Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Biotusz do macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z tkanki trzustki do drukowania 3D obciążonych komórkami konstruktów tkanki trzustkowej

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60434

⸱

13 grudnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Pohang University of Science and Technology, 2School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology, 3Asan Institute for Life Science, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, 4Division of Hepato-Biliary and Pancreatic Surgery, Department of Surgery, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, 5Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Bezkomórkowa matryca zewnątrzkomórkowa (dECM) może dostarczyć odpowiednich wskazówek mikrośrodowiskowych do podsumowania inherentnych funkcji tkanek docelowych w skonstruowanym konstrukcie. W tym artykule wyjaśniono protokoły decelularyzacji tkanki trzustkowej, ocenę biotuszu dECM pochodzącego z tkanki trzustki oraz generowanie konstruktów 3D tkanki trzustki przy użyciu techniki biodruku.

Streszczenie

Przeszczep wysp trzustkowych jest obiecującym sposobem leczenia dla pacjentów, którzy cierpią na cukrzycę typu 1, której towarzyszy hipoglikemia i wtórne powikłania. Jednak przeszczepianie wysp trzustkowych nadal ma kilka ograniczeń, takich jak niska żywotność przeszczepionych wysp trzustkowych z powodu słabego wszczepienia wysp trzustkowych i nieprzyjaznego środowiska. Ponadto komórki produkujące insulinę zróżnicowane z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych mają ograniczoną zdolność do wydzielania wystarczającej ilości hormonów, które mogą regulować poziom glukozy we krwi; Dlatego zdecydowanie konieczna jest poprawa dojrzewania poprzez hodowlę komórek z odpowiednimi sygnałami mikrośrodowiskowymi. W tym artykule wyjaśniamy protokoły przygotowania biotuszu do decelularnej macierzy zewnątrzkomórkowej (pdECM) pochodzącego z tkanki trzustki w celu zapewnienia korzystnego mikrośrodowiska, które może zwiększyć wrażliwość wysp trzustkowych na glukozę, a następnie opisujemy procesy generowania konstruktów tkanki trzustki 3D przy użyciu techniki biodruku opartej na mikroekstruzji.

Wprowadzenie

Ostatnio przeszczep wysp trzustkowych został uznany za obiecującą metodę leczenia pacjentów z cukrzycą typu 1. Względne bezpieczeństwo i minimalna inwazyjność zabiegu to wielkie zalety tego zabiegu1. Ma jednak kilka ograniczeń, takich jak niski wskaźnik sukcesu izolowania wysp trzustkowych i skutki uboczne leków immunosupresyjnych. Co więcej, liczba przeszczepionych wysp trzustkowych stale spada po przeszczepie ze względu na nieprzyjazne środowisko2. Aby przezwyciężyć te trudności, do przeszczepu wysp trzustkowych zastosowano różne biokompatybilne materiały, takie jak alginian, kolagen, poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA) lub glikol polietylenowy (PEG).

Technologia druku komórkowego 3D pojawia się w inżynierii tkankowej ze względu na jej duży potencjał i wysoką wydajność. Nie trzeba dodawać, że biotusze są znane jako ważne składniki zapewniające odpowiednie mikrośrodowisko i umożliwiające poprawę procesów komórkowych w drukowanych konstruktach tkankowych. Znaczna liczba hydrożeli rozrzedzających ścinanie, takich jak fibryna, alginian i kolagen, jest szeroko stosowana jako biotusze. Jednak materiały te wykazują brak złożoności strukturalnej, chemicznej, biologicznej i mechanicznej w porównaniu z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) w natywnej tkance3. Sygnały mikrośrodowiskowe, takie jak interakcje między wyspami trzustkowymi a ECM, są ważnymi sygnałami dla poprawy funkcji wysp trzustkowych. Bezkomórkowy ECM (dECM) może odtworzyć specyficzną dla tkanki kompozycję różnych składników ECM, w tym kolagenu, glikozaminoglikanów (GAG) i glikoprotein. Na przykład pierwotne wyspy trzustkowe, które zachowują swoje obwodowe ECM (np. kolagen typu I, III, IV, V i VI, laminina i fibronektyna) wykazują niską apoptozę i lepszą wrażliwość na insulinę, co wskazuje, że specyficzne tkankowo interakcje komórka-macierz są ważne dla zwiększenia ich zdolności do funkcjonowania podobnie do oryginalnej tkanki4.

W tym artykule wyjaśniamy protokoły przygotowania biotuszu z decelularizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej (pdECM) pochodzącego z tkanki trzustkowej, aby dostarczyć korzystnych wskazówek mikrośrodowiskowych dla zwiększenia aktywności i funkcji wysp trzustkowych, a następnie procesów generowania konstruktów tkanki trzustki 3D przy użyciu techniki biodruku opartej na mikroekstruzji (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Tkanki trzustki świni zostały pobrane z lokalnej rzeźni. Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Asan Medical Center w Seulu w Korei.

1. Decelularyzacja tkanek

  1. Przygotuj roztwory do decelularyzacji.
    UWAGA: 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) stosowana we wszystkich preparatach roztworów jest rozcieńczana przez dodanie wody destylowanej do 10x PBS.
    1. W przypadku 1% roztworu Triton-X 100 rozpuścić 100 ml 100% roztworu Triton-X 100 w 900 ml 1x PBS za pomocą mieszadła magnetycznego z mieszadłem z prędkością 150 obr./min przez 6 godzin. Przygotować 400 ml 1% roztworu Triton-X 100 z 40 ml 10% roztworu Triton-X 100 i 360 ml 1x PBS przygotowanego tuż przed użyciem.
      UWAGA: 10% roztwór Triton-X 100 można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będzie potrzebny.
    2. W przypadku 0,1% roztworu kwasu nadoctowego rozcieńczyć 8,5 ml 4,7% kwasu nadoctowego w 22,8 ml 70% etanolu w 368,7 ml wody destylowanej tuż przed użyciem.
  2. Usuń tkanki obwodowe trzustki i pokrój tkankę przed decelularyzacją.
    1. Umyj wyciętą trzustkę świni pod bieżącą wodą z kranu i usuń tkanki obwodowe za pomocą wysterylizowanych nożyczek.
    2. Przenieś trzustkę do plastikowej torby z kleszczami i zamrażaj w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę, aby skutecznie przeciąć trzustkę do następnego etapu.
    3. Zamrożoną trzustkę pokrój na kawałki o grubości 1 mm za pomocą tarki.
    4. Przenieść 50 g pokrojonej chusteczki do plastikowego pojemnika o pojemności 500 ml.
      UWAGA: W tym przypadku zaleca się plastikowy pojemnik z pokrywką, aby chronić tkanki przed zanieczyszczeniem i zapobiec parowaniu roztworu.
  3. Leczenie odczynnikami.
    UWAGA: Cały proces decelularyzacji należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C na cyfrowej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min. Na wszystkich etapach decelularyzacji wymagane jest fizyczne oderwanie za pomocą kleszczy, aby zapobiec sklejaniu się plastrów trzustki. Mycie pojemnika wodą destylowaną jest konieczne, aby całkowicie usunąć resztki odczynników z pojemnika.
    1. Przed jakimkolwiek odczynnikiem należy przemyć 50 g pokrojonej trzustki w 300 ml wody destylowanej za pomocą shakera.
    2. Mieszać tkankę w sposób ciągły z prędkością 150 obr./min, aż mętna woda zniknie (po około 12 godzinach). Wodę destylowaną należy wymieniać co 2 godziny < br /> UWAGA: Zaleca się wymianę wody destylowanej co godzinę, aby zapewnić skuteczność szybszego usuwania mętnej wody.
    3. Wylać wodę i potraktować 50 g tkanek 400 ml 1% Triton-X 100 w 1 roztworze PBS przez 84 godziny. Odświeżać roztwór co 12 godzin
      UWAGA: W tym momencie ilość tkanki zmniejszy się, ponieważ składniki komórkowe zaczną być usuwane.
    4. Stosuj 400 ml izopropanolu (IPA) przez 2 godziny, aby usunąć pozostały tłuszcz z trzustki.
      UWAGA: To normalne, że tkanka staje się twarda z powodu usuwania tłuszczu w tym procesie.
    5. Po 2 godzinach wyjmij IPA i przemyj chusteczkę 400 ml 1x PBS przez 24 godziny. Odświeżaj 1x PBS co 12 godzin.
    6. Aby wysterylizować pozbawioną komórek tkankę, wyrzuć poprzedni roztwór i potraktuj 400 ml 0,1% kwasu nadoctowego w 4% etanolu przez 2 godziny.
    7. Aby usunąć resztki detergentu, przemyj chusteczkę 400 ml 1x PBS przez 6 godzin. Odświeżaj roztwór co 2 godziny.
    8. Zbierz pozbawione komórek tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z kleszczami.
    9. Zamrażać próbkę w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę. Przykryć stożkową probówkę niestrzępiącą się chusteczką zamiast pokrywką i przymocować gumką w celu efektywnej liofilizacji.
    10. Liofilizować pozbawioną komórek tkankę w temperaturze -50 °C przez 4 d.
      UWAGA: W kroku 1.3 1 g tkanki niepozbawionej komórek należy również liofilizować w tych samych warunkach.

2. Ocena tkanek pozbawionych komórek

UWAGA: Aby ocenić resztkową ilość dsDNA, glikozaminoglikanów (GAG) i kolagenu w tkance pozbawionej komórek w porównaniu z tkanką natywną, do jednej partii oceny wymagane jest co najmniej 1 g każdej z tkanek niebezkomórkowych (tkanka natywna) i tkanka bezkomórkowa. Ilość dsDNA, GAG i kolagenu można obliczyć na podstawie suchej masy tkanki.

  1. Przygotuj roztwory do testów biochemicznych.
    1. Przygotuj roztwór papainy do trawienia próbki.
      UWAGA: Ilość buforu, który należy wykonać, można dostosować w zależności od liczby próbek.
      1. Rozpuść 119 mg 0,1 M fosforanu sodu (jednozasadowego), 18,6 mg 0,5 mM Na2-EDTA i 8,8 mg 5 mM cysteiny-HCl w 10 ml autoklawowanej wody.
      2. Doprowadzić pH roztworu do 6,5, dodając 10 M roztworu NaOH.
      3. Dodać 125 μl 10 mg/ml roztworu podstawowego papainy do powyższego roztworu i odwirować, pozwalając każdemu pierwiastkowi równomiernie się wymieszać.
    2. Przygotować roztwory do testu błękitu dimetylometylenowego (DMMB).
      1. Aby uzyskać barwnik DMMB, rozpuść 8 mg podwójnej soli chlorku 1,9-dimetylometylenu, 1,52 g glicyny i 1,185 g NaCl w 500 ml autoklawowanej wody. Dostosuj pH do 3, dodając 0,5 M roztworu HCl, jednocześnie mierząc zmianę pH za pomocą pH-metru stacjonarnego. Następnie przefiltruj to przez butelkowy filtr próżniowy o pojemności 500 ml.
      2. Przygotować 15 μl roztworu siarczanu chondroityny A o stężeniu 10 mg/ml dla wzorca.
    3. Przygotuj roztwory do testu hydroksyproliny.
      1. W celu uzyskania roztworu roboczego chloraminy rozpuścić 2,4 g octanu sodu, 1 g kwasu cytrynowego i 0,68 g wodorotlenku sodu w 24 ml wody destylowanej i dodać 240 μl lodowatego kwasu octowego, 10 μl toluenu i 6 ml IPA.
        UWAGA: Rozpuść wszystkie proszki w roztworze za pomocą mieszalnika wirowego. Roztwór roboczy chloraminy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy.
      2. W przypadku roztworu chloraminy T rozpuścić 0,35 g chloraminy T w 20 ml roztworu roboczego chloraminy i dodać 2,5 ml IPA. Wir, aby wymieszać wszystkie składniki.
        UWAGA: Przygotować bezpośrednio przed użyciem.
      3. W przypadku roztworu P-DAB umieść 3,75 g P-DAB w 6,5 ml kwasu nadchlorowego i 15 ml IPA; zawiń w folię aluminiową.
        UWAGA: Przygotować bezpośrednio przed użyciem.
  2. Dodaj 1 ml roztworu papainy do 10 mg liofilizowanej tkanki w 1,5 ml probówki do mikrowirówki i przemieszaj probówkę, aby lepiej strawić próbkę.
  3. Umieścić probówkę do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w gumowym stojaku i roztrawić próbki w zlewce o pojemności 500 ml zawierającej 300 ml wody o temperaturze 60 °C przez 16 godzin.
  4. Wirować przy 9 500 x g przez 20 minut, zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki.
  5. Określ ilościowo resztkowe DNA i główne białka w tkankach pozbawionych komórek.
    1. Załadować 1 μl strawionej próbki do spektrometru i zmierzyć ilość dsDNA zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Eksperymentator powinien związać włosy do tyłu i założyć maskę, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.
  6. Wykonaj test DMMB, aby określić ilościowo ilość GAG, która pozostaje w tkance pozbawionej komórek.
    1. Wymieszaj 1 μl roztworu siarczanu chondroityny A i 499 μl 1x PBS, aby uzyskać wzorce. Rozcieńczyć roztwór siarczanu chondroityny A wodą destylowaną o stężeniach 0, 4, 8, 12, 16 i 20 μg/ml.
    2. Załadować trzy porcje po 50 μl każdego stężenia próbki wzorcowej i wytrawionej do płytki 96-dołkowej.
    3. Dodaj 200 μl barwnika DMMB do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej.
    4. Natychmiast odczytać absorbancję przy długości fali 525 nm na czytniku mikropłytek.
  7. Wykonaj test hydroksyproliny, aby określić ilościowo ilość kolagenu.
    1. Aby przeprowadzić test hydroksyproliny, inkubować 250 μl strawionej próbki z równą objętością HCl w temperaturze 120 °C przez 16 godzin.
    2. Suszyć pozostałości w temperaturze pokojowej przez 3 godziny w celu schłodzenia próbek, a następnie ponownie rozpuścić próbki w 1 ml 1x PBS.
    3. Wirować przy 2 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Standardowo należy przygotować 100 μg/ml roztworu hydroksyproliny.
    5. Rozcieńczyć roztwór hydroksyproliny wodą destylowaną o stężeniu 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/ml dla roztworu wzorcowego.
    6. Umieścić trzykrotne próbki po 50 μl i roztwór wzorcowy na płytkę 96-dołkową.
    7. Dodać 50 μl roztworu chloraminy T, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Dodać 50 μl roztworu p-DAB i inkubować przez 30 minut w temperaturze 60 °C.
      UWAGA: Podwielokrotność w ciemnym pomieszczeniu. Po dodaniu owiń talerz folią aluminiową.
    9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    10. Po schłodzeniu zmierzyć absorbancję przy 540 nm na czytniku mikropłytek.

3. Przygotowanie biotuszu

UWAGA: proszek pdECM może być przechowywany stabilnie w temperaturze -80 °C przez co najmniej rok. Przed dostosowaniem pH strawiony roztwór pdECM można przechowywać w temperaturze -20 °C przez jeden miesiąc. Przed użyciem rozmrozić próbkę zamrożonego roztworu pdECM w temperaturze 4 °C przez noc. Roztwór pdECM o dostosowanym pH można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. Strawiony roztwór pdECM można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej kilka dni, ale nie dłużej niż 1 tydzień.

  1. Trawić liofilizowany pdECM z pepsyną.
    1. Aby uzyskać skuteczne trawienie biotuszu, sproszkować liofilizowany pdECM z ciekłym azotem za pomocą moździerza i tłuczka.
    2. Zebrać 200 mg proszku pdECM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodać 20 mg pepsyny i 8,4 ml 0,5 M kwasu octowego (końcowe stężenie wynosi 2 w/v%).
    3. Umieść mieszadło magnetyczne w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i mieszaj z prędkością 300 obr./min przez 96 godzin.
  2. Dostosuj pH strawionego roztworu pdECM.
    UWAGA: Aby uniknąć żelowania przed dostosowaniem pH, proces ten należy przeprowadzić na lodzie.
    1. Odfiltruj niestrawione cząstki w roztworze pdECM za pomocą sitka komórkowego 40 μm za pomocą pipety wyporowej na lodzie, aby uzyskać optymalne trawienie części.
    2. Dodaj 1 ml 10x PBS i odwiruj przed użyciem NaOH.
    3. Ustawić pH na 7 za pomocą 10 M NaOH, sprawdzając pH za pomocą pasków wskaźnikowych pH.
      UWAGA: Wirować za każdym razem, gdy dodawany jest NaOH, aby biotusz został dokładnie wymieszany z innymi odczynnikami.

4. Analiza reologiczna

  1. Konfiguracja eksperymentalna
    1. Przygotować 1,5% (w/v) biotuszu pdECM w celu oceny właściwości reologicznych.
    2. Ustalić geometrię płytki stożkowej 20 mm (średnica stożka 20 mm pod kątem 2°) w trybie reometru z kontrolowaną szybkością.
    3. Twórz sekwencje eksperymentalne w zainstalowanym oprogramowaniu (TRIOS), aby mierzyć lepkość, kinetykę żelowania i moduł dynamiczny biotuszu pdECM.
      1. Lepkość: Umieść biotusz pdECM na płytce. Zmierz złożoną lepkość (Pa·s) biotuszu pdECM przy rosnącej szybkości ścinania od 1 do 1,000 s-1 w stałej temperaturze 15 °C.
      2. Kinetyka żelowania: Umieść biotusz pdECM na płytce. Obliczyć moduł zespolony (G*), mierząc moduł przechowywania i ubytków biotuszu pdECM w temperaturze 4–37 °C przy szybkości przyrostowego wzrostu wynoszącej 5 °C/min (tryb przemiatania w czasie).
      3. Moduł dynamiczny: Umieścić biotusz pdECM na płytce w temperaturze 37 °C na 60 minut przed pomiarem. Zmierz zależny od częstotliwości moduł przechowywania (G') i moduł strat (G'') biotuszu pdECM w zakresie 0,1-100 rad/s przy 2% odkształceniu.

5. 3D drukowanie komórek w tkankach trzustkowych za pomocą wysepek trzustkowych

  1. Przygotowanie izolowanych wysepek
    1. Odizoluj pierwotne wysepki od szczura zgodnie z protokołami opisanymi w poprzednim work5.
    2. Aby oddzielić szczątki i martwe komórki od izolowanej wysepki, przepuść zawiesinę komórek przez sitko do komórek o średnicy 70 μm. Wysepki o średnicy mniejszej niż 70 μm są uważane za martwe lub nienormalne.
    3. Zawiesić izolowane wysepki w pożywce RPMI-1640 i umieścić je na szalce Petriego. Usunąć wysepki o średnicy większej niż 300 μm za pomocą pipety objętościowej P200 pod mikroskopem (soczewka obiektywowa 4x) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Hermetyzacja wysepek w biotuszu pdECM
    1. Przygotuj biotusz pdECM o dostosowanym pH i izolowaną wysepkę.
      UWAGA: Aby uniknąć żelowania przed dostosowaniem pH, proces ten należy przeprowadzić na lodzie.
    2. Delikatnie wymieszać biotusz pdECM i pożywkę zawieszoną na wysepkach (w stosunku 3:1) za pomocą pipety wyporowej, aż do uzyskania równomiernego wymieszania.
      UWAGA: Końcowe stężenie biotuszu pdECM wynosi 1,5%, a gęstość komórek w biotuszu pdECM wynosi 3,000 IEQ/mL.
  3. Drukowanie 3D komórek konstruktów tkanki trzustki
    1. Przygotuj wysterylizowaną strzykawkę i dyszę 22 G.
      UWAGA: Ten miernik został wybrany do drukowania wysepek o średnicy 100-250 μm.
    2. Załadować do strzykawki biotusz pdECM z wysepkami.
    3. Wydrukuj biotusz w zoptymalizowanych warunkach drukowania (prędkość posuwu: 150 mm/min; ciśnienie pneumatyczne: 15 kPa) w temperaturze 18 °C w kształcie siatki.
    4. Aby usieciować biotusz, umieść wydrukowany konstrukt w inkubatorze na 30 minut.
    5. Zanurz wydrukowany konstrukt w pożywce do hodowli wysp trzustkowych, która jest pożywką RPMI-1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny.

6. 3D drukowanie komórek trzustki o wzorzystej strukturze

  1. Przygotowanie dwóch rodzajów biotuszu
    1. Aby potwierdzić wszechstronność drukowania przy użyciu wielu biotuszów, przygotuj dwa zestawy biotuszów pdECM i zabarwij je, dodając 0,4% roztworu błękitu trypanowego i różu bengalskiego do każdego biotuszu pdECM w proporcji odpowiednio 1:20.
      UWAGA: Aby uniknąć żelowania przed dostosowaniem pH, proces ten należy przeprowadzić na lodzie.
    2. Delikatnie wymieszać biotusz pdECM i pożywkę zawieszoną na wysepkach (w stosunku 3:1) za pomocą pipety wyporowej, aż do uzyskania równomiernego wymieszania.
      UWAGA: Końcowe stężenie biotuszu pdECM wynosi 1,5%, a gęstość komórek w biotuszu pdECM wynosi 3,000 IEQ/mL.
  2. Drukowanie 3D komórek wielomateriałowych konstruktów tkanki trzustkowej
    1. Przygotuj wysterylizowane strzykawki i dyszę 25 G.
    2. Załaduj każdy biotusz (niebieski i czerwony) odpowiednio do dwóch różnych strzykawek.
    3. Wydrukuj biotusz w zoptymalizowanych warunkach drukowania (prędkość posuwu: 150 mm/min; ciśnienie pneumatyczne: 15 kPa) w temperaturze 18 °C w kształcie siatki z naprzemiennymi liniami niebieskim i czerwonym.
    4. Aby usieciować biotusz, umieść wydrukowany konstrukt w inkubatorze na 30 minut.
    5. Zanurz wydrukowany konstrukt w pożywce do hodowli wysp trzustkowych, która jest pożywką RPMI-1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Decelularyzacja tkanek trzustki
Opracowaliśmy proces przygotowania biotuszu pdECM w celu zapewnienia specyficznych dla tkanki trzustki mikrośrodowisk, które zwiększają funkcjonalność wysepek w biodrukowanej konstrukcji tkankowej 3D (Rysunek 2A). Po procesie decelularyzacji usunięto 97,3% dsDNA, natomiast reprezentatywne komponenty ECM, takie jak kolagen i GAGs, pozostały na poziomie odpowiednio 1278,1% i 96,9% w porównani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisywał rozwój biotuszów pdECM i wytwarzanie konstruktów 3D tkanki trzustkowej przy użyciu technik drukowania komórek 3D. Aby zrekapitulować mikrośrodowisko tkanki docelowej w konstrukcie tkanki zaprojektowanej w 3D, wybór biotuszu ma kluczowe znaczenie. W poprzednim badaniu potwierdziliśmy, że specyficzne tkankowo biotusze dECM są korzystne dla promowania różnicowania i proliferacji komórek macierzystych10. W porównaniu z polimerami syntetycznymi, dECM może służyć jako środowisko sp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez program rozwoju technologii biologicznych i medycznych Narodowej Fundacji Badawczej (NRF), finansowany przez rząd koreański (MSIT) (2017M3A9C6032067) oraz "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) nadzorowany przez IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szafy bezpieczeństwa biologicznegoCRYSTEPURICUBE 1200
ZamrażarkaThermo Scientific Forma957
Cyfrowa wytrząsarka orbitalnaDAIHAN ScientificDH.
Suszarka suchaDAIHAN ScientificWON-155
LiofilizatorLABCONCO7670540
LodówkaSANSUNGCRFD-1141
TarkaABM1415605793
Mikroskopy odwrócone MikrowirówkaLeicaDMi1
CRYSTEPURISPIN 17R
Czytnik mikropłytekThermo Fisher ScientificMultiskan GO
Mini wirówkaDAIHAN ScientificCF-5
Mieszadła wielopłytkoweDAIHAN ScientificSMHS-6
NanodropThermo LaboratoryjnyScientific ND-LITE-PR
Fisher ScientificSTARA2110
ReometrTAInstrument Discovery HR-2
Mieszalnik wirowyDAIHAN ScientificVM-10
Cirurgical Instruments
Nożyczki operacyjneHiroseHC.13-122
KleszczKorea Ace ScientificHC.203-30
Materiały
1,7 ml probówka do mikrowirówekAxygenMCT-175-C
10 ml szklana fiolkaScilabSL. VI1243
40 &mikro; m sitko do komórekFalcon352340
Zlewka 5 LDong Sung ScienceSDS 2400
50 ml rurka rogowaFalcon352070
500 ml zlewkaKorea Ace ScientificKA.23-08
Butelkowy filtr próżniowy 500 mlCorning431118
500 ml plastikowypojemnik LOCK& LOCKINL301
Płytka 96-dołkowaFalcon353072
Folia aluminiowaDAEKYO
KimwipeKimtech
Pręt magnetycznyKorea Ace ScientificBA.37110-0003
Moździerz i tłuczekDAIHAN ScientificSC. Pipeta wielokanałowa MG100
Eppendorf4982000314
szalka PetriegoSPL10100
Paski wskaźnikowe pHSigma-Aldrich1095350001
Sito siatkoweDAIHAN Scientific
Decelularyzacja
10x pbsHyclonSH30258.01
4,7% Kwas nadoctowyOmegafarm
70%SAMCHUN CHEMICALSE0220 SAM
Woda
IPASAMCHUN CHEMICALSsamchun I0348
Triton-X 100BiosesangT1020
Test biochemiczny
1,9-dimetylo-metylenowy niebieski chlorek podwójna sólSigma-Aldrich341088
10 N NaOHBiosesangS2018
Chloramina TSigma-Aldrich857319
Siarczan chondroityny ASigma-AldrichC4384
Kwas cytrynowySupelco46933
Cysteina-HClSigma-AldrichC1276
Lodowaty kwas octowyMerok100063
GlicynaSigma-Aldrich410225
HClSigma-AldrichH1758
Na2-EDTASigma-AldrichE5134
NaClSAMCHUN CHEMICALSS2097
PapainaSigma-Aldrichp4762
P-DABSigma-AldrichD2004
Kwas nadchlorowySigma-Aldrich311421
Octan soduSigma-AldrichS5636
Wodorotlenek soduSupelcoSX0607N
Fosforan sodu (monozasadowy)Sigma-AldrichRDD007
ToluenSigma-Aldrich244511
Bioink
CharicterizedFBS HycloneSH30084.03
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122
PepsynaSigma-AldrichP7215
Róża bengalskaSigma-Aldrich198250
RPMI-1640 średniroztwór błękitu trypanowego Thermo Fisher Scientific11875093
Sigma-AldrichT8154
WSO04010 miernik pH Fisher Thermo etanol destylowana

Bibliografia

  1. Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268(2017).
  2. Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
  3. Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
  4. Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452(2018).
  5. Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
  6. Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
  7. Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
  8. Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017(2019).
  9. Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
  10. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935(2014).
  11. Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
  12. Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104(2017).
  13. Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
  14. Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798(2017).
  15. La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
  16. Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
  17. Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
  18. Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
  19. Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876(2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ECM pochodz ca z tkanki trzustkidecelularyzowana macierz zewn trzkom rkowaprzygotowanie biotuszutechnika biodruku 3Denkapsulacja wysepeksk ad specyficzny dla tkankidruk ekstruzyjnycharakterystyka reologicznaprzej cie sol elocena wra liwo ci na glukoz
Biotusz do macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z tkanki trzustki do drukowania 3D obciążonych komórkami konstruktów tkanki trzustkowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.