Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Podsumowanie

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Streszczenie

Ludzka endometrium jest jedną z najbardziej reagujących hormonalnie tkanek w organizmie i jest niezbędna do zajścia w ciążę. Tkanka ta może również ulec chorobie i spowodować zachorowalność, a nawet śmierć. Systemy modelowe do badania biologii endometrium człowieka zostały ograniczone do systemów hodowli in vitro pojedynczych typów komórek. Ponadto komórki nabłonkowe, jeden z głównych typów komórek endometrium, nie rozmnażają się dobrze ani nie zachowują swoich cech fizjologicznych w hodowli, a zatem nasza wiedza na temat biologii endometrium pozostaje ograniczona. Po raz pierwszy udało nam się wygenerować organoidy endometrialne, które składają się zarówno z komórek nabłonkowych, jak i zrębowych ludzkiego endometrium. Te organoidy nie wymagają żadnych egzogennych materiałów rusztowań i specjalnie organizują się tak, że komórki nabłonkowe obejmują strukturę podobną do sferoidy i stają się spolaryzowane z komórkami zrębu w środku, które wytwarzają i wydzielają kolagen. Receptory estrogenowe, progesteronowe i androgenowe ulegają ekspresji w komórkach nabłonka i zrębu, a leczenie fizjologicznymi poziomami estrogenu i testosteronu sprzyja organizacji organoidów. Ten nowy system modelowy może być wykorzystany do badania prawidłowej biologii i chorób endometrium w sposób, który wcześniej nie był możliwy.

Wprowadzenie

Ludzki endometrium wyściela jamę macicy i służy jako pierwszy kontakt dla zarodka podczas implantacji. Endometrium składa się z komórek nabłonka światła i gruczołowego, podporowych fibroblastów zrębu, komórek śródbłonka i komórek odpornościowych. Razem te typy komórek tworzą tkankę endometrium, która jest jedną z najbardziej wrażliwych tkanek na hormony steroidowe płci ¹. Zmiany, które zachodzą podczas każdego cyklu miesiączkowego, są uderzające. Odpowiedni wzrost i przebudowa błony śluzowej macicy, aby umożliwić zagnieżdżenie się zarodka. Nieprawidłowa reakcja na estrogen i progesteron może skutkować opornym na leczenie endometrium, które nie pozwala na pomyślne zajście w ciążę, a nawet może prowadzić do chorób, w tym neoplazji endometrium.

W celu zbadania odpowiedzi hormonalnych i istotnych zmian zachodzących w endometrium, komórki z tkanek endometrium pobranych od pacjentek podczas operacji lub biopsji endometrium zostały namnażone w hodowli komórkowej. Komórki zrębu endometrium preferencyjnie proliferują i łatwo się rozmnażają, a proces różnicowania indukowany przez progesteron można podsumować in vitro. W rezultacie, wiele się nauczyliśmy podczas tego procesu różnicowania, określanego jako decydualizacja^2,3. Drugi główny typ komórek w endometrium, komórki nabłonka światła i gruczołowe, nie rosną jednak dobrze jako tradycyjne monowarstwy, tracąc polarność, starzejąc się i mając ograniczony potencjał proliferacyjny. W rezultacie mniej wiadomo o ich biologii i roli w ludzkim endometrium. Ponieważ wiele nowotworów wywodzi się z komórek nabłonkowych, mechanizmy związane z hiperplazją lub transformacją w komórki rakowe pozostają do pełnego zdefiniowania. Ponadto badania wykazały, że odpowiedź hormonalna obejmuje intymne działania parakrynne między komórkami nabłonkowymi i zrębowymi endometrium^4,5.

Niedawno, trójwymiarowa (3D) hodowla organoidów komórek nabłonka endometrium została założona przez dwie niezależne grupy^6,7, które są pierwszymi doniesieniami o organoidach utworzonych z tkanki endometrium. Organoidy te składały się z komórek nabłonka endometrium osadzonych w macierzy białkowej (tabela materiałów) i nie zawierały ważnego przedziału hormonalnego endometrium, fibroblastów zrębu. Ponieważ białka macierzy mogą się różnić w zależności od partii i mogą uruchamiać szlaki sygnałowe, które niekoniecznie występują w tkance, idealnym rozwiązaniem byłoby zastąpienie białek macierzy składnikami endometrium. W niniejszym badaniu przedstawiono protokół generowania wolnych od rusztowań ludzkich organoidów endometrialnych komórek nabłonka i zrębu ludzkiego endometrium. Obecność komórek zrębu nie tylko zapewnia wsparcie dla komórek nabłonkowych, ale także zapewnia niezbędne działania parakrynne, które zostały uznane za ważne dla odpowiedzi hormonalnej endometrium^4,8,9.

Nowy wielokomórkowy organoid endometrium oferuje system modelowy endometrium, który jest prosty do wygenerowania i który zawiera zarówno komórki nabłonkowe, jak i zrębowe. Te organoidy mogą być wykorzystywane do badania długoterminowych zmian hormonalnych i wczesnych zdarzeń chorobowych, takich jak nowotworzenie z powodu braku równowagi hormonalnej lub egzogennych urazów. Złożoność tych organoidów może ostatecznie zostać rozszerzona o inne typy komórek, w tym komórki śródbłonka i układu odpornościowego z prawdopodobnie komórkami mięśniówki macicy, aby naprawdę naśladować fizjologię tkanek ludzkich.

Protokół

Próbki endometrium zostały pobrane od kobiet przed menopauzą poddanych rutynowej histerektomii z powodu łagodnych chorób macicy w Northwestern University Prentice Women's Hospital, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board. Uzyskano pisemną zgodę od wszystkich kobiet włączonych do badania.

1. Przygotowanie form agarozowych

1. Przed rozpoczęciem izolacji komórek należy odlać i zrównoważyć 1,5% mikroformy agarozowe (tabela materiałów), aby pomieścić organoidy zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Generacja organoidów endometrialnych

1. Zbierz pierwotne komórki zrębu i nabłonka
   1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu techniki aseptycznej przygotować roztwór enzymu (2,5 mg/ml kolagenazy typu I + 0,1 mg/ml DNazy I w 10 ml dypazy [500 jednostek]) w temperaturze 37 °C i sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu techniki aseptycznej zeskrob endometrium z biopsji macicy i zmiel tkankę pod kapturem na bardzo małe kawałki za pomocą skalpela.
      nuta: Tkanka endometrium o wymiarach co najmniej 20 mm x 10 mm x 1 mm jest wymagana do wytworzenia wystarczającej liczby organoidów.
   3. Umieść świeżo zmieloną tkankę w roztworze enzymu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Zamknij nakrętkę i owiń górę folią woskową (tabela materiałów), aby zapobiec zanieczyszczeniu.
   4. Umieścić probówkę z chusteczką w łaźni wodnej lub inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut, delikatnie wstrząsając (80−100 obr./min).
   5. Ułóż sitko o pojemności 100 μm na sitku o pojemności 20 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przefiltrować roztwór przez dwa sitka, a następnie przepłukać stożkową probówkę o pojemności 15 ml 10 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS; Tabela materiałów) i przełóż płukanie przez sitko, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.
      nuta: Płyn przepływowy zawiera komórki zrębu i czerwone krwinki (łącznie ~20 ml). Komórki nabłonka zbiera się na sitku o średnicy 20 μm. Kawałki niestrawionej tkanki pozostają na wierzchu sitka o średnicy 100 μm. Wyrzuć niestrawioną tkankę do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.
   6. Odwrócić sitko o wielkości 20 μm z kroku 2.1.5 do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zmyć komórki nabłonka z sitka za pomocą 20 ml pożywki organoidowej (tabela materiałów) uzupełnionej 1% wstrzykiwaczem/paciorkowiec.
   7. Odwirować stożkowe probówki z etapów 2.1.5 i 2.1.6 przy 500 x g przez 5 minut.
   8. Z zebranymi komórkami zrębu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 10 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10-15 min. Odwirować stożkową probówkę przy 500 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 200−300 μl pożywki organoidowej (dalsze instrukcje znajdują się w kroku 2.2.2).
   9. Po zebraniu komórek nabłonka usunąć supernatant i ponownie zawiesić ze 100 μl pożywki organoidowej (dalsze instrukcje znajdują się w kroku 2.2.2).
2. Komórki wysiewające
   1. Po zrównoważeniu 1,5% form agarozy w studzienkach (1 pleśń na studzienkę) płytki 24-dołkowej, należy usunąć pożywkę organoidową na zewnątrz form agarozowych i przechylić płytkę do hodowli tkankowej tak, aby można było również ostrożnie usunąć pożywkę z komory wysiewu komórek szalek agarozowych.
   2. Zobacz zawiesiny komórek nabłonka (od kroku 2.1.9) i zrębu (od kroku 2.1.8) pod mikroskopem. Dodaj więcej pożywki organoidowej do zawiesin komórek nabłonka lub zrębu po 100 μl na raz, tak aby zawiesiny miały mniej więcej równą gęstość.
      nuta: Komórki nabłonkowe będą się zlepiać ze sobą i nie zaleca się trawienia/trypsynizacji komórek nabłonka w zawiesiny pojedynczych komórek.
   3. Połącz objętościowo 1 część komórek zrębu z 3 częściami komórek nabłonkowych.
   4. Odpipetować 50 μl (60 000 komórek) zawiesiny połączonych komórek do komory wysiewu komórek formy agarozowej.
   5. Gdy formy agarozy zostaną wypełnione komórkami, ostrożnie dodaj 400 μl świeżej pożywki organoidowej do dołka 24-dołkowej płytki.
      nuta: Pożywka sięga tuż pod powierzchnię szalek agarozowych i nie spowoduje wypływania komórek z pleśni. Po 2-3 dniach komórki osiądną i zaczną tworzyć organoidy.
   6. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień z 500 μl pożywki organoidowej.
   7. Po 2-3 dniach zmień podłoże na takie, które jest uzupełnione 0,1 nM estradiolu (E) i 0,8 nM testosteronu (T), aby promować organizację komórek nabłonka i zrębu.
      nuta: Chociaż organizacja komórek nabłonkowych i zrębowych może zachodzić z hormonami lub bez nich, więcej organoidów zorganizuje się w obecności hormonów.

3. Pozyskiwanie organoidów endometrialnych do eksperymentów

UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu, organoidy endometrialne mogą być przetwarzane do analizy histologicznej lub RNA. Poniższe kroki opisują, jak przetwarzać organoidy.

1. histologia
   1. Rozpuścić 1,5% agarozy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez gotowanie. Pozostawić płynną agarozę do ostygnięcia do temperatury około 50 °C.
   2. Pod mikroskopem preparacyjnym przechylić 24-dołkową płytkę i ostrożnie odpipetować pożywkę z zewnętrznej strony formy agarozowej. Ostrożnie odpipetować pożywkę z wnętrza formy agarozowej, aby uniknąć uszkodzenia organoidów.
   3. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie odpipetować 70-75 μl ciepłej (50 °C) 1,5% agarozy do komory naczynia z agarozą. Uważaj, aby nie naruszyć organoidów.
   4. Pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
   5. Dodać 4% paraformaldehydu (PFA) do każdego dołka na płytce 24-dołkowej i przymocować całą szczelną formę agarozy zawierającą organoidy na noc w temperaturze 4 °C. Następnie przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do przetworzenia w celu zatopienia parafiny.
2. Izolacja RNA
   1. Pod mikroskopem preparacyjnym przechylić 24-dołkową płytkę i ostrożnie odpipetować pożywkę z komory formy agarozowej.
   2. Na siłę odpipetować 1 ml świeżej pożywki organoidowej bezpośrednio do formy agarozowej, aby organoidy zostały wypłukane z mikrostudzienek. Uważaj, aby nie stworzyć zbyt wielu bąbelków.
   3. Powtórzyć pipetowanie ponownie z tym samym podłożem z kroku 3.2.2.
   4. Zebrać całą pożywkę zawierającą organoidy. Wirować z maksymalną prędkością, aby zebrać organoidy i przystąpić do ekstrakcji RNA.

Wyniki

Schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Tkanka macicy została pobrana podczas operacji po badaniu patomorfologicznym. Wyściółka endometrium została oddzielona od mięśnia macicy poprzez skrobanie, a następnie tkanka endometrium została poddana trawieniu enzymatycznemu do pojedynczych komórek zgodnie z opisem w protokole. Komórki nabłonkowe i zrębowe wprowadzono do mikrootworów w formach agarowych. Po 7 dniach hodowli organoidy poddano działaniu E i T przez dodatkowe 7−14 dni.

Dyskusja

Uzyskaliśmy ludzkie organoidy endometrialne składające się z komórek nabłonka i zrębu błony śluzowej macicy bez użycia egzogennych materiałów rusztowaniowych. Chociaż wykazano już, że pierwotne komórki nabłonka endometrium mogą tworzyć organoidy ^6,7, komórki te zostały osadzone w galaretowatej matrycy białek wydzielanych przez komórki mięsaka myszy (patrz tabela materiałów), aby pomóc w tworzeniu struktur podobnych do sferoid. Ponadto brakowało k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza HS, klasa biologii molekularnej	Denville Scientific	CA3510-6
Formy agarozowe	Sigma-Aldrich	Z764043	(https://www.microtissues.com/)
Chlorek amonu (NH4Cl)	Amresco	0621
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2257
Kolagenaza, typ II, proszek	Thermo Fisher Scientific	17101015
Dispase	Corning	354235
DNase I	Sigma-Aldrich	D4513
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Eozyna Stain	VWR	95057-848
Receptor estrogenowy (SP1), królicze przeciwciało monoklonalne	Thermo Fisher Scientific	RM-9101-S
Fluoroshield z DAPI, podłoże do montażu histologicznego	Sigma-Aldrich	F6057
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)	Corning	21-022-CV	1x bez czerwieni wapniowej, magnezowej i fenolowej
Roztwór barwienia hematokaliny	Thermo Fisher Scientific	3530-32	Zmodyfikowana formuła Harrisa, bezrtęciowy
roztwór heparyny	STEMCELL Technologie	07980	dodany do pożywki MammoCult
Roztwór podstawowy hydrokortyzonu	STEMCELL Technologies	07925	dodany do podłoża MammoCult
Pożywki organoidowe - Mammocult	STEMCELL Technologies	05620	uzupełniony o 2 &mikro; L/ml heparyny i 5 &mikro; L/ml hydrokortyzon
Paraformaldehyd, 16% roztwór	Mikroskopia elektronowa Nauki	15710
Penicylina-Streptomycyna	Thermo Fisher Scientific	15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH 7,4	Sigma-Aldrich	P3813
, PgR 1294, niesprzężony, supernatant kultury	Agilent Technologies	M356801-2
matryca białkowa - Matrigel	BD Biosciences	356231
Oczyszczone mysie przeciwciało anty-E-kadheryny	BD Biociences	610181	Clone 36
Rekombinowane przeciwciało anty-wimentynowe [EPR3776]	Abcam	ab92547
Zestaw do lizy i izolacji RNA	Zymo Research	R2060
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Testosteron	Sigma-Aldrich	86500
Plama trójchromowa	Abcam	ab150686
Film woskowy - Parafilm	VWR	52858-000

Receptor progesteronowy