Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60401

⸱

4 marca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka szczura dawcy do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami u zwierząt biorców. Metoda ta może być stosowana do badania wpływu gospodarza i/lub dawcy na rozwój nabłonka sutka i eliminuje potrzebę wstępnego oczyszczania, zwiększając w ten sposób przydatność tej techniki.

Streszczenie

Już w latach siedemdziesiątych naukowcy z powodzeniem przeszczepili komórki nabłonka sutka do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami szczurów. Przeszczepienie nabłonka sutka przy użyciu technik transplantacji wykorzystuje środowisko hormonalne zapewniane przez młodocianego żywiciela gryzoni. Badania te idealnie nadają się do zbadania wpływu różnych manipulacji biologicznych na rozwój gruczołu sutkowego i przeanalizowania wielu aspektów biologii gruczołu sutkowego. Powszechną, ale ograniczającą cechą jest to, że przeszczepione komórki nabłonkowe są pod silnym wpływem otaczającego zrębu i konkurują z endogennym nabłonkiem; Aby wykorzystać natywną tkankę sutka, biała poduszeczka tłuszczowa brzuszno-pachwinowa musi zostać oczyszczona w celu usunięcia nabłonka sutka gospodarza przed przeszczepem. Główną przeszkodą podczas korzystania z organizmu modelowego szczura jest to, że usuwanie rozwijającego się drzewa sutkowego u szczurów po odsadzeniu nie jest skuteczne. Po przesadzeniu do poduszek tłuszczowych wolnych od gruczołów, komórki nabłonka dawcy mogą ponownie zasiedlić oczyszczoną poduszeczkę tłuszczową gospodarza i utworzyć funkcjonalny gruczoł sutkowy. Międzyłopatkowa poduszeczka tłuszczowa jest alternatywnym miejscem dla tych przeszczepów. Główną zaletą jest to, że nie ma struktur przewodowych, ale zapewnia normalny zrąb, który jest niezbędny do promowania wzrostu nabłonka i jest łatwo dostępny u szczura. Kolejną ważną zaletą tej techniki jest to, że jest minimalnie inwazyjna, ponieważ eliminuje konieczność kauteryzacji i usuwania rosnącego endogennego drzewa sutkowego. Dodatkowo międzyłopatkowa poduszeczka tłuszczowa zawiera przyśrodkowe naczynie krwionośne, które można wykorzystać do oddzielenia miejsc do przeszczepu. Ponieważ gruczoły endogenne pozostają nienaruszone, technika ta może być również stosowana do badań porównujących endogenny gruczoł sutkowy z przeszczepionym gruczołem. W pracy opisano metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami szczurów.

Wprowadzenie

Poporodowy rozwój gruczołu sutkowego i morfogeneza przewodowa to procesy, na które duży wpływ ma sygnalizacja hormonalna na początku okresu dojrzewania. U myszy i szczurów, powszechnie stosowanych organizmów modelowych biologii gruczołów mlecznych, proces ten rozpoczyna się około 3 tygodnia życia, gdzie szybka proliferacja i różnicowanie prowadzą do powstania dojrzałego miąższu. Dojrzały gruczoł sutkowy może przechodzić liczne rundy ekspansji i inwolucji, co jest badane od początkuXX wieku. W kontekście hiperproliferacji i rozwoju nowotworów, techniki przeszczepu gruczołu sutkowego zostały opracowane w latach 19501 i ulepszone przez metodologię ilościową opracowaną przez Goulda i wsp. w 19772,3,4. Udoskonalenie techniki przeszczepiania u gryzoni przyczyniło się do znacznych postępów w zrozumieniu prawidłowej biologii gruczołu sutkowego, które są nadal szeroko stosowane do badania wpływu różnych metod leczenia i manipulacji genetycznych na prawidłowy rozwój gruczołu sutkowego i stany chorobowe.

Wiele hipotez zostało wygenerowanych, a następnie przetestowanych za pomocą przeszczepu gruczołu sutkowego, po raz pierwszy opisanych przez DeOme et al. w 1959 roku1. Eksperymenty przeprowadzone przez kilka dziesięcioleci wykazały skłonność tkanki przewodowej wyciętej z gruczołów sutkowych dawcy do ponownego zasiedlenia całej poduszeczki tłuszczowej5,6,7 i wskazały, że krytyczny składnik rozwoju gruczołu sutkowego znajduje się w tych strukturach nabłonkowych. Późniejsze badania na myszach wykazały, że pojedyncza komórka macierzysta sutka może ponownie zasiedlić oczyszczoną poduszeczkę tłuszczową i przyczyniły się do odkrycia pojedynczego, wspólnego przodka podstawowych i luminalnych komórek nabłonka sutka8,9,10. Zgodnie z tymi wnioskami zasugerowano, że przeszczep zwiększa pulę komórek z potencjałem do ponownego zasiedlenia wielu linii w wyniku plastyczności, umożliwiając przeszczepionym komórkom wyhodowanie funkcjonalnego gruczołu sutkowego7,10,11,12,13. Co ważne, zastosowanie technik transplantacji u gryzoni pozwala przezwyciężyć ograniczenia związane z nieprawidłowościami wywołanymi przez hodowlę komórkową14 i często zapewnia wyniki w ciągu zaledwie kilku tygodni.

Chociaż procedura była pierwotnie opisana w kontekście zmian przednowotworowych u myszy, wkrótce została rozszerzona na szczury i stosowana w połączeniu z leczeniem rakotwórczym, aby ustalić mnogość jako miarę podatności na raka15, ale popularność technik transplantacyjnych poszła w parze z rozwojem narzędzi genetycznych dla każdego gatunku. Chociaż badania na myszach obejmujące przeszczep przyczyniły się do wielu odkryć translacyjnych, miąższ gruczołu sutkowego szczura bardziej przypomina człowieka16,17 i oferuje wyraźne korzyści w badaniu raka piersi z dodatnim receptorem estrogenowym (ER+). Guzy sutka są indukowalne u obu gatunków, ale różnią się wrażliwością hormonalną i profilami ekspresji genów. Podstawowa różnica polega na tym, że guzy sutka u szczurów wyrażają się i zależą od funkcji receptorów hormonów jajnikowych i przysadkowych, a mianowicie estrogenu i progesteronu (PR), podobnie jak podtyp luminal-A ludzkiego raka piersi. Rzeczywiście, przeszczep komórek nabłonka sutka, opisany w tym protokole, został wykorzystany do badania wariantów genetycznych zaangażowanych w raka piersi i określenia autonomii komórkowej wpływu na komórki nabłonka sutka18.

Oprócz biologii guza, nabłonek przewodowy normalnego gruczołu sutkowego szczura wykazuje wyższy poziom rozgałęzienia i jest otoczony grubszą warstwą zrębu niż u myszy. Znaczenie zrębu jest dobrze udokumentowane w badaniach nad przeszczepem nabłonka sutka. Nabłonek sutka musi wchodzić w interakcje ze zrębem tłuszczowym, a najlepiej z własnym mezenchymem, aby przejść charakterystyczną dla siebie morfogenezę19,20. Wszczepienie tkanki do gruczołu sutkowego biorcy zapewnia optymalne środowisko; Jednak obecność endogennego nabłonka może zakłócać wyniki. Wstępne oczyszczanie gruczołu sutkowego z endogennego nabłonka jest powszechnie wykonywane w testach transplantacji myszy i wymaga chirurgicznego wycięcia endogennej tkanki sutka i/lub usunięcia sutka1,21,22. Chociaż jest to możliwe, wstępne oczyszczanie nabłonka sutka u szczurów po odsadzeniu nie jest tak szeroko wykonywane, głównie ze względu na nieskuteczność oczyszczania rosnącego drzewa sutkowego u szczurów po odsadzeniu. Ponieważ wykazano, że obszary tkanki tłuszczowej w innych częściach ciała mogą wspierać wzrost przeszczepionego nabłonka sutka21,23,24, procesu wstępnego oczyszczania można łatwo uniknąć u szczurów, przeszczepiając tkankę do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami.

Metoda transplantacji opisana w tym artykule polega na wstrzyknięciu enzymatycznie zdysocjowanych organoidów gruczołu sutkowego (fragmenty nabłonka gruczołu sutkowego i innych typów komórek zdolnych do morfogenezy) lub komórek monorozproszonych do międzyłopatkowej poduszeczki tłuszczowej w wsobnych, izogenicznych lub kongenicznych szczepach szczurów laboratoryjnych2. Ponieważ poduszeczka tłuszczowa między łopatkami jest zwykle pozbawiona tkanki sutkowej, zapewnia odpowiednie środowisko dla wielu miejsc przeszczepu bez konieczności wstępnego oczyszczania endogennego nabłonka. W rezultacie endogenne brzuszno-pachwinowe gruczoły sutkowe zwierzęcia gospodarza nie podlegają manipulacjom chirurgicznym, rozwijają się normalnie i nie mogą zakłócać interpretacji wyników. Dodatkowo, nienaruszone gruczoły sutkowe mogą być wykorzystane do porównania w celu oceny wpływu gospodarza i dawcy na rozwój nabłonka sutka i nowotworzenie 18,25. Chociaż ponowne zasiedlenie gruczołu sutkowego z pojedynczej komórki macierzystej jest dostępne dla myszy, nie zostało jeszcze opracowane dla szczurów, głównie z powodu braku dostępności przeciwciał do selekcji komórek macierzystych sutka szczura25,26,27. Mimo to przeszczepienie monorozproszonych komórek nabłonka sutka w celu ilościowego określenia potencjału ponownego zasiedlenia może być z powodzeniem przeprowadzone, a komórki te będą się normalnie rozwijać po wszczepieniu do odpowiedniego schematu2,3,4. Podczas gdy organoidy są dobre do wielu celów, komórki monorozproszone są wymagane do zastosowań ilościowych, na przykład do określenia liczby komórek nabłonka sutka wymaganych do inicjacji raka po leczeniu promieniowaniem jonizującym28 lub do porównania charakterystyki populacji komórek nabłonka sutka wybranych cytometrycznie przepływowo29.

Do tej pory opisana tutaj procedura jest najbardziej solidną metodą przeszczepu gruczołu sutkowego u szczura, której ogólnym celem jest zbadanie rozwoju gruczołu sutkowego i mechanizmów leżących u podstaw rozwoju raka piersi. Często zwierzęta dawcy i/lub biorcy są narażone na różne zmienne przed, w trakcie lub po przeszczepieniu nabłonka. Przykłady obejmują badania pojedynczych genów obejmujące chemiczną kancerogenezę30, radiation28,31,32, manipulacja genetyczna genomu gospodarza/dawcy18 oraz manipulacja hormonalna12. Główną zaletą dysocjacji enzymatycznej opisanej w tym protokole jest możliwość wyizolowania organoidów nabłonkowych lub komórek monorozproszonych do uzupełniających eksperymentów obejmujących cytometrię przepływową, hodowlę 3D, edycję genów i inne. Przyszłe zastosowania tej techniki będą obejmowały dodatkową manipulację tkanką dawcy i/lub gospodarza za pomocą inżynierii genetycznej. Na przykład komórki dawcy mogą być genetycznie modyfikowane ex vivo w dowolnie wybranym locus genomowym przy użyciu systemu edycji genów CRISPR-Cas9. Podobnie, szczury biorcy mogą być również modyfikowane genetycznie w celu zbadania interakcji między czynnikami genetycznymi modyfikowanymi przez dawcę i biorcę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta były trzymane i utrzymywane w obiekcie zatwierdzonym przez AAALAC, a eksperymenty opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Zwierzęta przeznaczone do wzajemnego przeszczepiania powinny być szczepami wsobnymi lub izogenicznymi, o preferowanym statusie kongenicznym lub krzyżowanym wstecznie przez co najmniej 6 pokoleń.

1. Pobieranie nabłonka gruczołu sutkowego szczura dawcy

  1. Określ liczbę szczurów-dawców potrzebnych do przeszczepu.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, 1 szczur dawca (w wieku 4 tygodni) może dostarczyć wystarczającą ilość komórek do przeszczepienia 4 zwierzętom biorcy. Niektóre zastosowania tego protokołu będą wymagały dodatkowej liczby komórek i mogą występować specyficzne dla szczepu różnice w całkowitej wydajności.
  2. Oznacz wszystkie materiały eksploatacyjne i zapewnij chirurgowi miejsce w przystępnym miejscu (Tabela 1).
  3. Zapisz masę ciała każdej samicy szczura-dawcy. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, aby w pełni znieczulić lub poddać eutanazji szczura dawcę. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
  4. Przenieś zwierzę na sterylne pole operacyjne. Połóż zwierzę na grzbiecie i spryskaj całą powierzchnię brzuszną 70% etanolem.
  5. Wykonaj strzałkowe nacięcie w kształcie litery X, umożliwiające dostęp do gruczołów sutkowych klatki piersiowej, brzucha i pachwin. Wypreparuj całą tkankę gruczołu sutkowego od szczura-dawcy za pomocą nożyczek (Ryc. 1). Usuń wszystkie widoczne węzły chłonne.
  6. Usuń tkankę sutka za pomocą kleszczy i umieść w oznakowanym naczyniu o średnicy 60 mm na lodzie. Do naczynia o średnicy 60 mm dodać 500 μl pożywki DMEM/F12 bez surowicy. Dostosuj położenie tkanki gruczołu sutkowego, aby pozostała całkowicie mokra
    7. .
  7. Drobno zmiel tkankę sutka za pomocą nożyczek. Aby to zrobić, pokrój tkankę na kawałki o rozmiarze 1-2 mmi 3 calach (Rysunek 1C). Trzymaj gruczoł na lodzie do momentu pobrania całej tkanki dawcy (nie dłużej niż 60 minut).
    UWAGA: Dodatkowy personel może zmielić gruczoły sutkowe i dodatkowo przygotować roztwór kolagenazy, podczas gdy chirurg przystępuje do ekstrakcji tkanek.

2. Pobieranie tkanki mózgowej od dawców poddanych eutanazji

  1. Ostrożnie odwróć ciało dawcy, aby ułożyć je w pozycji leżącej. Zabezpiecz za pomocą szpilek. Spryskaj głowę i górną część pleców 70% etanolem.
  2. Zlokalizuj podstawę czaszki i wykonaj nacięcie pod kłykciami potylicznymi. Włóż ostre nożyczki pod skórę i odetnij skórę od czaszki, w tym boki głowy.
  3. Użyj nożyc do kości lub mocnych nożyczek, aby przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej, od kości potylicznej do czołowej. Trzymaj ostrze tak powierzchownie, jak to możliwe i ustaw je pod kątem do góry, aby zapobiec zniszczeniu leżącej pod spodem tkanki mózgowej.
  4. Obierz kość za pomocą rongeurów lub mocnych kleszczy. Włóż narzędzie bocznie do móżdżku, aby złamać kość po obu stronach, odsłaniając kostny przewód słuchowy. Przeciąć połączenia z oponami mózgowymi.
  5. Delikatnie unieś mózg za pomocą zakrzywionych kleszczyków z cienką końcówką. Umieść mózg na kawałku folii i zapisz wagę, a następnie natychmiast przenieś do probówki o pojemności 15 ml z równą ilością (w:v) pożywki, przechowywanej na lodzie.
    1. Opcjonalnie należy użyć kleszczyków z cienką końcówką, aby usunąć przysadkę mózgową (znajdującą się pod mózgiem) w celu dodatkowego wykorzystania w procedurze przeszczepu, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  6. Użyj homogenizatora mechanicznego, aby rozbić tkankę. Homogenizuj mózg przez 10-15 s na niskiej prędkości. Pozostaw mieszaninę na lodzie na co najmniej 1 minutę, a następnie ponownie homogenizuj. Homogenizacja jest wystarczająca, gdy końcowa mieszanina jest wolna od dużych kawałków.
  7. Przefiltrować homogenat, przepuszczając go przez filtr 100 μm. Filtrat należy przechowywać na lodzie do czasu użycia (mniej niż 4 godziny).

3. Trawienie i przetwarzanie ekstraktów z gruczołu sutkowego

  1. Rozmrozić lub ogrzać odczynniki, jak wskazano (Tabela 1). Postępuj zgodnie z odpowiednimi krokami, aby odzyskać organoidy lub komórki monorozproszone.
  2. Przygotować 10 ml pożywki trawiącej bez surowicy (bez kolagenazy) dla każdego zwierzęcia dawcy (plik uzupełniający 1).
    UWAGA: Objętość użytego podłoża trawiącego można dostosować (przeskalować w górę lub w dół), aby dostosować się do zgrupowanej tkanki, jeśli ma to zastosowanie.
    1. Dla organoidów przejdź do ppkt 3.3.
    2. W przypadku komórek monodyspersyjnych należy przygotować świeżą mieszaninę monodyspersyjną i roztwór inaktywacyjny (plik uzupełniający 2, plik uzupełniający 3) oprócz pożywki do trawienia kolagenazy bez surowicy. Przejdź do kroku 3.3.
  3. Gdy cała tkanka sutka od dawców zostanie wyekstrahowana i zmielona, dodać enzym kolagenazę do ciepłej (lub pokojowej) pożywki trawiącej (plik uzupełniający 1). Wymieszaj przez odwrócenie.
  4. Przepuścić pożywkę do wytrawiania kolagenazy przez filtr 20 μm. Dozować 10 ml przefiltrowanej pożywki do oznaczonych probówek o pojemności 50 ml w celu roztrawienia.
  5. Do każdej próbki należy użyć nowej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść zmieloną tkankę dawcy z każdej płytki o średnicy 60 mm do probówki do wytrawiania kolagenazy. Odetnij 1 cm od końca końcówki o pojemności 1 000 μl i ręcznie umieść ją na urządzeniu przed użyciem. Delikatnie wymieszaj zmieloną tkankę, pipetując w górę i w dół 1-2 razy.
    UWAGA: Jeśli tkanka jest trudna do pipetowania podczas przenoszenia, użyj niewielkiej ilości pożywki do trawienia kolagenazy z probówki o pojemności 50 ml, a następnie przenieś ją z powrotem.
  6. Umieścić próbki w pozycji poziomej w inkubatorze z wytrząsaniem i pozostawić próbki do wytrawienia przez 1,5–2 godziny w temperaturze 37 °C, 200–220 obr./min.
    1. W przypadku organoidów przejdź do 3.7.
    2. W przypadku komórek monorozproszonych dodać DNazę I (0,2 μg/ml) do mieszaniny przez ostatnie 10 minut trawienia. Inkubować jak poprzednio, energicznie potrząsając. Przejdź do kroku 3.7.
  7. Gdy tkanka jest w pełni strawiona, zawiesinę osadzać za pomocą zimnego wirowania (4 °C) przez 10 minut w temperaturze 1 200 x g (Rysunek 1D).
    UWAGA: Utrzymuj probówki na lodzie między każdym krokiem, aby zwiększyć żywotność komórek.
  8. Upewnij się, że utworzyła się osadka, a następnie ostrożnie odlej warstwę sklarowanego osadu i tłuszczu. Delikatnie zawiesić osad w 10 ml świeżej pożywki DMEM/F12.
  9. Krótko wirować z prędkością 68 x g przez około 10 s. Długość wirowania (ale nie prędkość) może być zwiększona, jeśli nie ma wyraźnego rozdzielenia komórek. Przed kontynuowaniem sprawdź wzrokowo granulkę (Rysunek 1D).
  10. Ostrożnie usuń supernatant, pozostawiając niewielką objętość. Przejdź do następnego kroku, w zależności od tego, czy potrzebne są organoidy, czy komórki monorozproszone.
    UWAGA: Ważne jest, aby pozostawić niewielką objętość mediów w tubie, ponieważ granulka będzie bardzo luźna. Pozostała objętość mediów zostanie rozcieńczona na etapach mycia.
    1. W przypadku organoidów dodać kolejne 10 ml objętości pożywki DMEM/F12 i powtórzyć płukanie/wirowanie. Po drugim płukaniu ponownie zawiesić komórki w mniejszej objętości (1-2 ml) pożywki DMEM/F12 w celu filtracji. Przejdź do kroku 3.11.
    2. W przypadku komórek monorozproszonych rozpuść się w 2 ml wstępnie podgrzanego HBSS z 0,025% (w/v) trypsyny i 6,8 mM EDTA. Trawić przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C. Natychmiast dezaktywować.
      1. Dodaj 4 ml DMEM/F12 z 10% FBS, aby zatrzymać dezaktywację trypsyny.
      2. Wiruj komórki w temperaturze 270 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawieś w DMEM/F12 z 10% FBS. Przejdź do kroku 3.11, aby przefiltrować komórki.
  11. Przefiltruj komórki za pomocą sitka o pojemności 40 μm umieszczonego w nowej probówce o pojemności 50 ml. Wstępnie zwilż sitko, pipetując 1 ml tego samego podłoża bazowego, które zostało użyte do zawieszenia komórek, a następnie przepuść zawiesinę komórek przez filtr za pomocą pipety w celu zebrania fragmentów przewodów/organoidów.
    UWAGA: Przybliżona wydajność przefiltrowanego nabłonka z tkanki gruczołu sutkowego pojedynczego, 4-tygodniowego szczura dawcy wynosi 1 x 106 komórek.
    1. W przypadku organoidów należy wyrzucić filtrat. Organoidy sutkowe pozostaną w koszu sitka komórkowego, a mniejsze, niechciane komórki zostaną wyeliminowane. Odwróć sitko do komórek na nowej probówce o pojemności 50 ml i spłucz objętością niezbędną do zebrania komórek. Przejdź do kroku 3.12.
    2. W przypadku komórek monorozproszonych wyrzuć sitko komórkowe i zachowaj filtrat, ponieważ komórki nabłonka sutka przejdą przez filtr wraz z mniejszymi komórkami zrębu i odpornościowymi. Przepłukać probówkę, która była używana do mineralizacji/wirowania, kolejną objętością DMEM/F12 z 10% FBS i przepuścić przez to samo sitko do komórek. Monorozproszone komórki osadzać przez odwirowanie w stężeniu 1 200 x g przez 5 minut. Przejdź do kroku 3.12.
      UWAGA: Zawieszone ogniwa są gotowe do kolejnych aplikacji.
  12. Pulsacyjnie zakręć roztworem i upewnij się, że utworzy się osad komórkowy przed przejściem do następnego kroku. W razie potrzeby ponownie zakręć impulsowo.
  13. Ostrożnie usunąć supernatant. Zawiesić osad w małej objętości (1 000-2 000 μl DMEM/F12) w celu skoncentrowania komórek do liczenia.
  14. Policz komórki i rozcieńcz w razie potrzeby. Zawiesić żądaną liczbę komórek do przeszczepu w 20 μl pożywki DMEM/F12 dla każdego zwierzęcia. Zawsze trzymaj komórki na lodzie.
    UWAGA: Liczba komórek dawcy w zakresie 1 x 105 - 1 x 106 komórek będzie wymagana dla każdego miejsca przeszczepu w zależności od punktu końcowego badania. Na przykład eksperymenty z kancerogenezą często wymagają większej liczby przeszczepionych komórek w porównaniu z innymi zastosowaniami. Liczba potrzebnych komórek musi być określona doświadczalnie dla każdego szczepu. W procedurze opisanej w tym protokole wykorzystano 250 000 komórek dawcy w pożywce o objętości 20 μl na miejsce przeszczepu, przed zmieszaniem z homogenatem mózgu, jak opisano w kroku 3.16.
  15. Przygotuj wszelkie porcje komórek potrzebne do innych eksperymentów (np. FACS isolation3,26,27,30,33).
    1. W przypadku organoidów przejdź do kroku 3.16.
    2. W przypadku komórek monorozproszonych należy określić ilościowo żywotne komórki za pomocą barwienia trypanem lub błękitem metylenowym, a następnie kontynuować.
  16. Należy przygotować pojedyncze partie materiału dawcy dla wszystkich biorców przeszczepu. Połączyć równe objętości zawiesiny komórkowej (20 μl) z 50% homogenatem mózgu (20 μl) dla każdego miejsca przeszczepu.
    UWAGA: W każdym miejscu zostanie wstrzyknięte łącznie 40 μl na miejsce, ale zaleca się dodanie co najmniej 25% dodatkowej objętości na odpady.
  17. Natychmiast przystąp do przeszczepu lub zamroź komórki do przeszczepu później (potencjalny punkt zatrzymania).
    UWAGA: Zamrożone komórki nie zostały przetestowane przy użyciu tego protokołu i będą wymagały optymalizacji przed wygenerowaniem kohorty zwierząt do eksperymentów transplantacyjnych. Zdecydowanie zaleca się przeszczepianie świeżych komórek.

4. Procedura transplantacji (szczury biorcy w wieku 4-5 tygodni)

  1. Zważyć każdego szczura biorcę i obliczyć właściwą dawkę zatwierdzonego leku przeciwbólowego, który zostanie użyty w procedurze.
    UWAGA: Masę ciała można mierzyć do 24 godzin przed zabiegiem. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, aby unieruchomić lub krótko znieczulić każde zwierzę na czas golenia.
  2. Ogol obszar chirurgiczny na każdym zwierzęciu za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia. Zidentyfikuj podstawę czaszki i początek kręgosłupa. Około jednej trzeciej długości kręgosłupa ogol obszar o wymiarach 3 cm x 2 cm w górnej części klatki piersiowej pleców.
    UWAGA: Golenie można również wykonać w znieczuleniu w dniu przeszczepu, ale musi być wykonane poza sterylnym polem. Wróć szczura do jego domowej klatki, dopóki nie będzie potrzebny.
  3. Zlokalizuj wszystkie materiały potrzebne do przeszczepu (Tabela 1).
  4. Oceń system znieczulenia zwierząt laboratoryjnych przed użyciem. Uzupełnij wszelkie płyny i wymień wszystkie potrzebne zbiorniki lub części. Upewnij się, że przewód gazowy do komory anestezjologicznej jest otwarty, a wszystkie przewody obwodowe są zamknięte, aby znieczulenie izofluranem i tlen mogły swobodnie przepływać do zwierzęcia po umieszczeniu go w komorze.
  5. Ciepłe poduszki grzewcze wspomagające temperaturę ciała zwierząt biorców.
  6. Wygeneruj sterylne pole, które zostanie użyte do operacji. Ułóż zapasy zgodnie z opisem w Tabeli 1.
  7. Podawaj przedoperacyjne środki przeciwbólowe szczurom biorcom zgodnie ze wskazaniami w instytucjonalnie zatwierdzonym protokole opieki nad zwierzętami.
  8. Przepłukać strzykawki Hamilton sterylnym podłożem DMEM/F12, aby zapobiec utracie komórek. Upewnij się, że igła jest przymocowana do korpusu strzykawki, włożyć igłę do płynu i odciągnąć tłok. Napełnij do maksymalnej objętości. Nacisnąć tłok i wyrzucić zawartość do probówki na odpady. Powtórz 3-5 razy.
  9. Załadować całą objętość materiału dawcy (przygotowanego w kroku 3.16) do oddzielnej strzykawki dla każdego stanu (np. kontrolny, leczony, typu dzikiego, nokaut itp.). Włożyć końcówkę igły do płynu, odciągnąć tłok i trzymać igłę pod powierzchnią mieszaniny w miarę zmniejszania się objętości w probówce.
    UWAGA: Dodać co najmniej 10% dodatkowej objętości do każdej strzykawki. Nie wyrzucaj pozostałej mieszaniny, zamknij tubkę i trzymaj ją na lodzie na wypadek, gdyby potrzeba więcej.
  10. Po całkowitym załadowaniu strzykawki należy odwrócić strzykawkę i lekko nacisnąć tłok, aby usunąć pęcherzyki powietrza z końcówki igły. Przejdź do następnego kroku, gdy wszystko jest przygotowane.
    UWAGA: Upewnij się, że końcówka igły nigdy nie dotyka żadnej innej powierzchni, nawet w sterylnym polu. Pomocne jest oparcie korpusu strzykawki na małym pojemniku z lodem, aby zwiększyć żywotność komórek.
  11. Umieść zwierzę biorcy w komorze anestezjologicznej i włącz maszynę.
  12. Gdy zwierzę jest w pełni zrelaksowane (nie reaguje na stukanie lub delikatny ruch komory), skieruj znieczulenie na stożek nosowy i przenieś zwierzę do sterylnego pola.
    UWAGA: Wydłużony czas trwania znieczulenia nie jest dobrze tolerowany przez szczury. Wykonaj procedurę dla każdego zwierzęcia w ciągu 10 minut lub krócej.
  13. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej (na brzuchu), tak aby tył głowy i górna część kręgosłupa były dostępne.
    UWAGA: Przez cały czas należy zapewnić zwierzęciu odpowiednie wsparcie cieplne i regularnie oceniać głębokość znieczulenia za pomocą mocnego uszczypnięcia palca.
  14. Opcjonalnie należy zastosować maść weterynaryjną okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
  15. Oczyść świeżo ogolony obszar, aby usunąć nadmiar włosów. Wykonaj okrężne ruchy i nałóż 70% etanolu (lub inny odczynnik, zgodnie z wytycznymi instytucji) na skórę, a następnie zastosuj środek antyseptyczny (taki jak jod) i powtórz. Umieść zasłonę ręcznika na zwierzęciu, tak aby odsłonięty był tylko obszar ogolonego obszaru.
  16. Upewnij się, że zwierzę nie reaguje na głębokie bodźce mocnym szczypnięciem palca, a następnie przejdź do następnego kroku.
  17. Wykonaj małe (2 cm) nacięcie międzyłopatkowe za pomocą ostrego ostrza chirurgicznego.
    UWAGA: Nacięcie musi być powierzchowne, ponieważ poduszeczka tłuszczowa znajduje się tuż pod skórą.
  18. Zlokalizuj przyśrodkowe naczynie krwionośne w celu orientacji (Rysunek 2B).
  19. Podnieś skórę po jednej stronie nacięcia za pomocą kleszczy i trzymaj ją z dala od poduszeczki tłuszczowej podczas wykonywania przeszczepu (Rysunek 2B). Wbić igłę w miejsce przeszczepu.
    1. Opcjonalnie przesuń końcówkę igły wewnątrz tkanki i utwórz małą kieszeń do zebrania komórek. Wykonuj małe, powtarzalne ruchy. Nie wyjmować igły.
      UWAGA: Ten krok jest zalecany dla początkujących użytkowników protokołu. Zachowaj szczególną ostrożność podczas tworzenia kieszeni, ponieważ tkanka poduszeczki tłuszczowej między łopatkami jest bardzo delikatna.
  20. Ostrożnie wstrzyknąć 40 μl mieszaniny komórek do tkanki poduszeczki tłuszczowej między łopatkami. Powoli wyjmować igłę.
  21. Przytrzymaj tkankę na miejscu i pozwól przeszczepionym komórkom osiąść przez 3-5 sekund. W razie potrzeby użyj dodatkowej pary kleszczy.
  22. Wyjąć igłę. Powtórzyć procedurę wstrzykiwania (kroki 4.18-4.21) w drugim miejscu przeszczepu.
    UWAGA: Nabłonek z jednej grupy dawców może być wstrzykiwany w tę samą stronę poduszeczki tłuszczowej u każdego zwierzęcia lub naprzemiennie, aby zapobiec efektom partii wynikającym z dominacji ręki chirurga.
  23. Zamknij ranę pooperacyjną za pomocą klipsów lub szwów, a następnie przerwij znieczulenie.
  24. Zapewnij pooperacyjne leki przeciwbólowe zgodnie ze wskazaniami w instytucjonalnie zatwierdzonym protokole.
  25. Natychmiast przenieś zwierzę do klatki regeneracyjnej ze wsparciem termicznym. Monitoruj oznaki niepokoju, takie jak krwawienie z nacięcia lub problemy z oddychaniem.
    UWAGA: Zwierzę powinno w pełni wyzdrowieć w ciągu 5-10 minut. Zapoznaj się z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi powrotu zwierząt do kolonii i monitorowania pooperacyjnego po zabiegach przeżycia.
  26. Opcjonalnie należy przeprowadzić badania rakotwórczości w miejscu (miejscach) przeszczepu, podając czynniki rakotwórcze szczurom biorcom 3-4 tygodnie po przeszczepie.
    UWAGA: Zazwyczaj kancerogenezę sutka szczura przeprowadza się za pomocą chemicznego leczenia rakotwórczego w wieku 50-57 dni. Leczenie to dyktuje wiek operacji przeszczepu (która musi być wykonana w wieku 29-36 dni), aby dać wystarczająco dużo czasu na zainicjowanie wzrostu gruczołu sutkowego.

5. Ocena przerostu nabłonka

  1. Monitoruj cykl rujowy szczurów poprzez codzienne płukanie pochwy i zbadaj cytologię na szkiełku mikroskopowym. Rozpocząć 8-12 dni przed punktem końcowym badania. Poświęć wszystkie szczury na tym samym etapie. Jest to opcjonalny krok.
    UWAGA: Cykl rui szczura trwa 4-5 dni. Umożliwienie zwierzęciu przejścia przez 1-2 pełne cykle ułatwi interpretację, ponieważ do porównania można wykorzystać szkiełka z poprzednich cykli.
  2. Szczury biorcy przeszczepu należy składać w ofierze 6-8 tygodni po przeszczepie, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
    UWAGA: Przerost jest zwykle wykrywalny 3-6 tygodni po przeszczepie, ale może być wymagany dodatkowy czas.
  3. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej i oczyść ciało 70% etanolem. Podnieś skórę kleszczami i wykonaj nacięcie wzdłuż kręgosłupa, aby odsłonić międzyłopatkową poduszeczkę tłuszczową. Odetnij skórę od tkanki, aby widoczna była większość poduszeczki tłuszczowej.
  4. Zidentyfikuj przyśrodkowe naczynie krwionośne, które oddziela miejsca przeszczepu w poduszce tłuszczowej między łopatkami. Wytnij całą podkładkę jako pojedynczy kawałek tkanki lub przetnij wzdłuż naczynia krwionośnego i usuń boki pojedynczo.
  5. Umieść tkankę na dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym dla całego mocowania. Użyj 2 par kleszczyków i delikatnie rozprowadź tkankę, aby przywrócić jej pierwotną konformację na szkiełku.
    UWAGA: Tkanka sutka szczura jest niezwykle delikatna. Krawędzie tkanki mogą się pod sobą zwijać. Zawsze należy obchodzić się z nią ostrożnie i przytrzymywać w miejscu, aż chusteczka przylgnie do szkiełka (kilka sekund).
  6. Zamontuj w całości co najmniej jeden z endogennych brzuszno-pachwinowych gruczołów sutkowych (z węzłami chłonnymi dla orientacji) dla porównania.
  7. Umieść szkiełka w 70% etanolu na 7-10 dni, aby opróżnić tkankę. Uzupełniaj etanol tak często, jak to konieczne, aby upewnić się, że tkanka nie wyschnie.
  8. Przygotuj barwnik ałunowo-karminowy i przetwarzaj szkiełka, gdy tkanka jest wystarczająco nieprzezroczysta. Poczekaj, aż plama ostygnie przed użyciem (plik uzupełniający 4).
    UWAGA: Plamę można przygotować do jednego dnia przed etapem utrwalania i ponownego nawodnienia. Roztwór może być przechowywany w temperaturze 4 °C i ma ograniczony potencjał ponownego użycia.
  9. Utrwal tkankę, umieszczając szkiełka w 25% lodowatym kwasie octowym : 75% etanolu na 60 minut.
    1. Ponownie nawodnić tkankę poprzez serię 3 płukań w serii zmniejszających się stężeń etanolu: 70% etanolu przez 15 min, 50% etanolu przez 5 min idH2Oprzez 5 min.
  10. Bejcować ałunem karminem przez 4-8 dni. Każdego dnia sprawdzaj tył szkiełek, aby ustalić, czy plama całkowicie wniknęła w tkankę. Przejdź do następnego kroku po zakończeniu barwienia.
    UWAGA: Barwienie jest zakończone, gdy najgrubsze części gruczołu mają fioletowy odcień i nie wydają się już białe.
  11. Odbarwić i odwodnić tkankę, przenosząc szkiełka przez serię zwiększających się stężeń etanolu: 70% etanolu przez 30 min, 95% etanolu przez 30 min i 100% etanolu przez 30 min.
  12. Umieść odwodnione szkiełka w ksylenie na 3+ dni, aby oczyścić tkankę. Przenieść do oleju mineralnego w celu długotrwałego przechowywania.
  13. Po oczyszczeniu slajdów użyj mikroskopii świetlnej o małej mocy lub fotografii cyfrowej o wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać obrazy szkiełek do analizy. Upewnij się, że parametry akwizycji obrazu są spójne dla wszystkich slajdów.
    UWAGA: Wyrostek nabłonkowy musi być wyraźnie odróżnialny.
  14. Traktuj obecność wzrostu jako wynik binarny.
  15. Oblicz średnią liczbę przeszczepionych komórek nabłonkowych, które wytworzyły ≥1 wyrostek sutkowy w 50% miejsc przeszczepu, korzystając z uzyskanych obrazów. Kwantyfikacja innych cech fizycznych, w razie potrzeby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Gruczoły mlekowe dawcy i biorcy
Kroki izolacji i przygotowania nabłonkowych komórek gruczołu mlekowego szczura do transplantacji przedstawiono na Rysunku 1A. W 4. tygodniu życia endogenny gruczoł mlekowy szczura-dawcy rozpoczyna proces dojrzewania, a nabłonek można zwizualizować na preparatach całych preparatów barwionych karminem ałunowym (Rysunek 1B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje technikę przeszczepu komórek nabłonka sutka zoptymalizowaną pod kątem pracy ze szczurami. Izolowane organoidy nabłonka sutka od szczurów dawców (w wieku 3-5 tygodni) są szczepione w białą poduszeczkę tłuszczową między łopatkami szczurów biorców (również w wieku 3-5 tygodni). Wyniki można zinterpretować już po 4-6 tygodniach, przy użyciu mikroskopii świetlnej w celu zbadania przeszczepionej tkanki; Jednak optymalna ilość czasu między przeszczepem a poświęceniem musi zostać określona przed przeprowadze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Hollings Cancer Center's Cancer Center Support Grant P30 CA138313 finansowanie badań pilotażowych z National Institutes of Health (https://www.nih.gov/), oraz fundusze z Wydziału Patologii i Medycyny Laboratoryjnej Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny. Chcielibyśmy podziękować Marijne Smiths za nagranie wypowiedzi z wywiadu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; Filtry strzykawkowe FisherScientific09-715Gsterylno-filtrujące pożywki do trawienia kolagenazy
1,5 - 2,0 ml mikroprobówki wirówkowe (sterylne)Fisher Scientific05-408-129zawierające zawieszone komórki i/lub mieszaninę homogenatu mózgu
100 i mikro; Sitka do komórekM Corning431752filtrujące homogenate
strzykawki gazoszczelne 100 uL z igłami o rozmiarze 25 Hamilton81001 i 90525Do wstrzykiwania mieszaniny do przeszczepów zwierzętom biorcom (1 na genotyp/warunek dawcy)
Końcówki do pipet 1000 μL + pipeta-przenoszenie komórek/mieszanin/tkanek
Probówka polipropylenowa 15 mlFalcon (Corning)352196Przechowywanie mieszaniny homogenatu mózgu lub komórki: mieszanina homogenacyjna do przeszczepu
40 i mikro; Sitka do komórek MCorning431750organoidy filtrujące po umyciu granulatu komórkowego
50 ml probówki polipropylenoweFisher Scientific05-539-6do trawienia kolagenazy tkanki gruczołu sutkowego dawcy
Szalki 60 mmThermo Scientific130181do mielenia tkanki
Ałun Siarczan potasuSigma-Aldrich243361/237086barwienie gruczołu sutkowego całe mocowanie
Slajdy Waporyzator anestezjologiczny do użytku weterynaryjnego-postępuj zgodnie z protokołem instytucjonalnym
Beta-dine lub jod-
probówka do hodowli ze szkła borokrzemianowego do homogenizacjiFisher Scientific14-961-26do homogenizacji mózgu (użyj odpowiedniej rurki do homogenizatora)
CarmineSigma-AldrichC6152/1022barwienie gruczołu sutkowego szkiełka z całym mocowaniem
Aparat do liczenia komórek-
Czyste klatki dla zwierząt do rekonwalescencji-postępuj zgodnie z protokołem instytucjonalnym
Kolagenaza Typ 3Worthington Biochemical Corp.LS004183trawienie enzymatyczne mielonej tkanki gruczołu sutkowego od szczurów dawców
woda dejonizowana-do roztworów chemicznych
DMEM / F12GIBCO11320033do mielenia tkanki, pożywki do trawienia kolagenazy i mieszaniny komórek nabłonkowych
EDTA-mieszanina monodyspersyjna
Etanol, 200 ProofDecon Labs2705/2701Utrwalacz do szkiełek sutkowych, Szkiełko sutkowe do mycia całego mocowania, Czyszczenie miejsc nacięć chirurgicznych (rozcieńczony)
Surowica bydlęca płodu (FBS)Roztwór do inaktywacjihyklonu
Gaza-
Lodowaty kwas octowyFisher ScientificA38-212do utrwalacza szkiełka sutkowego całego mocowania (1:4 lodowaty kwas octowy w 100% etanolu)
HBSSGIBCO-mieszanina monodyspersyjna
Poduszki grzewcze--postępuj zgodnie z protokołem instytucjonalnym
Wiadra na lód (x2)--
Inkubator z rotacją orbitalną--musi być w stanie utrzymać 37° C, wytrząsanie z prędkością 220-225 obr./min (do trawienia tkanki sutka kolagenazą)
Znieczulenie izofluranem-postępuj zgodnie z protokołem instytucjonalnym
Mikroskop świetlny lub kamera cyfrowa-wizualizacja całego zamontowanego nabłonka sutka i / lub pozyskiwanie obrazów
Homogenizator mechanicznyFisherScientific-TissueMiser lub modele alternatywne
Olej mineralny, czystySigma-Aldrich / ACROS Organics8042-47-5długotrwałe przechowywanie oczyszczonego gruczołu sutkowego całe mocowania
Zbiorniki tlenu do parownika anestezjologicznego-postępuj zgodnie z protokołem instytucjonalnym
Ręczniki papierowe lub delikatne chusteczki do zadań-
Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopoweThermo ScientificP4981-001całe mocowania tkanki gruczołu sutkowego
Pooperacyjne przeciwbólowy-Protokół instytucjonalny
Wagapomiary masy ciała zwierząt, właściwe dawkowanie leków przeciwbólowych
Golarka-elektryczne maszynki do strzyżenia lub inne
słoiki do barwienia-minimum 1 na mycie chemiczne, rozmiar odpowiedni do liczby szkiełek, preferowane szkło
Sterylne zasłony poloweIMCO4410-IMCużywany podczas przeszczepu
Sterylne nożyczki i kleszcze x3 (autoklawowane)-autoklawowe narzędzia chirurgiczne używane dla dawców i biorców
Strzykawki: 5 ml (lub więcej)-do sterylnej filtracji pożywki do trawienia kolagenazy
TrypsynaMieszanina monodyspersjiWorthingtona
Pojemnik na odpady na płyny (nalewane lub zasysane)- -
Aplikator do spinania ran, klipsy i narzędzie do usuwaniaFine Science Tools12020-00Zamykanie nacięcia skóry nad białą podkładką międzyłopatkową
KsylenyFisher ScientificX3S-4oczyszczanie gruczołu sutkowego całe mocowanie ślizgów po barwieniu

Bibliografia

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343(1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173(1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7(2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634(1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002(2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

gruczo mlekowy szczuraizolacja tkanki gruczo u mlekowegotrawienie kolagenazfiltracja przez sito do kom rekmieszanie z homogenatem m zguchirurgiczne wstrzykiwanie przeszczepubarwienie preparat w ca ychrozw j gruczo u mlekowego
Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.