Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Summary

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Abstract

Organoidy ludzkiego mózgu różniące się od embrionalnych komórek macierzystych oferują unikalną możliwość badania skomplikowanych interakcji wielu typów komórek w systemie trójwymiarowym. Tutaj przedstawiamy stosunkowo prostą i niedrogą metodę, która daje organoidy mózgowe. W tym protokole ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste są rozbijane na małe klastry zamiast pojedynczych komórek i hodowane w podstawowych pożywkach bez heterologicznej macierzy błony podstawnej lub egzogennych czynników wzrostu, co pozwala wewnętrznym sygnałom rozwojowym kształtować wzrost organoidu. Ten prosty system wytwarza różnorodne typy komórek mózgowych, w tym komórki glejowe i mikroglejowe, komórki macierzyste i neurony przodomózgowia, śródmózgowia i tyłomózgowia. Organoidy wygenerowane za pomocą tego protokołu wykazują również cechy właściwej organizacji czasowej i przestrzennej, o czym świadczą obrazy w jasnym polu, histologia, immunofluorescencja i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Ponieważ te organoidy zawierają typy komórek z różnych części mózgu, mogą być wykorzystywane do badania wielu chorób. Na przykład w niedawnym artykule wykazaliśmy wykorzystanie organoidów wygenerowanych z tego protokołu do badania wpływu hipoksji na ludzki mózg. Podejście to można wykorzystać do zbadania szeregu trudnych do zbadania schorzeń, takich jak upośledzenia neurorozwojowe, zaburzenia genetyczne i choroby neurologiczne.

Introduction

Z powodu niezliczonych praktycznych i etycznych ograniczeń, badanie ludzkiego mózgu było bardzo trudne. Podczas gdy badania z wykorzystaniem gryzoni miały kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia ludzkiego mózgu, mózg myszy ma wiele różnic^1,2. Co ciekawe, myszy mają gęstość neuronów co najmniej 7 razy mniejszą niż mózg naczelnych^3,4. Chociaż z ewolucyjnego punktu widzenia naczelne są bliższe ludziom niż gryzonie, praca z nimi nie jest praktyczna dla większości badaczy. Celem tego protokołu było podsumowanie wielu ważnych cech ludzkiego mózgu przy użyciu uproszczonej i tańszej metody bez konieczności stosowania heterologicznej macierzy błony podstawnej lub egzogennych czynników wzrostu, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności komórek mózgowych i organizacji komórkowej.

Praca formatywna z laboratorium Sasai wykorzystała metodę hodowli ciał embrionalnych bez surowicy (SFEBq) do wygenerowania dwu- i trójwymiarowych typów komórek neuronalnych z sygnalizowanych embrionalnych komórek macierzystych (ESC)5^,6. Wiele metod organoidów ludzkiego mózgu podążało stosunkowo podobną ścieżką od sygnalizowanych ESCs^7,8. W przeciwieństwie do tego, protokół ten rozpoczyna się od klastrów odłączonych ludzkich ESC (hESC), podobnie jak początkowe etapy przełomowych prac laboratoriów Thomsona i Zhanga przed etapami posiewu^9,10, a także początkowy etap protokołu organoidów mózgowych laboratorium Pasca przed dodaniem egzogennych czynników wzrostu¹¹. Matryce błony podstawnej (np. Matrigel) były wykorzystywane w wielu protokołach organoidów mózgowych i wykazano, że są skutecznym rusztowaniem ⁸. Jednak najczęściej stosowane matryce membran podstawnych nie są pozbawione komplikacji, ponieważ współoczyszczają się z nieznanymi ilościami czynników wzrostu ze zmiennością między partiami podczas produkcji¹². Ponadto matryce te mogą komplikować obrazowanie oraz zwiększać ryzyko zanieczyszczenia i kosztów.

Chociaż organoidy ludzkiego mózgu mogą być używane do odpowiadania na wiele pytań, istnieją pewne ograniczenia, o których należy pamiętać. Po pierwsze, począwszy od embrionalnych komórek macierzystych, organoidy bardziej przypominają niedojrzałe mózgi niż starzejące się mózgi i jako takie mogą nie być idealnymi modelami chorób występujących w starszym wieku, takich jak choroba Alzheimera. Po drugie, podczas gdy nasz protokół znalazł markery rozwoju przodomózgowia, śródmózgowia i tyłomózgowia, które są przydatne do badania wpływu leczenia lub choroby na komórki z wielu regionów mózgu jednocześnie, inne protokoły można stosować, aby skoncentrować się na określonych regionach mózgu^13,14. Wreszcie, kolejnym ograniczeniem modeli organoidów jest rozmiar, podczas gdy średnia długość ludzkiego mózgu wynosi około 167 mm, organoidy mózgowe wykonane za pomocą pobudzenia dorastają do 4 mm⁸, a organoidy utworzone przez ten protokół rosną do 1-2 mm w ciągu 10 tygodni. Niemniej jednak protokół ten stanowi ważne narzędzie do badania ludzkiej tkanki mózgowej i interakcji wielu typów komórek.

Protocol

1. Utrzymanie komórek macierzystych

1. Utrzymuj hESC H9 na warstwie matrycy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (patrz Tabela materiałów, odtąd nazywana po prostu matrycą) zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Aby pokryć jedną płytkę 6-dołkową lub jedno 10-centymetrowe naczynie, połącz 100 μl matrycy z 5,9 ml lodowatego zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM)/F12 firmy Dulbecco. Owinąć płytki folią parafinową i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Stosować je następnego dnia do pasowania komórek po odessaniu nadmiaru matrycy/podłoża.
2. Hoduj komórki z tygodnia na tydzień w proporcji około 1:12 co 7 dni. Utrzymuj komórki za pomocą pożywki mTESR-1 w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 °C (5%_O2, 5% CO₂). Codziennie odświeżaj multimedia. Odchwaszczaj komórki różnicujące z kultury między przejściami za pomocą szklanych narzędzi.
3. Komórki H9 powinny być pasażowane od czterech do sześciu dni przed wykorzystaniem ich do produkcji organoidów. Komórki powinny być pasażowane w stosunku około 1:8 skupisk komórek. Aby to zrobić, zacznij od przepłukania komórek pożywką DMEM F12 i dysocjacji komórek za pomocą neutralnej proteazy (np. Dyspazy, odtąd nazywanej po prostu proteazą), przepłucz DMEM / F-12 i umieść je w 30-60 skupiskach komórek na 4 płytkach (6-dołkowych lub 10 cm) przy ~20% konfluencji. Dwa dni przed zbiorem przenieś je do zwykłego inkubatora (21%_O2, 5% CO₂). Płytki powinny osiągnąć ~80% zbiegu po rozpoczęciu tworzenia organoidów.

2. Dysocjacja komórek macierzystych w hodowli organoidów

1. Podwielokrotnić roztwór podstawowy proteazy (5 j./ml).
   UWAGA: Zazwyczaj zamrażamy 1 ml porcji w temperaturze -20 °C do stosowania przez kilka miesięcy.
2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy proteazy do stężenia roboczego, dodając 1 ml roztworu podstawowego plus 5 ml DMEM/F12 na każdą 6-dołkową lub 10-centymetrową płytkę hESC.
3. Odessać i usunąć pożywkę do hodowli komórkowych, a następnie przykryć hESC roztworem proteazy. Umieść płytki w inkubatorze na 10-15 minut lub do momentu, gdy krawędzie kolonii zaokrąglą się i zaczną oddzielać się od matrycy.
4. Przechylić płytkę, odessać roztwór proteazy i delikatnie umyć komórki trzykrotnie DMEM/F12. Stosować 2 ml / dołek do każdego mycia w przypadku płytki 6-dołkowej i 6 ml w przypadku płytki 10 cm. Upewnij się, że kolonie pozostają przyczepione do matrycy podczas wykonywania tego kroku.
5. Dodać z powrotem około 1,5 ml świeżej pożywki mTESR do każdego dołka (lub 5 ml w przypadku płytki 10 cm) i spłukać komórki z płytki za pomocą delikatnego pipetowania.
6. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml delikatnie zassać i dozować hESC w płytce, aż osiągną około 1/30 części swojego pierwotnego rozmiaru. Klastry kolonii powinny przypominać kwadraty o rozmiarach ~250-350 μm po zakończeniu tych kroków.

3. Generacja organoidów

1. Przenieś komórki do pojedynczej kolby T75 o bardzo niskim przyłączeniu zawierającej 30 ml pożywki mTESR bez podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
2. Następnego dnia przechyl kolbę (kolby) tak, aby żywe komórki zebrały się w rogu (może to zająć 5-10 minut pierwszego dnia, ale będzie szybsze w miarę powiększania się klastrów).
   UWAGA: Jeżeli na tym etapie lub w którymkolwiek kolejnym etapie do dna kolby przylega duża liczba komórek, należy przenieść komórki do nowej kolby. To normalne, że przez pierwsze dwa dni występuje duża liczba martwych komórek. Podczas wymiany nośnika należy usunąć jak najwięcej resztek komórek.
3. Gdy komórki osiądą, odessaj pożywkę i martwe komórki, pozostawiając około 10 ml pożywki zawierającej żywe komórki.
4. Dodaj ~20 ml pożywki o niskiej zawartości bFGF (DMEM/F12 uzupełniony 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamina, 1x NEAA, 0,05% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1 mM monotioglicerolu (MTG) uzupełniony 30 ng / ml bFGF).
5. Sprawdź komórki w dniu 2. Jeśli większość komórek wygląda zdrowo i jasno, nie ma potrzeby nic robić. Jeśli jednak więcej niż jedna trzecia komórek wydaje się ciemna, zastąp pożywkę (przy użyciu tej samej techniki przechylania, co w kroku 3.2) ~20 ml pożywki o niskiej zawartości bFGF uzupełnionej 20 ng/ml bFGF.
6. W dniu 3 należy zastąpić połowę pożywki (stosując technikę przechylania w kroku 3.2) 20 ml pożywki o niskiej zawartości bFGF uzupełnionej 10 ng/ml bFGF.
7. W 5 dniu zastąp połowę pożywki (stosując technikę przechylania w kroku 3.2) 20 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NIM: DMEM/F12, 1x suplement N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/ml heparyny).
   UWAGA: Jeśli istnieją jakiekolwiek duże skupiska komórek lub organoidów, które są znacznie większe niż inne, należy je usunąć z hodowli. Rozmiar szacuje się na podstawie wyglądu pod mikroskopem; Na przykład za pomocą okularu z siatką celowniczą. Większość organoidów ma podobne rozmiary (około 100 ± 20 μm). Usunęliśmy organoidy, które były około 2 razy mniejsze lub większe od pozostałych.
8. Połowę pożywki (~15 ml) (przy użyciu techniki przechylania) należy wymieniać na NIM co drugi dzień.
9. Po 3 tygodniach w hodowli dodaj 100x penicyliny/streptomycyny do pożywki (NIM: DMEM/F12, 1x suplement N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/ml heparyny) w końcowym stężeniu 1x, jeśli jest to pożądane. Odświeżaj nośnik co drugi dzień.
   UWAGA: W ten sposób utrzymywaliśmy organoidy przez okres do 6 miesięcy w hodowli.

4. Ekstrakcja i przygotowanie RNA

1. Delikatnie wyekstrahować około 15 organoidów (w zależności od wielkości) z kolby za pomocą pipety o pojemności 10 ml i umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml.
   1. Delikatnie otocz organoidy w wirówce (200 x g przez 1 min) i trzykrotnie spłucz 1x PBS (DPBS) firmy Dulbecco.
2. Ekstrakcja RNA przy użyciu zwalidowanego systemu lub protokołu (np. zestawu RNeasy).
3. Zmierzyć wartość gęstości optycznej każdej próbki przy długości fali 260 i 280 nm.
4. Przygotuj cDNA przy użyciu zwalidowanego systemu lub protokołu (np. zestawu do syntezy cDNA iScript).
5. Wykonaj qRT-PCR przy użyciu wstępnie zwalidowanych starterów (Tabela 1), w tym co najmniej jednego genu porządkowego.

5. Immunohistochemia

1. Utrwalenie
   1. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) i umieścić go w temperaturze 4 °C.
   2. Za pomocą sterylnej maszynki do golenia odetnij końcówkę sterylnej pipety do przenoszenia.
   3. Delikatnie ekstrahuj organoidy za pomocą wyciętej pipety transferowej, ponieważ można je łatwo rozbić, zwłaszcza gdy rosną, i umieść je na 6-dołkowej płytce z dodatkowymi pożywkami lub DPBS.
   4. Przechyl płytkę, zassaj nośnik i zastąp go 1x DPBS. Wypłucz komórki 1x DPBS jeszcze dwa razy.
   5. Zastąp DPBS 4% roztworem PFA i umieść na wytrząsarce w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Chociaż ustaliliśmy czas na 2 dni (dla małych organoidów) do 7 dni (dla organoidów >3 miesiące), możliwe są również krótsze czasy (np. 16-24 godziny).
   6. Przygotować 30%, 20% i 10% roztwory sacharozy w DPBS.
   7. Po utrwaleniu w PFA zastąpić 10% roztworem sacharozy i umieścić na wytrząsarce w temperaturze 4 °C na 24 godziny.
   8. Zastąp 10% sacharozę 20% sacharozą i umieść na shakerze w temperaturze 4 °C na 24 godziny.
   9. Zastąp 20% sacharozy 30% sacharozą i umieść na shakerze w temperaturze 4 °C na 24 godziny.
2. Sekcje zamrożone
   1. Przygotuj płaską warstwę suchego lodu i umieść na niej opisaną plastikową foremkę.
   2. Wlej cienką warstwę medium o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do formy i pozwól jej zacząć twardnieć (w ciągu kilku sekund).
   3. Umieść kilka organoidów na wierzchu OCT w formie za pomocą pipety transferowej z odciętą końcówką i zwróć szczególną uwagę na położenie organoidów.
   4. Powoli dodawaj OCT, aż forma będzie pełna, a organoidy pokryte. Pozwól mu całkowicie stwardnieć przez dodatkowe 10 minut.
      UWAGA: Podczas gdy zamrażanie przez ponad 10 minut pomaga zapewnić idealne względne rozmieszczenie wielu organoidów do cięcia, możliwe jest użycie mieszanki etanolu i suchego lodu lub ciekłego azotu w celu szybszego zamrożenia.
   5. Zaznacz względne położenie organoidów markerem, aby ułatwić ich znalezienie podczas cięcia.
   6. Umieść foremki w torbie lub pudełku i przechowuj w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do cięcia sekcji.
   7. Za pomocą kriostatu pokrój skrawki 10 μm i umieść tkankę na oznakowanych, dodatnio naładowanych szkiełkach.
3. Barwienia
   1. Przygotować roztwór blokujący (0,3% Triton X-100, 4% normalna surowica osła w PBS).
   2. Użyj hydrofobowego pisaka papkowego, aby narysować wokół obwodu tkanki.
   3. Przepłukać szkiełka PBS 3 razy po 5 minut każde.
   4. Zastąp PBS roztworem blokującym na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   5. Zastąpić roztwór blokujący roztworem przeciwciała (przeciwciało o odpowiednim stężeniu, 0,1% Triton X-100, 4% normalna surowica osła w PBS) w temperaturze 4 °C przez noc.
   6. Następnego dnia umyj szkiełko 3 razy PBS przez 10 minut każde.
   7. Zastąp PBS odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym (o odpowiednim stężeniu) rozcieńczonym w roztworze przeciwciała przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   8. Płukać 3 razy przez 10 minut za każdym razem za pomocą 1x PBS.
   9. Nałóż barwnik 4',6-diamidino-2-fenyloindolowy (DAPI) i spłucz trzy razy przez 10 minut za pomocą 1x PBS.
   10. Szkiełka nakrywkowe przymocować do przedniej części szkiełek za pomocą roztworu montażowego, pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w ciemności i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.

Results

Rysunek 1 pokazuje reprezentatywne obrazy w jasnym polu kilku punktów czasowych, aby pokazać, jak wyglądają komórki/organoidy na różnych etapach protokołu. HESC usunięto z płytki do hodowli tkankowej, rozbito na małe kawałki i umieszczono w kolbie T75 o bardzo niskim przyłączeniu, gdzie uformowały kulki. Ważne jest, aby zauważyć, że komórki wyglądają na jasne i podobnej wielkości, bez ciemnych, umierających komórek w centrach tych skupisk. Komórki były stopniowo odzwyczajane od bFGF. W 5 dni...

Discussion

Podobnie jak inne modele organoidów, jest to sztuczny system, który ma kilka zastrzeżeń. Chociaż różnice między partiami pod względem ogólnych poziomów ekspresji były niewielkie, poszczególne organoidy wykazywały różnice. Na przykład lokalizacja obszarów dodatnich Sox-2 nie była identyczna w każdym organoidzie (ryc. 3). Chociaż qPCR jest odpowiedni do poszukiwania ogólnych zmian w partiach komórek, dodatkowe techniki, takie jak sekwencja RNAseq pojedynczej komórki, zostaną wykorzystane w przyszłych badan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 koza anty-mysz	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 koza anty-królik	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Suplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	Mikroskop A9647
BX43	Olympus, Shinjuku, Tokio, Japonia
Barwienie DAPI	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
Przeciwciało GFAP	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESC	WiCell, Madison, WI, Stany Zjednoczone	WA09
Heparyna	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, Stany Zjednoczone	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamina	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, Stany Zjednoczone	11140-050
Normalna surowica osła (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
Maszyna qPCR	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, Stany Zjednoczone	1855196
Zestaw RNeasy	Qiagen, Hilden, Niemcy	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	Mikroskop AB5603
TMS-F	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Termosy T75 o bardzo niskim nasadce	Corning, Corning, Nowy Jork, USA	3814