Artykuł metodologiczny

Analiza wirusowych SSHHPS grupy IV przy użyciu metod in vitro i in silico

27K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60421

⸱

21 grudnia 2019

 ,  , 
1National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, 2United States Naval Research Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy ogólny protokół identyfikacji krótkich odcinków homologicznych sekwencji białka gospodarz-patogen (SSHHPS) osadzonych w poliproteinie wirusa. SSHHP są rozpoznawane przez proteazy wirusowe i kierują ukierunkowanym niszczeniem określonych białek gospodarza przez kilka wirusów grupy IV.

Streszczenie

Enzymy alfawirusowe są syntetyzowane w pojedynczym polipeptydzie. Niestrukturalna poliproteina (nsP) jest przetwarzana przez proteazę cysteinową nsP2 w celu wytworzenia aktywnych enzymów niezbędnych do replikacji wirusa. Proteazy wirusowe są wysoce specyficzne i rozpoznają konserwatywne sekwencje motywów miejsca cięcia (~6-8 aminokwasów). W kilku wirusach grupy IV sekwencje motywu motywu miejsca rozszczepienia proteazy nsP można znaleźć w specyficznych białkach gospodarza zaangażowanych w generowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, a w niektórych przypadkach docelowe białka wydają się być powiązane z fenotypem wywołanym przez wirusa. Wirusy te wykorzystują krótkie odcinki homologicznych sekwencji białek gospodarz-patogen (SSHHPS) do ukierunkowanego niszczenia białek gospodarza. Aby zidentyfikować SSHHPS, sekwencje motywu motywu miejsca rozszczepienia proteazy wirusowej można wprowadzić do BLAST i przeszukać genom (genomy) gospodarza. Rozszczepienie początkowo można przetestować przy użyciu oczyszczonej proteazy wirusowej nsP i substratów transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) wykonanych z E. coli. Substraty FRET zawierają cyjan i żółte białko fluorescencyjne oraz sekwencję miejsca rozszczepienia (sekwencja CFP-YFP). Ten test proteazy może być stosowany w sposób ciągły w czytniku płytek lub nienieprzerwanie w żelach SDS-PAGE. Modele związanych substratów peptydowych mogą być generowane in silico, aby pomóc w wyborze substratu i badaniach mutagenezy. Substraty CFP/YFP zostały również wykorzystane do identyfikacji inhibitorów proteazy. Te metody in vitro i in silico mogą być stosowane w połączeniu z testami komórkowymi w celu określenia, czy docelowe białko gospodarza wpływa na replikację wirusa.

Wprowadzenie

Dowody poziomego transferu genów z wirusa na gospodarza lub z gospodarza na wirusa można znaleźć w różnych genomach1,2,3,4. Przykładami endogenizacji wirusowej są sekwencje dystansowe CRISPR znajdujące się w genomach bakteryjnych gospodarzy4. Ostatnio znaleźliśmy dowody na sekwencje białek gospodarza osadzone w niestrukturalnych poliproteinach wirusów grupy IV (+)ssRNA. Sekwencje te w regionach kodujących genomu wirusa mogą być rozmnażane pokoleniowo. Krótkie odcinki homologicznych sekwencji białka gospodarz-patogen (SSHHPS) znajdują się w wirusie i gospodarzu5,6. SSHHPS to konserwatywne sekwencje motywów miejsca rozszczepienia rozpoznawane przez proteazy wirusowe, które mają homologię do określonych białek gospodarza. Sekwencje te kierują niszczeniem określonych białek gospodarza.

W naszej poprzedniej publikacji6, sporządziliśmy listę wszystkich białek gospodarza, które były celem proteaz wirusowych i stwierdziliśmy, że lista celów była nielosowa (Tabela 1). Widoczne były dwie tendencje. Po pierwsze, większość proteaz wirusowych, które przecinały białka gospodarza, należała do wirusów grupy IV (24 z 25 przypadków dotyczyły proteaz wirusowych grupy IV), a jedna proteaza należała do retrowirusów grupy VI (HIV, ludzki wirus niedoboru odporności)7. Po drugie, cele białkowe gospodarza cięte przez proteazy wirusowe były na ogół zaangażowane w generowanie wrodzonych odpowiedzi immunologicznych, co sugeruje, że rozszczepienia miały na celu zantagonizowanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Połowa białek gospodarza, na które ukierunkowane są proteazy wirusowe, była znanymi składnikami kaskad sygnałowych, które generują interferon (IFN) i cytokiny prozapalne (Tabela 1). Inni byli zaangażowani w transkrypcję komórek gospodarza8,9,10 lub translation11. Co ciekawe, Shmakov et al.4 wykazali, że wiele sekwencji protospacerowych CRISPR odpowiada genom zaangażowanym w koniugację lub replikację plazmidu4.

Grupa IV obejmuje między innymi Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae i Togaviridae. Kilka nowych i pojawiających się patogenów należy do grupy IV, takich jak wirus Zika (ZIKV), Zachodni Nil (WNV), Chikungunya (CHIKV), wirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS) i wirus bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS). Genom (+)ssRNA jest zasadniczo fragmentem mRNA. Aby wytworzyć enzymy niezbędne do replikacji genomu, genom (+)ssRNA musi najpierw zostać poddany translacji. W alfawirusach i innych wirusach grupy IV enzymy niezbędne do replikacji są wytwarzane w pojedynczej poliproteinie (tj. nsP1234 dla VEEV). Niestrukturalna poliproteina (nsP) jest proteolitycznie przetwarzana (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) przez proteazę nsP2 w celu wytworzenia aktywnych enzymów12 (Figura 1). Rozszczepienie poliproteiny przez proteazę nsP2 jest niezbędne do replikacji wirusa; Wykazano to poprzez delecję i mutagenezę ukierunkowaną na miejsce aktywne cysteiny miejsca aktywnego proteazy nsP213,14. Warto zauważyć, że translacja białek wirusowych poprzedza zdarzenia replikacji genomu. Na przykład nsP4 zawiera zależną od RNA polimerazę RNA potrzebną do replikacji genomu (+)ssRNA. Replikacja genomu może wytwarzać produkty pośrednie dsRNA; Te produkty pośrednie mogą wyzwalać wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza. W związku z tym wirusy te mogą rozszczepiać białka wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza na wczesnym etapie infekcji, aby stłumić ich działanie15,16,17.

Wyciszenie może wystąpić na poziomie DNA, RNA i białka. Wspólną cechą każdego z mechanizmów wyciszania pokazanych na rysunku 1 jest to, że krótkie obce sekwencje DNA, RNA lub białka są wykorzystywane do kierowania niszczeniem określonych celów, aby zantagonizować ich funkcję. Mechanizmy wyciszania są analogiczne do programów typu "wyszukaj i usuń", które zostały napisane w trzech różnych językach. Krótka sekwencja miejsca rozszczepienia jest analogiczna do "słowa kluczowego". Każdy program ma enzym, który rozpoznaje dopasowanie między krótką sekwencją ("słowem kluczowym") a słowem w "pliku", który ma zostać usunięty. Po znalezieniu dopasowania enzym tnie ("usuwa") większą sekwencję docelową. Trzy mechanizmy pokazane na rysunku 1 są wykorzystywane do obrony gospodarza przed wirusami lub do obrony wirusa przed układem odpornościowym gospodarza.

Proteazy wirusowe rozpoznają krótkie sekwencje motywów miejsca cięcia między ~2-11 aminokwasami; w nukleotydach odpowiada to 6-33 zasadom. Dla porównania, sekwencje dystansowe CRISPR to ~26-72 nukleotydy, a RNAi to ~20-22 nukleotydy18,19. Chociaż sekwencje te są stosunkowo krótkie, można je rozpoznać w specyficzny sposób. Biorąc pod uwagę większą różnorodność aminokwasów, prawdopodobieństwo losowego rozszczepienia jest stosunkowo niskie w przypadku proteazy wirusowej rozpoznającej sekwencje białek składające się z 6-8 aminokwasów lub dłuższych. Przewidywanie SSHHPS w białkach gospodarza będzie w dużej mierze zależało od specyficzności badanej proteazy wirusowej. Jeśli proteaza ma ścisłe wymagania dotyczące specyficzności sekwencji, szansa na znalezienie sekwencji miejsca rozszczepienia wynosi 1/206 = 1 na 64 miliony lub 1/208 = 1 na 25,6 miliarda; jednak większość proteaz ma zmienne tolerancje podmiejsc (np. R lub K mogą być tolerowane w miejscu S1). W związku z tym nie ma wymogu identyczności sekwencji między sekwencjami znajdującymi się w gospodarzu a wirusem. W przypadku proteaz wirusowych, które mają luźniejsze wymagania dotyczące sekwencji (takich jak te należące do Picornaviridae), prawdopodobieństwo znalezienia miejsca rozszczepienia w białku gospodarza może być wyższe. Wiele pozycji w tabeli 1 pochodzi z rodziny Picornaviridae.

Notacja Schechtera i Bergera20 jest powszechnie używana do opisania reszt w substracie proteazy i podmiejsc, z którymi się wiążą, używamy tego zapisu w całym tekście. Reszty w podłożu, które są N-końcem wiązania nożycowego, są oznaczone jako P3-P2-P1, podczas gdy te, które są C-końcowe, są oznaczone jako P1'-P2'-P3'. Odpowiednie podmiejsca w proteazie, które wiążą te reszty aminokwasowe, to odpowiednio S3-S2-S1 i S1'-S2'-S3'.

Aby określić, które białka gospodarza są celem ataku, możemy zidentyfikować SSHHPS w miejscach cięcia poliprotein wirusa i poszukać białek gospodarza, które je zawierają. W niniejszym artykule przedstawiamy procedury identyfikacji SSHHPS przy użyciu znanych sekwencji miejsca cięcia proteazy wirusowej. Opisane metody bioinformatyczne, testy proteazy i metody in silico są przeznaczone do stosowania w połączeniu z testami komórkowymi.

Dopasowanie sekwencji białek gospodarza, do których dążą proteazy wirusowe, ujawniło specyficzne dla gatunku różnice w tych krótkich sekwencjach miejsc rozszczepienia. Na przykład odkryto, że proteaza nsP2 wirusa wenezuelskiego zapalenia mózgu koni (VEEV) przecina ludzki TRIM14, białko z motywem trójdzielnym (TRIM)6. Niektóre białka TRIM są czynnikami restrykcyjnymi wirusa (np. TRIM5α21), większość z nich uważa się za ligazy ubikwityny E3. TRIM14 nie ma domeny RING (naprawdę interesujący nowy gen) i nie jest uważany za klasę ligazy E322. Zaproponowano, że TRIM14 jest adaptorem w mitochondrialnym przeciwwirusowym signalosomie (MAVS)22, ale może mieć inne funkcje przeciwwirusowe23. Wyrównanie sekwencji TRIM14 z różnych gatunków pokazuje, że konie nie mają miejsca rozszczepienia i mają okrojoną wersję TRIM14, w której brakuje C-końcowej domeny PRY/PRY. W tej domenie znajduje się miejsce poliubikwitynacji (ryc. 2). U koni wirusy te są wysoce śmiertelne (~20-80% śmiertelności), podczas gdy u ludzi tylko ~1% umiera z powodu infekcji VEEV24. Rozszczepienie domeny PRY/SPRY może przejściowo spowodować zwarcie kaskady sygnalizacyjnej MAVS. Kaskada ta może być wywoływana przez dsRNA i prowadzi do produkcji interferonu i cytokin prozapalnych. W związku z tym obecność SSHHPS może być przydatna do przewidywania, które gatunki mają systemy obronne przeciwko określonym wirusom grupy IV.

W wirusach grupy IV mechanizmy antagonizmu IFN są uważane za wielokrotnie zbędne25. Rozszczepienie białka gospodarza może być przejściowe podczas infekcji, a stężenia mogą z czasem powrócić. Odkryliśmy w komórkach, że produkty rozszczepienia TRIM14 można wykryć bardzo wcześnie po transfekcji (6 godzin) z plazmidem kodującym proteazę (promotor wirusa cytomegalii). Jednak w dłuższych okresach nie wykryto produktów rozszczepienia. W komórkach zakażonych wirusem kinetyka była inna, a produkty rozszczepienia można było wykryć w zakresie 6-48 h6. Inni zgłaszali pojawienie się produktów rozszczepienia białka gospodarza już po 3-6 godzinach od zakażenia9,11.

Aktywność proteolityczna w komórkach jest często trudna do wychwycenia; produkty rozszczepienia mogą różnić się rozpuszczalnością, stężeniem, stabilnością i żywotnością. W testach komórkowych nie można zakładać, że produkty rozszczepienia będą się gromadzić w komórce lub że intensywność pasm białka ciętego i nieciętego będzie wykazywać kompensacyjne wzrosty i spadki, ponieważ cięte białko może ulec bardzo szybkiej degradacji i może nie być wykrywalne w Western blot przy oczekiwanej masie cząsteczkowej (MW) (np. Region zawierający epitop może zostać rozszczepiony przez inne proteazy gospodarza lub może być ubikwitynowany). Jeśli substratem proteazy wirusowej jest białko wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, jego stężenie może się zmieniać podczas infekcji. Na przykład, niektóre białka wrodzonej odpowiedzi immunologicznej są obecne przed infekcją wirusową i są dalej indukowane przez interferon26. Stężenie białka docelowego może zatem ulegać wahaniom podczas infekcji, a porównanie lizatów komórkowych niezakażonych i zakażonych może być trudne do zinterpretowania. Ponadto nie wszystkie komórki mogą być jednakowo transfekowane lub zakażone. Z drugiej strony, testy proteazy in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych białek E. coli mają mniej zmiennych, które można kontrolować, a takie testy można wykonać przy użyciu SDS-PAGE zamiast immunoblotów. Zanieczyszczające proteazy mogą być zahamowane we wczesnych etapach oczyszczania białka z substratu CFP/YFP, a zmutowane proteazy wirusowe mogą być oczyszczane i testowane jako kontrola w celu ustalenia, czy rozszczepienie jest spowodowane proteazą wirusową, czy zanieczyszczającą proteazą bakteryjną.

Jednym z ograniczeń testów proteaz in vitro jest to, że nie są one tak skomplikowane jak komórki ssaków. Aby enzym mógł przeciąć swój substrat, oba muszą być zlokalizowane razem. Proteazy wirusowe grupy IV różnią się budową i lokalizacją. Na przykład proteaza ZIKV jest osadzona w błonie retikulum endoplazmatycznego (ER) i skierowana w stronę cytozolu, podczas gdy proteaza VEEV nsP2 jest rozpuszczalnym białkiem w cytoplazmie i jądrze27. Niektóre sekwencje miejsc rozszczepienia znalezione w analizie ZIKV SSHHPS znajdowały się w peptydach sygnałowych, co sugeruje, że rozszczepienie może zachodzić jednocześnie w przypadku niektórych celów. W związku z tym w tych analizach należy również wziąć pod uwagę lokalizację proteazy i substratu w komórce.

Testy oparte na komórkach mogą być cenne dla ustalenia roli zidentyfikowanego białka (białek) gospodarza w infekcji. Metody, które mają na celu zatrzymanie rozszczepienia proteazy wirusowej w białkach gospodarza, takie jak dodanie inhibitora proteazy6 lub mutacja w docelowym 16, mogą być wykorzystane do zbadania ich wpływu na replikację wirusa. Nadekspresja docelowego białka może również wpływać na replikację wirusa28. Do ilościowego określenia replikacji wirusa można zastosować testy płytki nazębnej lub inne metody.

Protokół

1. Bioinformatyka: Identyfikacja SSHHPS w genomie gospodarza przy użyciu BLAST

UWAGA: Protein BLAST jest dostępny pod adresem blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

  1. Wprowadź ~20 aminokwasów otaczających wiązanie podatne na przecięcie (scissile bond) w poliproteinie wirusowej. Wybierz sekwencje białek nieredundantne i wpisz genom gospodarza, w którym ma zostać przeprowadzona analiza (np. Homo sapiens).
    1. W razie potrzeby wybierz PHI-BLAST. Wprowadź sekwencję wzorca (np. dla 25 reszt V12 pokazanych poniżej wprowadź wzorzec "AG" bez cudzysłowu).

      figure-protocol-1

      UWAGA: W PHI-BLAST nawiasy kwadratowe [XY] oznaczają, że w danej pozycji podstronu może znajdować się aminokwas X lub Y (np. AG[AC][GAY]).
    2. Przeanalizuj wyniki BLAST i zidentyfikuj trafienia wykazujące wysoką identyczność sekwencji z resztami konserwatywnymi w miejscach cięcia poliproteiny (np. białko motywu tripartite 14) (Rycina 3).
      UWAGA: W przypadku serynowych proteaz oczekuje się wyższego stopnia konserwatywności reszty P1, natomiast w przypadku cysteinowych proteaz – wyższej konserwatywności reszty P2.
    3. Zaznacz kolorem reszty, które są identyczne z sekwencją miejsca cięcia i występują w kolejności sekwencyjnej (bez przerw). Reszty dopuszczalne w danym podstronie, ale występujące w innym miejscu cięcia, zaznacz drugim kolorem.
      UWAGA: Można również znaleźć reszty reprezentujące substytucje konserwatywne (np. Leu zamiast Val), które nie występują w wirusowym miejscu cięcia; mogą one być lub nie być rozpoznawane przez proteazę wirusową.
    4. Uszereguj trafienia BLAST na podstawie liczby następujących po sobie reszt identycznych lub dopuszczalnych, które pasują do sekwencji miejsca cięcia. Z listy wybierz białka zawierające ≥6 reszt identycznych lub podobnych do analizy w testach proteazy.
    5. Powtórz procedurę dla pozostałych miejsc cięcia (nsP2/3, nsP3/4 itp.) i stopniowo zwiększaj precyzję przewidywań, dodając do wzorca PHI-BLAST kolejne wysoko konserwatywne reszty.

2. Analizy in vitro: Projektowanie i przygotowywanie substratów proteaz

  1. Skonstruuj plazmid kodujący cyjanowy białko fluorescencyjne (CFP), ≤25 aminokwasów sekwencji miejsca cięcia, a następnie żółte białko fluorescencyjne (YFP, znane również jako Venus29).
    UWAGA: Plazmid można skonstruować, wykorzystując klonowanie niezależne od sekwencji i ligacji (SLIC)30 lub komercyjną syntezę genów. W niniejszej pracy wykorzystano komercyjnie zsyntetyzowany plazmid pet15b zawierający sekwencję przedstawioną na Ryc. 4.
    1. W celu optymalizacji długości substratu skonstruuj dodatkowe substraty FRET o zmiennej długości, zawierające od 12 do 25 aminokwasów naturalnych sekwencji miejsc cięcia poliproteiny wirusowej, stosując reakcję SLIC z dwoma fragmentami. Przeanalizuj cięcie, wykorzystując test oparty na żelu SDS-PAGE lub mierząc parametry kinetyki stanu stacjonarnego za pomocą metod opisanych poniżej.
      UWAGA: W niektórych przypadkach miejsca cięcia można zidentyfikować na podstawie homologii do znanych miejsc cięcia31. Jeśli nie zaobserwowano cięcia substratów zawierających sekwencje złączeń poliproteiny, może istnieć potrzeba dodania dodatkowych reszt lub motywu strukturalnego (np. alfa-helisy32). Alternatywnie, oczyszczona proteaza wirusowa może być nieaktywna. Przed przystąpieniem do analizy SSHHPS potwierdź cięcie sekwencji poliproteiny wirusowej. Liczbę reszt w substracie zoptymalizowano dla proteazy VEEV, stosując substraty o zmiennej długości (od 12 do 25 aminokwasów), a następnie analizując Vmax oraz Km32,33. Miejsca cięcia proteazy ns2B/nsB wirusa Zika użyte w przykładach zostały opublikowane34,35.
  2. Przygotuj substraty CFP/YFP, przeprowadzając świeżą transformację 8-20 µL kompetentnych komórek E. coli BL-21(DE3) plazmidem CFP-V12-YFP zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie wysiej je na płytki z agarem Luria Bertani (LB) zawierające 50 µg/mL ampicyliny (37 °C).
    1. Zautoklawuj cztery kolby o pojemności 4 L zawierające medium LB (1,5 L medium na kolbę) oraz kolbę 250 mL z 100 mL LB. Każdą kolbę zakryj folią aluminiową.
    2. Zaszczep kulturę 100 mL kolonią świeżo transformowanych bakterii i hoduj w 37 °C przy wstrząsaniu (200 rpm) przez noc.
    3. Aby przygotować substrat CFP/YFP, zaszczep cztery kolby 4 L za pomocą 25 mL kultury nocnej. Rozpocznij wstrząsanie kultur w 37 °C i monitoruj wzrost co godzinę za pomocą spektroskopii UV-vis przy 600 nm.
    4. Gdy bakterie osiągną absorbancję ~1,0 przy 600 nm (około 3-4 h wzrostu), indukuj ekspresję białka, dodając 0,5 mL 1 M izopropyl-β-D-tiogalaktosydu (IPTG) na kolbę. Po dodaniu IPTG obniż temperaturę inkubatora z wstrząsaniem do 17 °C i kontynuuj ekspresję przez noc, przez 17-20 h.
    5. Osadź bakterie w wirówce wysokich obrotów przy 7,000 x g przez 10 min (4 °C) i zachowaj osady. Usuń i wylej medium ciekłe. Przechowuj osady w -80 °C lub poddaj natychmiastowej lizie.
    6. Przygotuj 100 mL buforu do lizy zawierającego 50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 35 mL odczynnika do ekstrakcji białek bakteryjnych, 30 mg lizozymu, 25 U DNazy i 1 tabletkę inhibitora proteaz. Resuspenduj osady w buforze do lizy za pomocą pipety i przenieś ~25-35 mL do jednorazowych probówek stożkowych 50 mL.
    7. Umieść probówki w plastikowym zlewce z wodą z lodem. Włóż końcówkę sonikatora do probówek tak, aby znajdowała się ~1 cm od dna probówki, i sonikuj lizaty 10-20 razy na poziomie 5 w odstępach 15 s, aż lizat stanie się płynny i jednorodny.
      UWAGA: Podczas sonikacji należy stosować ochronniki słuchu.
    8. Przenieś lizat do probówek do wirowania wysokich obrotów i wiruj przy 20,500 x g przez 30 min w 4 °C. Po wirowaniu zachowaj nadsącz (~100 mL) i przenieś go do czystej butelki. Wylej osad.
    9. Przygotuj 1 L buforu A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl). Przygotuj 300 mL buforu B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 300 mM imidazolu).
    10. Urównoważ kolumnę niklową 100 mL, używając 3 objętości kolumny buforu A przy szybkości przepływu 5 mL/min.
    11. Nałóż lizat na kolumnę niklową przy szybkości przepływu od 2 do 5 mL/min. Przemyj kolumnę 2 objętościami kolumny buforu A, a następnie ~5 objętościami 20% buforu B. Podczas płukania 20% buforem B absorbancja przy 280 nm (A280) wzrośnie, ponieważ zanieczyszczenia będą wypłukiwane z kolumny. Kontynuuj płukanie kolumny, aż A280 eluatu powróci do wartości bazowych.
    12. Eluuj białko 2-3 objętościami kolumny 100% buforu B przy szybkości przepływu 2-5 mL/min i zbieraj frakcje po 10 mL. Zmierz A280 każdej frakcji.
    13. Połącz i zagęść frakcje o A280 > 0,1, używając jednostki do ultrafiltracji odśrodkowej 15 mL. Wiruj jednostki ultrafiltracyjne przy 5,000 x g przez 15 min i dodawaj kolejne frakcje, aż objętość zostanie zredukowana do ~50-75 mL.
    14. Odetnij 14-calowy fragment tubingu do dializy z granicą odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 6-8 kDa. Nawodnij tubing do dializy, gotując go w całkowitym zanurzeniu w 300 mL wody przez 10 min. Zawiąż pewny węzeł na jednym końcu membrany. Napełnij worek buforem do dializy, aby upewnić się, że nie ma pęknięć ani wycieków. Usuń bufor z worka i trzymaj worek zanurzony w buforze do dializy.
    15. Przenieś zagęszczone białko z etapu 2.2.13 do worka do dializy za pomocą plastikowej pipety. Usuń pęcherzyki powietrza z worka. Zamknij worek drugim węzłem lub klipsem do dializy. Dializuj białko przeciwko 500 mL 50 mM Tris pH 7,6, 5 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), 250 mM NaCl w cylindrze miarowym 500 mL przez noc w 4 °C.
    16. Dializuj białko po raz drugi przeciwko 500 mL 50 mM Tris pH 7,6 w 4 °C przez 2 h.
  3. Do kolumny wymiany anionowej przygotuj 500 mL buforu A (50 mM Tris pH 7,6) i 500 mL buforu B (50 mM Tris pH 7,6, 1,0 M NaCl). Urównoważ kolumnę wymiany anionowej 30 mL za pomocą 3 objętości kolumny buforu A (2-5 mL/min).
    1. Wyjmij białko z worka do dializy i przenieś do butelki. Trzymaj butelkę w lodzie. Nałóż zdializowane białko na kolumnę (2-5 mL/min).
      NOTE: Białko CFP/YFP zwiąże się z kolumną i będzie miało żółty kolor.
    2. Przemyj kolumnę buforem A, aż A280 powróci do poziomu bazowego (5 mL/min). Eluuj białko, stosując gradient (0-50% buforu B, 100 mL) i zbieraj frakcje po 10 mL.
    3. Oceń frakcje kolumny za pomocą SDS-PAGE. Połącz te, których czystość wynosi >95%.
    4. Zagęść białko do A280 ~10-20, używając jednostki do ultrafiltracji odśrodkowej 15 mL. Wiruj koncentrator przy 4,500 x g przez 10 min w 4 °C i dodawaj białko, aż wszystkie frakcje zawierające białko zostaną połączone.
  4. Ostrożnie usuń białko z koncentratora za pomocą pipety. Rozdziel białko do probótek mikrocentryfugowych 1,5 mL i zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania w -80 °C. Wymień bufor białka w temperaturze pokojowej, używając kolumny PD-10 urównoważonej odpowiednim buforem do testu przed użyciem.
  5. Stosując prawo Beera, oblicz stężenie białka, wykorzystując A280 i obliczony współczynnik ekstynkcji (np. dla substratu V12 ɛ = 47,790 M-1 cm-1).
    UWAGA: Współczynnik ekstynkcji (ɛ) można obliczyć z sekwencji białka przedstawionej na Ryc. 4, korzystając z programu Expasy ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/).

3. Przygotowanie cysteinowej proteazy nsP2 alphavirusa

  1. Zaprojektować i skonstruować plazmid kodujący proteazę. W przypadku proteaz cysteinowych należy użyć plazmidu pet32 do konstrukcji białka fuzyjnego z tioredoksyną (Trx).
    UWAGA: Plazmid pet32 koduje miejsce cięcia trombiny (LVPRGS) w celu usunięcia tioredoksyny i znacznika His (Rycina 5). Tioredoksyna pomoże utrzymać cysteinę w centrum aktywnym w stanie zredukowanym podczas ekspresji. W przypadku proteaz serynowych tioredoksyna nie jest potrzebna, a kroki obejmujące jej usuwanie za pomocą trombiny można pominąć. Sekwencja proteazy nsP2 VEEV została wprowadzona do plazmidu pet32b przygotowanego komercyjnie, aby uniknąć pracy z czynnikami selektywnymi (Select agents).
    1. Przeprowadzić świeżą transformację DNA plazmidowego do szczepu E. coli BL21(DE3)pLysS zgodnie z instrukcjami producenta. Wysiać bakterie na płytki z agarem LB zawierającym ampicylinę.
      UWAGA: Chloramfenikol jest stosowany wyłącznie dla szczepów E. coli niosących plazmid pLysS i jest pomijany w przypadku użycia komórek BL21(DE3). Na tym etapie nie ma potrzeby dodawania chloramfenikolu do płytki z agarem LB.
    2. Autoklawować cztery kolby o pojemności 4 L zawierające po 1,5 L pożywki LB (łączna objętość 6 L) oraz 100 mL pożywki LB w kolbie 250 mL. Każdą kolbę zabezpieczyć folią aluminiową.
    3. Zaszczepić 100 mL kultury nocnej LB/Ampicylina kolonią z płytki i hodować w inkubatorze z wytrząsaniem (200 rpm) w temperaturze 37 °C.
    4. Zaszczepić kolby 4 L za pomocą 25 mL kultury nocnej i dodać odpowiednie antybiotyki.
      UWAGA: Pożywka dla komórek BL21(DE3) pLysS niosących plazmid pet32 powinna mieć końcowe stężenia 25 µg/mL chloramfenikolu i 50 µg/mL ampicyliny.
    5. Indukować ekspresję białka, dodając 0,5 mL IPTG do kultury, gdy absorbancja przy 600 nm osiągnie wartość 1,0. Obniżyć temperaturę w inkubatorze z wytrząsaniem do 17 °C. Kontynuować ekspresję przez noc (~17 h).
    6. Zsedymentować komórki poprzez wirowanie (7 000 x g przez 10 min w 4 °C). Odlać i usunąć pożywkę ciekłą.
      UWAGA: Osady można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy lub poddać natychmiastowej lizie.
    7. Przygotować 100 mL buforu do lizy (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 2 mM beta-merkaptoetanolu (BME), 30 mg lizozymu, 5% glicerolu, 25 U DNazy, 35 mL odczynnika do ekstrakcji białek bakteryjnych). Butelki z BME otwierać w dygestorium chemicznym podczas dodawania. Lizat bakteryjny przechowywać w lodzie lub w 4 °C w tym oraz we wszystkich kolejnych krokach.
      UWAGA: W przypadku proteaz cysteinowych dodaje się 2 mM BME, aby utrzymać nukleofilową cysteinę w stanie zredukowanym. Kolumny można prowadzić w temperaturze pokojowej, używając schłodzonych buforów. Bufory powinny być przygotowane z zimnej wody dejonizowanej schłodzonej do 4 °C.
    8. Resuspendować osady bakteryjne w ~25 mL buforu do lizy i przenieść ~25 mL lizatu do 4 x 50 mL jednorazowych probówek stożkowych. Umieścić probówki w plastikowych zlewkach z wodą z lodem. Sonikować lizat 10 razy na poziomie 5 w odstępach 15 s.
    9. Przenieść lizat do probówek do wirówki wysokich obrotów. Oczyścić lizat poprzez wirowanie (30 min, 20 500 x g w 4 °C).
    10. Przygotować 0,5 L Buforu A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glicerolu, 2 mM BME) i schłodzić do 4 °C.
    11. Przygotować 250 mL Buforu B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glicerolu, 2 mM BME, 300 mM imidazolu) i schłodzić do 4 °C.
    12. Zrównoważyć 50 mL kolumnę niklową 3 objętościami kolumny Buforu A. Nałożyć oczyszczony lizat na kolumnę z przepływem 2-5 mL/min i odrzucić frakcje nieprzepływowe.
    13. Przemyć kolumnę (2-5 mL/min) 2 objętościami kolumny Buforu A, a następnie 5 objętościami kolumny Buforu A zawierającego 20% Buforu B (60 mM imidazolu). Eluować białko (5 mL/min) za pomocą 100% Buforu B i zbierać frakcje 10 mL.
    14. Połączyć i zagęścić frakcje zawierające proteazę o A280 ≥ 0,1, używając 15 mL odśrodkowej jednostki ultrafiltracyjnej i wirując przez 15 min przy 5 000 x g w 4 °C. Po zredukowaniu objętości do ~5 mL, przeprowadzić wymianę buforową białka w jednostce zagęszczającej, dodając świeży bufor do dializy do białka (50 mM Tris pH 7,6, 250 mM NaCl, 5 mM ditiotreitolu (DTT), 1 mM EDTA, 5% glicerolu). Wirować ponownie przy 5 000 x g w 4 °C przez 15 min; powtórzyć etap wymiany buforowej 2-3 razy. Przed dializą dodać do białka trombinę (20 µL stężenia 1 jednostka/µL) w celu usunięcia tioredoksyny i znacznika His.
    15. Przenieść białko do worka do dializy i dializować przeciwko 500 mL buforu do dializy (4 °C) w 500 mL cylindrze miarkowym przez noc.
      NOTE: System FPLC (szybka chromatografia cieczowa białek) oraz kolumna niklowa powinny zostać dokładnie oczyszczone buforem do płukania (2 M NaCl, 50 mM EDTA) przed przejściem do kolumny wymiany anionowej. Jakiekolwiek pozostałości niklu w liniach FPLC spowodują zabarwienie roztworów buforowych zawierających DTT na brązowo po zmieszaniu. Przemyć kolumnę niklową i system FPLC 4 objętościami kolumny wody. Dokładnie przepłukać system FPLC wodą za pomocą pompy. Kolumnę niklową można regenerować, przepuszczając przez żywicę 2 objętości kolumny 0,2 M siarczanu niklu przed kolejnymi oczyszczaniami.
  2. W celu przygotowania kolumny wymiany anionowej przygotować 1 L Buforu A (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glicerolu).
    1. Przygotować 0,5 L Buforu B (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glicerolu, 1,25 M NaCl).
    2. Zrównoważyć 30 mL kolumnę wymiany anionowej Buforem A (3 objętości kolumny, 2-5 mL/min). Umieścić probówki w kolektorze frakcji w celu zbierania frakcji nieprzypisanych.
      UWAGA: Proteaza VEEV ma obliczony punkt izoelektryczny (pI) równy 8,7 i będzie wiązać się z kolumnami wymiany kationowej, ale przepłynie przez kolumny wymiany anionowej. pI można obliczyć z sekwencji białka za pomocą programu Expasy ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/).
    3. Rozcieńczyć dializowane białko w stosunku 1:3 Buforem A, a następnie nałożyć białko (5 mL/min). Zbierać frakcje nieprzypisane w objętościach 10 mL.
  3. Zdjąć kolumnę wymiany anionowej z systemu FPLC. Podłączyć do systemu FPLC kolumnę wymiany kationowej. Zrównoważyć 30 mL kolumnę wymiany kationowej 3 objętościami kolumny Buforu A (5 mL/min).
    1. Nałożyć frakcje nieprzypisane z kolumny wymiany anionowej na kolumnę wymiany kationowej z przepływem 2-5 mL/min. Przemyć kolumnę Buforem A, aż A280 powróci do poziomu linii bazowej. Eluować białko gradientem 100 mL (0-50% Buforu B) i zbierać frakcje 10 mL.
      UWAGA: Proteaza VEEV zostanie eluowana przy stężeniu NaCl około 0,6 M.
    2. Przebadać frakcje kolumny za pomocą SDS-PAGE. Połączyć frakcje o czystości >95% i zagęścić do A280 ≈ 2, używając 15 mL odśrodkowych jednostek ultrafiltracyjnych. Enzym można zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Ciągły pomiar aktywności enzymu przy użyciu czytnika płytek

  1. Przygotować 50 mL buforu do analizy (50 mM HEPES pH 7.0).
    1. Ze względu na stosunkowo niskie wartości kcat proteaz wirusów z rodzaju alphavirus, rozcieńczyć enzym w buforze do analizy do stężenia 4,7 µM (będzie to odpowiadać w przybliżeniu A280 = 0,2 dla proteazy VEEV bez Trx).
    2. Aby zmierzyć aktywność enzymu, przygotować w buforze do analizy roztwór zapasowy substratu o stężeniu 185 µM; będzie to odpowiadać w przybliżeniu A280 = 9. W 8 probówkach do mikrocentryfugi przygotować mieszaniny reakcyjne przedstawione w Tabeli 2, łącząc odpowiednie objętości roztworu zapasowego substratu (185 µM) i buforu. Do czarnej płytki 96-dołkowej o zredukowanej powierzchni dołka (half-area) nanieść pipetą 45 µL mieszanin reakcyjnych do 3 dołków (kolumny 1, 2, 3). Wiersz A powinien zawierać mieszaninę reakcyjną o [S] = 5 µM, a wiersz H mieszaninę o [S] = 140 µM.
    3. Ustawić czytnik płytek na jednoczesną detekcję fluorescencji przy dwóch długościach fali z ustalonym ustawieniem fotopowielacza (PMT) (np. low):
      Długość fali 1 wzbudzenie = 434 nm, emisja = 527 nm
      Długość fali 2 wzbudzenie = 434 nm, emisja = 470 nm
    4. Ustawić czas odczytu na 20 min (wykonując 1 pomiar na minutę) i wybrać dołki do odczytu. Włożyć płytkę do czytnika i mierzyć spontaniczną szybkość hydrolizy przez 20 min. Monitorować stosunki emisji (emisja przy 527/emisja przy 470) w czasie.
    5. Wykonać pomiar końcowy płytki zawierającej substrat „UNCUT” (nieprzecięty).
      UWAGA: Wartości te zostaną wykorzystane w późniejszych obliczeniach danych. Średnia ze stosunków emisji z 3 dołków będzie stanowić wartości substratu „UNCUT” dla t = 0 w Tabeli 3.
    6. Wyjąć płytkę i nanieść pipetą 5 µL enzymu do każdego dołka. Odczytać płytkę ponownie przez 20 min z częstotliwością 1 pomiaru na minutę. Ustawić czytnik płytek na wyjście wartości bezwzględnych.
      UWAGA: W tym teście nachylenia będą ujemne. Każdy dołek będzie zawierał całkowitą objętość 50 µL.
    7. Po zakończeniu odczytu uszczelnić płytkę folią, aby zapobiec parowaniu. Pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej przez noc, aby umożliwić enzymowi całkowite przecięcie substratu.
    8. Po około 24 h usunąć folię uszczelniającą i wykonać pomiar końcowy płytki, używając tego samego ustawienia PMT co w przypadku poprzednich płytek. Wyznaczyć średnie stosunki emisji i wpisać je do Tabeli 3 w kolumnie „CUT” (przecięty). Potwierdzić rozszczepienie substratu za pomocą opisanej poniżej nieciągłej analizy SDS-PAGE (Krok 5.1.).
    9. Wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego. Wypisać jednostki fluorescencji w każdym punkcie czasowym dla obu długości fal (Tabela 4).
    10. Obliczyć liczbę nmol substratu, które zostały przecięte w czasie t, korzystając z równania (1), gdzie X to stosunek emisji (527 nm/470 nm) w danym punkcie czasowym, neg to stosunek emisji substratu „UNCUT” w t = 0, a pos to stosunek emisji całkowicie „CUT” substratu zmierzony po 24 h cięcia (Tabela 3).

      figure-protocol-2

      UWAGA: Reprezentatywne dane fluorescencji dla jednego dołka (dołek E7) zawierającego 80 µM substratu (4 nmol S na dołek) przedstawiono w Tabeli 4. Obliczenia wykonano dla każdego dołka na płytce.
    11. Dla każdego dołka wykreślić zależność nmol od czasu (min) i wyznaczyć prędkości początkowe (nachylenia), dopasowując dane do wzoru y = mx + b. Dla danych zebranych w punkcie 4.1.5 wykreślić nmol w funkcji czasu (min) dla każdego dołka. Nachylenie będzie równe ilości produktu w nmol wytworzonego na minutę. Od prędkości reakcji katalizowanych enzymatycznie odjąć spontaniczne prędkości hydrolizy zmierzone w 4.1.5 (Tabela 5).
      UWAGA: Pierwszy odczyt można usunąć z danych, jeśli jest on nienaturalnie wysoki z powodu ruchu płytki podczas wkładania do czytnika.
    12. Obliczyć ilość enzymu w mg dodaną do każdego dołka (np. 0,0009 mg). Jednostkę definiuje się jako µmol produktu wytworzonego na minutę (µmol/min). Podzielić nmol/min przez ilość enzymu w mg obecną w dołku, aby otrzymać mU/mg; podzielić przez 1000, aby otrzymać U/mg.
    13. Wykreślić [S] µM na osi x oraz U/mg na osi y i dopasować dane do równania Michaelisa-Menten, aby wyznaczyć Vmax i Km. Można to zrobić za pomocą oprogramowania (np. GraFit).

5. Okresowe oznaczanie aktywności enzymu za pomocą analizy SDS-PAGE

  1. Przygotować 50 µL mieszaniny reakcyjnej zawierającej 10 µM substratu i bufor zamiast enzymu, a następnie oznaczyć ją jako „UNCUT”.
    UWAGA: Objętości substratu i buforu są podane w Tabeli 2. Jeśli przeprowadzono analizę ciągłą, próbki można wykorzystać bezpośrednio z płytki 96-dołkowej.
    1. Przygotować 50 µL mieszaniny reakcyjnej zawierającej 10 µM substratu i 5 µL enzymu, a następnie oznaczyć ją jako „CUT”. Uruchomić stoper w momencie dodania enzymu do substratu.
      UWAGA: Do dodatkowych probówek zawierających enzym i substrat można dodać inhibitory. Należy dostosować objętość dodanego buforu, aby skompensować objętość dodanego inhibitora. Stężenie DMSO nie powinno przekraczać 2%.
    2. Inkubować reakcje przez ok. 15-24 h w temperaturze pokojowej (22 ± 3 °C). Przerwać reakcje poprzez dodanie 50 µL 2x buforu Laemmliego. Po przerwaniu reakcji gotować każdą probówkę przez 3-10 min.
    3. Złożyć komorę elektroforetyczną zgodnie z instrukcjami producenta. Włożyć gotową kasetę z żelem poliakrylamidowym 12% z 17 dołkami oraz ogranicznik buforu po przeciwnej stronie. Napełnić wewnętrzny zbiornik komory 1x buforem do elektroforezy SDS, aż bufor osiągnie górną krawędź kasety. Napełnić zewnętrzny zbiornik w połowie tym samym buforem.
    4. Aby przeanalizować cięcie za pomocą analizy nieciągłej, nałożyć 5 µL każdej mieszaniny reakcyjnej do dołka żelu SDS-PAGE, zaczynając od reakcji „UNCUT”. W pierwszym lub ostatnim dołku należy umieścić marker masy cząsteczkowej.
    5. Podłączyć elektrody komory elektroforetycznej do zasilacza i rozdzielić produkty przy napięciu 110 V przez 60 min. Wyjąć żel z kasety, wsuwając narzędzie do rozdzielania płyt pomiędzy płyty. Umieścić żel w plastikowej kuwecie i zanurzyć w 5-10 mL roztworu do barwienia żeli; prążki będą widoczne w ciągu 30 min. Po 1-24 godzinach usunąć nadmiar barwnika, zanurzyć żel w wodzie i użyć obrazowca żeli do wykonania zdjęcia żelu.

6. Dokowanie peptydów substratowych do cysteinowej proteazy VEEV-nsP2

  1. Pobierz plik współrzędnych proteazy cysteinowej VEEV z bazy PDB (https://www.rcsb.org/). Kod PDB to 2HWK. Zapisz plik jako 2HWK.pdb.
    1. Przygotuj strukturę białka za pomocą oprogramowania MOE (https://www.chemcomp.com/). Wczytaj plik PDB białka do programu MOE. Kliknij Select oraz Solvent na prawym pasku bocznym i usuń rozpuszczalnik.
    2. Otwórz panel Structure Preparation z górnego paska menu Protein. Automatycznie popraw wszystkie elementy strukturalne, klikając Correct, a następnie przeprowadź protonowanie struktury, klikając Protonate3D. Przypisz ładunki częściowe do białka, otwierając panel Partial Charges i wybierając Amber 99 oraz Adjust hydrogens and Lone pairs as required. Na koniec zapisz plik struktury jako „2HWK_dock.pdb”.
  2. Zbuduj struktury dla peptydów substratowych (nsP12, nsP23, nsP34) oraz TRIM14 za pomocą programu MOE. Otwórz panel Protein Builder, wprowadź sekwencję substratu, ustaw geometrię (Geometry) na Extended i kliknij Build. Struktura zostanie wyświetlona w oknie programu MOE.
    1. Zminimalizuj strukturę peptydu, klikając Minimize w panelu. Zapisz strukturę jako plik PDB (Rysunek 6).
  3. Wykonaj dokowanie peptydów substratowych do VEEV-nsP2, korzystając z PyRx/AutoDock 4.2 (http://autodock.scripps.edu/). Otwórz narzędzie PyRx, edytuj ustawienia preferencji i dezaktywuj wszystkie torsje (torsions) w sekcji Ligand Preparation. Wczytaj cząsteczkę substratu, kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę cząsteczki w panelu Navigator i wybierz Make ligand, aby przygotować plik dokujący ligandu. Wczytaj białko 2HWK_clean.pdb i wybierz Make macromolecule, aby przygotować plik dokujący pdbqt (Rysunek 7).
    1. Uruchom AutoDock Wizard w panelu dokowania na dole. Wybierz przygotowane pliki ligandu i białka. Zdefiniuj kieszeń wiążącą białka, ręcznie dostosowując wymiary siatki (grid), która jest wycentrowana na katalitycznym reszucie Cys-477. Użyj domyślnego parametru odstępów 0.375 Å. Kliknij Run AutoGrid, aby wygenerować mapy siatki.
    2. Uruchom AutoDock i wybierz metodę Lamarckian Genetic Algorithm (LGA). Kliknij Docking Parameters i ustaw Number of GA runs na 50. Dla pozostałych opcji pozostaw parametry domyślne. Kliknij Forward, aby rozpocząć proces dokowania.
    3. Otwórz panel Analyze Results. Przeanalizuj wszystkie przewidziane pozy wiązania. Wybierz najlepszy model z najniższą przewidywaną energią wiązania i uzasadnionymi oddziaływaniami wiążącymi pomiędzy Cys-477 a substratem w miejscu cięcia. Zapisz model wiązania jako plik PDB do dalszych symulacji MD.

7. Symulacje MD kompleksów VEEV-substratu po dokowaniu

  1. Przygotuj pliki wejściowe za pomocą oprogramowania Amber (http://ambermd.org/). Zgodnie ze standardowym protokołem, symulacje MD dla przewidzianych modeli wiązania substratów wykonuje się przy użyciu pakietu AMBER i pola siłowego ff99SB.
    UWAGA: Systemy solwatowane poddaje się dokładnej minimalizacji energii przed symulacjami MD. Zastosowano okresowe warunki brzegowe w celu symulacji układu ciągłego. Do obliczenia dalekozasięgowych oddziaływań elektrostatycznych wykorzystano metodę Particle Mesh Ewald (PME). Symulowany układ poddano najpierw stopniowemu zwiększaniu temperatury od 0 K do 300 K w czasie 100 ps, a następnie równoważono przez 500 ps w temperaturze 300 K, po czym przeprowadzono produkcyjne serie symulacji o łącznej długości 2 ns.
    1. Uruchom zadanie symulacyjne w centrum obliczeń wysokiej wydajności. Nasze symulacje zostały przeprowadzone na klastrze Biowulf (https://hpc.nih.gov/) (Rycina 8).
    2. Wizualizuj wyniki trajektorii za pomocą programu VMD (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). Przeanalizuj oddziaływania wiążące oraz zmiany konformacyjne substratów i TRIM14 w obrębie miejsca aktywnego nsP2 (Rycina 9).

Wyniki

Analiza SSHHPS proteazy ns2B/3 ZIKV zidentyfikowała 4 białkowe cele gospodarza: FOXG1, SFRP1, podjednostkę alfa Gs z biblioteki cDNA siatkówki oraz mitochondrialną nukleotydazę 5',3'- NT5M (Rysunek 10)6. Co istotne, żadna inna metoda nie przewidziała tych białek jako potencjalnych celów proteazy ZIKV. Mutacje w genie FOXG1 powiązano z zespołem wrodzonym charakteryzującym się zaburzeniami rozwoju i strukturalnymi nieprawidłowościami mózgu, takimi jak mikrocefalia. SFRP1 jest wydzielanym białkiem związanym z receptorem frizzled (SFRP); te rozpuszczalne receptory mogą konkurencyjnie wiązać ligandy Wnt, aby antagonizować i hamować sygnalizację Wnt. Szlak sygnalizacyjny Wnt bierze udział w regulacji odpowiedzi IFN podczas infekcji flawiwirusami36. Oczekuje się, że rozszczepienie SFRP1 zwiększy replikację flawiwirusów. SFRP1 bierze również udział w różnicowaniu komórek Th1737. Dopasowania sekwencji SSHHPS wykazały różnice gatunkowe w sekwencjach miejsc rozszczepienia (Rysunek 10D). Sekwencja miejsca rozszczepienia w SFRP1 była identyczna u ludzi i kurcząt; ZIKV może wywoływać śmiertelność i mikrocefalię u embrionów kurcząt38. U gryzoni wysoko konserwowany reszta P1 (K/R)R↓G jest zastąpiona glicyną (RGG). Szczepy myszy immunokompetentne są zazwyczaj odporne na infekcję i chorobę wywoływaną przez ZIKV39.

Parametry kinetyki stanu stacjonarnego oraz stałe inhibicji dla sekwencji poliprotein wirusowych i sekwencji białek gospodarza można zmierzyć, stosując ciągły test w czytniku płytek31,40,41 (Rysunek 11A). W celu uzyskania jakościowych informacji o cięciu, takich jak rozszczepienie konkretnej sekwencji lub inhibicja proteazy przez różne związki, można zastosować test nieciągły (Rysunek 11B).

Można wymagać optymalizacji liczby reszt pomiędzy CFP a YFP. Model związany z substratem można opracować, wykorzystując metody in silico. Reprezentatywny model dokowania złącza nsP1/nsP2 przedstawiono na Rysunku 9. Dla proteazy nsP2 VEEV zgłaszano cięcie 12-aminokwasowej sekwencji wirusa Semliki Forest (SFV) (Km = 0.58 mM)33. Wydłużenie sekwencji substratu do 19, 22 i 25 reszt oraz zmniejszenie siły jonowej buforu doprowadziło do znacznej redukcji Km. Analiza struktury krystalicznej nsP2 VEEV oraz upakowania kryształów wykazała również, że część jednego ze złączy była upakowana przy domenie proteazy i miała strukturę helikalną. Zatem dłuższe substraty VEEV mogą wiązać się lepiej dzięki rozpoznawaniu motywu struktury drugorzędowej.

W przypadku TRIM14 otrzymaliśmy Km = 21 µM6,33. Km dla substratu zawierającego sekwencję białka gospodarza była porównywalna z wartościami Km substratów zawierających sekwencje miejsc cięcia poliproteiny wirusowej (Km(V12) = 12 µM i Km(V34) = 21 µM). Sekwencje miejsc cięcia w złączach nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 oraz nsP3/nsP4 były cięte z różną wydajnością. Przypuszcza się, że w komórce umożliwia to sekwencyjne cięcie poliproteiny42.

Należy zachować ostrożność w interpretacji wyników negatywnych. Jeśli nie dojdzie do cięcia, miejsce cięcia może być zbyt krótkie lub oczyszczona proteaza może być nieaktywna. W przypadku substratów, które ulegają cięciu, konieczne są dodatkowe eksperymenty w celu potwierdzenia cięcia białka o pełnej długości lub cięcia w komórkach zainfekowanych wirusem. Należy dobrać odpowiednie eksperymenty uzupełniające. Można również zbadać wpływ nadekspresji lub wyciszenia białka docelowego na replikację wirusa.

figure-results-1
Rycina 1: Trzy mechanizmy wyciszania. Wyciszanie może zachodzić na poziomie DNA, RNA lub białka. Te algorytmy typu „szukaj i usuń” wykorzystują „słowo kluczowe” do kierowania rozszczepieniem pliku zawierającego to słowo. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Morazzani i wsp.32 oraz przywołanych w niej referencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Gatunkowe różnice w sekwencjach miejsc cięcia. Na dopasowaniu przedstawiono C-końcowe domeny PRY/SPRY homologów TRIM14. Domenę PRY/SPRY można zidentyfikować po konserwowanych motywach zaznaczonych na szaro. Ludzkie TRIM14 jest cięte w miejscu QEAGA↓G przez cysteinową proteazę nsP2 VEEV. Sekwencja SSHHP została zaznaczona kolorami. Aminokwas zaznaczony na zielono to reszta P1'; na niebiesko to reszta P4, a na czerwono inne konserwowane reszty w sekwencji motywu miejsca cięcia. Konie posiadają skróconą wersję TRIM14, w której brakuje domeny PRY/SPRY. Lizyna zaznaczona na cyjanowo jest poliubikwitynowana i jest ważna dla montażu sygnałosomu MAVS. C-końcowa domena PRY/SPRY może być przejściowo cięta przez proteazę nsP2, aby upośledzić wewnątrzkomórkową odpowiedź przeciwwirusową gospodarza podczas ostrej infekcji wirusowej. U koni domena ta jest zawsze nieobecna. Sugeruje to, że domena PRY/SPRY białka TRIM14 może pełnić funkcję ochronną przeciwko infekcjom VEEV. Rycina została powielona z pracy Morazanni i wsp.6 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Identyfikacja SSHHPS przy użyciu BLAST.** Sekwencja motywu miejsca cięcia w złączu nsP1/nsP2 VEEV jest dopasowana do sekwencji SSHHP w białku gospodarza TRIM14. Pozostałość zaznaczona kolorem zielonym to pozostałość P1'; na niebiesko zaznaczono pozostałość P4, a na czerwono inne konserwatywne pozostałości sekwencji motywu miejsca cięcia. Większość dopasowań wykazała homologię do regionów poza konserwatywnym motywem miejsca cięcia lub nie obejmowała pozostałości wiązania scissile P1/P1'. TRIM14 wykazało dopasowanie do 6 pozostałości w kolejności sekwencyjnej, w tym P1 i P1'. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Sekwencje białkowe i DNA substratu CFP-V12-YFP dla cysteinowej proteazy nsP2 wirusa VEEV. Miejsca restrykcyjne NdeI (CATATG) i XhoI (CTCGAG) zaznaczono wielkimi literami. Na czerwono zaznaczono sekwencję miejsca cięcia z wirusowego poliproteiny, znajdującą się pomiędzy nsP1 a nsP2. Pozostałość zaznaczona na zielono to pozostałość P1', a na niebiesko pozostałość P4 miejsca cięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Sekwencja białkowa konstruktu cysteinowej proteazy Trx-VEEV-nsP2. Tio-redoksyna (Trx) jest zaznaczona na żółto. Miejsce cięcia trombiną oraz znacznik His są zaznaczone na cyjanowo. Diada Cys-His jest oznaczona na czerwono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Struktury peptydów w programie MOE. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rysunek 7: Dokowanie peptydu substratowego przy użyciu PyRx/AutoDock. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Zadania uruchomione w klastrze Biowulf. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rycina 9: Model substratu P12 VEEV zawierającego sekwencję miejsca cięcia na złączu nsP1/nsP2. Diada katalityczna Cys-477/His-546 zaznaczono na niebiesko. Rycina została przygotowana przy użyciu programu Pymol (https://pymol.org). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-10
Rycina 10: Analiza SSHHPS proteazy ns2B/ns3 wirusa Zika. (A) Przewidywane białkowe cele gospodarza dla proteazy ns2B/ns3 ZIKV. Pozostałości zaznaczone na czerwono odpowiadają sekwencji pojedynczego miejsca cięcia. Pozostałości zaznaczone na zielono są tolerowane w podstronie i odpowiadają pozostałościom w innych miejscach cięcia. SFRP1 posiadało najwyższą liczbę identycznych pozostałości w kolejności następującej. (B) Białka CFP-substrat-YFP (~50-60 kDa) zawierające przewidywaną sekwencję SSHHP z każdego białka gospodarza (ludzkiego) zostały wyekspresowane i oczyszczone. Proteaza ZIKV przecięła ludzkie białka FOXG1, SFRP1, NT5M oraz podjednostkę Gsalpha wyizolowaną z biblioteki cDNA siatkówki. Produkty cięcia mają masę około 28-30 kDa. Sekwencje substratów są dostępne w pracy Morazzani i wsp.6 (C) Podczas gdy proteaza ns2B/ns3 przecięła SFRP1, nie przecięła jej homologów (SFRP2 i SFRP4). (D) Dopasowanie miejsc cięcia z różnych gatunków zwierząt może być przydatne w wyborze modelu zwierzęcego dla wirusa Grupy IV. Należy zauważyć, że konserwatywna sekwencja R↓G różni się między ludźmi a gryzoniami w białku SFRP1. Rycina powielona z pracy Morazzani i wsp.6 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-11
Rycina 11: Analiza kinetyki stanu stacjonarnego z wykorzystaniem testów ciągłych i nieciągłych. (A) Dane kinetyczne przedstawione w Tabeli 5 zostały wykreślone w programie GraFit. Wstawka przedstawia wykres Lineweavera-Burka. (B) Żel SDS-PAGE pokazujący produkty cięcia substratu CFP-V12-YFP. W ścieżce 1 znajduje się substrat „NIECIĘTY” (48 kDa). W ścieżce 2 znajduje się substrat „CIĘTY” (31 kDa i 27 kDa). W ścieżkach 3-9 zastosowano różne związki w celu przetestowania ich aktywności inhibicyjnej. Ścieżka 4 zawiera kowalencyjny inhibitor E64d. Reakcje te prowadzono przez noc, przez ok. 17 h w temperaturze pokojowej. Aby uzyskać wyraźny wzór prążków, konieczne było zagotowanie próbek. Proteaza nsP2 jest widoczna (56 kDa) w reakcjach zawierających enzym, ale nie w ścieżce 1. Ścieżka 1 stanowi kontrolę „bez enzymu”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Specyficzne dla sekwencji niszczenie białka lub kwasu nukleinowego kierowane przez obcą sekwencję obserwuje się tylko w kilku przypadkach w biologii. Mechanizmy pokazane na rysunku 1 są mechanizmami obronnymi, które chronią gospodarza przed wirusem lub wirusa przed gospodarzem.

Za pomocą metod bioinformatycznych możemy zidentyfikować cele, które są niszczone przez te systemy. W naszych analizach sekwencji SSHHP odkryliśmy, że wiele z nich można znaleźć w białkach potrzebnych do generowania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Niektóre z nich miały oczywiste role, takie jak MAVS i TRIF (interferon-β indukujący adaptację zawierającą domenę TIR), podczas gdy inne były związane z odpornością poprzez bardziej złożone mechanizmy (np. Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Informacje docelowe przechowywane w sekwencji SSHHP mogą potencjalnie zidentyfikować szlaki, które mają działanie przeciwwirusowe przeciwko tym wirusom. Odpowiedzi przeciwwirusowe in vivo są często specyficzne dla wirusa26,43. Na przykład podzbiory białek TRIM mają działanie przeciwwirusowe na różne wirusy 43,44,45, niektóre są wirusowymi czynnikami restrykcyjnymi (np. HIV i TRIM5α). Specyficzność białek TRIM (zidentyfikowano ~70) jest nadal badana44,45. Informacje zawarte w SSHHPS mogą przyczynić się do zrozumienia, w jaki sposób wirusy te unikają wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Inne wzorce i korelacje mogą zostać odkryte w miarę badania większej liczby SSHHPS.

Różnice specyficzne dla poszczególnych gatunków były widoczne w naszych analizach (Ryc. 2, Ryc. 10). Wiadomo, że wirusy te atakują niektóre gatunki bardziej niż inne. Informacje o zakresie hostów, podatności hosta i obronie hosta mogą być obecne w SSHHPS. Na przykład koniowate, gatunek najbardziej podatny na wirusy zapalenia mózgu koni, nie miały regionu ludzkiego TRIM14, który został przejściowo przecięty przez proteazę VEEV nsP2. Ludzie rzadko umierają z powodu zakażeń wirusem VEEV, ale mogą być zakażeni24 razy. Ludzkie białko TRIM14 przenosiło sekwencję6 rozszczepienia proteazy nsP2. Obecność miejsca rozszczepienia sugeruje, że ludzie mają mechanizm obronny przed tymi wirusami. Uważa się, że ptaki są potencjalnymi rezerwuarami tych wirusów46. Odpowiednia sekwencja SSHHP w białku TRIM14 od kurcząt różniła się od sekwencji znalezionych u ludzi i innych gatunków. Subtelne różnice, takie jak te, mogą sprawić, że białko gospodarza docelowego będzie nierozszczepione lub łatwiej rozszczepione. Aguirre i wsp.16 wykazali, że nierozkurczone zmutowane białko STRING indukowało wyższe poziomy IFN po zakażeniu wirusem dengi i że myszy naturalnie przenoszą wersję STING, która nie jest cięta przez proteazę Denga ns2B3. Mysie białko STING nie zostało przecięte przez proteazę ZIKV47. W naszej analizie SSHHPS zaobserwowaliśmy również różnice w sekwencjach miejsc rozszczepienia proteazy ZIKV, gdy porównaliśmy białka ludzkie z białkami gryzoni6 (Figura 10D). Odtwarzanie specyficznych dla gatunku rozszczepień proteolitycznych białek gospodarza może być ważne w modelach zwierzęcych stosowanych w przypadku wirusów grupy IV. Hamowanie rozszczepienia białek gospodarza ma również wpływ na rozwój inhibitorów proteazy grupy IV. W naszej poprzedniej publikacji wykazaliśmy, że możemy hamować rozszczepienie TRIM14 przez proteazę VEEV nsP2 za pomocą estru metylowego CA0746. Wynik ten sugeruje, że małocząsteczkowe inhibitory tych proteaz mogą być w stanie modulować wrodzone odpowiedzi immunologiczne, które są zdolne do tłumienia infekcji 6,31.

Zmienność genetyczna w obrębie gatunku może również powodować różnice w rozszczepieniu proteolitycznym. Subtelne różnice w użyciu kodonów mogą wpływać na pauzę rybosomu48. Ponieważ niektóre proteazy wirusowe grupy IV są osadzone w błonie ER, różnice w tych przerwach mogą wpływać na rozszczepienie celu, jeśli rozszczepienie następuje równotranslacyjnie. Niektóre z miejsc rozszczepienia, które zidentyfikowaliśmy, znajdowały się w przewidywanych sekwencjach peptydów sygnałowych (np. SFRP1), podczas gdy inne były wewnętrzne.

Analiza SSHHPS może dostarczyć informacji, które różnią się od innych metod analizy białek gospodarza. Analiza SSHHPS była niedroga i łatwa do zastosowania. Zastosowanie bakteryjnego systemu ekspresji pozwoliło na przetestowanie krótkich odcinków (~25 aminokwasów) sekwencji ssaków bez użycia hodowli komórek ssaków. Odkryliśmy, że substraty CFP-YFP były w stanie tolerować wszystkie testowane sekwencje białek ludzkich; Jednak plony były różne. W podobnych testach substraty zawierające sekwencje białek ludzkich o długości aż 63 aminokwasów zostały z powodzeniem wyrażone, oczyszczone i wykorzystane do analiz kinetycznych i badań przesiewowych inhibitorów 49,50,51. Ponieważ do testu nieciągłego potrzebne są tylko niewielkie ilości substratu, można zbadać dużą liczbę celów. Jedną z zalet systemu jest to, że podłoża CFP/YFP mogą być używane do analiz SDS-PAGE oraz do bardziej skomplikowanych analiz kinetycznych (np. IC50, Ki, Km, Vmax). W celu odkrywania leków, związki hamujące mogą wytwarzać artefakty w testach fluorescencyjnych. Tak więc test nieciągły w połączeniu z testem ciągłym pozwala potwierdzić rozszczepienie lub zahamowanie rozszczepienia. Próbki do nieciągłego testu SDS-PAGE można pobrać bezpośrednio z płytek 96-dołkowych. Substraty CFP/YFP zostały wykorzystane do przesiewania bibliotek złożonych52. Wymagane są jednak dodatkowe analizy w celu określenia, czy podłoże nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, takich jak obliczenie współczynnika Z53.

Jednym z wyzwań związanych z projektowaniem podłoża jest zidentyfikowanie obszaru wokół wiązania nożycowego, który jest związany i rozpoznawany przez proteazę. W przedstawionych tutaj przykładach zaczęliśmy od 12 sekwencji reszt, które były wyśrodkowane wokół wiązania nożycowego. Po przeanalizowaniu dopasowań sekwencji miejsc cięcia stwierdzono homologię do reszt N-końcowych wiązania nożycowego dla proteazy VEEV, natomiast dla proteazy ZIKV stwierdzono homologię do kilku reszt C-końcowych. Model in silico zadokowanego podłoża można wykorzystać do zaprojektowania eksperymentów mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, które badają miejsca wiązania substratu. Ponieważ substrat i sekwencje enzymów znajdują się na plazmidach, mogą być mutowane w celu przetestowania modeli in silico lub tolerancji podmiejsc. Może to być korzystne, jeśli struktura krystaliczna związanego podłoża (substratów) nie jest dostępna.

Analiza SSHHPS może również dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów, za pomocą których fenotypy wywołane przez wirusa są wytwarzane przez enzymy wirusowe. Jeden z celów ZIKV, SFRP1, jest częścią szlaku sygnałowego Wnt i odgrywa rolę zarówno w rozwoju mózgu i oczu, jak i w odpowiedziach immunologicznych 36,37,54,55,56,57. Odkryliśmy, że inne sekwencje białek, które mogą być cięte przez proteazę ZIKV ns2B / ns3, również znajdowały się w białkach zaangażowanych w rozwój mózgu i oczu; Nieprawidłowości w obu przypadkach zaobserwowano we wrodzonym zespole Zika i uważa się, że są one częścią fenotypu58 wywołanego przez wirusa.

Przewidywalność interakcji gospodarz-patogen może być wykorzystana do różnych zastosowań: specyficzne dla celu terapie wirusem onkolitycznym; zmniejszanie ryzyka związanego ze szczepionkami zawierającymi żywe wirusy; udoskonalanie, przewidywanie lub selekcja modeli zwierzęcych; przewidywanie zasięgu żywiciela lub podatności; przewidywanie zdarzeń odzwierzęcych; i przewidywanie obrony gospodarza. Ponieważ opisane metody są oparte na sekwencjach, mogą być przydatne do włączenia do oprogramowania w przyszłości.

Oświadczenia

Wyrażone tutaj opinie są opiniami autorów i nie reprezentują opinii Marynarki Wojennej Stanów Zjednoczonych, Armii Stanów Zjednoczonych, Departamentu Obrony Stanów Zjednoczonych ani rządu Stanów Zjednoczonych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez projekty Agencji Redukcji Zagrożeń Obronnych (DTRA) o numerach CB-SEED-SEED09-2-0061 i CBCall4-CBM-05-2-0019, a częściowo przez program badawczy Intramural/Extramural NCATS, NIH (XH) i Naval Research Laboratory.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolba Erlenmeyera 250 mlVWR89000-362
2-merkaptoetanolAcros Organics (Fisher)125472500Niebezpieczeństwo: Silnie toksyczny. Otwórz butelkę w kapturze, aby uniknąć wdychania oparów.
Kolba Erlenmeyera o pojemności 4 l z szeroką szyjką Pyrex z nakrętkąMillipore SigmaCLS49954L-1EA
AKTA Prime PlusGE Healthcare17-0729-01
Kolumna AKTA XK 16/20GE Healthcare28988937
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5Millipore SigmaUFC501096
Filtrodśrodkowy Amicon Ultra-15Millipore SigmaUFC901096
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4Millipore SigmaUFC801024
AmpicillinSigmaA0166Niebezpieczeństwo: Reakcje alergiczne (skórne lub oddechowe).
Chelatowanie sefarozy Fast FlowGE Healthcare17-0575-02Po zrównoważeniu żywicy z 0,2 M siarczanem niklu w tekście określa się ją mianem kolumny niklowej. Kolumna będzie miała zielony kolor po umyciu wodą. Kolumna będzie miała niebieski kolor po zrównoważeniu z buforem.
ChloramfenikolRPIC61000Niebezpieczeństwo: Może powodować raka.
Probówki wirówkowe Corning 50 mlCorning430828Sugestia: Probówki polipropylenowe są mniej podatne na pękanie podczas sonikacji niż rurki polietylenowe
Corning 96 Well Półpłytka powierzchniowa, niewiążąca powierzchniaCorning3993
Klipsy do rurek do dializyFisher ScientificPI68011
Jednorazowa kolumna odsalająca PD-10GE Healthcare17-0851-01
DNAseSigmaDN25-1G
DTT (DL-Dithiothreitol)RPID11000-50.0Ostrzeżenie: Ostra toksyczność pokarmowa; działanie drażniące na skórę i oczy
EDTAFisher ScientificS311-500
Fisherbrand Szalki Petriego z przezroczystą pokrywkąFisher ScientificFB0875712
GlycerolAcros Organics (Fisher)15892-0010
HEPESMillipore SigmaH4034-1KG
ImidazoleAcros Organics301870010Niebezpieczeństwo: Toksyczny, drażniący
IPTG (Izopropyl β-D-tiogalaktopiranozyd)Calbiochem (Millipore Sigma)420291Nie wdychać pyłu. Unikać kontaktu z oczami i skórą.
Bufor do próbek LaemmliBIO-RAD1610737
Luria Bertani AgarFluka (Millipore Sigma)L3027-1KGSugestia: Autoklaw z mieszadłem magnetycznym w cieczy i mieszanie podczas chłodzenia. Poczekaj z dodaniem antybiotyku, aż będziesz mógł trzymać ręce na butelce bez bólu przez 30 sekund.
Luria Bertani MediaFisher BioodczynnikiBP1426-2
LysozymeSigmaL4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra Pionowa elektroforeza CellGel BoxBIO-RAD
Nalgene Oak Ridge Szybkoobrotowe probówki wirówkowePPCO Nalgene (Thermo Scientific)3119-0050
NanodropThermo Fisher
New Brunswick Innova 42R Shaker IncubatorEppendorfM1335
Sześciowodny siarczan niklu (krystaliczny / certyfikowany ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificN73-500Niebezpieczeństwo: Szkodliwy po połknięciu lub wdychaniu działa drażniąco na skórę i oczy
One Shot BL21(DE3) Kompetentny chemicznie E. coliInvitrogen (Thermo Fisher)C600003Może być szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia. Może powodować podrażnienie skóry i oczu u osób wrażliwych.
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemicznie kompetentny E. coliInvitrogen (Thermo Fisher)C606003Może być szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia. Może powodować podrażnienie skóry i oczu u osób wrażliwych.
użyto plazmidu pet15b DNANovagen (Millipore Sigma)69661GenScript Inc. Plazmid pet15b został użyty do substratów CFP/YFP.
pet32bNovagen (Millipore Sigma)69016-3Plazmid pet32b został użyty do budowy proteazy cysteinowej.
Inhibitor proteazy Pierce Mini tabletki, wolne od EDTAThermo FisherA32955Ostrzeżenie: Działanie/drażniące skóry; uszkodzenie oczu
Czytnik płytekUrządzenia molekularneModel M5
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein StandardBIO-RAD161-0373
Odczynnik do ekstrakcji białekNovagen (Millipore Sigma)70584-4BugBuster lub Bper (Katalog # 78248, ThermoFisher)
Q-Sepharose Fast FlowG.E. Healthcare17-0510-01Żywica anionowymienna
RunBlue (12%) 17-dołkowe żele PAGEExpedeonBCG01227Można użyć dowolnego 12% prefabrykowanego żelu poliakrylamidowego
RunBlue 20x SDS Running BufferExpedeonNXB50500Rozcieńczyć 50 ml 950 ml wodą dejonizowaną, aby uzyskać 1x
RunBlue Instant Blue Gel StainExpedeonISB1LNie rozcieńczać, stosować zgodnie z zaleceniami
Chlorek soduFisher ChemicalS271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 SonicatorBranson Ultrasonics (VWR)Model nr 101-063-346RSonikator był używany na poziomie 5
Spectra/Por 6-8 kD MWCOSpectrum Labs132645TRurki do dializy
SP-Sepharose Fast FlowGE Opieka zdrowotna17-0729-01kationowymiennej
z osocza bydlęcegoSigmaT6634-500UN
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Uwaga: Działa drażniąco na oczy/skórę
Do komercyjnej syntezy DNA Trombina z żywicy

Bibliografia

  1. Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84 (22), 11876-11887 (2010).
  2. Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7 (5), 1729-1739 (2014).
  3. Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
  4. Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8 (5), 1-18 (2017).
  5. Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. , (2018).
  6. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  7. Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396 (2), 219-226 (2006).
  8. Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64 (2), 748-756 (1990).
  9. Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136 (1), 10-19 (1984).
  10. Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507 (1), 1-5 (2001).
  11. Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78 (15), 8172-8182 (2004).
  12. Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
  13. Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63 (11), 4653-4664 (1989).
  14. Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191 (2), 932-940 (1992).
  15. Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86 (17), 9311-9322 (2012).
  16. Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8 (10), e1002934(2012).
  17. Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391 (2), 171-176 (2009).
  18. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15 (2), 188-200 (2001).
  19. Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
  20. Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27 (2), 157-162 (1967).
  21. Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5 (11), 1109-1115 (2004).
  22. Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111 (2), E245-E254 (2014).
  23. Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336(2016).
  24. Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140 (3-4), 281-286 (2010).
  25. Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3 (6), 629-658 (2011).
  26. Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4 (3), e4894(2009).
  27. Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81 (19), 10268-10279 (2007).
  28. Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62 (3), 255-262 (2015).
  29. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  30. Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
  31. Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55 (21), 3007-3019 (2016).
  32. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  33. Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64 (1), 89-97 (2009).
  34. Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353 (6298), 503-505 (2016).
  35. Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
  36. Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
  37. Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42 (10), 2564-2573 (2012).
  38. Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25 (22), 1691-1697 (2016).
  39. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
  40. Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. , Washington, D.C. (2017).
  41. Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56 (47), 6221-6230 (2017).
  42. Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278 (43), 41636-41645 (2003).
  43. Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4 (2), e16(2008).
  44. Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8 (11), 849-860 (2008).
  45. van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5 (3), (2017).
  46. Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (1), e0004347(2016).
  47. Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115 (27), E6310-E6318 (2018).
  48. Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
  49. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411 (2), 200-209 (2011).
  50. Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (7), 765-778 (2014).
  51. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (21), 7687-7697 (2012).
  52. Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12 (3), 176-189 (2014).
  53. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  54. Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121 (Pt 6), 737-746 (2008).
  55. Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14 (5), 562-569 (2011).
  56. Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
  57. Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35 (11), 4729-4740 (2015).
  58. Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171 (3), 288-295 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wirusy grupy IVci cie przez proteaz wirusowanaliza SSHHPSprzeszukiwanie genomu gospodarza za pomoc BLASTtest substratu FRETekspresja i oczyszczanie bia ekdokowanie in silicosymulacja AutoDockanaliza elowa SDS PAGEbia kowe cele gospodarza
Analiza wirusowych SSHHPS grupy IV przy użyciu metod in vitro i in silico
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.