocą spektrofotometru, oraz ilości użyte do multipleksowego PCR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Amplifikacja PCR
   1. Wykonaj fluorescencyjne genotypowanie mikrosatelitarne przy użyciu multipleksowego systemu STR (Tabela Materiałów).
   2. Użyj warunków PCR pokazanych w Rysunek 4 do amplifikacji PCR przy użyciu systemu multiplex STR (tabela materiałów).
      nuta: W tym multipleksowym systemie STR stosowane są następujące startery: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenina, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818 i Penta D.

Rysunek 4: Warunki cyklu PCR dla systemu multipleksowego STR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Rozpuścić produkty PCR za pomocą elektroforezy kapilarnej.
   1. Zawiesić 1 μl każdej amplifikowanej próbki w 0,5 μl wewnętrznego standardowego pasa systemu multipleksowego i 9,5 μl wysoce zdejonizowanego formamidu (tabela materiałów).
   2. Przepuścić próbki przez przyrząd do elektroforezy kapilarnej (Tabela materiałów) przy użyciu odpowiedniej matrycy separacji (Tabela materiałów) dla przyrządu i zestawu barwników systemu multipleksowego.

9. analiza danych
   1. Przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy fragmentów DNA i porównaj allele POC z allelami rodzicielskimi, aby określić ich pochodzenie.
   2. Ustaw rozmiar standardowy.
      nuta: Dzięki temu oprogramowanie może rozpoznać drabinkę, która jest używana w systemie multipleksowym STR i przypisać pary zasad do amplikonów opartych na drabince. Poniższe kroki dotyczą jednego konkretnego oprogramowania (Spis materiałów), ale mogą być również pomocne przy konfigurowaniu innych typów oprogramowania.
      1. Otwórz oprogramowanie. Kliknij Rozpocznij nowy projekt, a następnie Nowy standard rozmiaru.
      2. Nadaj normie rozmiaru nazwę (np. ABI_600).
      3. W polu Wprowadź definicję standardu nowego rozmiaru wprowadź następujące informacje: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. Następnie kliknij Dodaj rozmiar(y).
         UWAGA: Wprowadzone liczby pojawią się pod polem po prawej stronie, które nazywa się Aktualna standardowa definicja rozmiaru (patrz Rysunek 5).
      4. Kliknij Zapisz.
   3. Aby zaimportować i przeanalizować plik, kliknij Dodaj pliki i wybierz plik fsa do analizy. Kliknij Dodaj wybrane pliki, a następnie OK. Następnie wykonaj następujące kroki:
      1. Znajdź kolumnę Rozmiar standardowy i wybierz ABI_600 (lub inną nazwę nadaną standardowi rozmiaru).
      2. W obszarze Metoda analizy kliknij pozycję Domyślny rozmiar — NPP, a następnie kliknij zielony przycisk Analizuj.
      3. Plik jest teraz gotowy do wyświetlenia. Dostosuj opcje wyświetlania, aby wyświetlić dane zgodnie z potrzebami.
   4. Rozwiązywanie problemów - metoda analizy
      nuta: Oprogramowanie może czasami nie identyfikować szczytów i nie ustawiać ich prawidłowo. Dzieje się tak, gdy szczyty są albo zbyt niskie, albo zbyt wysokie. Poniższe dwie metody analizy mogą to skorygować i powinny zostać wypróbowane przed ponownym przetestowaniem próbki.
      1. Metoda analizy 1 dla wysokich szczytów:
         1. Kliknij Nowa metoda analizy i nazwij ją High Peaks (lub inną nazwą zgodnie z osobistymi preferencjami).
         2. Kliknij Zakres, a następnie Zakres częściowy, aby przeprowadzić analizę i określić rozmiar. Następnie wpisz 100 w polach Punkt początkowy i Rozmiar początkowy.
         3. W polu Punkt zatrzymania wprowadź wartość 10 000. W polu Stop Size (Rozmiar przystanku) wprowadź wartość 1000.
         4. Następnie kliknij Minimalne wysokości pików i zmień liczby tak, aby próg szczytu dla kolorów był następujący: Niebieski: 50; Zielony: 50; Żółty: 20; Czerwony: 100; Pomarańczowy: 5000.
         5. Zapisz nową metodę analizy.
      2. Metoda analizy 2 dla niskich szczytów:
         1. Kliknij na Nowa metoda analizy i nazwij ją Low Peaks (lub inną nazwą zgodnie z osobistymi preferencjami).
         2. Kliknij Zakres, a następnie Zakres częściowy, aby przeprowadzić analizę i określić rozmiar. Następnie wpisz 100 w polach Punkt początkowy i Rozmiar początkowy.
         3. W polu Punkt zatrzymania wprowadź wartość 10 000. W polu Stop Size (Rozmiar przystanku) wprowadź wartość 1000.
         4. Następnie kliknij Flagi jakości i zmień zakres przepustek tak, aby brzmiał od 0,5 do 1. Zmień zakres niskiej jakości tak, aby odczytywał od 0,0 do 0,0. Zmień Przyjmij liniowość na następującą: z (bp) 100,0 do (bp) 800.0.
         5. Zapisz nową metodę analizy.
            nuta: Teraz można ponownie przeanalizować plik, wybierając opcję Niskie szczyty lub Wysokie szczyty w obszarze Metoda analizy, a następnie klikając zielony przycisk Analizuj.

Rysunek 5: Zrzut ekranu przedstawiający edytor standardowego rozmiaru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Cytometria przepływowa

1. Wybór idealnego bloku FFPE
   1. Korzystając ze szkiełek podstawowych i mikroskopu świetlnego, wybierz blok FFPE, który ma około 50−70% tkanek składających się z CV.
      UWAGA: Rysunek 6 jest reprezentatywnym przykładem odpowiedniego bloku do analizy cytometrii przepływowej, ponieważ składa się z około 50% CV (prawa połowa sekcji) i 50% tkanek matczynych (lewa połowa). Obecność tkanek matczynych jest ważna, ponieważ służą one jako wewnętrzna kontrola piku diploidalnego.
   2. W przypadku bloków, które nie mają idealnej ilości CV, należy wzbogacić o CV podczas wykonywania sekcji. W tym celu należy określić, po której stronie świeżo wyciętych sekcji znajduje się więcej CV, zgodnie z odpowiadającym im slajdem H&E. Na tej podstawie użyj ostrza, aby odciąć drugą połowę, którą należy wyrzucić, aby wzbogacić się o CV.
      UWAGA: Rysunek 7 pokazuje blok, który nie ma wystarczającego CV do analizy cytometrii przepływowej. W przypadku bloków takich jak ten, sekcje muszą być przycięte w taki sposób, aby połowa, która zawiera mniej CV, została odrzucona w celu zwiększenia ilości CV w stosunku do tkanek matczynych, jak pokazano na rysunku. Pamiętaj, aby wyciąć więcej sekcji, aby zrekompensować to, co zostało odrzucone.

Rysunek 6: Przekrój H&E reprezentujący blok POC, który jest idealny do cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Przekrój H&E reprezentujący trudniejszy blok dla cytometrii przepływowej. Ta reprezentatywna sekcja BHP pokazuje, że tylko dolna połowa tej sekcji powinna być używana do analizy cytometrii przepływowej, w celu wzbogacenia CV. Obszar opisany, oznaczony jako "CV", składa się głównie z CV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Cięcia
   1. Pozostaw klocki na lodzie na 15 minut, aby ułatwić cięcie.
   2. Używając najlepszego możliwego bloku FFPE, wytnij cztery odcinki o grubości 50 μm (lub dwa odcinki o grubości 100 μm) za pomocą mikrotomu.
      nuta: W przypadku cytometrii przepływowej preferowane jest stosowanie grubszych przekrojów.
   3. W przypadku, gdy idealny blok FFPE nie jest dostępny, należy dążyć do utrzymania stosunku CV do tkanki matczynej. Na przykład, jeśli tylko 30% bloku składa się z CV, podczas gdy reszta ma tkanki matczyne, usuń co najmniej połowę sekcji, która zawiera tkanki matczyne i użyj więcej odcinków do kompensacji (patrz Rysunek 7).
   4. Umieść skrawki w oznaczonych probówkach 15 ml.
      nuta: Pamiętaj, aby zakleić etykiety taśmą, ponieważ odczynniki organiczne użyte w następnym kroku mogą rozpuścić i usunąć atrament.
3. Protokół cytometrii przepływowej z tkanek FFPE
   1. Deparafinowanie i ponowne nawodnienie
      1. Wykonaj następujące prania (Tabela 3) pod wyciągiem.
      2. Napełnić probówkę o pojemności 15 ml 6 ml odpowiedniego odczynnika, postępując zgodnie z kolejnością przedstawioną w tabeli 3, pozostawić skrawki w odczynnikach na odpowiedni czas, a następnie usunąć odczynnik za pomocą odsysania próżniowego i szklanej pipety Pasteura.
      3. Pomiędzy każdym krokiem zanurz pipetę Pasteura najpierw w 70% etanolu, następnie w wodzie destylowanej, a następnie przejdź do następnego kroku.
      4. Bądź bardzo ostrożny, aby nie usunąć kawałków tkanki wraz z odczynnikiem. Przechyl probówkę o pojemności 15 ml pod kątem 60 stopni, aby ułatwić odsysanie płynnego odczynnika bez pobierania chusteczek.
         ostrożność: Wyrzucone płyny zawierają ksylen i należy je wyrzucać do pojemników na odpady ksylenu.
   2. Przygotowanie roztworu
      1. Przygotować roztwór cytrynianu, rozpuszczając 2 g kwasu cytrynowego w 1 litrze podwójnie destylowanej wody. Doprowadzić pH do 6. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      2. Przygotować roztwór pepsyny, rozpuszczając 0,01 g pepsyny w 2 ml 9 części na tysiąc NaCl, pH 1,64. Dotyczy to jednej próbki.
         ostrożność: Pepsyna jest toksyczna i może łatwo się rozpraszać i unosić w powietrzu. Podczas obchodzenia się z pepsyną w postaci proszku należy nosić maskę, a po użyciu wytrzeć cały obszar roboczy.
      3. Jodek propidyny (PI)-rybonukleaza Przygotowanie roztworu dla jednej próbki.
         1. Zmieszać 50 μl PI z 450 μl PBS (do rozcieńczenia 10x).
         2. Do mieszaniny dodać 50 μl rybonukleazy A (1 mg/ml). Przechowywać przez cały czas zawinięte w folię.
   3. Trawienie i barwienie
      1. Dodać 4 °C roztwór cytrynianu do probówek o pojemności 15 ml, a następnie umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C na 2 godziny.
      2. Pozostaw roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej (15 min). Usuń roztwór cytrynianu.
      3. Dodaj 6 ml 1x PBS, odwiruj i odczekaj 1-2 minuty, aby tkanki osiadły na dnie. Usuń 1x PBS za pomocą odsysania próżniowego i szklanej pipety Pasteura.
      4. Dodać 1 ml roztworu pepsyny (podgrzanego do temperatury 37 °C) i umieścić w suchej łaźni o temperaturze 37 °C na 30 minut. Wirować co 10 minut. Przygotować roztwór PI-rybonukleazy A w ciągu ostatnich 10 minut tej inkubacji.
      5. Dodaj 6 ml 1x PBS, odwiruj i odczekaj 1-2 minuty, aby tkanki osiadły na dnie. Usuń 1x PBS za pomocą odsysania próżniowego i szklanej pipety Pasteura.
      6. Dodać 550 μl roztworu PI-rybonukleazy A i umieścić próbki w suchej łaźni o temperaturze 37 °C na 30 min.
         nuta: Na tym etapie próbki można zawinąć w folię i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C do następnego ranka.
      7. Przefiltruj roztwór przez siatkę filtracyjną o średnicy 48 μm. Zebrać filtrat w polistyrenowych rurkach okrągłodennych, które mogą być używane z cytometrem przepływowym. Za pomocą kleszczy umieść kawałek siatki filtracyjnej o wymiarach 5 cm na 5 cm w górnej części probówki, tak aby ciecz mogła być pipetowana przez siatkę i do probówki.
         nuta: Próbki są teraz gotowe do badania za pomocą cytometru przepływowego. Trzymaj je zawinięte w folię, aż będą gotowe do uruchomienia.
   4. Badaj próbki za pomocą cytometru przepływowego z pomocą technika platformy cytometrii przepływowej organizacji.
      nuta: Kanał PE służy do wykrywania DNA barwionego PI, a natężenie przepływu powinno być ustawione na Wolne podczas akwizycji. Upewnij się, że napięcie jest tak dobrane, aby pik diploidalny znajdował się w przybliżeniu na poziomie 200 wzdłuż osi x PE-A, aby ułatwić analizę i interpretację. Staraj się rejestrować co najmniej 20 000 zdarzeń na próbkę.

Zastosowany odczynnik (po 6 ml)	czas trwania
1) Ksylen	2 x 10 min
2) 100% etanol	2 x 10 min
3) 95% etanolu	Czas trwania: 10 min
4) 70% etanolu	Czas trwania: 10 min
5) 50% etanolu	Czas trwania: 10 min
6) Woda destylowana	2 x 10 min

Tabela 3: Odczynniki i czas trwania deparafinowania i rehydratacji.

4. Analiza danych cytometrii przepływowej
   1. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej (tabela materiałów).
      nuta: Poniższe kroki dotyczą jednego konkretnego oprogramowania (Spis materiałów), ale mogą być również pomocne przy konfigurowaniu innych typów oprogramowania.
      1. Po uruchomieniu próbek na cytometrze przepływowym pobierz pliki FCS 2.0 do analizy.
      2. Otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej, kliknij Plik | Nowy dokument.
      3. Kliknij ikonę histogramu (), a następnie przeciągnij wskaźnik, aby utworzyć prostokąt.
      4. Wyszukaj plik FCS, a następnie kliknij Otwórz. Wzdłuż osi x kliknij FCS-A, a następnie wybierz PE-A.
      5. Kliknij ikonę wykresu kropkowego (), a następnie przeciągnij wskaźnik, aby utworzyć kolejny prostokąt poniżej wykresu histogramu. Następnie wyszukaj ten sam plik FCS, który został wybrany dla histogramu.
      6. Zmień oś x wykresu kropkowego na PE-A, a oś y na PE-W.
         UWAGA: Rysunek 8A pokazuje wygląd wykresów w tym momencie.
      7. Kliknij ikonę regionu () i narysuj pole na wykresie kropkowym, które zaczyna się przed diploidalnym szczytem (około 100 na osi x w Rysunek 8B) i kończy się około 700 na osi x, jak pokazano na wykresie kropkowym w Rysunek 8B.
         nuta: Diploidalny pik w Rysunek 8 znajduje się w przybliżeniu na osi x na poziomie 200. Jest to wybierane arbitralnie, ponieważ próbki są rejestrowane przez cytometr przepływowy, po prostu w celu ułatwienia analizy i interpretacji wyników.
      8. Kliknij na Działka | Edytuj regiony/bramy, a następnie wpisz R0 w komórce znajdującej się obok komórki G0 w obszarze Strategia. Następnie kliknij Zamknij.
      9. Kliknij w dowolnym miejscu histogramu, a następnie na Wykres | Formatowanie wydruku/nakładki. W obszarze Brama wybierz G0 = R0, a następnie kliknij OK.
         nuta: Jest to krok bramkowania, który pozwala lepiej zwizualizować piki ploidalne. Histogram powinien teraz wyglądać jak histogram w Rysunek 8B. Możliwe jest pobawienie się utworzoną bramą (poprzez przesunięcie pola narysowanego w kroku 2.4.1.7) w celu skupienia się na określonych obszarach wykresu kropkowego.
      10. Aby oznaczyć wykresy, kliknij ikonę obszaru tekstowego (), a następnie przeciągnij wskaźnik, aby utworzyć ramkę u góry dokumentu, a następnie wpisz następujące informacje: identyfikator pacjenta, identyfikator POC i użyty blok (ponieważ na jeden POC może przypadać kilka bloków), procent CV obecny na bloku, napięcie użyte do uruchomienia próbki, i datę.

Rysunek 8: Zrzut ekranu przedstawiający histogram i wykres punktowy reprezentatywnej próbki, która jest niebramkowana (A) i bramkowana (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Złożoność tkanek trzonowych i fakt, że mogą one mieć różne genotypy, wymaga rygorystycznej analizy i użycia kilku metod, takich jak ocena morfologiczna, immunohistochemia p57, genotypowanie mikrosatelitarne, cytometria przepływowa i FISH. Na przykład jeden pacjent (1790) został skierowany z dwoma PHM, które okazały się triploidalne tylko na podstawie analizy mikromacierzy POC. W związku z tym u pacjenta zdiagnozowano nawrót PHM. Genotypowanie mikrosatelitarne jej dwóch "PHM" wraz z DNA pa...

Dyskusja

HM są nieprawidłowymi ciążami u ludzi o niejednorodnej etiologii i mają różne typy histologiczne i genotypowe, co sprawia, że ich dokładna klasyfikacja i diagnoza są trudne. Histopatologiczna ocena morfologiczna często okazywała się niedokładna, a zatem sama w sobie nie jest wiarygodna w klasyfikowaniu HM do CHM i PHM oraz odróżnianiu ich od poronień nietrzonowych. Dlatego dokładna diagnoza HM wymaga zastosowania innych metod, takich jak genotypowanie DNA w mikrosatelitach multipleksowych, analiza ploidalności za pomocą ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BD FACS Canto II	BD BioSciences	338960
Przyrząd do elektroforezy kapilarnej: Genomes Applied Biosystems 3730xl Analizator DNA	Applied Biosystems	313001R	Usługa oferowana przez Centrum Genomiki Stosowanej (http://www.tcag.ca)
Kwas cytrynowy	Sigma	251275
Cytoseal 60, podłoże do montażu histopatologicznego	Fisher
Roztwór podstawowy Eozyny Y (1%)	Fisher	SE23-500D
FCSalyzer - oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej	SourceForge-https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Zestaw Qiagen	Qiagen	80234
Kleszcze	Fine Science Tools	11295-51	Do cięcia i czyszczenia
Lodowcowy Kwas octowy (skoncentrowany)	Sigma	A6283-500mL
Szkiełka nakrywkowe szklane: Szkło nakrywkowe	Fisher	12-541a
Hematoxylin	Fisher	CS401-1D
Wysoce dejonizowany formamid: Hi-Di Formamid	Thermofisher	4311320
platforma IHC: Benchmark Ultra
	Ultident	30-34120
Mikrotom	Leica	RM2135
Ostrza mikrotomu	Fisher	12-634-1C
Siatka filtrująca Nitex, 48 μ	m Filmar	74011	http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; każdy inny filtr jest odpowiedni, ale jest to niedroga i skuteczna opcja od firmy niebadawczej
p57 przeciwciało Cell	Marque	457M
Pipeta Pasteura	VWR	53499-632
Maszyna do PCR	Perkin Elmer, Applied Biosystems	GeneAmp PCR System 9700
PeakScanner 1.0	Applied Biosystems	4381867	Oprogramowanie do analizy genotypowania.
Pepsyna z błony śluzowej żołądka świń	Sigma	P7012
Polistyrenowe rurki okrągłodenne	BD Falcon	352058
Dodatnio naładowane prowadnice: Superfrost Plus 25x75mm	Fisher	1255015
PowerPlex 16 HS System	Promega Corporation	DC2102
Jodek propidyny	Sigma	P4864
Rybonukleaza A z trzustki bydlęcej	Sigma	R4875
Matryca separacyjna: POP-7 Polimer	Thermofisher	4352759
UltraPure Agaroza	Fisher	16500-500
Ksylen	Fisher	X3P1GAL