Artykuł metodologiczny

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60427

⸱

22 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Unidade de Investigação Cardiovascular, Departamento de Cirurgia e Fisiologia, Faculdade de Medicina, Universidade do Porto, 2Department of Physiology, Kilimanjaro Christian Medical University College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu opisanie krok po kroku techniki ekstrakcji i oceny funkcji serca za pomocą kardiomiocytów ze skóry. Metodologia ta umożliwia pomiar i ostrą modulację funkcji miofilamentów za pomocą małych zamrożonych biopsji, które można pobrać z różnych lokalizacji serca, od myszy po mężczyzn.

Streszczenie

W tym artykule opisujemy kroki wymagane do wyizolowania pojedynczego permeabilizowanego ("oskórowanego") kardiomiocytu i podłączenia go do aparatu do pomiaru siły oraz silnika w celu przeprowadzenia badań funkcjonalnych. Badania te pozwolą na pomiar sztywności kardiomiocytów (siły biernej) i jej aktywacji różnymi roztworami zawierającymi wapń (Ca2+) w celu określenia m.in.: maksymalnego rozwoju siły, czułości miofilamentu Ca2+ (pCa50), kooperatywności (nHill) oraz szybkości przebudowy siły (ktr). Metoda ta umożliwia również określenie wpływu leków działających bezpośrednio na miofilamenty oraz ekspresji egzogennych białek rekombinowanych zarówno na właściwości aktywne, jak i bierne kardiomiocytów. Klinicznie badania kardiomiocytów ze skórą podkreślają patofizjologię wielu chorób mięśnia sercowego i umożliwiają ocenę in vitro wpływu interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na mięśnie sercowe. Podsumowując, technika ta umożliwia wyjaśnienie patofizjologii serca poprzez badanie korelacji między parametrami in vitro i in vivo w modelach zwierzęcych a tkankami ludzkimi uzyskanymi podczas operacji na otwartym sercu lub przeszczepu.

Wprowadzenie

Tradycyjnie, ocena właściwości mechanicznych mięśnia sercowego była podejmowana głównie w preparatach wielokomórkowych, takich jak mięśnie brodawkowate i beleczki1,2. Wielokomórkowe paski mięśnia sercowego obejmują niejednorodną populację komórek, w tym kurczliwe kardiomiocyty o nieznanym wzorcu orientacji i generowania siły, aktywności elektrycznej i rozkładu stresu/naprężenia, a także otaczającą macierz tkanki łącznej3,4. Preparat bez kolagenu i zawierający pojedynczy kardiomiocyt pozwoliłby na pomiar długości sarkomeru i właściwości kurczliwości mostka krzyżowego w bardzo precyzyjny i kontrolowany sposób5,6. Dlatego w ciągu ostatnich czterech dekad opracowano kilka metodologii pozwalających na badanie właściwości mechanicznych, kurczliwych i relaksacyjnych pojedynczego kardiomiocytu6,7. Funkcja kurczliwości tych komórek jest silnie zależna od długości sarkomeru i kinetyki cyklu krzyżowego3. W związku z tym pożądane jest badanie funkcji mięśni bezpośrednio w pojedynczych izolowanych komórkach serca, biorąc pod uwagę, że pozwala to na ocenę długości i wydajności sarkomeru, a także funkcji mostka krzyżowego i właściwości skurczowych. Jednak izolowanie i przyłączanie funkcjonalnych kardiomiocytów z rozsądną rozdzielczością sarkomeru optycznego przy jednoczesnym rejestrowaniu pomiaru siły na poziomie μN jest nadal trudne i ewoluuje3,6. Innym wyzwaniem jest logistyka, którą należy zainstalować, aby wyizolować kardiomiocyty ze świeżo pobranych biopsji. Na przykład nieprzewidywalność pobierania biopsji u ludzi może zagrozić wykonalności eksperymentów.

Ponadto, kwestie etyczne dotyczące zastępowania, ograniczania i udoskonalania eksperymentów na zwierzętach na potrzeby procedur naukowych (zasady 3R) promowały zmiany w badaniach na poziomie komórkowym i tkankowym, najlepiej w biopsjach ludzkich lub w mniejszych próbkach zwierzęcych. Rzeczywiście, stopniowe udoskonalanie metodologii oceny funkcji serca in vitro na mniejszym poziomie złożoności pozwala na właściwą integrację wyników z całym ciałem i przełożenie ich na scenariusz kliniczny7. Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie próbek przechowywanych w temperaturze -80 °C do ekstrakcji kardiomiocytów może być atrakcyjną alternatywą.

Tkanka mięśnia sercowego jest cięta na małe kawałki i homogenizowana za pomocą moździerza i tłuczka. Wynikiem tej homogenizacji jest zawieszenie oskórowanych, wiązkowych i izolowanych komórek o różnym stopniu uszkodzenia sarkolemmalnego, w którym mioplazma jest wystawiona na działanie pożywki do kąpieli, a wszystkie składniki komórkowe są wypłukiwane. Struktury takie jak miofibryle, które są dalej oddalone od sarkolemmy, są zachowane. W ten sposób skracanie sarkomeru i właściwości funkcjonalne związane z aparatem miofibrylarnym pozostają nienaruszone i mogą być rejestrowane8,9.

System pomiaru siły kardiomiocytów składa się z silnika elektromagnetycznego, używanego do regulacji długości kardiomiocytów, oraz przetwornika siły, który mierzy izometryczny skurcz kardiomiocytów. Przepuszczalny lub oskórowany kardiomiocyt umieszcza się w komorze doświadczalnej zawierającej roztwór relaksujący ([Ca2+] < 10 nM) i przykleja silikonem do 2 cienkich igieł: jednej przymocowanej do silnika, a drugiej do przetwornika siły. Układ optyczny służy do określania morfologii kardiomiocytów i długości sarkomerów. Protokół eksperymentalny często składa się z serii zapisów sił na roztworach buforowych zawierających różne stężenia Ca2 +, określenia kinetyki mostka krzyżowego aktyna-miozyna oraz pomiaru biernego napięcia zamontowanych kardiomiocytów na wcześniej określonych długościach sarkomeru (Figura 1). Izolacja permeabilizowanych kardiomiocytów z próbek mięśnia sercowego zamrożonych w ciekłym azocie (a następnie przechowywanych w temperaturze -80 °C) jest techniką wykorzystującą mechanikę komórkową i biochemię białek do pomiaru maksymalnej siły aktywowanej Ca2+ (aktywnej) na pole przekroju poprzecznego (Taktywne, kN∙m-2), napięcia niezależnego od Ca2+ (pasywnego) (T pasywnego, kN∙m-2), czułość miofilamentów Ca2+ (pCa50), kooperatywność miofilamentów (nHill), szybkość przebudowy siły (ktr), a także zależności długości sarkomeru Taktywnego, Tpasywnego, pCa50, nHill i ktr.

Celem tego protokołu jest zilustrowanie i podsumowanie potencjału systemu pomiaru siły kardiomiocytów jako wiarygodnej procedury oceny funkcjonalnych właściwości mechanicznych kardiomiocytów jednoskórnych wyizolowanych z zamrożonych próbek różnych gatunków.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zgodne z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (publikacja NIH nr 85-23, wersja z 2011 r.) oraz portugalskim prawem dotyczącym dobrostanu zwierząt (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Protokół eksperymentalny (018833) został zatwierdzony przez właściwe lokalne organy nadzorcze.

1. Przygotowanie roztworów zapasowych (Tabela 1)

  1. Przygotować 1000 mL roztworu relaksującego do izolacji kardiomiocytów (RELAX-ISO) zgodnie z instrukcjami w Tabeli 2. Rozpuścić powyższy odczynnik w ≈500 mL i dostosować pH do 7,0 za pomocą KOH. Uzupełnić końcową objętość do 1000 mL.
    1. Rozdzielić RELAX-ISO do probówek 50 mL. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować 250 mL roztworu aktywującego zgodnie z instrukcjami w Tabeli 3. Rozpuścić powyższe odczynniki w ≈100 mL wody ultrapure. Dostosować pH do 7,1 za pomocą 5 M KOH w temperaturze 15 °C.
    UWAGA: Zazwyczaj konieczne jest dodanie znacznej ilości KOH, aby osiągnąć pożądane pH. Umieścić kolbę miarową w pojemniku z lodem, aby schłodzić roztwór do 15 °C.
    1. Uzupełnić końcową objętość do 250 mL. Mieszać ten roztwór nieprzerwanie za pomocą mieszadła magnetycznego aż do momentu zmieszania go z roztworem relaksującym.
  3. Przygotować 100 mL roztworu relaksującego zgodnie z instrukcjami w Tabeli 4. Rozpuścić powyższe odczynniki w ≈50 mL wody ultrapure. Dostosować pH do 7,1 za pomocą KOH 5 M w temperaturze 15 °C.
    UWAGA: Zazwyczaj konieczne jest dodanie znacznej ilości KOH, aby osiągnąć pH 7,1. Umieścić kolbę miarową w pojemniku wypełnionym lodem, aby schłodzić roztwór do 15 °C. Siła jonowa roztworów stosowanych podczas pomiarów wynosiła 180 mM.
    1. Uzupełnić końcową objętość do 100 mL. Mieszać ten roztwór nieprzerwanie za pomocą mieszadła magnetycznego aż do momentu zmieszania go z roztworem aktywującym.
  4. Zmieszać roztwory aktywujący i relaksujący w proporcjach przedstawionych w Tabeli 5, aby uzyskać roztwory pCa w zakresie od 5,0 do 6,0.
    1. Podczas mieszania obu roztworów należy utrzymywać je w ciągłym ruchu za pomocą mieszadła.
    2. Rozdzielić każdą mieszaninę do mikroprobówek 2 mL . Wszystkie mikroprobówki przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Przygotować nową partię roztworu pCa (od 4,5 do 6,0) dla każdego protokołu.

2. Kalibracja przetwornika siły

UWAGA: Kalibracja przetwornika siły jest rutynową procedurą, którą należy przeprowadzać co kilka miesięcy lub zawsze wtedy, gdy istnieje podejrzenie braku kalibracji. Przetwornik siły jest bardzo czuły i łatwo ulega uszkodzeniu. Należy obchodzić się z nim delikatnie na każdym etapie użytkowania, w tym podczas kalibracji, przyklejania kardiomiocytu oraz czyszczenia.

  1. Odłącz przetwornik siły od reszty aparatury.
  2. Za pomocą zacisku umieść przetwornik siły poziomo w taki sposób, aby igła była skierowana w dół, w tej samej orientacji, w której kardiomiocyt będzie generował siłę. Ułatwi to zawieszenie serii odważników o znanej masie (za pomocą gumki recepturki, sznurka chirurgicznego lub szpilki).
    UWAGA: Przed przystąpieniem do tego kroku sprawdź charakterystykę przetwornika siły, aby zweryfikować współczynnik skalowania [mg/volt] i uniknąć nadmiernego obciążenia przetwornika. Dla modelu przetwornika siły współczynnik skalowania wynosi 50 (50 mg odpowiada 1 volt) i stosujemy 5 odważników o masach od 12,5 do 250 mg.
  3. Włącz przetwornik siły i pozostaw go do rozgrzania na 30 min.
  4. Zacznij od zawieszenia najlżejszego odważnika na przetworniku siły i zarejestruj odpowiadające mu napięcie zmierzone na wyjściu FORCE OUT.
    1. Powtórz tę procedurę dla maksymalnie pięciu odważników.
  5. Wykreśl zależność siły przyłożonej do przetwornika (obciążenia) od napięcia i sprawdź liniowość.
  6. Jeśli brak jest liniowości, wyreguluj potencjometry zera i wzmocnienia na płytce obwodu przetwornika. Szczegółowe informacje znajdziesz w instrukcji obsługi urządzenia.
    1. Obracaj potencjometrem zera, aż napięcie wyjściowe wyniesie 0.0 V.
    2. Zawieś odważnik o średniej masie na igle przetwornika i wyreguluj potencjometr wzmocnienia, aby odczytać odpowiadające mu napięcie (na przykład 50 mg odpowiada 1 V). Zdejmij odważnik i ponownie ustaw potencjometr zera na 0.0.
    3. Powtarzaj krok 2.6.2, aż odczyty z obciążeniem i bez obciążenia będą prawidłowe.
  7. Zamontuj ponownie przetwornik siły w aparaturze.

3. Konfiguracja aparatury eksperymentalnej

  1. Rozmrozić jedną fiolkę każdego z roztworów: aktywującego, 4,5, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0 oraz relaksującego i przechowywać je w lodzie.
    UWAGA: ATP i PCr są związkami labilnymi, które należy przechowywać w niskich temperaturach.
  2. Przygotować do użycia mikroskop, aparat pomiarowy oraz powiązany z nim komputer (Rysunek 1).
  3. Ustawić temperaturę tak, aby termometr w komorze wskazywał 15 °C. Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzać w tej temperaturze, z wyjątkiem inkubacji kinazy i fosfatazy (20 °C).
  4. Włączyć przetwornik siły oraz silnik.

4. Ekstrakcja i permeabilizacja odartek kardiomiocytów

  1. Rozmrozić 50 mL roztworu RELAX-ISO.
  2. Włączyć wirówkę i schłodzić ją do 4 °C.
  3. Rozmrozić 3-5 µg próbki mięśnia sercowego w szalce Petriego zawierającej 2,5 mL roztworu RELAX-ISO.
  4. Pokroić tkankę na małe kawałki za pomocą ostrza skalpela (Rysunek 2). Próbkę należy kroić precyzyjnie, aby uniknąć niepotrzebnego uszkodzenia komórek.
  5. Przenieść 2,5 mL roztworu RELAX-ISO z tkanką do homogenizatora szklanego Potter-Elvehjem za pomocą uciętego końcówki pipety.
  6. Rozbić tkankę mechanicznie za pomocą młynka przy prędkości obrotowej 30-40 rpm. Przecisnąć tkankę 3 razy przez 2 s każdorazowo, aby uzyskać dobrą zawiesinę komórkową.
  7. Przygotować 10% Triton w roztworze RELAX-ISO (250 µL Tritonu z 2,25 mL RELAX-ISO) w probówce 15 mL i dodać ten roztwór do zawiesiny komórkowej.
  8. Delikatnie wymieszać, odwracając probówkę 3 razy.
  9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min, a następnie przez 4 min na lodzie.
  10. Wypłukać Triton, dodając RELAX-ISO do pełna probówki 15 mL; delikatnie wymieszać (odwracając probówkę 3 razy), a na koniec odwiruzować komórki w wirówce z kątowym rotorem (1 min przy 348 x g). Usunąć supernatant do poziomu 3 mL powyżej granulatu komórkowego.
    UWAGA: Supernatant należy usuwać ostrożnie, aby nie naruszyć granulatu komórkowego. Niemniej jednak, nieunikniona będzie strata części komórek w supernatancie.
  11. Powtórzyć krok 4.10 co najmniej 4 razy lub do momentu, gdy nie będą obserwowane pęcherzyki powietrza powstające z pozostałości Tritonu.
    UWAGA: Im więcej etapów płukania zostanie wykonanych, tym więcej komórek zostanie utraconych wraz z odrzucanym supernatantem.
  12. Podczas ostatniego płukania usunąć supernatant do momentu uzyskania objętości 5-10 mL zawiesiny komórkowej.

5. Wybór i przyklejanie odartego kardiomiocyta

  1. Nanieś kroplę zawiesiny komórkowej na szkiełko nakrywowe umieszczone na szkiełku przedmiotowym w uchwycie do preparatów mikroskopowych (Rysunek 1).
  2. Wybierz pojedynczy, prętowaty kardiomiocyt o dobrym wzorcu prążkowania i odpowiedniej wielkości (Rysunek 2).
  3. Zlokalizuj końcówki igieł przetwornika siły i silnika, korzystając z najmniejszego powiększenia mikroskopu odwróconego.
  4. Obróć szkiełko nakrywowe tak, aby wybrany kardiomiocyt znajdował się poziomo, a jego końce były wyrównane z igłą przetwornika siły i silnika (Rysunek 2).
  5. Za pomocą końcówki tamponu nanieś cienką linię kleju na krawędź szkiełka nakrywowego (Rysunek 2).
  6. Zanurz końcówki igieł przetwornika siły i silnika w linii kleju, aby stworzyć wokół obu końcówek obrączkę z kleju.
    UWAGA: Kroki 5.6 – 5.10 wykonuje się przy uważnym sterowaniu zmotoryzowanymi mikropozycjonerami.
  7. Szybko przesuń końcówki igieł w pobliże płaszczyzny ogniskowej kardiomiocytu.
  8. Przesuń końcówkę igły przetwornika siły w dół, tak aby przykleiła się do jednego końca kardiomiocytu.
  9. Powtórz tę procedurę z końcówką silnika i drugim końcem komórki.
    UWAGA: Procedura ta musi zająć mniej niż 2-3 min, ponieważ klej utwardza się bardzo szybko.
  10. Po 5-8 min unieś igły o ≈15 µm, aby uniknąć przyklejenia komórki do szkiełka nakrywowego. Wykonuje się to poprzez jednoczesne przesunięcie w górę obu mikromanipulatorów.
  11. Pozostaw klej do utwardzenia. Procedura ta może trwać od 15 do 45 min, w zależności od rodzaju kleju. W naszym przypadku kardiomiocyt jest odpowiednio przyklejony po ≈15 min.

6. Rejestracja pomiarów siły aktywności, pasywności oraz wrażliwości na Ca2+

  1. Napełnić pierwszą studzienkę eksperymentalną roztworem relaksującym (55-100 µL w aparaturze eksperymentalnej) oraz druga studzienka eksperymentalna z roztworem aktywującym.
  2. Używając oprogramowania kamery, umieść obszar zainteresowania (ROI) w miejscu kardiomiocyta z wyraźnym wzorem prążkowania.
    UWAGA: W przypadku kardiomiocytów robocza długość sarkomeru waha się od 1,8 do 2.2 µm, a optymalna długość sarkomeru wynosi około 2.15 µm.
  3. Zmierz odległość między dwoma przeciwległymi końcami kardiomiocyta (od silnika do obwódki z kleju przetwornika, Rycina 3) po ustaleniu optymalnej długości sarkomeru (2.2 µm). Zapisz wartość jako długość miocytu w oprogramowaniu.
  4. Zmierz szerokość i głębokość kardiomiocytu, przy czym tę drugą z pomocą lustra pryzmatycznego umieszczonego prostopadle do komórki.
    UWAGA: Do wizualizacji komórki przez pryzmat wymagane będzie zastosowanie mocnego, zewnętrznego źródła światła. W przypadku braku pryzmatu, przyjmując, że komórki serca mają kształt eliptyczny, głębokość kardiomiocyta można określić jako 70% szerokości kardiomiocyta.
  5. Obliczenie pola przekroju poprzecznego (CSA, mm²2) przy założeniu eliptycznego kształtu kardiomiocyta.
    figure-protocol-1
  6. Delikatnie przesuń stolik mikroskopu tak, aby komórka przemieściła się z szkiełka nakrywnego do dołka z roztworem relaksującym znajdującego się z tyłu stolika.
    UWAGA: Ta procedura może łatwo uszkodzić komórkę. Przed przesunięciem komórki należy delikatnie przesunąć igły nieco wyżej. Należy unikać wyjmowania komórki z roztworu.
  7. W oprogramowaniu wybierz protokół zawierający dwa skracania komórki (do 80% jej początkowej długości), które wystąpią po zanurzeniu komórki w Ca.2+ roztwór oraz w roztworze relaksacyjnym, odpowiednio (Rycina 1, plik uzupełniający).
    UWAGA: Pierwszy "Slack" komórki zostanie przeprowadzony w roztworze aktywującym, a drugi "Slack" w roztworze relaksującym. W ten sposób użytkownik będzie mógł obliczyć całkowitą siłę (Fcałkowity) komórki z 1st oraz siła bierna (Fbierny) komórki z 2ndUżyj wzoru, aby obliczyć siłę aktywną, Faktywny = Fłącznie - FbiernyKomórkę skraca się o 80%, aby odłączyć wszystkie mostki poprzeczne i zarejestrować siłę.
  8. Wzbudź skurcz izometryczny, przesuwając stolik mikroskopu tak, aby kardiomiocyt przemieścił się z roztworu relaksacyjnego do roztworu aktywującego (pCa=4,5(1)).
    UWAGA: Jeśli komórka jest funkcjonalna, ulegnie ona natychmiastowemu skurczowi.
  9. Po osiągnięciu plateau siły należy rozpocząć rejestrację danych dotyczących siły.
    UWAGA: Testy można przeprowadzać indywidualnie. W zależności od oprogramowania istnieje możliwość stworzenia sekwencji testów, która będzie odpowiadać różnym Ca2+ roztwory wewnątrz Ca2+protokół badania wrażliwości (Rysunek 1, Plik uzupełniający).
  10. Odczekać ok. 10 s, a następnie przenieść komórkę do roztworu aktywującego.
    UWAGA: Należy odczekać 10 s przed zanurzeniem komórki w roztworze relaksacyjnym. Jeśli komórka zostanie przeniesiona zbyt wcześnie, mogą zostać utracone istotne dane niezbędne do obliczenia siły regeneracji komórki (wartość ktr).
  11. Szybko przesuń stolik tak, aby kardiomiocyt został zanurzony w roztworze relaksacyjnym.
  12. Należy poczekać do zakończenia testu.
  13. Powtórz kroki 6.8 – 6.12, aby komórka została dwukrotnie aktywowana w roztworze aktywującym (pCa=4,5(2)).
    UWAGA: Zazwyczaj po pierwszej aktywacji końce kardiomiocytów mogą ulec lekkiemu odczepieniu z końcówek igieł, zmieniając długość kardiomiocyta, pole przekroju poprzecznego (CSA) i/lub długość sarkomeru. Ponownie dostrój do pożądanej długości sarkomeru i wprowadź skorygowane wymiary do oprogramowania.
    1. Przejdź do kroku 6.13.2 dla Ca2+ protokół czułości lub zapis danych, jeśli jedynymi wymaganymi parametrami są wartości siły biernej i czynnej komórki, a następnie oddzielenie komórki od igieł i ich oczyszczenie acetonem w celu usunięcia kleju.
    2. Dostosuj długość sarkomeru komórki do 2.2 µm w razie potrzeby ponownie lekko je rozciągając.
    3. Zastąp roztwór aktywujący kolejnym roztworem Ca2+ roztwór (55-100 µL tutaj). Powtórzyć kroki 6.8–6.12.
    4. Zastąp roztwór aktywujący kolejnym roztworem Ca2+ roztwór (55-100 µL tutaj) i powtórzyć kroki 6.8 – 6.12, aż do przetestowania wszystkich roztworów (5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0).
    5. Na koniec ponownie aktywować komórkę za pomocą roztworu aktywującego (pCa4,5(3)). Powtórzyć kroki 6.8–6.12.

7. Inkubacja z kinazami i fosfatazami

  1. Po przeprowadzeniu wybranego protokołu bazowego, rozcieńczyć kinazę/fosfatazę w roztworze relaksacyjnym (Relaxing solution) do zalecanego stężenia.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu zaleca się wyznaczenie krzywej zależności odpowiedzi od dawki.
  2. Ustawić temperaturę studzienek eksperymentalnych na 20 °C.
  3. Napełnić studzienki eksperymentalne kinazą/fosfatazą, roztworem relaksacyjnym oraz roztworem aktywującym (55-100 µL).
  4. Delikatnie przesunąć stolik mikroskopu tak, aby komórka została zanurzona w studzience zawierającej kinazę/fosfatazę.
  5. Inkubować kardiomiocyt z kinazą/fosfatazą przez co najmniej 30 min lub zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Powtórzyć wybrany protokół bazowy.

8. Zakończenie eksperymentu

  1. Odkleić kardiomiocyt od końcówek przetwornika siły i silnika poprzez rozciągnięcie komórki.
  2. Ostrożnie usunąć pierścień z kleju z końcówek igieł za pomocą patyczka kosmetycznego nasączonego acetonem.
  3. Wyłączyć urządzenie.

9. Analiza danych

  1. Zebierz wszystkie pliki z każdego przebadanego kardiomiocyta.
    UWAGA: Każdy test będzie odpowiadał jednemu plikowi. Oznacza to, że dla każdego Ca2+ do roztworu lub długości sarkomeru będzie przypisany odpowiedni plik.
  2. Obliczanie sił aktywnych i pasywnych pojedynczego kardiomiocytu.
    1. Otwórz plik odpowiadający pierwszej aktywacji (pCa=4,5(1)) za pomocą arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 3A, Dodatek A w pliku uzupełniającym).
      UWAGA: Do przeprowadzenia analizy wykorzystaliśmy program stworzony na specjalne zamówienie. Proszę zapoznać się z Dodatek A w Plik uzupełniający.
    2. Średnia ≈60 wartości przed oraz średnia ≈60 wartości po 1st luz komórki (gdy komórka jest zanurzona w Ca)2+ roztworu). Te dwie wartości odpowiadają odpowiednio a i b.
    3. Powtórz tę samą analizę dla 2nd luźność komórki (gdy komórka jest zanurzona w roztworze relaksacyjnym). Te dwie wartości odpowiadają odpowiednio c i d.
    4. Oblicz różnicę między a i b (całkowita siła, F)łącznie).
    5. Oblicz różnicę między c i d (siła pasywna, F)bierny).
    6. Oblicz siłę aktywną, Faktywny = Fcałkowity - Fbierny.
    7. Znormalizuj wszystkie wartości siły do CSA (patrz powyższa formuła), aby uzyskać całkowite naprężenie (Tcałkowity), napięcie bierne (Tbierny) i napięcie aktywne (Taktywny).
    8. Powtórz kroki od 9.2.1 do 9.2.5 dla 2nd aktywacja (pCa=4,5(2)).
    9. Przyjmij te wartości jako reprezentujące Tcałkowita, Taktywny oraz Tbierny analizowanego kardiomiocytu.
      UWAGA: Pierwsza aktywacja komórki za pomocą pCa4.5(1) zazwyczaj wiąże się ze zmianami wymiarów komórki. Z tego powodu dokładniejsza jest druga aktywacja pCa4.5, która powinna zostać wykorzystana.
    10. Powtórz kroki od 9.2.1 do 9.2.5 dla każdego pliku/testowanego roztworu pCa (5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 4,5(3)).
  3. Obliczanie pCa50 i nHill dla pojedynczego kardiomiocytu.
    UWAGA: Do tej analizy należy użyć nienormalizowanej wartości Faktywny wartości z plików 4,5(2), 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0 i 4,5(3).
    1. Wprowadź do pliku arkusza kalkulacyjnego wszystkie nienormalizowane wartości Faktywny dla każdego Ca2+ testowany roztwór (4,5(2), 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 4,5(3)).
    2. Oblicz współczynnik korekcyjny = Faktywny [4.5(2)] - Faktywny [4.5(3)] / 7.
    3. Oblicz poprawione wartości Faktywny dla każdego Ca2+ roztwory (5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0) poprzez odjęcie Faktywny - współczynnik korekcyjny.
    4. Oblicz względną siłę (Fwzględny) dla każdego Ca2+ roztwory poprzez normalizację każdego Faktywny wartości przez odpowiadające im wartości skorygowane.
      UWAGA: Fwzględny [4.5(3)] powinno być równe 1. Każdy protokół eksperymentalny rozpoczyna się i kończy aktywacją kontrolną przy nasyceniu Ca2+2+ stężenie (pCa 4,5(2) i 4,5(3)). Pozwala to na normalizację siły oraz ocenę spadku aktywności (rundown) preparatów poprzez porównanie zmian maksymalnego Ca2+siła aktywacji (Fmaks.). Jeśli na koniec protokołu eksperymentalnego kardiomiocyt generuje siłę mniejszą niż co najmniej 70% maksymalnej siły pierwszego skurczu, taką komórkę/pomiar należy wykluczyć z analizy.
    5. Użyj Fwzględny or odpowiadające im wartości pCa w celu dopasowania do krzywej sigmoidalnej według następującego równania F(Ca) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill).
    6. Wyznaczyć wartości pCa oraz nHill z powyższego równania.
  4. Oblicz tempo ponownego wytworzenia siły (ktr) pojedynczego kardiomiocyta.
    1. Wykonaj dopasowanie do krzywej odpowiadającej wartościom bezpośrednio po 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. rozluźnienie komórki
    2. Oblicz nachylenie krzywej; wartość ta będzie odpowiadać szybkości ponownego generowania siły.
    3. Powtórz kroki 9.4.1 i 9.4.2 dla każdego Ca2+ roztwór
      UWAGA: W przypadku najniższych stężeń roztworów wapnia (Ca) uzyskano słabe dopasowanie krzywej (R kwadrat ≤ 0,90).

Wyniki

Funkcjonalne permeabilizowane kardiomiocyty powinny wyglądać jednorodnie i wykazywać spójny wzór prążkowania przez cały czas trwania eksperymentu. Choć po przedłużających się badaniach spodziewany jest pewien stopień degradacji i spadek siły, wartości napięcia aktywnego powinny pozostać względnie stabilne. Należy wykluczyć komórki wykazujące wyraźne oznaki utraty prążkowania lub znaczący spadek siły (< 15 kN∙m-2 lub <80% początkowej siły aktywnej). Tabela 6 przedstawia normalne wartości oczekiwane dla najważniejszych parametrów uzyskanych z próbek od gryzoni, świń i ludzi.

Uzyskane parametry zależą głównie od wybranego protokołu. Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne przebiegi siły dla 3 z 8 pomiarów siły niezbędnych do przeprowadzenia protokołu miofilamentów Ca2+-czułość. Poprzez przeniesienie komórki do dołka zawierającego roztwór aktywujący, kardiomiocyt zaczyna generować siłę, aż do osiągnięcia plateau. Po krótkim teście rozluźnienia (slack test, czas trwania 1 ms), podczas którego kardiomiocyt skraca się do 80% swojej długości, otrzymujemy wartości bazowe dla siły zerowej. Po teście rozluźnienia komórka nadal generuje siłę, będąc zanurzoną w roztworze aktywującym. Całkowita siła (Fcałkowity) oblicza się poprzez odjęcie wartości plateau od wartości minimalnej. Nachylenie ostatniej części tej krzywej pozwala wyznaczyć wartość szybkości ponownego generowania siły (ktr) (Rycina 6), co stanowi miarę pozornego tempa przyłączania i odłączania mostków poprzecznych (faplikacja i gaap)10Kiedy ktr R2 wartość wynosi <0,90 wartość ktr powinna zostać wykluczona, co zazwyczaj dzieje się przy niższych stężeniach Ca2+ stężenia (pCa 5,6, 5,8 i 6,0). Po przeniesieniu komórki z powrotem do dołka zawierającego roztwór relaksacyjny, komórka ulega rozluźnieniu, a generowana przez nią siła spada. Siła bierna (Fbierny) oblicza się poprzez odjęcie wartości minimalnej (uzyskanej po przedłużonym skróceniu komórki) od tej nowej wartości siły. Siła aktywna wynika z różnicy między Fcałkowity oraz Fpasywny.

Maksymalna siła aktywna i pasywna charakteryzująca kardiomiocyt jest tą pochodzącą z drugiej aktywacji komórki przy użyciu nasyconego roztworu Ca2+ (pCa = 4,5). Pierwszą aktywację zazwyczaj pomija się, ponieważ długość sarkomeru często wymaga ponownego dostosowania.

Aby przeprowadzić protokół badania wrażliwości miofilamentów na Ca2+, konieczne jest wykonanie co najmniej 9 testów aktywacji (4,5; 4,5; 5,2; 5,6; 6,0; 5,0; 5,4; 5,8 i 4,5). Przedstawiona sekwencja jest jedynie przykładem, lecz powinna zawsze zaczynać się od 4,5 (dwukrotnie) i kończyć wartością 4,5. Programowanie oprogramowania do akwizycji danych dla protokołu badania wrażliwości miofilamentów na Ca2+ przedstawiono na Rysunku 1 w Pliku uzupełniającym.

Po obliczeniu siły aktywnej dla wszystkich tych roztworów aktywujących, należy sprawdzić, czy ostatnia aktywacja przyniosła ponad 80% początkowej siły maksymalnej (w przeciwnym razie wyniki dla tej komórki powinny zostać odrzucone, jak wspomniano powyżej). Aby skorygować spadek Fmax w serii eksperymentalnej, do normalizacji punktów danych można wykorzystać interpolowane wartości Fmax. Znormalizowane dane można dopasować do krzywej sigmoidalnej za pomocą następującego równania F(Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill). Uzyskane wartości parametrów reprezentują wrażliwość na wapń (Ca50, którą można przekształcić w pCa50) oraz kooperatywność (nHill). Wszystkie wartości siły mogą zostać przekształcone w wartości napięcia po normalizacji do powierzchni przekroju poprzecznego. Poza protokołami wrażliwości miofilamentów na Ca2+ i aktywacji zależnej od długości, można przeprowadzić inne testy. Dotyczy to zależności Tactive, Tpassive od długości sarkomeru (Rysunek 7) oraz siły resztkowej kardiomiocytów. Rejestry siły resztkowej oblicza się z początkowego powrotu siły (pCa 4.5) osiągniętego po zmianie długości komórki (80%) i normalizuje się do każdej całkowitej siły stanu ustalonego osiągniętej przed zmianą długości11. Wzrost siły resztkowej zazwyczaj wskazuje na mostki poprzeczne o powolnej kinetyce odrywania i wyższej sztywności.

Na koniec należy podkreślić, że technikę tę można przeprowadzać na kardiomiocytach pozbawionych błony komórkowej (skinned), wyizolowanych mechanicznie z próbek zamrożonych lub świeżo pobranych, a także na komórkach wyizolowanych enzymatycznie, a następnie poddanych permeabilizacji błon. Sposób izolacji kardiomiocytów ma istotny wpływ na wyniki uzyskane za pomocą tej techniki. Rysunek 8 przedstawia różnice zaobserwowane pomiędzy trzema procedurami izolacji.

figure-results-1
Rysunek 1: Zintegrowany schemat aparatury pomiarowej. Aparatura pomiarowa obejmuje mikroskop, mikromanipulatory oraz powiązany z nimi komputer. W dolnej części rysunku przedstawiono kardiomiocyt pozbawiony błony komórkowej (skinned cardiomyocyte) przyklejony pomiędzy silnikiem a przetwornikiem siły. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Schemat protokołu izolacji, permeabilizacji i przyklejania komórek. Obraz w lewym górnym rogu składa się z 4 zdjęć przedstawiających fragmenty próbki serca w roztworze RELAX-ISO (A) w szalce Petriego, (B) w probówce używanej do mechanicznej homogenizacji tkanki, (C) homogenizator, (D) tkankę bezpośrednio po homogenizacji oraz (E) tkankę w probówce do permeabilizacji Tritonem. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Wyznaczanie długości oraz długości sarkomeru w usuniętym kardiomiocycie (skinned cardiomyocyte). Wyznaczanie długości i szerokości komórki przy długości sarkomeru ≈2.2 µm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-4
Rycina 4: Protokół aktywacji zależnej od długości (naśladuje mechanizm Franka-Starlinga in vitro). Reprezentatywne zapisy siły oraz parametry wyznaczone z protokołów wrażliwości miofilamentów na Ca2+, przeprowadzonych przed (A, 1.8 µm) i po rozciągnięciu kardiomiocytu do 2.2 µm (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Protokół badania wrażliwości miofilamentów na Ca2+. Reprezentatywne zapisy siły i pochodne parametry. Dla uproszczenia przedstawiono tylko 3 z 8 krzywych siły. Mianowicie kardiomiocyt aktywowany nasycającym, pośrednim oraz najniższym stężeniem roztworu zawierającego Ca2+ (odpowiednio 4,5, 5,6 i 6,0). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-6
Rysunek 6: Reprezentatywne zapisy z komórki kardiologicznej myszy aktywowanej w różnych roztworach wapnia oraz odpowiadające im krzywe dopasowania ktr. (A) pCa 4,5; (B) pCa 5,0; (C) pCa 5,2; (D) pCa 5,4; (E) pCa 5,6; (F) pCa 6,0 oraz wartości E dla napięcia całkowitego, pasywnego i aktywnego, wartość ktr oraz Rsquare dla dopasowania ktr. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-results-7
Rysunek 7: Protokoły zależności Tpassive (A) i Tactive (B) od długości sarkomeru. Napięcie bierne i napięcie czynne obliczono w pojedynczym kardiomiocycie przy długości sarkomeru od 1,8 µm do 2,3 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Reprezentatywne wyniki dla kardiomiocytów wyizolowanych mechanicznie z próbek mięśnia sercowego świeżych ("Fresh") i zamrożonych ("Frozen") oraz z serca trawionego kolagenazą (modyfikowana technika Langendorfa) z późniejszą permeabilizacją Tritonem ("Collag+Triton"). Wartości (A) całkowitego napięcia, (B) napięcia aktywnego i (C) napięcia pasywnego dla kardiomiocytów aktywowanych roztworem pCa 4.5 przy długości sarkomeru ≈2.2 µm. (D) Krzywa wrażliwości na wapń oraz odpowiadające jej wartości (E) pCa50 i (F) nHill. (G) Siła resztkowa i wartości (H) ktr obliczone dla roztworu maksymalnej aktywacji (pCa 4.5). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Przechowywać wRoztwory zapasowe[M]Objętość końcowa (mL)Masa/objętośćUwagi
4°CWodorotlenek potasu (KOH)11005.611 gDo regulacji pH
4°CWodorotlenek potasu (KOH)55014.03 gDo regulacji pH
4°CBES15010.66 g
4°CKwas propionowy11007.483 mLDostosować pH do 7.0 za pomocą KOH 5M lub 1M
4°CCaEGTA składający się z:0.1100Wymieszać i podgrzewać roztwór w temperaturze 60°C przez ponad 1 godzinę. Dostosować pH do 5-6 za pomocą 1M KOH.
- CaCO30.11.001 g
- Titriplex (EGTA)0.13.804

Tabela 1: Instrukcje przygotowania roztworów zapasowych.

RELAX-ISO (do izolacji kardiomiocytów)[mM]Masa
Na2ATP5.953,28 g
MgCl2.6H2O6.041,23 g
Tritiplex (EGTA)20,76 g
KCl139.610,41 g
Imidazol100,68 g

Tabela 2: Instrukcje przygotowania roztworu Relax-ISO.

Roztwór aktywujący (do pomiarów)[mM]Masa / objętość
Na2ATP5.970,823 g
MgCl₂ 1 M6.281,57 mL
Kwas propionowy40.6410,16 ml
BES10025 ml
CaEGTA (wcześniej przygotowany roztwór zapasowy)717,5 ml
Na2PCr14.50,925 g

Tabela 3: Instrukcje przygotowania roztworu aktywującego.

Roztwór relaksacyjny (do pomiarów)[mM]Masa / objętość
Na2ATP5.890,325 g
MgCl₂ 1 M6.480,65 ml
Kwas propionowy40.764,08 ml
BES10010 ml
Titriplex (EGTA)6.970,265 g
Na2PCr14.50,370 g

Tabela 4: Instrukcje przygotowania roztworu relaksacyjnego.

pCa = -Log [Ca2+]Rozluźniający (pCa=9.0)
mL		Aktywujący (pCa=4.5)
mL
50.8639.14
5.11.238.80
5.21.5438.46
5.3238.00
5.42.5137.49
5.53.1436.86
5.63.8936.11
5.74.835.20
5.85.8934.11
5.97.1432.86
68.5731.43

Tabela 5: Instrukcje przygotowania roztworów pCa.

ParametrGryzońŚwiniaCzłowiek
Napięcie czynne, kN·m-2 (w punkcie 2.2 µm)17 – 2819 – 4019 – 36
Napięcie bierne, kN·m-2 (przy 2.2 µm)3.6 – 5.51.9 – 6.81.8 – 2.3
pCa505.58 – 5.645.40 – 5.505.43 – 5.82
nHill2.60 – 2.762.95 – 3.362.99 – 3.10
ktr, s-14.00 – 8.001.00 – 3.000.90 – 2.00

Tabela 6: Typowe parametry i wskaźniki uzyskane z pojedynczych permeabilizowanych kardiomiocytów gryzoni, świń i ludzi. Adaptacja z12.

ProblemMożliwa przyczynaRoztwór
Kardiomiocyt odrywa się podczas maksymalnej aktywacjiZbyt krótki czas klejenia; Klej jest stary i wyschniętyWydłuż czas klejenia; rozważ otwarcie nowej tubki z klejem.
Obecny jest Triton® w zawiesinie komórkowej, której nie można już usunąćPowtórzyć procedurę ekstrakcji, dodając jeden lub dwa dodatkowe cykle z użyciem Tritonu.® etapy wypłukiwania
Kardiomiocyt wykazuje niską siłę w warunkach kontrolnychEkstrakcja przebiegła nieprawidłowo, w wyniku czego otrzymano komórki niskiej jakości.Zwiększyć wielkość próbki i przeprowadzić ponowną ekstrakcję. Jeśli problem nadal występuje, jest to prawdopodobnie spowodowane niewłaściwym pobraniem próbki – w takim przypadku próbkę należy odrzucić.
Komórka widocznie się kurczy, lecz nie rejestruje się żadnej siły; Komórka wykazuje nietypowe wartości siłyPrzetwornik siły jest wyłączonyWłącz urządzenie
Przetwornik siły nie jest prawidłowo skalibrowanyKalibrować przetwornik siły, używając zestawu odważników o znanych wartościach (należy sprawdzić instrukcję obsługi producenta).
Igła przetwornika siły jest luźnaPonownie przykleić igłę, używając kleju Crystalbond 509 lub wosku jubilerskiego.
Wzór prążkowania nie jest wystarczająco wyraźny, aby określić długość sarkomeru.Niewystarczające oświetlenieZwiększyć natężenie światła mikroskopu lub przesunąć komórkę z powrotem w stronę szkiełka nakrywki i ponownie ocenić długość sarkomeru (dołki mają niższe natężenie światła)
Ekstrakcja przebiegła nieprawidłowo, w wyniku czego uzyskano komórki niskiej jakości.Zwiększyć wielkość próbki i przeprowadzić nową ekstrakcję
Końcówki igieł nie znajdują się w tej samej płaszczyźnieZa pomocą mikromanipulatorów przesuń końcówki igieł w górę lub w dół, aż do znalezienia ostrości obrazu sarkomerów.
Brak zmienności długości i/lub siły podczas akwizycjiSilnik lub przetwornik siły są wyłączoneWłącz je
Silnik jest uszkodzony i nie powoduje skracania się komórki.Należy go wymienić lub spróbować skalibrować go za pomocą generatora funkcji
Zbyt duży poziom szumów w rejestracjach akwizycyjnychZbyt silny przepływ powietrza wokół urządzeniaZabezpieczyć urządzenie przed bezpośrednim strumieniem powietrza.
Zbyt wiele wibracji wokół aparaturyZaleca się stosowanie stołu stabilizującego. Nawet w takim przypadku zaleca się usunięcie wszelkich urządzeń, które mogą posiadać kompresor lub emitować wibracje (zamrażarki, lodówki).
Ca2+krzywa czułości wykazuje nietypowe wartości, a wartości siły nie zwiększają się wraz ze wzrostem [Ca]2+].Mieszanie roztworu aktywującego i relaksacyjnego nie zostało wykonane prawidłowo (należy sprawdzić punkty 3.10 do 3.14 sekcji metod, prawdopodobnie z powodu niewystarczającego wymieszania)Rozmrozić fiolki o tym samym stężeniu, zebrać zawartość wszystkich fiolek do jednego zlewka, wymieszać za pomocą mieszadła i ponownie podzielić. Ponownie przetestować te roztwory w nowej celi. Jeśli to nie rozwiąże problemu, przygotować nową partię Ca.2+roztwory zawierające

Tabela 7: Tabela rozwiązywania problemów.

Dyskusja

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą stanowi ważną technikę wyjaśniającą modyfikacje zachodzące na poziomie kardiomiocytów w kontekście fizjologicznym (np. rozciągnięcie) i patologicznym (np. niedokrwienie). Metodologia ta ma kilka zalet, takich jak wymóg minimalnej ilości mięśnia sercowego do oceny funkcji kardiomiocytów uzyskanych z rozmrożonych próbek; Wykorzystując kardiomiocyty z szerokiej gamy gatunków (myszy13, szczur 1,14,15, królik16, świnia17, pies18, świnka morska19 i człowiek20) oraz różne lokalizacje serca, w tym przedsionki, lewą i prawą komorę lub określony obszar zawału serca. Co więcej, technika ta pozwala na dostarczanie określonych stężeń Ca2+ i energii (ATP) przy jednoczesnym pomiarze funkcji struktur regulacyjnych i kurczliwych w ich natywnej konfiguracji.

Pomimo prostoty tej techniki, istnieje kilka krytycznych kroków. Istotne jest, aby zagwarantować jakość każdego etapu od samego początku, w tym pobierania próbek. Białka miofilamentowe są podatne na proteazy21. W związku z tym obowiązkowe jest przechowywanie próbek w ciekłym azocie natychmiast po ich pobraniu. Świeże próbki, które nie były wcześniej zamrażane, będą wytwarzać znacznie większe siły, dlatego nie zaleca się mieszania pomiarów wykonanych w próbkach świeżych i mrożonych w tym samym protokole. Drugim najbardziej krytycznym etapem jest ekstrakcja kardiomiocytów. Podczas tej procedury bardzo ważne jest, aby przez większość czasu utrzymywać próbkę na lodzie. Koktajl inhibitorów proteazy może być stosowany w celu zmniejszenia ryzyka degradacji białka podczas ekstrakcji/przepuszczalności22. Po trzecie, próbki należy ciąć na mniejsze kawałki za pomocą precyzyjnych ruchów skalpela, ponieważ zauważyliśmy obniżoną jakość kardiomiocytów, gdy ten krok został zignorowany. Kolejnym krytycznym krokiem jest mycie kardiomiocytów, ponieważ trudno jest uzyskać właściwą równowagę między wymywaniem Tritona (przenika komórkę, ale sprzyja jej odklejaniu) a utrzymaniem jak największej liczby komórek w supernatancie. Ważne jest, aby najpierw spróbować ekstrakcji i liczby wymywania dla każdej próbki, gatunku lub protokołu. Na przykład w naszych rękach zauważyliśmy, że ekstrakcje tkanek otyłych szczurów ZSF1 mają "tłusty" aspekt, co sprawiało, że komórki te były bardziej śliskie podczas klejenia, ale nie trudniejsze do zmierzenia. Sposobem na obejście tego problemu było przeprowadzenie większej liczby eksperymentów, aby uzyskać rozsądną liczbę komórek na zwierzę. Ponadto ważne jest, aby wybrać dobrą komórkę do klejenia, a mianowicie o dobrym prążkowaniu i rozsądnej długości. Jeśli kardiomiocyt nie ma tych cech, w większości przypadków odczepia się od końcówek igły lub wytwarza żadną lub małą siłę. Ważne jest również, aby użyć odpowiedniego kleju do mocowania kardiomiocytów, biorąc pod uwagę czas klejenia i jego skuteczność w przyklejaniu komórki do igły. W naszych rękach klej silikonowy (Tabela Materiałów) utwardza się szybko (10-15 min) i wystarczająco mocno. Wreszcie ostatni krytyczny krok związany jest z ostrożnym podniesieniem kardiomiocytu 5 minut po sklejeniu komórki (aby uniknąć przyklejenia komórki do szkiełka nakrywkowego) i przed przeniesieniem jej do studzienek (aby uniknąć przeciągania komórki przez etap mikroskopu). Tabela 7 podsumowuje rozwiązywanie problemów związanych z tą techniką, jej podstawowe przyczyny i możliwe rozwiązania w celu przezwyciężenia częstych problemów.

Głównym ograniczeniem tej metody jest to, że nie może ona odpowiedzieć na wszystkie pytania związane z kurczliwością miofilamentów, takie jak szybkość aktywacji/dezaktywacji miofilamentów. W warunkach in vivo depolaryzacja błony, wewnątrzkomórkowy wzrost Ca2 + i jego dyfuzja do miofilamentów muszą nastąpić, aby miocyty się skurczyły, podczas gdy w kardiomiocytach ze skórą dyfuzja Ca2 + do miofilamentów następuje natychmiast, gdy komórka jest zanurzona w roztworze Ca2 + . To szybsze tempo dyfuzji Ca2 + spowoduje odchylenie analizy aktywacji/dezaktywacji miofilamentów23.

Na eksperymenty te mają wpływ różne czynniki, w tym temperatura, pH roztworu, perturbacja mechaniczna (luz-ponowne rozciąganie vs. luz) i procedury mocowania komórek (wiązanie szpilkami vs. klej), wszystkie te zmienne odpowiadają za rozbieżności w literaturze pod względem ktr i zależnego od długości sarkomeru wzrostu siły 4,12.

Przyszły postęp tej techniki obejmuje przeprowadzanie badań funkcjonalnych w nienaruszonych, a nie permeabilizowanych kardiomiocytach. Ta technika ma tę wadę, że polega na wykorzystaniu kardiomiocytów świeżo wyizolowanych (wcześniej nie zamrożonych). Kolejną ważną kwestią, która nie jest bezpośrednio związana z tą metodyką, ale może mieć na nią istotny wpływ, jest maksymalny okres przechowywania zamrożonej próbki. W szczególności obowiązkowe jest ustalenie stopnia degradacji miofilamentów w czasie przechowywania (tj. jak długo można przechowywać zamrożone próbki, aby zapewnić dobrą jakość danych funkcjonalnych pochodzących z wyekstrahowanych kardiomiocytów).

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Portugalskiej Fundacji na rzecz Nauki i Technologii (FCT), Unii Europejskiej, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) i Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) za finansowanie jednostki badawczej UnIC (UID/IC/00051/2013). Projekt ten jest wspierany przez FEDER w ramach COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projektu DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), wspieranego przez Regionalny Program Operacyjny Norte Portugal (NORTE 2020), w ramach umowy partnerstwa Portugalia 2020, za pośrednictwem Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (EFRR), projektu NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), wspieranego przez europejskie fundusze strukturalne i inwestycyjne, regionalnego programu operacyjnego Lizbony programu na rok 2020. Patrícia Rodrigues była finansowana przez FCT (SFRH/BD/96026/2013), a João Almeida-Coelho przez Universidade do Porto/FMUP i FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonSigma34580
Adenozyno-5'-trifosforan soli disodowej hydrat (Na2ATP)SigmaA2383
Węglan wapnia (CaCO3)Merck1.02067.0500
ImidazolVWR24720.157
Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2.6H2O)Merck1.05833.0250
Roztwór chlorku magnezu (MgCl2 1M)SigmaM1028
N,N-bis(2-hydroksyetylo)tauryna (BES)SigmaB9879
Hydrat soli disodowej fosfokreatyny (Na2PCr)SigmaP7936
Chlorek potasu (KCl)Merck1.04936.1000
Wodorotlenek potasu (KOH)Merck8.14353.1000
Kwas propionowy (C3H6O2)Merck8.00605.0500
Silikonowa rurka do wyciskaniaMarineland31003
Tritiplex (EGTA)Merck1.08435.0025
Triton® X-100 10%Merck648463
Homogenizator tkankowy (GKH GT Motor Control)Kontroler długości Terre Haute Glas-col
(model 315C-I)Przetwornik siły Aurora Scientific
(model 403 A)Aurora Scientific
Software ASI 600AAurora Scientific
Sotware VSL (model 900B)Naukowy
mikroskop odwrócony Aurora (IX51)Olimp

Bibliografia

  1. Leite-Moreira, A. M., et al. Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load. Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).
  2. Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart. Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).
  3. Cokkinos, D. V. Introduction to Translational Cardiovascular Research. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).
  4. van der Velden, J., Stienen, G. J. M. Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins. Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).
  5. Garnier, D. Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge. Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).
  6. Brady, A. J. Mechanical properties of isolated cardiac myocytes. Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).
  7. Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. Introduction to Translational Cardiovascular Research. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).
  8. Liang, W. Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato. Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).
  9. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).
  10. Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
  11. Sequeira, V., et al. Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness. Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).
  12. Edes, I. F., et al. Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes. American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).
  13. King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).
  14. Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
  15. Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9 (1), 2956(2019).
  16. Rodrigues, P. G., et al. Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle. American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).
  17. van der Velden, J., et al. Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction. Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).
  18. Wakili, R., et al. Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs. Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).
  19. Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch. Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).
  20. Falcao-Pires, I., et al. Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness. Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).
  21. Lim, C. C., et al. Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes. Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).
  22. Woulfe, K. C., et al. A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study. Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12(2019).
  23. Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P. Exploring cardiac biophysical properties. Global Cardiology Science Practice. 2015, 10(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena funkcji sercafunkcja miofilament wwra liwo na wappomiar si yizolacja kardiomiocyt wkom rki permeabilizowanetraktowanie Tritonemprzetwornik si yd ugo sarkomeru
Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.