Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Podsumowanie

Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.

Streszczenie

Trójwymiarowa (3D) hodowla organoidów z próbek guzów ludzkich pacjentów oraz modele ksenoprzeszczepów (PDX) raka prostaty, określane jako organoidy pochodzące od pacjentów (PDO), są nieocenionym źródłem do badania mechanizmu nowotworzenia i przerzutów raka prostaty. Ich główną zaletą jest to, że zachowują charakterystyczną genomową i funkcjonalną heterogeniczność oryginalnej tkanki w porównaniu z konwencjonalnymi liniami komórkowymi, które tego nie robią. Co więcej, hodowle 3D ChNP mogą być wykorzystywane do przewidywania skutków leczenia farmakologicznego u poszczególnych pacjentów i stanowią krok w kierunku medycyny spersonalizowanej. Pomimo tych zalet, niewiele grup rutynowo stosuje tę metodę, częściowo ze względu na rozległą optymalizację warunków hodowli PDO, które mogą być wymagane dla różnych próbek pacjentów. Wcześniej wykazaliśmy, że nasz model PDX przerzutów do kości raka prostaty, PCSD1, podsumowuje oporność przerzutów do kości dawcy na terapię antyandrogenową. Wykorzystaliśmy organoidy 3D PCSD1 do dalszego scharakteryzowania mechanizmów oporności antyandrogenowej. Po przeglądzie obecnie opublikowanych badań modeli PDX i PDO, opisujemy krok po kroku protokół hodowli 3D PDO przy użyciu kopułowych lub pływających kulek z błoną podstawną (np. Matrigel) w zoptymalizowanych warunkach hodowli. Opisano również obrazowanie in vivo ściegami i przetwarzanie komórek na potrzeby histologii. Protokół ten może być dodatkowo zoptymalizowany pod kątem innych zastosowań, w tym western blot, kokultury itp., i może być wykorzystany do zbadania cech chNP hodowanych w 3D w odniesieniu do oporności na leki, nowotworzenia, przerzutów i terapii.

Wprowadzenie

Trójwymiarowe organoidy hodowlane zwróciły uwagę ze względu na ich potencjał do podsumowania architektury in vivo, funkcjonalności komórkowej i sygnatury genetycznej ich oryginalnych tkanek^1,2,3,4,5. Co najważniejsze, organoidy 3D utworzone na podstawie tkanek nowotworowych pacjenta lub modeli ksenoprzeszczepów pobranych od pacjenta (PDX) zapewniają nieocenione możliwości zrozumienia mechanizmów sygnalizacji komórkowej po nowotworzeniu i określenia wpływu leczenia farmakologicznego na każdą populację komórek^6,7^{,8,9,10,11,12,13}. Drost et al.⁵ opracowali standardowy protokół tworzenia ludzkich i mysich organoidów prostaty, który został szeroko przyjęty w dziedzinie urologii. Ponadto włożono wiele wysiłku w dalszą charakterystykę organoidów 3D i zrozumienie szczegółowych mechanizmów nowotworzenia i przerzutów^4,12,14,15. Oprócz wcześniej ustalonego i powszechnie akceptowanego protokołu dla kultur organoidów 3D, opisujemy tutaj krok po kroku protokół dla hodowli 3D PDO przy użyciu trzech różnych metod domingu w zoptymalizowanych warunkach hodowli.

W tym manuskrypcie organoidy 3D zostały stworzone jako model ex vivo raka prostaty z przerzutami do kości (BMPC). Komórki użyte do tych hodowli pochodziły z serii Prostate Cancer San Diego (PCSD) i pochodziły bezpośrednio z tkanek nowotworowych z przerzutami do kości raka prostaty (PCSD18 i PCSD22) lub modeli guza ksenoprzeszczepu (PDX) pochodzących od pacjenta (próbki o nazwach PCSD1, PCSD13 i PCSD17). Ponieważ spontaniczne przerzuty komórek raka prostaty do kości są rzadkie w genetycznie modyfikowanych modelach mysich¹⁶, zastosowaliśmy bezpośrednie wstrzyknięcie ludzkich komórek nowotworowych do kości udowej (IF) samcom myszy Rag2^{-/-γc-/- w} celu ustalenia modeli PDX raka prostaty z przerzutami do kości¹⁷.

Po ustaleniu organoidów 3D z heterogenicznych komórek nowotworowych pacjenta lub ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta, konieczne jest potwierdzenie ich tożsamości jako komórek nowotworowych prostaty i określenie ich fenotypów w hodowlach organoidów 3D. Chemia immunofluorescencyjna (IFC) umożliwia wizualizację ekspresji białek in situ w każdej komórce, często wskazując potencjalne funkcje dla określonych populacji komórek^2,4. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły IFC dla zdecydowanej większości próbek, w tym tkanek i komórek, są proste i w pełni zoptymalizowane. Jednak gęstość komórek i liczba organoidów może być znacznie niższa niż w przypadku konwencjonalnej hodowli. W związku z tym protokół IFC dla organoidów wymaga dodatkowych kroków w celu zapewnienia prawidłowego przetwarzania i zatapiania w parafinie dla wszystkich organoidów w próbkach. Opisujemy dodatkowe kroki procesu wstępnego zatapiania agarozy oraz wskazówki dotyczące oznaczania lokalizacji podzielonych organoidów na szkiełku, co zwiększa wskaźnik sukcesu IFC na organoidach, zwłaszcza gdy próbki organoidów mają mniejszą gęstość komórek niż pożądana.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dla Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego (UCSD) (IRB). IRB #090401 Otrzymano zgodę od UCSD Institutional Review Board (IRB) na pobranie próbki chirurgicznej od pacjentów do celów badawczych. Uzyskano świadomą zgodę każdego pacjenta i uzyskano wycinek chirurgiczny raka prostaty z przerzutów do kości w wyniku ortopedycznej naprawy patologicznego złamania kości udowej. Protokoły dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone w ramach protokołu zatwierdzonego przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego (UCSD) oraz zatwierdzonego przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) #S10298. Komórki z mechanicznie i enzymatycznie zdysocjowanej tkanki nowotworowej pacjenta wstrzyknięto do kości udowej 6 do 8 tygodniowego samca Rag2^-/-; γ myszy _c^-/- zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁷. Objętość guza ksenoprzeszczepu określono za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo i pomiarów suwmiarką. Po wzroście guza do 2,0 cm (maksymalny dopuszczalny rozmiar zatwierdzony przez IACUC), guz został pobrany w celu ustanowienia organoidów 3D.

UWAGA: Rysunek 1 pokazuje przebieg tworzenia organoidów 3D oraz numer protokołu dla każdego etapu procedur eksperymentalnych.

1. Przetwarzanie tkanek nowotworowych ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta (PDX)

UWAGA: To jest pierwszy krok do stworzenia organoidów dla guza pochodzącego z mysiego modelu ksenoprzeszczepu. Protokół ten jest zaadaptowany z poprzedniej publikacji Drost et al.⁵ i zmodyfikowaliśmy warunki pożywki, aby uwzględnić suplementację surowicy do pożywek organoidowych.

1. Przetwarzaj próbkę guza zgodnie z poniższym opisem.
   1. Próbki guza należy rozdrobnić na 1-3 mm³ kawałki i trawić próbki za pomocą 10 ml roztworu do dysocjacji komórek przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Aby zakończyć trawienie, dodaj do próbek 20 ml kompletnej pożywki DMEM.
   3. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o pojemności 70 μm. Użyj sterylnego kołnierza tłoka, aby wepchnąć resztki tkanki na wierzch sitka komórkowego o wielkości 70 μm.
   4. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Umyj osad komórkowy trzykrotnie świeżą kompletną pożywką adDMEM. Dopasować objętość pożywki do przemywania i ponownego zawieszenia do objętości pożywki sugerowanej w Tabeli 3. Na przykład w przypadku hodowli na płytkach 24-dołkowych objętość prania powinna wynosić 500 μl.
      UWAGA: Jak pokazano w tabeli 3, protokół ma zastosowanie do różnych warunków hodowli.
   6. Określ końcową liczbę komórek za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego i hemocytometru.
   7. Po uzyskaniu liczby komórek ponownie zawiesić osad komórkowy w 80 μl 2% FBS w PBS na 2 x 10⁶ komórek nowotworowych.
   8. Dodaj 20 μl koktajlu zubożenia komórek myszy na 2 x 10⁶ komórek nowotworowych. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C.
   9. Dostosuj objętość do 500 μl z 2% FBS w buforze PBS na 2 x 10⁶ komórek nowotworowych.
      UWAGA: Na jednej kolumnie LS można przetworzyć do 1 x 10⁷ komórek nowotworowych w 2,5 ml zawiesiny komórkowej.
   10. Załaduj kolumny LS na magnetyczny separator kolumnowy i umieść stożkową rurkę o pojemności 15 ml na stojaku pod spodem, aby zebrać przepływ.
   11. Przepłukać każdą kolumnę 3 ml 2% FBS w buforze PBS. Wyrzuć stożkową probówkę z przepływem do płukania i zastąp nową, sterylną probówką stożkową o pojemności 15 ml.
   12. Dodaj zawiesinę komórkową (do 2,5 ml 1 x 10⁷ komórek nowotworowych) do kolumny. Zbierz przepływ, który zostanie wzbogacony o ludzkie komórki nowotworowe.
   13. Przepłukać kolumnę dwukrotnie 1 ml 2% FBS w buforze PBS.
       UWAGA: Ważne jest, aby wykonać kroki mycia, gdy tylko kolumna będzie pusta. Staraj się również unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza.
2. Odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej należy przeznaczyć na probówkę o pojemności 1,5 ml w celu uzyskania pożądanej hodowli (Tabela 3).
3. Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml przy ciśnieniu 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
4. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.

2. Przetwarzanie pierwotnych tkanek nowotworowych pacjenta

UWAGA: To jest pierwszy krok do założenia organoidów.

1. Postępuj zgodnie ze wszystkimi krokami 1 z wyjątkiem procesu wyczerpywania się komórek myszy, który nie jest konieczny do przetwarzania pierwotnych tkanek nowotworowych pacjenta.

3. Formowanie dołączonej okrągłej kopuły na płycie

UWAGA: Ten manuskrypt opisuje trzy sposoby na wykonanie kopuły z mieszaniny osadu komórkowego i błony podstawnej (np. Matrigel), jak pokazano w Rysunek 1 i Rysunek 2. W krokach 2-4 komórki i błona podstawna powinny być trzymane na lodzie, aby zapobiec zestaleniu się błony podstawnej.

1. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości błony podstawnej (np. 40 μl) dla zestawu płytek 24-dołkowych (tabela 3).
2. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są dobrze zawieszone w błonie podstawnej.
3. Odpipetować odpowiednią objętość (Tabela 3) mieszaniny błony komórkowej i podstawnej (i opcjonalnie 10 μl kompletnej pożywki adDMEM) do środka wstępnie podgrzanej płytki do hodowli tkankowej.
4. Odwrócić płytkę i natychmiast umieścić ją do góry nogami w inkubatorze do hodowli komórkowych CO₂ ustawionym na 5% CO₂ , 37 °C na 15 minut. Zapobiega to osiadaniu komórek i przyleganiu do dna płytki, jednocześnie umożliwiając zestalenie się błony podstawnej.
5. Odpipetować odpowiednią objętość (Tabela 3) wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 μM dichlorowodorku Y-27632 do każdej studzienki.
6. Umieścić płytkę prawą stroną do góry w inkubatorze do hodowli komórkowych CO₂ (5% CO₂, 37 °C).
7. Zmieniaj nośnik co 3-4 dni. Po 5-7 dniach użyj pożywki hodowlanej bez 10 μM dichlorowodorku Y-27632 w celu utrzymania kultur.

4. Formowanie pływającej kopuły z dołączonej okrągłej kopuły na płycie

1. Po kroku 3.7 odłącz kopułę za pomocą skrobaka do komórek.

5. Formowanie pływających koralików

UWAGA: Ten protokół nazywa się pływającymi koralikami, ponieważ mieszanina membrany podstawnej, mediów i organoidów wygląda jak koraliki.

1. Wytnij kawałek folii parafinowej o wymiarach 2 cale x 4 cale.
2. Umieść folię parafinową na wgłębieniach pustego stojaka na końcówki z plastikowego pudełka na końcówki o pojemności 1000 μl.
3. Delikatnie dociśnij folię parafinową, aby obrysować wgłębienia za pomocą palca wskazującego w rękawiczce, ale bez przebijania się przez folię parafinową.
4. Spryskaj folię parafinową 70% etanolem i włącz lampę UV w kapturze do hodowli komórkowych, aby sterylizować przygotowaną folię parafinową przez co najmniej 30 minut.
5. Przygotować mieszaninę komórek i 20 μl błony podstawnej. Gęstość wysiewu może wynosić 50 000 - 250 000 komórek na kopułę.
6. Odpipetować mieszaninę komórek przetworzonych z etapu 1 lub 2 i 20 μl błony podstawnej do formy divot utworzonej w przygotowanym filmie parafinowym.
7. Zawiesić osad komórkowy w błonie podstawnej i odpipetować zawiesinę komórek w przygotowanych wgłębieniach pokrytych parafiną.
8. Umieść zestalone kulki i folię parafinową na 6-dołkowej płytce. W jednym dołku w płytce 6-dołkowej może zmieścić się do 5 koralików.
9. Odpipetować 3-5 ml wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 μM dichlorowodorku Y-27632 do każdej studzienki, delikatnie strzepując kulki z filmu parafinowego.
   UWAGA: Jako minimalną objętość zalecane jest 3 ml. Dla maksymalnej liczby kulek (N=5) na studzienkę zaleca się 5 ml podłoża.
10. Umieścić płytkę w inkubatorze CO₂ (5% CO₂ , 37 °C).
11. Zmieniaj pożywkę organoidową co 3-4 dni. Po 5-7 dniach użyj pożywki hodowlanej bez 10 μM dichlorowodorku Y-27632 w celu utrzymania kultur.

6. Łączenie obrazów organoidów in vivo za pomocą mikroskopu⁸

UWAGA: Niektóre mikroskopy nie są w stanie dotrzeć do zewnętrznego obwodu płytki komórkowej (ściany krawędziowej); dlatego sugerujemy używanie studzienek blisko obwodu płytki komórkowej podczas łączenia obrazów.

1. Umieść płytkę do hodowli komórkowej w pozycji skierowanej do góry w uchwycie płytki w mikroskopie Keyence.
2. Umieść soczewkę na środku kopuły celu.
3. Skonfiguruj automatyczny proces zszywania, wybierając liczbę klatek. Na przykład można wybrać 3 x 3 lub 5 x 5, aby wygenerować 9 obrazów lub łącznie 25 obrazów.
4. Naciśnij przycisk przechwytywania, aby rozpocząć proces obrazowania.
5. Otwórz oprogramowanie przeglądarki obrazów i załaduj grupę obrazów wykonanych w kroku 4.
6. Kliknij opcję Zszywanie obrazów, aby utworzyć zszyty obraz o wysokiej rozdzielczości.
   UWAGA: Przechwytywanie obrazów seryjnych 9 lub 25 można wykonać ręcznie lub automatycznie w celu ustawienia ostrości komórek.

7. Przetwarzanie organoidów do histologii: metoda odwirowania agarozy

UWAGA: Ten protokół jest adaptacją poprzedniej publikacji Vlachogiannis et al.⁷. Dodaliśmy krok polegający na osadzaniu agarozy, aby z powodzeniem osadzić wszystkie populacje organoidów.

1. Usuń istniejące media ze studni. Uważaj, aby nie zasysać kopuł membrany podstawnej.
2. Dodać równą (równą objętości pożywki usuniętej z kroku 1) objętość roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
3. Usuń kopułę membrany podstawnej za pomocą pipety i zmiażdż kopułę membrany podstawnej za pomocą końcówki pipety. Zebrać zdysocjowaną kopułę i roztwór do odzyskiwania komórek w probówce o pojemności 1,5 ml.
4. Wirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min.
5. Usunąć supernatant (roztwór do odzyskiwania komórek). Zachować wszystkie supernatanty w oddzielnych probówkach do końca, gdy obecność organoidów zostanie potwierdzona na ostatnim etapie granulowania.
6. Dodać żądaną objętość (Tabela 3) zimnego PBS i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby mechanicznie zakłócić osad
.
7. Wirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min.
8. Usunąć supernatant (PBS).
9. Utrwalić osad w dopasowanej objętości (np. 500 μl na jeden osad z 24-dołkowej hodowli na płytce, tabela 3) 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
10. Po utrwaleniu odwirować przy ciśnieniu 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
11. Usunąć supernatant (PFA).
12. Przemyć odpowiednią objętością (np. 500 μl na jeden osad z 24-dołkowej hodowli na płytkach, tabela 3) PBS i odwirować przy 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min.
13. Przygotuj ciepłą agarozę (2% agarozy w PBS).
    UWAGA: W tym przypadku granulki komórkowe do zamrożonych odcinków mogą być bezpośrednio ponownie zawieszone w 200 μl związku OCT bez dalszych kroków w Protokole 7.
14. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl agarozy (2% w PBS).
    1. Natychmiast po dodaniu agarozy delikatnie oderwać osad komórkowy od ścianki probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml. Jak pokazano w Rysunek 3, jeśli osad komórkowy nie jest fizycznie oderwany od ścianki probówki o pojemności 1,5 ml, istnieje ryzyko utraty całości lub części osadu komórkowego podczas procesu zatapiania agarozy.
15. Poczekaj, aż 2% agaroza w PBS całkowicie się zestali.
16. Odłączyć zestalony blok agarozy od probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
17. Przenieść odłączony blok agarozy zawierający osad komórkowy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
18. Napełnij probówkę 70% EtOH i kontynuuj, stosując konwencjonalny protokół odwadniania tkanek i zatapiania parafiny.

8. Histologia i cytochemia immunofluorescencyjna (IFC) organoidów

1. Wybierz slajdy do histologii lub IFC.
2. Przed rozpoczęciem procesu barwienia dowiedz się, gdzie znajdują się komórki na szkiełku i narysuj okrąg wokół komórek na szkiełku za pomocą markera.
3. Narysuj obwód wokół krawędzi lub krawędzi szkiełka oraz miejsca, w których znajdują się okręgi na szkiełku w zeszycie laboratoryjnym, aby zapisać ich położenie.
4. Wykonaj żądane barwienie.
   UWAGA: Podczas tego procesu zaznaczone kółka znikają, ponieważ zwykły ekspres nie jest odporny na chemikalia. Nawet niektóre markery histologiczne mogą zostać usunięte podczas procesu barwienia.
5. Po procesie barwienia umieść szkiełko nad rysunkiem w zeszycie laboratoryjnym, aby znaleźć lokalizacje komórek na szkiełku.

Wyniki

3D organoidy zostały pomyślnie stworzone na podstawie modelu ksenoprzeszczepu (PDX) przerzutowego raka prostaty (BMPC) do kości, jak również bezpośrednio z tkanki raka prostaty z przerzutami do kości pacjenta (Rysunek 4). Krótko mówiąc, nasze modele PDX BMPC zostały ustalone przez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do kości udowej (IF) samcom myszy Rag2^-/- c^-/-, a następnie guzy PDX zostały pobrane i przetworzone zgodnie z opisem w tym manuskrypcie. Jak pokazano w

Dyskusja

Organoidy 3D pochodzące z komórek raka prostaty z przerzutami do kości pacjenta są nadal stosunkowo rzadkie. W tym miejscu opisujemy strategie i dalej zoptymalizowany protokół do pomyślnego ustanowienia seryjnych organoidów 3D pochodzących od pacjentów (PDO) BMPC. Ponadto opisano protokoły zabezpieczania organoidów w próbkach o mniejszej gęstości komórek do analizy IFC i IHC. Zróżnicowane fenotypy w postaci torbieli, sferoid i bardziej złożonych organoidów wskazują, że protokół ten zapewnia warunki hodowli, które pozwala...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 ml Pipettman	Gilson	F123602
1 ml Strzykawka	BD	329654
probówka 1,5 ml	Spectrum Lab Products	941-11326-ATP083
Igła 25G	BD PrecisionGlide	305122
4% paraformaldehydu (PFA)	Alfa Aesar	J61899
70% etanolu (EtOH)	VWR	BDH1164-4LP
A83-01	Tocris Bioscience	2939
Accumax	Innowacyjne technologie komórkowe, Inc.	AM105
adDMEM	Life Technologies	12634010
Agarose	Lonza	50000
Przeciwciało -dla cytokeratyny 5	Przeciwciało 905901
Biolegend dla cytokeratyny 8	Biolegend	904801
B27	Life Technologies	17504044
System obrazowania bioluminescencyjnego, IVIS 200	Perkin Elmer Inc	IVIS 200
Płytka do hodowli komórkowych - 24-dołkowa	Costar	3524
- 48-dołkowa	Costar	3548
- 6-dołkowa	Costar	3516
, Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
Roztwór do odzyskiwania komórek	Corning	354253
Skrobak do komórek	Sarstedt	83.180
Sitko do komórek	Falcon (Corning)	352350
Inkubator CO2	Fisher Scientific	3546
DAPI	Vector Vectashield	H-1200
DHT	Sigma-Aldrich	D-073-1ML
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Gemini Bio-Products	100-106
FGF10	PeproTech	100-26
FGF2	Kleszcze PeproTech	100-18B
	Denville Scientific	S728696
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
LS Kolumny	Miltenyi	130-0420401
Magnetyczny separator kolumn: Separator QuadroMACS	Miltenyi	130-090-976
Marker	VWR	52877-355
Matrigel (Obniżony współczynnik wzrostu)	Mediatech Inc. (Corning)
Matrigel (wysokie stężenie)	BD (Fisher Scientific)	CB354248
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopem, Keyence	BZ-X800 (najnowsze oprogramowanie) BZ-X700 (stare oprogramowanie)
Mikroskop, Keyence	BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)
Zestaw do zmniejszania liczby komórek myszy	Miltenyi	130-104-694
N-acetylocysteina	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nikotynamid	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Noggin	PeproTech	120-10C
OCT	Compound Tissue-Tek	4583
Parafilm	American National Can	N/A
Pen-Strep	Mediatech Inc. (Corning)	30-002-CI-1
Końcówki do pipet na 1 ml (niebieskie końcówki)	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
Tłok (od strzykawki 3 ml)	Strzykawka BD	309657
Prostaglandyna E2	Tocris Bioscience	2296
R-Spondin 1	Trevigen	3710-001-01
SB2021190	Sigma-Aldrich	S7076-25MG
Mały blat Wirówka	ThermoFisher Scientific	75002426
Kąpiel Wodna	Fisher Sci	2320
Y-27632 Dichlorowodorek	Abmole	Bioscience M1817