Artykuł metodologiczny

Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/60419

⸱

3 grudnia 2019

 ,  ,  , 
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, Korea University of Science and Technology (UST)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak mierzyć przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest pomocna w podstawowych badaniach biologicznych nad zdrowiem jelit związanych z interakcją między bakteriami jelitowymi a ich gospodarzem oraz w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji czynników probiotycznych i chemicznych w leczeniu zespołu nieszczelnego jelita i chorób zapalnych jelit.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W organizmach żywych, nadmierna przepuszczalność jelit jest poważnym objawem, który prowadzi do wielu chorób zapalnych jelit (IBD). Caenorhabditis elegans to model zwierzęcy niebędący ssakiem, który jest szeroko stosowany jako system testowy ze względu na jego krótką żywotność, przejrzystość, opłacalność i brak problemów etycznych u zwierząt. W tym badaniu opracowano metodę badania wpływu różnych bakterii i 3,3'-diindolilometanu (DIM) na przepuszczalność jelit C. elegans za pomocą wysokoprzepustowego systemu analizy obrazu. Robaki zostały zakażone różnymi bakteriami jelitowymi lub były leczone jednocześnie DIM przez 48 godzin i karmione izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)-dekstranem przez noc. Następnie zbadano przepuszczalność jelit, porównując obrazy fluorescencji z intensywnością fluorescencji wewnątrz ciał robaków. Metoda ta może również mieć potencjał do identyfikacji probiotycznych i chorobotwórczych bakterii jelitowych, które wpływają na przepuszczalność jelit w modelu zwierzęcym i jest skuteczna w badaniu wpływu szkodliwych lub prozdrowotnych substancji chemicznych na przepuszczalność jelit i zdrowie jelit. Jednak protokół ten ma również pewne znaczne ograniczenia na poziomie genetycznym, zwłaszcza w przypadku określania, które geny są zmieniane w celu kontrolowania choroby, ponieważ metoda ta jest najczęściej stosowana do określania fenotypu. Ponadto metoda ta ogranicza się do dokładnego określenia, które patogenne substraty wywołują stan zapalny lub zwiększają przepuszczalność jelit robaków podczas infekcji. Dlatego konieczne są dalsze dogłębne badania, w tym badanie molekularnego mechanizmu genetycznego z wykorzystaniem zmutowanych bakterii i nicieni, a także analiza składników chemicznych bakterii, aby w pełni ocenić funkcję bakterii i substancji chemicznych w określaniu przepuszczalności jelit.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przepuszczalność jelit jest uważana za jedną z głównych barier związanych z mikrobiotą jelitową i odpornością błony śluzowej i prawdopodobnie wpływa na nią kilka czynników, takich jak modyfikacje mikrobioty jelitowej, upośledzenie nabłonka lub zmiany warstwy śluzu1. Ostatnie prace donoszą o skutecznych protokołach pomiaru przepuszczalności jelit hodowanych ludzkich komórek jelitowych poprzez analizę szybkości strumienia fluorescencji w warstwie komórek jelitowych2, ale mniej prac badawczych przedstawia odpowiednią procedurę pomiaru przepuszczalności jelit u nicieni, szczególnie u C. elegans, za pomocą barwienia FITC-dekstranu.

Istnieją dwa reprezentatywne protokoły pomiaru przepuszczalności jelit u C. elegans za pomocą czerwieni nilowej3 i disodu erioglaucyny (lub testu Smerfów)4,5. W tym protokole zastosowaliśmy dekstran FITC (średnia masa cząsteczkowa 10 000), który ma znacznie wyższą masę cząsteczkową niż czerwień nilowa (MW = 318,37) i disodowa erioglaucyny (MW = 792,85). FITC-dekstran jest bardziej podobny niż barwniki disodowe czerwieni nilowej lub erioglacjucyny do rzeczywistych makrocząsteczkowych składników odżywczych, takich jak węglowodany, które są wchłaniane przez warstwę jelitową. Przepuszczalność jelit C. elegans karmionych disodem erioglaucyny (niebieski barwnik Smerf) można łatwo ocenić bez mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak w teście Smerfa ilościowa analiza przepuszczalności jelit jest trudna ze względu na brak standaryzacji i powinna być oceniana ręcznie4,5. W przypadku testu czerwieni nilowej, czerwień nilowa barwi również kropelki lipidów w komórkach, co może zakłócać dokładne określenie przepuszczalności jelit u C. elegans6. Obecne protokoły umożliwiają szybką i precyzyjną analizę ilościową przepuszczalności jelit u C. elegans leczonych różnymi bakteriami jelitowymi i substancjami chemicznymi, unikając jednocześnie niespecyficznego barwienia lipidów.

C. elegans jest typowym modelem w dziedzinach biologicznych ze względu na przystępną cenę, łatwą manipulację, ograniczone problemy z etyką zwierząt i krótką żywotność, co jest korzystne dla szybkich eksperymentów7. W szczególności, po opublikowaniu całego genomu C. elegans, okazało się, że prawie 40% genów w genomie C. elegans jest ortologicznych w stosunku do genów powodujących choroby u ludzi8. Co więcej, przezroczysty korpus umożliwia obserwację wnętrza organizmu, co jest korzystne dla badań zdarzeń komórkowych i zastosowań fluorescencyjnych w biologii komórki, na przykład barwienia komórek macierzystych za pomocą DAPI lub immunohistochemistry9. C. elegans jest często wykorzystywany jako zwierzę doświadczalne do badania interakcji między mikrobiotą jelitową a gospodarzem; ponadto C. elegans jest używany do badań przesiewowych prozdrowotnych bakterii probiotycznych10,11,12, a także dietetycznych chemikaliów promujących zdrowie jelit13,14.

Pseudomonas aeruginosa i Enterococcus faecalis to dobrze znane bakterie jelitowe, które negatywnie wpływają na układ pokarmowy, zwłaszcza na komórki nabłonka okrężnicy przewodu pokarmowego15,16. Dlatego pomiar przepuszczalności jelit wywołanej przez te bakterie jest niezbędny do badań przesiewowych i opracowania nowych leków, które mogą odzyskać i zmniejszyć uszkodzenia spowodowane zapaleniem i infekcją bakteryjną. W tym protokole przetestowaliśmy wpływ tych bakterii jelitowych na przepuszczalność jelitową C. elegans.

Raportujemy również zoptymalizowany protokół testowania substancji chemicznych na przepuszczalność jelit C. elegans. W tym celu użyliśmy 3,3'-diindolilometanu (DIM) jako modelowej substancji chemicznej, ponieważ DIM jest bioaktywnym związkiem metabolitowym pochodzącym z indolo-3-karbinolu, który jest obecny w roślinach spożywczych Brassica i doniesiono, że ma działanie terapeutyczne na IBD u myszy17,18. Ponadto niedawno odkryliśmy, że DIM poprawia dysfunkcję przepuszczalności jelit zarówno w hodowanych ludzkich komórkach jelitowych, jak i w modelowym nicieniu C. elegans19.

W tym badaniu użyliśmy trzech różnych warunków eksperymentalnych. Po pierwsze, zmierzyliśmy wpływ różnych bakterii, P. aeruginosa i E. faecalis, na przepuszczalność jelit (Rysunek 1). Po drugie, zmierzyliśmy wpływ żywego i inaktywowanego termicznie P. aeruginosa na przepuszczalność jelit (Rysunek 2). Po trzecie, zmierzyliśmy wpływ DIM (modelowej substancji chemicznej) na przepuszczalność jelit C. elegans karmionych P. aeruginosa (Ryc. 3).

Celem tego badania było opracowanie zoptymalizowanych protokołów, które mierzą przepuszczalność jelit C. elegans, która jest zmieniana przez leczenie różnymi bakteriami jelitowymi, jak również chemikaliami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie kultury P. aeruginosa PAO1 i Escherichia coli OP50

  1. Przygotować 500 ml wysterylizowanej pożywki Luria-Bertani (LB) (Tabela 1) i zaszczepić pojedynczą kolonię P. aeruginosa w pożywce. Inkubować kulturę przez 14-15 godzin w temperaturze 37 °C z prędkością wytrząsania 150 obr./min.
  2. Równomiernie rozprowadzić kulturę bakteryjną do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 500 ml i odwirować probówki przy ciśnieniu 3,220 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  3. Usunąć supernatant do momentu, gdy objętość osiągnie 50 ml (jedna dziesiąta objętości początkowej) i ponownie zawiesić osad bakteryjny.
  4. Skoncentrowaną kulturę bakteryjną przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Okres przechowywania kultury P. aeruginosa może wynosić do 1 miesiąca, ale świeża kultura jest lepsza do wywoływania uszkodzenia jelit.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Oprócz całych żywych bakterii, supernatant kultury bakteryjnej może być użyty do zbadania działania bakterii jelitowych19.
  5. Aby przygotować E. coli OP50, należy wyhodować E. coli OP50 w pożywce DYT (Tabela 1), a następnie zastosować podobne kroki do opisanych powyżej, ale zmniejszyć objętość do jednej szóstej pierwotnej objętości. Na przykład, jeśli początkowa objętość wynosi 500 ml, po usunięciu supernatantu pozostała objętość wynosi około 83 ml.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Przygotowanie kultury Enterococcus faecalis KCTC 3206

  1. Przygotuj 500 ml wysterylizowanego bulionu z naparu z serca mózgu (BHI) (Tabela 1).
  2. Zaszczepić jedną kolonię w 500 ml bulionu BHI i inkubować kulturę przez 14–15 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 150 obr./min.
  3. Równomiernie rozprowadzić kulturę bakteryjną do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 500 ml i odwirować probówki przy ciśnieniu 3,220 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  4. Usunąć sklarowany osad do momentu, gdy jego objętość wyniesie 50 ml (jedna dziesiąta objętości początkowej) i ponownie zawiesić osad.
  5. Skoncentrowaną kulturę bakteryjną przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Świeża kultura jest lepsza do testowania wpływu na przepuszczalność jelit.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Przygotowanie inaktywowanych termicznie kultur E. coli OP50 i inaktywowanych termicznie P. aeruginosa PAO1

  1. Zahoduj i zbierz bakterie zgodnie z powyższym opisem (kroki 1.1–1.3).
  2. Inaktywuj termicznie kulturę E. coli OP50 lub P. aeruginosa PAO1, jak opisano wcześniej20,21,22. W celu inaktywacji termicznej inkubować zawieszone bakterie w temperaturze 65 °C (łaźnia wodna) przez 30 minut.
  3. Schłodzić zagęszczoną kulturę bakteryjną do temperatury pokojowej i przechowywać ją w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Okres przechowywania może wynosić do 1 miesiąca.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Przygotowanie pożywki do hodowli nicieni (NGM) do testowania wpływu różnych bakterii na przepuszczalność jelitową C. elegans

  1. W szklanej butelce o pojemności 500 ml umieść 1,25 g peptonu, 1,5 g NaCl, 8,5 g agaru, mieszadło magnetyczne i 487,5 ml wody destylowanej (tabela 1).
  2. Mieszaninę dobrze wymieszać, pozostawić mieszaninę w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C i schłodzić mieszaninę do temperatury 55 °C w łaźni wodnej przez 30 minut.
  3. Usunąć pożywkę z łaźni wodnej, dodać składniki (0,5 ml 1 M CaCl2, 0,5 ml cholesterolu, 0,5 ml MgSO4, 12,5 ml KPO4) (Tabela 1) do NGM i dobrze wymieszać.
    nuta: Wszystkie poszczególne składniki muszą być sterylizowane w autoklawie, z wyjątkiem cholesterolu (rozpuszczonego w absolutnym etanolu), a każdy etap doświadczalny musi być przeprowadzony na czystym stanowisku badawczym.
  4. Rozprowadzić 20 ml NGM na każdą szalkę Petriego o wymiarach 90 x 15 mm i pozostawić agar do zestalenia się na czystej ławce w temperaturze pokojowej (około 20 °C). Płytki NGM można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Płytki NGM używane do barwienia FITC-dekstranu przygotowano według tej samej procedury (z kroków 4.1–4.3). 10 ml NGM rozprowadzono na każdą szalkę Petriego o wymiarach 60 x 15 mm i pozostawiono do zestalenia na czystej ławce w temperaturze pokojowej (około 20 °C).
  5. Wyjąć kulturę bakteryjną z lodówki o temperaturze 4 °C i dokładnie wymieszać kulturę przed rozprowadzeniem kultury na płytkach NGM.
  6. Dodać łącznie 800 μl kultury bakteryjnej do każdej świeżej płytki NGM i pozostawić płytki do wyschnięcia w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez noc.
    nuta: Do pierwszego eksperymentu (Rysunek 1) przygotowano dwie płytki NGM z E. coli OP50, jedną płytkę NGM z P. aeruginosa PAO1 i jedną płytkę NGM z E. faecalis KCTC3206. Do drugiego eksperymentu (Rysunek 2) przygotowano dwie płytki NGM z żywym E. coli OP50, jedną płytkę NGM z żywym P. aeruginosa PAO1 i jedną płytkę NGM z inaktywowanym termicznie P. aeruginosa PAO1.

5. Przygotowanie płytek NGM do badania wpływu substancji chemicznej (DIM) na przepuszczalność jelit C. elegans karmionych P. aeruginosa

  1. Dodaj 0,5 g peptonu, 0,6 g NaCl, 195 ml wody destylowanej, mieszadło magnetyczne i 6,8 g agaru do szklanej butelki o pojemności 500 ml (agar NGM).
  2. Dodaj 0,5 g peptonu, 0,6 g NaCl, 195 ml wody destylowanej i mieszadło magnetyczne bez agaru do kolejnej szklanej butelki o pojemności 500 ml (bulion NGM).
  3. Dwie butelki (z kroków 5.1–5.2), jedną pustą szklaną butelkę o pojemności 100 ml należy sterylizować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C. Następnie pozostawić butelki zawierające podłoże do ostygnięcia do temperatury 55 °C w łaźni wodnej przez 30 minut. Trzymaj podłoże agarowe w łaźni wodnej i wyjmij butelkę z bulionem (z kroku 5.2) do następnego kroku.
  4. Dodaj dodatki chemiczne do bulionu NGM: 0,4 ml 1 M CaCl2, 0,4 ml cholesterolu w etanolu (ml), 0,4 ml 1 MMgSO4 i 10 ml 1 M KPO4 (wszystkie te składniki muszą być sterylizowane z wyjątkiem cholesterolu w etanolu). Następnie dokładnie wymieszać mieszaninę za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 55 °C.
  5. Oznacz autoklawowaną pustą szklaną butelkę o pojemności 500 ml dimetylosulfotlenkiem (DMSO), a autoklawowaną pustą szklaną butelkę o pojemności 100 ml za pomocą DIM.
  6. Przenieś 50 ml bulionu NGM do butelki o pojemności 100 ml z oznaczeniem DIM. Dodaj 500 μl bulionu DIM 20 mM do butelki i dobrze wymieszaj.
    nuta: DIM jest rozpuszczony w DMSO (zapas DIM 20 mM).
  7. Szybko wyjmij podłoże agarowe NGM z łaźni wodnej, dodaj 50 ml podłoża agarowego NGM do butelki z etykietą DIM i dokładnie wymieszaj.
  8. Umieścić 20 ml podwielokrotności pożywki NGM zawierającej DIM na każdej szalce Petriego o wymiarach 90 mm x 15 mm. Z tego kroku można wykonać około pięciu płytek NGM zawierających DIM.
    nuta: Końcowe stężenie DIM w każdej płytce NGM wyniesie 100 μM.
  9. Aby przygotować płytkę NGM zawierającą DMSO, przenieś 150 ml bulionu NGM do butelki o pojemności 500 ml z oznaczeniem DMSO. Dodaj 1,5 ml DMSO do butelki i dobrze wymieszaj.
  10. Dodaj 150 ml podłoża agarowego NGM do butelki z oznaczeniem DMSO i dokładnie wymieszaj.
  11. Umieścić 20 ml podwielokrotności pożywki NGM zawierającej DMSO na każdej szalce Petriego o wymiarach 90 mm x 15 mm. Na tym etapie można wykonać około piętnastu płytek NGM zawierających DMSO.
    nuta: Końcowe stężenie DMSO w każdej płytce NGM wyniesie 0,5%.
  12. Zestalić płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 godziny i przechowywać je w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  13. Wyjąć kulturę E. coli OP50 lub P. aeruginosa PAO1 z lodówki o temperaturze 4 °C (od kroku 1.4) i odpowiednio wymieszać kulturę przed rozprowadzeniem na płytkach NGM.
  14. Umieścić 800 μl kultury bakterii E. coli OP50 lub P. aeruginosa PAO1 na każdej świeżej płytce agarowej NGM i pozostawić płytki do wyschnięcia w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez noc.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. W trzecim eksperymencie (Rysunek 3) przygotowano dwie płytki NGM zawierające DMSO pokryte żywym E. coli OP50, jedną płytkę NGM zawierającą DMSO pokrytą żywym P. aeruginosa PAO1 i jedną płytkę NGM zawierającą DIM pokrytą żywym P. aeruginosa PAO1.

6. Przygotowanie C. elegans zsynchronizowanych z wiekiem

  1. Hoduj robaki na solidnej płytce NGM i karm je E. coli OP50, aż do osiągnięcia pożądanej populacji.
  2. Zsynchronizuj jaja, stosując metodę składania jaj z określonym czasem lub roztwór wybielający, jak opisano wcześniej20,23,24.

7. Leczenie bakterii lub karmienie DIM i FITC-dekstranem

  1. Inkubować jaja zsynchronizowane z wiekiem w temperaturze 20 °C przez 64 godziny na płytkach NGM uzupełnionych żywymi bakteriami E. coli OP50 jako pokarmem.
  2. Przemyć zsynchronizowane z wiekiem larwy L4 buforem S i przenieść je (ponad około 500 robaków) na płytki NGM zawierające różne bakterie i substancje chemiczne (opisane w UWAGA po krokach 4.6 i 5.14). Inkubować je w temperaturze 20 °C przez 48 h.
    nuta: Czas zabiegu może wynosić od 24 do 72 godzin, w zależności od zastosowanych bakterii i chemikaliów. Efekt terapeutyczny lub zapobiegawczy DIM można również ocenić poprzez wstępne traktowanie robaków patogenami, a następnie leczenie robaków DIM (efekt terapeutyczny) lub poprzez wstępne traktowanie robaków DIM, a następnie leczenie patogenami (efekt zapobiegawczy)19.
  3. Aby przygotować płytki uzupełnione dekstranem FITC, należy zmieszać 2 ml inaktywowanego termicznie E. coli OP50 z 4 mg dekstranu FITC. Następnie podzielić 100 μl mieszaniny FITC-dekstranu i E. coli OP50 na dwadzieścia świeżych płytek agarowych NGM (60 mm x 15 mm) i pozostawić płytki do wyschnięcia na 1 godzinę na czystej ławce.
    nuta: Końcowe stężenie dekstranu FITC-w każdej płytce NGM wyniesie 20 μg/ml.
  4. Przygotować pięć płytek NGM zawierających E. coli OP50 bez dekstranu FITC-dekstran do badania kontrolnego nośnika. W tym celu podzielić 100 μl inaktywowanej termicznie E. coli OP50 na każdą świeżą płytkę agarową NGM (60 mm x 15 mm) i pozostawić płytki do wyschnięcia na 1 godzinę na czystej ławce.
    nuta: Do każdego niezależnego eksperymentu wymagane jest piętnaście płytek NGM uzupełnionych dekstranem FITC i pięć płytek NGM bez dekstranu FITC.
  5. Po 48 godzinach leczenia (od kroku 7.2) przemyć robaki buforem S, przenieść robaki na płytki z dodatkiem dekstranu FITC i płytki NGM bez dekstranu FITC, a następnie inkubować płytki przez noc (14–15 godzin).
    nuta: Dla każdej grupy badanej wymagane jest 5 powtórzeń barwienia FITC-dekstranem (lub podawania w grupie kontrolnej nośnika).
  6. Umyj robaki buforem S i pozwól im wpełznąć do świeżej płytki agarowej NGM przez 1 godz.
    nuta: Do każdego niezależnego eksperymentu potrzebnych jest łącznie 20 świeżych płytek NGM. W tym kroku możesz użyć płytki NGM uzupełnionej bez lub z E. coli OP50.
  7. Dodać 50 μl 4% roztworu formaldehydu do każdego dołka czarnej 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Przenieś około 50 robaków z każdej płytki NGM do każdej studzienki w celu pomiarów fluorescencji. Po 1 do 2 minutach dokładnie usuń cały formaldehyd z każdej studzienki i dodaj 100 μl podłoża montażowego, aby pokryć studzienki.
    nuta: Roztwór formaldehydu (4%) służy do unieruchamiania i utrwalania robaków. Dla każdej grupy badanej wykorzystuje się 5 dołków (5 powtórzeń) do analizy obrazu.

8. Obrazowanie C. elegans za pomocą systemu obrazowania operetki i oznaczanie przepuszczalności jelit poprzez pomiar wychwytu fluorescencji FITC-dekstranu

UWAGA: Stereomikroskopia fluorescencyjna może być używana do analizy obrazu zamiast systemu Operettka.

  1. Przechwytuj obrazy fluorescencyjne i mierz intensywność fluorescencji za pomocą systemu obrazowania Operetta High-Content i analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Harmony.
  2. W oprogramowaniu Harmony naciśnij ikonę Otwórz pokrywę, aby otworzyć pokrywę i włożyć płytkę do urządzenia.
  3. Skonfiguruj parametry.
  4. Kliknij przycisk Konfiguruj, wybierz typ płyty (96-dołkowa płyta corning z płaskim dnem) i dodaj kanały (kanały jasnego pola i EGFP).
  5. Dostosuj układ. Przejdź do wyboru Układ, a następnie wybierz Ścieżka i dostosuj parametry (pierwsze zdjęcie na 1 μm, liczba płaszczyzn to 10, odległość to 1 μm).
  6. Wybierz jedną z studzienek zabiegowych i jedno pole przechwytywania i naciśnij Testuj, aby sprawdzić, czy zdjęcia są zadowalające w sekcji Uruchom eksperyment.
  7. Jeśli zdjęcia są zadowalające, wróć do sekcji Konfiguracja i naciśnij ikonę resetowania na końcu ekranu. Następnie należy zaznaczyć wszystkie studnie docelowe i odpowiednią liczbę pól przechwytywania.
  8. Przejdź ponownie do pozycji Uruchom eksperyment i wprowadź nazwę tablicy, a następnie naciśnij Start, aby rozpocząć przetwarzanie.
  9. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, przejdź do sekcji analizy obrazu i wprowadź obraz. Znajdź komórkę, wybierając kanał EGFP i metodę B. Dostosuj wspólny próg do 0,5, obszar do >200 μm2, współczynnik podziału do 3,0, indywidualny próg do 0,18 i kontrast do więcej niż 0,18. Następnie oblicz właściwości intensywności i wybierz średnią jako wynik wyjściowy. Naciśnij ikonę Zastosuj, aby zapisać konfigurację.
  10. Przejdź do sekcji Ocena, aby zmierzyć intensywność, uzyskując mapę cieplną i tabelę danych. Ustaw parametr Readout na Cells — Intensity Cell EGFP Average — Average per Well i rozpocznij ocenę.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  11. Aby wyodrębnić dane z Operetki, kliknij przycisk Ustawienia i wybierz Zarządzanie danymi.
  12. Wybierz pozycję Zapisz archiwum, a następnie otwórz przycisk przeglądania i wybierz plik.
  13. Aby wybrać plik, kliknij mały sygnał + w lewym rogu, a następnie kliknij Pomiar i wybierz Nazwa płyty.
  14. Wybierz plik i kliknij przycisk OK.
  15. Wybierz ścieżkę, aby zapisać plik, klikając sygnał Przeglądaj w aktywnej ścieżce.
  16. Kliknij przycisk Start, aby zapisać plik danych.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

9. Analiza statystyczna fluorescencji FITC-dekstranu C. elegans

  1. Zaimportuj dane i oblicz średnią i odchylenie standardowe (SD) za pomocą oprogramowania statystycznego.
  2. Przeanalizuj istotną różnicę za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnego porównania Tukeya.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po inkubacji z P. aeruginosa PAO1, C. elegans wykazał znaczny wzrost fluorescencji FITC-dekstranu w ciele robaka w porównaniu do fluorescencji wykazanej po inkubacji z pozostałymi dwoma szczepami bakteryjnymi (Rysunek 1). Intensywność fluorescencji robaków karmionych E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 i E. faecalis KCTC3206 wynosiła odpowiednio 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9 i 105,6 ± 10,6%. Dane podkreślają, że P. aeruginosa spowodował bardziej istotne u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystując tę nową metodę określania przepuszczalności jelit u C. elegans, która łączy zautomatyzowaną mikroskopię fluorescencyjną i ilościową analizę obrazu, można określić różnice spowodowane przez mikroorganizmy jelitowe lub substancje chemiczne in vivo, szczególnie w jelicie C. elegans. Protokół ten jest przydatny do badań przepuszczalności jelit i ma zastosowanie do wielu zadań, takich jak oznaczanie reaktywnych form tlenu (ROS) w warunkach stresu i badania morfologiczne, ze względu na wygodę i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant badawczy Koreańskiego Instytutu Nauki i Technologii (2E29563).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3,3'-diindolylmetan SigmaD9568
90 razy; 15 mm szalki PetriegoSPL Life Sciences, Korea Południowa10090
60 razy; Szalki Petriego 15 mmSPL Life Sciences, Korea Południowa10060
Bactor AgarBeckton DickinsonREF. 214010
Roztwór formaldehydu SigmaF1635
Napar z mózgu i serca (BHI) Becton DickinsonREF. 237500
Caenorhabditis elegans N2Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)Typ dziki 
CholesterolSigmaC3045
Płytka testowa Costa, 96 dołków z przezroczystym płaskim dnem nieobrobiona, bez pokrywki PolistyrenCorning IncorporatedREF. 3631
DimetylosulfotlenekSigmaD2650
Enterococcus faecalis KCTC 3206Koreańska kolekcja do hodowli typuKCTC NR 3206Fałszywa beztlenowa
Escherichia coli OP50Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)
Izotiocyjanian fluoresceiny - oprogramowanie dekstranSigmaFD10S
Harmony PerkinElmerverson 3.5
Luria-Bertani LB mediumMerckVM743185 626  1.10285.5000
Siarczan magnezu siedmiowodny Fisher BioreagentsBP2213-1
Fluoromount wodne medium montażoweSigmaF4680
Operetka CLS System analizy o wysokiej zawartościPerkinElmer 
HH16000000 PeptoneMerckEMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01Koreańska kolekcja dla kultur typuKCTC NR 1637
Chlorek soduFisher BioodczynnikiBP358-1
Mikroskop stereoskopowyNikon, JaponiaSMZ800N
Ekstrakt z drożdżyBecton DickinsonREF. 212750

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189(2014).
  2. Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
  3. Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26(2018).
  4. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  5. Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135(2016).
  6. Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352(2018).
  7. Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
  8. Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
  9. Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
  10. Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441(2018).
  11. Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
  12. Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
  13. Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290(2014).
  14. Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
  15. Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
  16. Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
  17. Huang, Z., et al. 3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
  18. Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
  19. Kim, J. Y., et al. 3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
  20. Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437(2017).
  21. Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
  22. Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  24. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  25. Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227(2015).
  26. Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791(2018).
  27. Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).
  28. Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
  29. Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
  30. Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
  31. Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
  32. Kim, Y. H., et al. 3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
  33. Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
  34. Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

C elegansobrazowanie wysokoprzepustowedekstran FITCinfekcja bakteryjnatraktowanie DIMintensywno fluorescencjiurz dzenie Operettaoprogramowanie Harmonybariera jelitowa

Powiązane artykuły