Pomiar szybkości mutacji drobnoustrojów za pomocą testu fluktuacji

Podsumowanie

Tutaj prezentowany jest protokół do przeprowadzenia testu fluktuacji i oszacowania szybkości mutacji mikrobiologicznych za pomocą markerów fenotypowych. Protokół ten umożliwi naukowcom testowanie mutacji w różnych mikroorganizmach i środowiskach, określając, w jaki sposób genotyp i kontekst ekologiczny wpływają na tempo spontanicznych mutacji.

Streszczenie

Testy fluktuacji są powszechnie używane do szacowania tempa mutacji u mikrobów rosnących w płynnym środowisku. Wiele kultur jest zaszczepianych kilkoma tysiącami komórek, z których każda jest wrażliwa na selektywny marker, który można oznaczyć fenotypowo. Te równoległe kultury rosną przez wiele pokoleń przy braku markera fenotypowego. Podzbiór kultur służy do oszacowania całkowitej liczby komórek zagrożonych mutacjami (tj. wielkości populacji pod koniec okresu wzrostu lub N_t). Pozostałe kultury umieszcza się na selektywnym agarze . Rozkład obserwowanych opornych mutantów wśród równoległych kultur jest następnie wykorzystywany do oszacowania oczekiwanej liczby zdarzeń mutacyjnych, m, przy użyciu modelu matematycznego. Podzielenie m przez N_t daje oszacowanie częstości mutacji na locus na pokolenie. Test składa się z trzech krytycznych aspektów: wybranego markera fenotypowego, wybranej objętości równoległych kultur oraz upewnienia się, że powierzchnia selektywnego agaru jest całkowicie sucha przed inkubacją. Test jest stosunkowo niedrogi i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego. Jest to również mniej pracochłonne niż alternatywne podejścia, takie jak akumulacja mutacji i testy jednokomórkowe. Test działa na organizmach, które szybko przechodzą przez wiele pokoleń i zależy od założeń dotyczących wpływu markerów na dopasowanie i śmierć komórki. Jednak niedawno opracowane narzędzia i badania teoretyczne oznaczają, że problemy te można teraz rozwiązać w sposób analityczny. Test umożliwia oszacowanie szybkości mutacji różnych markerów fenotypowych w komórkach o różnych genotypach rosnących w izolacji lub w społeczności. Przeprowadzając wiele testów równolegle, testy można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób kontekst środowiskowy organizmu wpływa na tempo spontanicznych mutacji, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, rakotwórczości, starzenia się i ewolucji.

Wprowadzenie

W 1901 roku holenderski botanik Hugo de Vries ukuł termin mutacja¹. Dwadzieścia sześć lat później, kiedy Hermann Joseph Müller odkrył mutagenne działanie promieni rentgenowskich², mutacje były już postrzegane jako jedna z sił napędowych ewolucji. Jednak natura mutacji nie była jasna. Aby odpowiedzieć na fundamentalne pytanie, czy mutacje pojawiają się spontanicznie (tj. mutacja spontaniczna), czy w odpowiedzi na selekcję (tj. mutację indukowaną), potrzebna była metoda obserwacji zdarzeń mutacyjnych. Taka metoda mierzyłaby oczekiwaną liczbę mutacji na podział komórki lub to, co było już znane jako współczynnik mutacji^3,4.

Rysunek 1: Schematyczna ilustracja przedstawiająca sposób przeprowadzania testu fluktuacji ze szczepem drobnoustrojów w płytce z 96 studniami. (A) Zaszczepić i zaaklimatyzować komórki w probówkach o pojemności 50 ml zawierających pięć różnych środowisk (testy "czerwone", "niebieskie", "zielone", "fioletowe" i "pomarańczowe"). (B) Przygotować równoległe kultury z niewielką liczbą wrażliwych komórek na płytce o głębokości 96 sztuk. Test "czerwony" ma 20 równoległych kultur, podczas gdy testy "niebieskie", "zielone", "fioletowe" i "pomarańczowe" mają 19 równoległych kultur. Pozycje równoległych kultur na płytce z 96 głębokimi dołkami są losowe. Randomizację można wykonać za pomocą skryptu Supplementary LayoutGenerator.R lub innego narzędzia. Układ w prawym górnym rogu to wynik randomizacji. (C) Inkubować płytkę z 96 głębokimi dołkami i pozwolić komórkom podzielić się i spontanicznie zmutować. Sześć kultur z głębokich studni A1, B1, C1, E1, F1 i G1 pokazuje, jak zmienia się liczba mutantów: odpowiednio 4, 0, 2, 2, 1 i 4 krwinki czerwone po trzecim podziale komórkowym. Liczba mutantów różni się nie tylko ze względu na różną liczbę spontanicznych mutacji (0, 1 lub 2, jak wykazano w przypadku pierwszej krwinki czerwonej), ale także dlatego, że jest to ważne, gdy podczas cyklu hodowli spontanicznie pojawia się mutacja oporności (podział komórki 1, 2 lub 3). (D) Po inkubacji płytki z 96 studzienkami głębokościowymi liczbę mutantów określa się poprzez posiew 81 równoległych kultur. Na układzie są to okręgi bez pogrubionych krawędzi. Całą równoległą kulturę posiewa się na jednej studzience 6-dołkowej płytki zawierającej selektywny agar. (E) Pozostałe 15 kultur rozcieńcza się i posiewa na nieselektywnym agarze w celu określenia średniej liczby komórek (_{N t}). Na układzie są one oznaczone jako Ntwells i mają pogrubione krawędzie. Dla każdego oznaczenia N_t uśrednia się z trzech równoległych kultur. Na dole po prawej stronie znajduje się szalka Petriego zawierająca nieselektywną płytkę agarową z 25 jtk rozcieńczonej kultury wyhodowanej w studzience głębinowej D1 (część "zielonego" testu). (F) Po inkubacji selektywnych płytek 6-dołkowych policzono liczbę obserwowanych mutantów i oszacowano oczekiwaną liczbę zdarzeń mutacyjnych, m, za pomocą estymatora maksymalnego prawdopodobieństwa. (G) Znając zarówno liczbę mutacji, m, jak i liczbę komórek w teście, N_t, wskaźnik mutacji oszacowano na m / N_t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Salvador Luria i Max Delbrück w 1943 roku dostarczyli genialne rozwiązanie tego problemu za pomocą testu fluktuacji⁵ (zobacz Rysunek 1). Test rozpoczyna się od wielu populacji (zwanych kulturami równoległymi), które są inicjowane niewielką liczbą komórek drobnoustrojów (ryc. 1A, B). Po wzroście w łagodnym, nieselektywnym środowisku (ryc. 1C), równoległe hodowle są przenoszone na płytki zawierające selektywny marker (fagi, antybiotyki itp.), gdzie przeżywają tylko komórki z mutacją oporności i mogą wytworzyć kolonię (ryc. 1D). Głównym oczekiwaniem było to, że jeśli mutacje oporności zostaną wywołane, liczba komórek, które są nosicielami mutacji, powinna być rozłożona między różne populacje ze średnią równą wariancji. Luria i Delbrück odkryli w teście fluktuacji, że liczba mutantów wahała się drastycznie, a wariancja liczby mutantów w różnych populacjach była znacznie większa niż średnia. W ten sposób Luria i Delbrück wykazali, że mutacje są spontaniczne. Wykazali, że mutacje pojawiają się spontanicznie, gdy DNA jest replikowane, a liczba mutantów zależy od tego, kiedy mutacja występuje podczas wzrostu populacji. Zobacz rysunek 1C, gdzie sześć populacji, z których każda rozpoczęła się komórką drobnoustroju (na niebiesko), nie doświadcza żadnej, 1 lub 2 pojedynczych mutacji. Populacje A1, E1 i F1 doświadczyły jednej pojedynczej mutacji (pierwsza czerwona krwinka), ale ponieważ pojedyncza mutacja spontanicznie pojawia się w różnych punktach czasowych podczas cyklu hodowlanego, populacje kończyły się bardzo różną liczbą obserwowanych mutantów (odpowiednio cztery, dwa i jeden). Z drugiej strony, populacje C1 i G1 zakończyły się taką samą liczbą obserwowanych mutantów jak E1 i A1, pomimo doświadczenia dwóch zdarzeń mutacyjnych zamiast jednego. Fluktuacja obserwowanych mutantów między populacjami nie tylko nadała testowi nazwę, ale także wykazała, że częstość mutacji (tj. odsetek zmutowanych komórek) jest niewystarczającym wskaźnikiem szybkości mutacji.

Ogólnym celem testu fluktuacji jest oszacowanie tempa spontanicznych mutacji określonego genotypu bakterii lub innego jednokomórkowego organizmu rosnącego w określonym płynnym środowisku. Test fluktuacji pozostaje najodpowiedniejszym narzędziem do badania zależności środowiskowej wskaźników mutacji drobnoustrojów i umożliwia szybkie i niedrogie oszacowanie tempa mutacji. Alternatywne podejścia do szacowania częstości mutacji, takie jak sekwencjonowanie o maksymalnej głębokości⁶, sekwencjonowanie populacji⁷, eksperymenty z akumulacją mutacji⁸, lub porównywanie sekwencji genomu potomstwa z sekwencjami rodziców⁹ są znacznie bardziej pracochłonne, a zatem słabo nadają się do potencjalnego wykrywania zależności środowiskowych. Jednak dynamiczne aspekty powstawania i naprawy mutacji są w dużej mierze niedostępne dla testu fluktuacji lub dla żadnej z metod oznaczania częstości mutacji wymienionych powyżej. Aby zbadać, jak liczba mutacji zmienia się w czasie, przestrzeni lub między pojedynczymi komórkami w populacji, konieczne są podejścia do pojedynczej komórki^11,12 są niezbędne, oprócz tego, że są bardziej pracochłonne niż testy fluktuacji, wymagają wysoce specjalistycznych umiejętności i sprzętu.

W praktyce, test fluktuacji polega na zliczaniu komórek, które uzyskały marker fenotypowy z powodu mutacji, która występuje w środowisku bez selekcji dla tego markera. Metaanaliza setek opublikowanych testów¹⁰ pokazuje, że od momentu powstania testu w 1943 roku zastosowano co najmniej 39 różnych markerów fenotypowych. Test fluktuacji może być wykorzystany do porównania średnich i zależności środowiskowej wskaźników mutacji między szczepami laboratoryjnymi, klinicznymi, niemutatorowymi i mutatorowymi rosnącymi w środowiskach permisywnych. Test pozwala na oszacowanie tempa mutacji w komórkach o różnym pochodzeniu genetycznym rosnących w minimalnym lub bogatym środowisku. Test jest odpowiedni nie tylko dla populacji rosnących jako monokultura, ale może być również używany do badania wpływu interakcji komórka-komórka na szybkość mutacji¹¹. Gdy szczep będący przedmiotem zainteresowania jest hodowany równolegle z drugim szczepem, a do rozróżnienia szczepów stosuje się neutralny marker, można oznaczyć tempo mutacji dla dwóch szczepów w tej samej probówce w tym samym czasie.

Testy fluktuacji wykazały, że tempo spontanicznych mutacji zależy zarówno od genotypu komórki, jak i jej środowiska¹² i jest cechą, która sama ewoluuje¹³. Za każdym razem, gdy tempo mutacji jednego konkretnego genotypu zmienia się wraz ze środowiskiem, jest to opisywane jako plastyczność szybkości mutacji¹¹. Wskaźniki mutacji plastycznych zostały najdokładniej omówione w przypadku mutagenezy wywołanej stresem (SIM)¹⁴. Ponadto, korzystając z testów fluktuacji, wykazano niedawno, że gęstość, do której rośnie populacja komórek (zazwyczaj hodowla wsadowa o nośności) jest ściśle związana z szybkością mutacji wśród bakterii i jednokomórkowych eukariontów. Tempo mutacji na genom na pokolenie zmniejsza się w gęstych populacjach nawet 23-krotnie^10,11. Ta plastyczność szybkości mutacji związana z gęstością (DAMP) może zależeć od systemu wykrywania kworum¹⁵ i działać niezależnie od SIM¹⁶.

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół dla testu fluktuacji używanego do badania szczepu Escherichia coli K-12 uzyskującego odporność na antybiotyk ryfampicynę w środowisku podłoża o minimalnej zawartości glukozy. Jednak protokół ten powinien być postrzegany jako podstawowy szablon, który można wykorzystać do badania szerokiej gamy drobnoustrojów, po prostu modyfikując warunki hodowli i fenotypowe markery mutacji. Protokół ewoluował od samego początku^{5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29} poprzez zastosowanie na szerokiej gamie drobnoustrojów, a nawet komórek rakowych³⁰ i został zmodyfikowany w celu zwiększenia przepustowości, co było niezbędne do prawidłowego testowania zależności środowiskowych wskaźników mutacji drobnoustrojów^10,11,16. Opisany tutaj protokół nie obejmuje wszystkich zagadnień metodologicznych i analitycznych testu fluktuacji, które zostały już dobrze omówione w literaturze, w szczególności wpływu mutacji opornych na dopasowanie³¹, opóźnienie fenotypowe³², cell death³³, oraz przydatność różnych dostępnych algorytmów do szacowania częstości mutacji^26,34. Może to być ważne, na przykład, gdy zależność środowiskowa efektów dopasowania może prowadzić do błędnych zmian w szacunkach szybkości mutacji³⁵. Zauważamy jednak, że narzędzia analityczne, których tutaj używamy, mogą poradzić sobie z różnicami w dopasowaniu mutantów i śmierci komórki. Jak wspomniano w uwagach i dyskusji, zaleca się również rozważenie wielu markerów fenotypowych, które prawdopodobnie nie będą miały takich samych skutków przystosowania zależnego od środowiska. Protokół ten umożliwi ludziom rutynowe oznaczanie zależności środowiskowych od tempa mutacji w różnorodności szczepów drobnoustrojów i środowisk. Oznaczanie mutacji w różnych środowiskach nie zostało jeszcze dokładnie przetestowane, a po uwzględnieniu gęstości populacji, testy fluktuacji mogą dać bardziej precyzyjne oszacowanie częstości mutacji¹⁰. Protokół ten umożliwi przeprowadzenie większej liczby testów fluktuacji, co jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw wskaźników mutacji, co z kolei ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ewolucji, rakotwórczości, starzenia się i oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Protokół

1. Dzień 1: Inokulacja i aklimatyzacja kultur

1. Zaszczepić 3 ml płynnego bulionu lizogenicznego (LB, patrz Tabela Uzupełniająca 1) odrobiną lodu z bulionu glicerolu E. coli MG1655 (18% glicerolu, -80 °C). Potrząsać kulturą LB przy 120 obr./min przez ~7 h w temperaturze 37 °C.
   nuta: W tym eksperymencie stosuje się E. coli K12 MG1655 rosnący w LB, ale test ten można przeprowadzić na dowolnym szczepie E. coli lub dowolnym innym gatunku drobnoustrojów nadających się do hodowli. Temperatura inkubacji, czas inkubacji i poziom składników odżywczych w pożywkach wzrostowych mogą podlegać zmianom w zależności od gatunku lub szczepu.
2. Rozcieńczyć kulturę 2,000 razy za pomocą roztworu soli fizjologicznej. Dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu do trzech 50 ml probówek polimerowych z nakrętką stożkową (probówki 50 ml) z 10 ml płynnej pożywki o minimalnym dnie (DM, patrz tabela uzupełniająca 1), zawierającej odpowiednio 80 mg/l, 125 mg/l lub 250 mg/l glukozy. Jest to ten sam pożywka (tj. środowisko), w którym zostanie oszacowana szybkość mutacji. Wstrząsnąć kulturami z prędkością 120 obr./min przez noc w temperaturze 37 °C.
   nuta: Wybór pożywek zależy od gatunku, szczepu lub pytania badawczego.

2. Dzień 2: Pokolenie mutantów w równoległych kulturach

1. Najpierw przygotuj środowiska, w których bakterie będą hodowane. Zawsze przygotuj 10% więcej niż jest to wymagane (np. dwadzieścia kultur o pojemności 1 ml wymaga 22 ml). Przygotować 22 ml 1) s.m. z 80 mg/l glukozy, 2) d.m. z 125 mg/l glukozy, 3) s.m. z 250 mg/l glukozy, 4) s.m. z 80 mg/l glukozy i 5) s.m. z 250 mg/l glukozy w pięciu probówkach po 50 ml. Oznacz je odpowiednio jako GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B i GLC-250B.
2. Przygotuj inokulum dla środowiska. Upewnij się, że inokulum na 1 ml środowiska zawiera 1,000-5,000 komórek. Zrób to, wykonując poniższe czynności.
   1. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) kultur nocnych (od kroku 1.2) przy długości fali 600 nm.
   2. Rozcieńczyć każdą hodowlę przez noc, aby osiągnąć ostateczną gęstość 1,000-5,000 komórek na ml s.m. z glukozą. W naszych rękach, jeśli OD mierzony w 2.2.1 wynosi 0,3, oznacza to wykonanie 100-krotnego rozcieńczenia (w roztworze soli) nocnej hodowli, a następnie dodanie 11 μl tego roztworu do środowiska o objętości 22 ml.
3. Przygotuj kultury równoległe.
   UWAGA: Protokół ten jest napisany dla jednej płytki z 96 dołkami, wykonując pięć testów fluktuacji (maksymalna rozsądna liczba na jednej płytce 96-dołkowej), przy użyciu trzech środowisk. Wraz z nabraniem doświadczenia można prowadzić równolegle wiele płytek głębinowych.
   1. Utwórz losowy układ równoległych kultur dla jednej płytki z 96 głębokimi dołkami. Można do tego użyć dodatkowego skryptu języka R LayoutGenerator.R (zobacz układ w Rysunek 1B). Umieść każdą równoległą kulturę na płytce z 96 głębokimi dołkami zgodnie z układem.
      nuta: Uruchomienie LayoutGenerator.R zapewni, że pierwszy test ma 20 równoległych kultur, a drugi, trzeci, czwarty i piąty test ma po 19 równoległych kultur.
   2. Przenieś 1 ml zaszczepionej pożywki do każdej studzienki płytki o głębokości 96 zgodnie z randomizowanym układem.
   3. Przymocuj pokrywę płytki głębokiej studzienki za pomocą taśmy. Nie mocuj mocno pokrywki, ponieważ wzrost kultury jest wrażliwy na ilość napowietrzania.
   4. Zważyć całą płytkę z pokrywką i taśmą i wstrząsnąć płytką z prędkością 250 obr./min przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Umieścić 2 l wody destylowanej w inkubatorze w celu ustabilizowania ilości parowania w zestawach doświadczalnych.
4. Określić wielkość inokulum poprzez posiew 10 μl każdej z zaszczepionych pożywek na nieselektywnej płytce agarowej z tetrazolem (TA) (patrz Tabela Uzupełniająca 1). Użyj sterylnego rozsiewacza w kształcie litery L, aż powierzchnia agaru wyschnie. Inkubować płytki agarowe TA pod przykryciem do dołu przez noc w temperaturze 37 °C.
   nuta: Agar TA to bogaty agar, który zawiera cukier L-arabinozę i rozpuszczalny w wodzie barwnik chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu, który jest bezbarwny w postaci utlenionej. Kiedy bakterie redukują barwnik, zmienia on kolor na czerwony z powodu tworzenia formazanu. Kolonie na agarze TA, które nie mogą wykorzystywać L-arabinozy, są ciemnoczerwone. Inne szczepy, takie jak MG1655, są różowawe. Zaleca się stosowanie agaru TA zamiast standardowego agaru LB, ponieważ kolorowe kolonie bakterii są łatwiejsze do zauważenia, co sprawia, że liczenie kolonii jest bardziej wiarygodne i szybsze.
5. Przygotować selektywny agar TA zawierający ryfampicynę w płytkach 6-dołkowych. Odpipetować 5 ml selektywnego agaru TA do każdej studzienki z 6 płytek dołkowych. Przygotuj antybiotyk ryfampicynę tuż przed dodaniem go do agaru TA.
   UWAGA: Gdy cykloseryna jest używana jako marker, należy użyć minimalnej pożywki Davisa z 250 mg/l glukozy uzupełnionej agarem i L-arabinozą oraz chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu jako selektywnego agaru. Mianowicie, agar TA nie selekcjonuje tylko komórek, które są odporne na cykloserynę, ponieważ trypton i ekstrakt drożdżowy (oba niezbędne składniki agaru TA) zawierają aminokwas D-alaninę. Ten aminokwas antagonizuje przeciwbakteryjne działanie cykloseryny i umożliwia wszystkim komórkom tworzenie kolonii.
   1. Pozostaw selektywne i pozostałe nieselektywne płytki w ciemności (np. w pudełku) w temperaturze pokojowej.

3. Dzień 3: Hodowle galwaniczne na selektywnych i nieselektywnych płytkach agarowych

1. Policz jednostki tworzące kolonie (CFU) na nieselektywnych płytkach agarowych i określ wielkość inokulu, mnożąc CFU przez 100. Jest to stosunek między objętością kultury równoległej (1 ml = 1 000 μl) a objętością posiewu (10 μl).
   nuta: Jeśli nieselektywne płyty są przechowywane w lodówce, CFU można policzyć później.
2. Po 24 godzinach inkubacji zważyć całą płytkę studzienki głębinowej w celu określenia stopnia parowania. Prawdopodobnie będzie to około 10%.
3. Obliczyć średnią objętość równoległej kultury po 24 godzinach inkubacji (V[24h]) w mikrolitrach, używając objętości wyjściowej V[0h] = 1,000 μl i masy płytki przeliczonej na mikrolitry, gdzie gęstość pożywki wzrostowej mierzy się w mg/μl. W tym badaniu wykorzystano gęstość 1 mg/μl:
   
4. Przenieś trzy losowo wybrane kultury na test (w sumie 15, zaznaczonych czarnym kółkiem w układzie w Rysunek 1B) do oznakowanych probówek mikrowirówek. Pozostaw je na ławce do późniejszego wykorzystania (patrz krok 3.6) w celu określenia ostatecznej wielkości populacji (lub N_t).
5. Umieścić na płytce pozostałe 81 równoległych kultur z płytki głębokiej studzienki na selektywnym agarze TA zawierającym ryfampicynę. Odpipetować jedną całą równoległą kulturę z płytki głębokiej 96 dołków do jednego dołka płytki 6-dołkowej. Upewnij się, że każda płytka 6-dołkowa zawiera równoległe kultury z więcej niż jednego testu fluktuacji.
   1. Zdejmij pokrywki z selektywnych płytek agarowych i pozostaw odkryte w sterylnych warunkach. Wysuszyć cały płyn na powierzchni selektywnego agaru TA.
      nuta: Całkowite wyschnięcie agaru ma kluczowe znaczenie. Nie należy jednak przesuszać selektywnego agaru TA, ponieważ nie wolno dopuścić do jego pęknięcia.
6. Podczas suszenia selektywnych płytek agarowych TA, co może potrwać do kilku godzin, należy oznaczyć N_t z 15 kultur przygotowanych w kroku 3.4 przy użyciu jednostek tworzących kolonie (CFU).
   1. Oznaczyć jtk przez rozcieńczenie kultur z probówek do mikrowirówek. Stosować pięć 10-krotnych etapów rozcieńczania, mieszając i wirując 900 μl roztworu soli ze 100 μl kultury na każdym etapie. Płytka 40 μl ostatniego rozcieńczenia (o współczynniku rozcieńczenia 10:⁵) na nieselektywnym agarze TA i płytki inkubacyjne przykryć na noc w temperaturze 37 °C.
      nuta: Serię rozcieńczeń w płytkach 96-dołkowych można wykonać za pomocą pipety wielokanałowej, co może zwiększyć szybkość tego etapu.
7. Gdy wszystkie studzienki na płytce 6-dołkowej są wolne od płynu hodowlanego, załóż pokrywkę z powrotem i umieść płytkę 6-dołkową pokrywką w dół na stole, aż wszystkie płytki 6-dołkowe wyschną. Gdy wszystkie wyschną, inkubować płytki pod pokrywką do dołu w temperaturze 37 °C przez 44-48 h.
   nuta: W przypadku innych markerów (kwas nalidyksowy, cykloseryna, higromycyna B lub 5-FOA) inkubować płytki przez 68-72 godziny. Upewnij się, że wilgotność w inkubatorze jest wysoka. Bardzo ważne jest, aby selektywne płytki agarowe nie wysychały w okresie inkubacji.

4. Dzień 4: Określenie liczby komórek w kulturach

1. Policz jtk na nieselektywnych płytkach agarowych. Oszacować liczbę żywotnych komórek w hodowli, mnożąc jtk przez współczynnik rozcieńczenia (10⁵) i stosunek między obliczoną średnią objętością V [24h] w mikrolitrach (patrz krok 3.3) a objętością posiewu (40 μl):
   
2. N_t konkretnego genotypu rosnącego w określonym środowisku jest średnią tych wartości z trzech kultur.

5. Dzień 5: Oszacowanie tempa mutacji

1. Policz liczbę kolonii opornych na antybiotyk na selektywnych płytkach agarowych TA (tj. liczbę opornych komórek, które powstały w wyniku spontanicznej mutacji w płytce głębokiej w dniach 2-3). Zapisz rozkład między równoległymi hodowlami obserwowanej liczby mutantów dla danego testu (np. 16 lub 17 wartości, w tym liczby zerowe).
   UWAGA: Jeśli selektywne płytki są przechowywane w lodówce, kolonie odporne na antybiotyk można policzyć później.
   1. Użyj każdego rozkładu, aby oszacować liczbę zdarzeń mutacji, m, przy użyciu pakietu R flan³⁶.
      nuta: Istnieje również pakiet R rSalvador o podobnej funkcjonalności²⁹.
   2. Zapisz rozkład zaobserwowanych mutantów dla jednego testu w pliku tekstowym jako pojedynczą kolumnę.
2. Użyj oprogramowania Shinyflan (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/), aby oszacować m zgodnie z poniższymi opisami.
   1. W zakładce Testowanie hipotez pozostaw wartości domyślne (tj. zaznaczone Nieznane Dopasowanie, Metoda Szacowania = Maksymalne Prawdopodobieństwo (ML), Rozkład Czasu Życia Mutanta = Wykładniczy (model LD), Parametr Winsora = 1,024, Liczba Mutacji i Dopasowanie = 1, Poziom Ufności = 0,95, Liczba Klas i Wartość Maksymalna = 100).
   2. Kliknij przycisk Przeglądaj i wybierz plik tekstowy z rozkładem zaobserwowanych mutantów. Spróbuj najpierw z plikiem danych uzupełniających.
   3. Po przesłaniu pliku kliknij Wykonaj test. Po prawej stronie pod Wynikiem testu, pod Test ML dla jednej próbki (model LD), znajdź Numer Mutacji. To jest m, oczekiwana liczba zdarzeń mutacyjnych.
   4. W 95-procentowym przedziale ufności dla liczby mutacji znajdź górną i dolną granicę m.
3. Gdy m i N_t (określone przez CFU) są dostępne, oszacuj szybkość mutacji określonego genotypu w określonym środowisku jako . Podziel górną i dolną granicę m przez N_t w ten sam sposób, aby wygenerować przedziały ufności dotyczące częstości mutacji (Uwaga: nie uwzględnia to niepewności w N_t).
   nuta: Wyniki przedstawiono jako częstość mutacji na locus rpoB na pokolenie. Współczynnik mutacji na parę zasad jest generowany przez podzielenie wskaźnika mutacji na locus rpoB przez 79, co jest naszą obecną wiedzą na temat tego, ile mutacji punktowych w genie rpoB nadaje oporność na ryfampicynę³⁷. Pomnożenie szybkości mutacji na nukleotyd przez wielkość chromosomu (E. coli K-12 MG1655 = 4 639 675 pz) daje szybkość mutacji na genom.
4. Powtórz kroki 5.1−5.3 z pozostałymi czterema testami fluktuacji.

Wyniki

Wyniki były zbierane za pomocą zgłoszonego protokołu w ciągu czterech różnych tygodni przez trzech różnych indywidualnych badaczy, gdzie co tydzień używano płytki z 96 głębokimi studniami do wygenerowania pięciu szacunków szybkości mutacji. W sumie trzy 96 płytek głębokich wygenerowały 15 oszacowań częstości mutacji (± 95% przedział ufności, CI) w E. coli K-12 MG1655 (Rysunek 2A, jak użyto w protokole), podczas gdy jedna płytka z 96 głęboką studnią została użyta do pięciu oszacowań (± 95% CI) mutanta E. coli K-12 BW25113 ΔmutT (Rysunek 2B). W Rysunek 2 mediana precyzji z międzykwartylowym zakresem szacowania m wynosi 17,5% (1,00%−28,9%, n = 20). Precyzja to współczynnik zmienności oczekiwanej liczby zdarzeń mutacyjnych (m) obliczony jako σ_m / m x 100% (gdzie σ jest obliczany, jak pokazano wcześniej³⁸). Surowe dane dla Rysunek 2 jest dostępny w Pliku Danych Uzupełniających "Krasovec_etal_JoVE_data.csv". Do pliku danych uzupełniających dołączony jest skrypt R do generowania Rysunek 2. Więcej informacji na temat szczepów bakteryjnych można znaleźć w Tabeli Uzupełniającej 2 oraz w Tabeli Uzupełniającej 3, w której wyjaśniono kolumny w pliku danych. Punkty danych uzyskane za pomocą ryfampicyny i kwasu nalidyksowego zostały wcześniej opublikowane w Krašovec et al.¹⁰ i mają tutaj takie same identyfikatory, jak przy pierwszej publikacji.

W Rysunek 2A przedstawiono tempo mutacji MG1655 trzech różnych markerów fenotypowych, cykloseryny, ryfampicyny i kwasu nalidyksynowego. W tym przypadku oceniano częstość mutacji w minimalnym podłożu Davisa z 80, 125 i 250 mg / L glukozy, jak wyjaśniono w protokole. W jednym przypadku użyto 1000 mg/l glukozy (Rysunek 1B). W praktyce można zastosować dowolne początkowe stężenie glukozy. Zgodnie z oczekiwaniami, wskaźniki mutacji były wyższe w przypadku oporności na cykloserynę, najniższe w przypadku oporności na kwas nalidyksowy, a wskaźnik oporności na ryfampicynę znajdował się pośrodku. Jest to zgodne ze znanymi wielkościami docelowymi dla tych trzech oporności, gdzie największa dotyczy cykloseryny, a najmniejsza kwasu nalidyksowego. Dyskusja i Rysunek 3 zawierają szczegółowe informacje na temat wykorzystania docelowych rozmiarów, objętości równoległych kultur i poziomu składników odżywczych w środowisku, aby zoptymalizować pomiar szybkości mutacji drobnoustrojów za pomocą testu fluktuacji.

Test fluktuacji wyraźnie pokazuje, który szczep jest konstytutywnym mutatorem, a który ma normalne tempo mutacji. Szczep ΔmutT miał około 50-krotnie wyższy wskaźnik mutacji do oporności na kwas nalidyksowy ( Rysunek 2B) jako MG1655 ( Figura 2A). Jednakże, aby określić tempo mutacji określonego genotypu w różnych środowiskach, zaleca się wykonanie co najmniej pięciu powtórzeń na genotyp na środowisko przy użyciu tylko jednego markera fenotypowego. Szczegółowy zarys metod statystycznych stosowanych wcześniej do analizy tego typu eksperymentów można znaleźć w informacjach uzupełniających w Krašovec et al.¹⁰.

Rycina 2: Reprezentatywna liczba wskaźników mutacji oszacowanych za pomocą testu fluktuacji w populacjach Escherichia coli. (A) Szybkość mutacji określona przez zgłoszony protokół w dzikim typie MG1655 (kręgi). Rysunek przedstawia tempo mutacji w obecności oporności na ryfampicynę (jasnoniebieskie kółka), kwas nalidyksowy (czerwone kółka) i cykloserynę (ciemnoniebieskie kółka). W przypadku kwasu nalidyksowego zastosowano większe objętości hodowli wynoszące 10 ml (patrz Plik danych uzupełniających). Dane dla ryfampicyny i kwasu nalidyksowego są przekreślone z rysunku 2a w Krašovec et al.¹⁰. (B) Szybkość mutacji do oporności na kwas nalidyksowy w klasie Keio³⁹ ΔmutT mutant (czerwone trójkąty). Zwróć uwagę na skalę logarytmiczną na osi szybkości mutacji. Słupki błędów = 95% przedziały ufności obliczone zgodnie z opisem w protokole. Dane są ponownie wykreślane z rysunku 4a w Krašovec et al.¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat blokowy do rozwiązywania problemów z testem fluktuacji. Schemat blokowy należy śledzić od góry, odnosząc się kolejno do trzech pytań w żółtych rombach, dostosowując protokół zgodnie z zawartością powstałych zielonych pól i wdrażając protokół zgodnie ze wskazówkami na czerwonych owalu. Zobacz pierwsze trzy akapity dyskusji, aby uzyskać więcej informacji na temat rozwiązywania problemów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Formuły dla mediów używanych w protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela uzupełniająca 2: Szczepy bakteryjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela uzupełniająca 3: Szczegółowy opis kolumn w pliku danych surowych Krasovec_etal_JoVE_data.csv. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dodatkowe pliki danych. Kliknij tutaj, aby pobrać te pliki.

Dyskusja

Każde oszacowanie częstości mutacji musi maksymalizować osiągniętą precyzję, aby zapewnić powtarzalność i odtwarzalność w ramach badań i między badaniami³⁴. W przypadku testu fluktuacji należy wziąć pod uwagę trzy kluczowe kwestie. Pierwsze dwa zostały ustawione w podanym protokole, ale będą wymagały rozwiązania problemów (patrz rysunek 3), jeśli protokół jest dostosowany do pracy z różnymi szczepami lub środowiskami. Pierwszym z nich jest wybór odpowiedniego markera fenotypowego. W przypadku bakterii zaleca się oszacowanie częstości występowania w jednym z dwóch loci markerowych, rpoB lub gyrA, nadających oporność odpowiednio na antybiotyki ryfampicynę i kwas nalidyksowy. Wielkość docelowa dla mutacji oporności na antybiotyki w tych dwóch loci jest różna. Istnieje 79 i 20 unikalnych mutacji nadających oporność odpowiednio na ryfampicynę³⁷ i kwas nalidyksowy⁴⁰ . W praktyce oznacza to, że średnio częściej obserwuje się mutanty oporne na ryfampicynę. Tak więc pierwszym pytaniem (Q1 na rysunku 3), na które należy odpowiedzieć, jest to, czy szczep jest mutatorem. W przypadku badań mutatorów konstytutywnych, w przypadku których spodziewanych jest wiele obserwowanych kolonii mutantów, lepiej jest użyć markera o mniejszym rozmiarze docelowym (np. kwasu nalidyksowego). Patrz rysunek 2B, gdzie tempo mutacji konstytutywnego mutatora E. coli K-12 BW25113Δ mutT oszacowano przy użyciu kwasu nalidyksowego jako markera. Podczas pracy z niemutatorowymi szczepami bakterii, które mają częstość mutacji typu dzikiego (tj. Normalnego), ryfampicyna jest lepszym wyborem (patrz Rysunek 2A). Jeśli z jakiegoś powodu potrzebnych jest więcej obserwowanych mutantów, odpowiednim markerem jest odporność na cykloserynę. W przypadku tego markera mutacje oporności mogą pojawić się w więcej niż dziesięciu genach⁴¹, co oznacza, że rozmiar docelowy jest jeszcze większy niż w przypadku ryfampicyny. Podczas badania drożdży i archeonów zaleca się oszacowanie szybkości mutacji w białkach rybosomalnych 25S i URA3, nadając oporność odpowiednio na higromycynę B i kwas 5-fluoro-orotowy (5-FOA).

Drugą krytyczną kwestią jest objętość kultur równoległych. To, która objętość zostanie użyta, zależy od rzeczywistej liczby obserwowanych mutantów. Na oczekiwaną liczbę obserwowanych mutantów ma wpływ docelowa wielkość wybranego markera fenotypowego, zdolność szczepu do naprawy i unikania mutacji (średni wskaźnik mutacji) oraz zdolność nośności środowiska, na którą wpływa zarówno zastosowana pożywka, jak i objętość hodowli. Jeśli żadne równoległe hodowle nie zawierają zmutowanych kolonii opornych na ryfampicynę, należy zastosować cykloserynę lub zwiększyć liczbę posianych komórek. Można to osiągnąć, dodając więcej glukozy do minimalnej pożywki lub hodując komórki w bogatszym (lub kompletnym) środowisku. Jednak w wielu przypadkach taki wzrost zagęszczenia populacji wiąże się ze zmniejszeniem tempa mutacji, co skutkuje ograniczonym, jeśli w ogóle, wzrostem liczby obserwowanych kolonii mutantów¹⁰. Jeśli zwiększenie składników odżywczych nie jest rozwiązaniem, to zwiększenie liczby komórek poprzez zwiększenie objętości każdej równoległej hodowli jest opcją. Gdy środowisko zawiera minimalną ilość soli, a cukier jest jedynym źródłem węgla i energii (tj. odpowiedź na pytanie Q2 na rysunku 3 brzmi "minimalne podłoże"), należy użyć objętości od 0,5 do 1,5 ml. Jeśli środowisko jest bogate, objętość równoległych kultur powinna wynosić od 0,35 do 1 ml. Ostatnie pytanie dotyczy mediany liczby odpornych kolonii. Jeśli zaobserwuje się zbyt mało zmutowanych kolonii (tj. odpowiedź na pytanie Q3 na rysunku 3 wynosi 0), a środowisko nie ma być modyfikowane, należy zwiększyć objętość równoległych kultur lub zastosować antybiotyk o większym rozmiarze docelowym (np. cykloserynę). Z drugiej strony, jeśli na wszystkich selektywnych płytkach obserwuje się wiele zmutowanych kolonii (więcej niż ~150 na płytkę, patrz ryc. 3), wówczas liczba posianych komórek powinna zostać zmniejszona, co zwykle oznacza użycie mniejszej objętości lub przejście na antybiotyk o mniejszym rozmiarze docelowym (np. kwas nalidyksowy).

Po wybraniu objętości najlepiej, aby wszystkie równoległe kultury na jednej płytce z 96 głębokimi dołkami miały tę samą objętość. Pozwala to na bardziej precyzyjne określenie rzeczywistej objętości równoległych kultur na podstawie wagi płytki. Kiedy tempo mutacji danego genotypu jest porównywane między różnymi środowiskami, ponownie najlepiej jest użyć tej samej objętości równoległych kultur we wszystkich środowiskach. Jeśli kwas nalidyksowy jest używany do szacowania częstości mutacji typu dzikiego (tj. normalnego) lub stosuje się inny marker fenotypowy, który ma jeszcze mniejszy rozmiar docelowy niż kwas nalidyksowy, objętość należy jeszcze bardziej zwiększyć. Jedną z opcji jest wykonanie równoległych kultur w probówkach o pojemności 50 ml i objętości do 15 ml. Na przykład, 10 ml równoległych kultur przygotowano w probówkach o pojemności 50 ml podczas szacowania szybkości mutacji E. coli K-12 MG1655 do kwasu nalidyksowego (patrz ryc. 2A). Równoległe kultury o pojemności 10 ml zostały następnie posiane na selektywnym agarze TA i przelane na duże płytki o średnicy 150 mm zamiast standardowych szalek Petriego o średnicy 90 mm. Wadą przygotowywania równoległych kultur w probówkach o pojemności 50 ml jest to, że przepustowość jest znacznie niższa w porównaniu z testowaniem szybkości mutacji na płytce z 96 głębokimi dołkami. Jednym z rozwiązań jest zmniejszenie liczby równoległych kultur. Wpłynie to jednak na precyzję oszacowania m, która zależy od oczekiwanej liczby zdarzeń mutacyjnych i liczby równoległych kultur²⁶. Uzyskanie rozkładu obserwowanych mutantów z 14−17 równoległymi kulturami (jak to zrobiono na rysunku 2), jest dobrą równowagą między solidną przepustowością a akceptowalnym poziomem precyzji²⁶ wynoszącym 20%. Poziom dokładności mediany wynoszący 17,5% jest podobny do mediany precyzji z przedziałem międzykwartylowym 16,4% (5,7%−38,9%, n = 580) obliczonym na podstawie znacznie większego zestawu danych¹⁰. Dlatego zaleca się, aby podczas przygotowywania równoległych kultur w 96 głębokich płytkach lub probówkach o pojemności 50 ml rozkład obserwowanych mutantów był uzyskiwany przy użyciu co najmniej 14 równoległych kultur. Gdy tempo mutacji jest szacowane w różnych środowiskach, zaleca się przetestowanie poziomów precyzji poprzez przeprowadzenie eksperymentu na wielu płytkach, w którym wszystkie 96 równoległych kultur na jednej płytce jest hodowanych w tym samym środowisku. Ponadto, podczas przygotowywania równoległych kultur, bardzo ważne jest, aby inokulum zawierało małą liczbę komórek, ponieważ zmniejsza to ryzyko obecności w inokulum jakichkolwiek opornych komórek. Istniejące wcześniej oporne mutanty nie są pożądane w inokulum, ponieważ ich liczba wzrośnie i stworzy trawnik na selektywnych płytkach, a oszacowanie tempa mutacji nie będzie możliwe. Na przykład w większości niemutatorowych populacji E. coli szybkość mutacji do oporności na ryfampicynę jest rzędu ~^10-8. Tak więc, aby uniknąć inokulacji kultury istniejącym wcześniej opornym mutantem, należy zaszczepić mniej niż 10⁸ komórek (np. 10³−10⁴ komórek). Ostatnim krytycznym krokiem jest upewnienie się, że przed inkubacją selektywnych płytek agarowych powierzchnia selektywnego agaru jest całkowicie sucha. Rozsiewacze nie mogą być używane, jeśli używane są płytki 6-dołkowe, a początkowa objętość hodowli równoległej wynosi na przykład 1 ml. Płytki należy pozostawić odkryte w sterylnych warunkach, aby płyn powierzchniowy wyschł. Czas ten może być bardzo zmienny, w zależności od warunków otoczenia i stanu płyt. Czas ten powinien być zminimalizowany, ale może wynosić nawet kilka godzin.

Test fluktuacji ma nieodłączne ograniczenia. Bada fenotypowe markery mutacji tylko w niewielkim podzbiorze genomu. Test wymaga zatem dużych populacji, które przechodzą przez wystarczającą liczbę pokoleń, aby zaobserwować wystarczającą liczbę mutacji, aby w ogóle oszacować tempo. Oznacza to, że testy fluktuacji mogą być stosowane tylko w przypadku organizmów, które są zdolne do szybkiego przechodzenia przez dużą liczbę pokoleń, takich jak bakterie, drożdże piekarskie⁴² lub komórki ssaków z kultur płynnych³⁰. Ponadto mutacje są rzadkimi zdarzeniami występującymi w określonych warunkach biochemicznych danej komórki. Fakt, że testy fluktuacji obejmują duże populacje komórek w czasie, oznacza, że okoliczności te mogą się znacznie różnić. Korzystając z tego testu, trudno jest zatem badać progresję tempa mutacji w danej populacji od fazy opóźnienia do wczesnej i późnej fazy wykładniczej, a ostatecznie do fazy stacjonarnej. Wszelkie różnice w częstości mutacji między pojedynczymi komórkami w populacji są całkowicie ukryte przed testem fluktuacji. Dynamikę mutacji pojedynczych komórek można badać za pomocą śledzenia pojedynczej cząsteczki białka naprawy DNA MutS⁴³ lub przez zliczanie ognisk nagromadzonych białek MutL⁴⁴. Niedawne postępy w sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym umożliwiły również bezpośrednie oszacowanie wskaźników mutacji w triach rodzic-potomstwo ^9,45 i rodowodowych wielopokoleniowych⁴⁶. Taki postęp metodologiczny zaczyna pozwalać na bezpośrednie liczenie mutacji zachodzących w ciągu jednego pokolenia. Jednak to bezpośrednie podejście wymaga drogich i najnowocześniejszych technologii, takich jak mikroskopia fluorescencyjna, mikrofluidyka lub sekwencjonowanie całego genomu. Z drugiej strony test fluktuacji jest stosunkowo niedrogi i potrzebny jest tylko standardowy sprzęt laboratoryjny. Przeprowadzenie większej liczby testów fluktuacji ułatwi również generowanie nowych hipotez, które mogą być testowane przy użyciu bardziej bezpośrednich podejść do pojedynczych komórek.

Od dawna istnieje zainteresowanie badaniem mutacji, więc test fluktuacji prawdopodobnie pozostanie powszechnie stosowaną metodą. Liczba cytowań przełomowej pracy Lurii i Delbrücka⁵ w ciągu ostatnich 4 lat (2015-2018) znalazła się w pierwszej piątce cytowań tej pracy. Jednak ze względu na dużą ilość precyzyjnej pracy ręcznej potrzebnej do prawidłowego przeprowadzenia testu fluktuacji, większość badań przeprowadza tylko kilka testów fluktuacji. Jest to jednak niewystarczające, aby ujawnić środowiskowe zależności tempa mutacji. Dzięki usprawnieniu testów fluktuacji przy użyciu płytek wielodołkowych, jak wyjaśniono w tym artykule, obecna maksymalna możliwa przepustowość wynosi 11 płytek głębinowych (55 testów fluktuacji) równolegle, jak opisano tutaj. Przeprowadzanie dwóch zestawów testów fluktuacji rozłożonych równolegle o jeden dzień pozwala na przeprowadzenie do 110 testów tygodniowo. Kolejna skokowa zmiana przepustowości może być jeszcze możliwa dzięki automatyzacji różnych etapów testów fluktuacji z podanego czysto ręcznego protokołu. Ponadto, aby zbadać zależności środowiskowe tempa mutacji, należy wziąć pod uwagę gęstość zaludnienia. Poprzednie wyniki¹⁰ pokazują, że gdy weźmie się pod uwagę znane czynniki wpływające na tempo mutacji, kontrolowanie gęstości populacji może zmniejszyć zmienność w szacunkach częstości mutacji o ponad 90%. Aby kontrolować zagęszczenie, zalecamy, aby N_t (używane do szacowania częstości mutacji) było oznaczane niezależnie od metody stosowanej do określania zagęszczenia populacji. U bakterii N_t można oznaczyć za pomocą CFU i gęstości, na przykład za pomocą testu luminescencji opartego na ATP¹⁰.

Wysoka przepustowość i kontrolne zagęszczenie są niezbędne podczas badania, w jaki sposób kontekst ekologiczny organizmu wpływa na tempo spontanicznych mutacji. Wiedza o istnieniu plastyczności szybkości mutacji jest ważna, ale zrozumienie jej przyczyn i skutków jest kluczowym wyzwaniem, któremu należy sprostać, jeśli plastyczność szybkości mutacji ma zostać włączona do szerszego kontekstu biologicznego. Test fluktuacji jest doskonałym narzędziem, które można wykorzystać do testowania wielu hipotez, ponieważ wyniki uzyskuje się szybko, a testy są niedrogie w porównaniu z innymi metodami. Na przykład przygotowuje się grunt pod badanie zależności środowiskowych od tempa mutacji w społecznościach bakteryjnych i mikrobiomach. Dostosowanie testu fluktuacji do kokultur może przetestować hipotezę, że szczepy wpływają na tempo mutacji za pośrednictwem małych cząsteczek. Przeprowadzenie tysięcy testów fluktuacji z kokulturami może określić, czy szczepy różnią się zarówno pod względem zdolności do wzajemnego modyfikowania tempa mutacji, jak i podatności na modyfikację ich szybkości mutacji przez inne. Być może różnice między szczepami w podatności na manipulację szybkością mutacji można przypisać specyficznej zmienności genetycznej. Może to zmienić nasze poglądy na temat tego, jak ewolucja działa w złożonych społecznościach, zwłaszcza w odniesieniu do przykładów o dużym znaczeniu, takich jak pojawienie się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 ml Probówki do mikrowirówek	Starlab International GmbH	S1615-5550
Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu	Sigma-Aldrich	T8877-10g
Płytki 6-dołkowe	Greiner Bio-One	REF 657102
90 mm Szalki Petriego Potrójnie wentylowane	ThermoFisher Scientific	REF 120189
96 płytka głębinowa (Masterblock 2 mL)	Greiner Bio-One	REF 780270
Siarczan amonu	Fisher Chemical	A/6440/53
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	REF 214010
Ekstrakt z drożdży baktonowych	Becton, Dickinson and Company	REF 212750
Cycloserine	Sigma-Aldrich	1158005-250MG	Tylko do oznaczania alternatywnego markera fenotypowego
D-glukoza bezwodna	Fisher Chemical	G/0500/61
50 mL Probówka wirówkowa	Corning	REF 430828
L-(+)-Arabinoza	Sigma-Aldrich	A3256-500g
Siarczan magnezu siedmiowodny	Fisher Chemical	M/1050/53
Kwas nalidyksowy	Sigma-Aldrich	N8878-5G	Tylko do oznaczania alternatywy marker fenotypowy
Fosforan potasu dwuzasadowy trójwodny	Sigma-Aldrich	P5504-500g
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P0662-500g
Ryfampicyna	EMD Millipore Corp, USA	557303-1GM
Chlorek sodu	Fisher Chemical	S/3160/60
Spektrofotometr	Jenway	6320D
Chlorowodorek tiaminy	Sigma-Aldrich	T4625-25g
Cytrynian trisodowy dwuwodny	Sigma-Aldrich	S1804-500g
Trypton	Fisher Chemical	1278-7099