Artykuł metodologiczny

Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu

DOI:

10.3791/60450

⸱

21 listopada 2019

 ,  ,  , 
1Ph.D. Program for Neural Regenerative Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University and National Health Research Institutes, 2Center for Neurotrauma and Neuroregeneration, Taipei Medical University, 3TMU Neuroscience Research Center, Taipei Medical University, 4Department of Neurosurgery, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Surgery, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania i śledzenia nieinwazyjnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza są wykorzystywane jako sonda rezonansu magnetycznego (MRI) do znakowania MSC i nieinwazyjnego śledzenia in vivo po podaniu donosowym za pomocą rezonansu magnetycznego w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie oparte na komórkach macierzystych w leczeniu urazów mózgu, takich jak urazowe uszkodzenie mózgu (TBI), są obiecującym podejściem do badań klinicznych. Jednak przeszkody techniczne, takie jak inwazyjne dostarczanie komórek i śledzenie przy niskiej skuteczności przeszczepów, pozostają wyzwaniami w translacyjnej terapii opartej na łodygach. W artykule opisano nową technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych opartą na znakowaniu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) nanocząstkami superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), a także podawaniu donosowym znakowanych MSC. Te nanocząstki są osadzone w izotiocyjanianach fluoresceiny (FITC) i można je bezpiecznie znakować MSC, które są następnie dostarczane do mózgów myszy z indukcją TBI drogą donosową. Są one następnie nieinwazyjnie śledzone in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) w czasie rzeczywistym. Do ważnych zalet tej techniki, która łączy SPIO do znakowania komórek i podawania donosowego, należą: (1) nieinwazyjne śledzenie MSC in vivo po podaniu przez długie okresy śledzenia, (2) możliwość wielokrotnego dawkowania ze względu na nieinwazyjną drogę dostarczania MSC oraz (3) możliwe zastosowania u ludzi, ze względu na bezpieczeństwo SPIO, nieinwazyjny charakter metody śledzenia komórek za pomocą MRI, i drogi podania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są atrakcyjnymi kandydatami do terapii opartej na komórkach macierzystych w leczeniu zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i urazów u ludzi. Co więcej, MSC zostały wykorzystane jako nośnik do dostarczania białek terapeutycznych w miejscach urazu1,2. W ostatnich latach opracowano obiecujące innowacje w celu ustalenia: 1) nowych dróg dostarczania komórek oraz 2) śledzenia komórek w terapiach zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego opartych na komórkach macierzystych. Donosowe dostarczanie komórek macierzystych do mózgu zależy od zdolności komórek do ominięcia płytki cribriform i częściowego wejścia do opuszki węchowej drogą miąższową3. Połączenie podawania donosowego i znakowania MSCs nanocząstkami superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO) stanowi obiecujące podejście do zastosowań klinicznych MSCs w leczeniu zaburzeń OUN, ponieważ nanocząstki SPIO są bezpiecznymi sondami do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i umożliwiają nieinwazyjne, czułe śledzenie podłużne MSCs po dostarczeniu za pomocą MRI3,4,5. Ponadto podawanie donosowe jest bezpieczną i nieinwazyjną drogą, która umożliwia wielokrotne podawanie w krótkim czasie.

Ten artykuł opisuje bardzo czułą i nieinwazyjną technikę śledzenia MSCs in vivo po dosaniu donosowym w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu (TBI), który wykorzystuje komórki znakowane SPIO i MRI. Jedną z ważnych zalet znakowania SPIO jest czułe wykrywanie SPIO w tkance za pomocą rezonansu magnetycznego, co umożliwia skuteczne i nieinwazyjne śledzenie komórek. Zastosowane tutaj nanocząstki SPIO są dostępne na rynku i oznaczone fluoroforem izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), który pozwala na wykrycie SPIO w tkance bez barwienia immunologicznego lub dodatkowego przetwarzania. Ponadto możliwe jest prowadzenie podłużnego śledzenia w czasie rzeczywistym i badanie biodystrybucji dostarczonych MSC.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt, z aprobatą Komisji Etyki ds. Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym w Tajpej (nr zatwierdzenia. LAC-2018-0574; 15.03.2019).

1. Znakowanie MSCs za pomocą nanocząstek SPIO

  1. Aby oznaczyć MSC za pomocą SPIO, dodać 6 ml pożywki do znakowania (25 μg/ml SPIO w zmodyfikowanej pożywce Eagle [DMEM] firmy Dulbecco bez płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) do kolby T75 zawierającej MSCs (80% konfluencji).
  2. Inkubować komórki z pożywką etykietującą w inkubatorze CO2 (37 °C, 5 % CO2 ) bez wstrząsania. Po 24 godzinach delikatnie usuń nośnik do etykietowania za pomocą sterylnej pipety Pasteura z plastikową końcówką podłączoną do próżni. Przemyj komórki jednowarstwowo 2x 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby usunąć wszelkie ślady niezinternalizowanego SPIO.
    1. Aby ustalić, czy komórki zostały pomyślnie oznakowane, sprawdź znakowane komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym lub mikroskopem konfokalnym, jeśli SPIO są oznaczone fluoroforem (tj. jak te używane tutaj; Rysunek 1B,C). Alternatywnie, należy wykonać barwienie komórek błękitem pruskim (patrz kroki 6.2–6.4 dla protokołu barwienia).
  3. Zebrać przylegające komórki przez potraktowanie 3 ml trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C. Po 5 minutach inkubacji dodaj 7 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM z 10% FBS (v/v), aby dezaktywować trypsynę. Zawiesinę komórek pobrać za pomocą pipety do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS. Policz żywe komórki za pomocą barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru.
    nuta: Osad komórek oznaczonych komórek będzie miał ciemny kolor z powodu obciążenia żelazem (Rysunek 1D). Protokół ten jest odpowiedni do znakowania MSC i obrazowania MRI. Procedura etykietowania MSC6 została wcześniej zoptymalizowana i uwzględniono tutaj tylko kroki mające na celu przygotowanie oznakowanych MSC do śledzenia in vivo, ponieważ śledzenie in vivo jest najważniejsze. Protokół hodowli i znakowania innych typów komórek powinien być zoptymalizowany przez badacza.
  5. Dostosuj stężenie komórek za pomocą PBS do 150 000 komórek (lub liczby, która daje wystarczający sygnał MRI) w 18 μl PBS (lub całkowitej objętości, która zostanie wykorzystana w procedurze podawania donosowego).
    nuta: Zauważono, że stężenie komórek wyższe niż 150 000 komórek/18 μl PBS prowadzi do agregacji komórek, co może wpływać na efektywność podawania donosowego. Jeśli do podania donosowego potrzebna jest większa liczba komórek, należy zwiększyć całkowitą objętość zawiesiny komórkowej i zwiększyć liczbę podań donosowych, ponieważ podanie donosowe jest procedurą nieinwazyjną i możliwe jest wielokrotne dawkowanie.

2. Kontrolowane uderzenie w korę mózgową (CCI)

UWAGA: W tym protokole, samce myszy C57 BL/6 (w wieku 7-8 tygodni) były trzymane w 12/12 godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do jedzenia i wody.

  1. Aby przygotować każdą mysz na uraz CCI, należy podać zolazepam (50 mg/kg) i ksylazynę (20 mg/kg) koktajl znieczulający poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) (1 ml/kg). Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca przy braku reakcji na uszczypnięcie palca. Alternatywnie umieść mysz w komorze zaopatrzonej w 2%-4% izofluranu na 60 sekund.
  2. Ogol sierść na grzbietowej powierzchni czaszki między uszami za pomocą elektronicznej maszynki do strzyżenia włosów. Kilkakrotnie wyczyść ogolony obszar za pomocą sterylnego wacika nasączonego jodem. Użyj bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem, aby usunąć jod.
  3. Umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej i zabezpiecz mysz za pomocą nauszników i pasków na nos. Wykonaj nacięcie śródstrzałkowe (około 2,5 cm) w ogolonej skórze za pomocą sterylnych nożyczek, aby uzyskać dostęp do powierzchni czaszki.
  4. Usuń tkankę z kości za pomocą wacika, aby odsłonić czaszkę. Oczyść powierzchnię czaszki za pomocą bawełnianego wacika nasączonego 3%H2O2 przez 10 s, a następnie wyczyść ją suchym wacikiem.
    nuta: Szwy czaszki oraz zarówno bregma, jak i lambda mogą być teraz łatwo zidentyfikowane.
  5. Zidentyfikuj wybrane współrzędne na powierzchni czaszki dla urazu CCI i narysuj okrąg (o średnicy 4 mm) wokół współrzędnych za pomocą ołówka lub odpowiedniego markera.
    nuta: W tym protokole do indukcji CCI wykorzystano współrzędne przednio-tylne (AP) -2,0 mm i przyśrodkowo-boczne (ML) +1,5 mm.
  6. Użyj mikrowiertła i okrągłego zadzioru (średnica 0,5 mm), aby rozrzedzić czaszkę w zaznaczonym okręgu. Unikaj wywierania nacisku podczas wiercenia, ponieważ wiercenie w kości może spowodować uszkodzenie miąższu mózgu. Usuń kurz kostny za pomocą czystego i suchego bawełnianego wacika.
  7. Delikatnie usuń płat kostny za pomocą sterylnych cienkich kleszczy, aby odsłonić oponę twardą, zachowując ją w stanie nienaruszonym. Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej, która była używana do przygotowania przed urazem i umieść ją w ramce stereotaktycznej urządzenia CCI.
  8. Ustabilizuj głowę myszy za pomocą nauszników i pasków na nos. Upewnij się, że główka myszy jest wypoziomowana w kierunku rostralno-ogonowym i w razie potrzeby wyreguluj paski nosowe.
  9. Postępuj zgodnie z instrukcjami na skrzynce sterowniczej, aby wyzerować końcówkę impaktora do odsłoniętej powierzchni kory mózgowej. Upewnij się, że końcówka udaru jest wyrównana bezpośrednio nad żądanymi współrzędnymi kory mózgowej, w które ma zostać uderzona, za pomocą pokręteł sterujących X i Y na podstawie impaktora.
  10. Ustaw parametry eksperymentu za pomocą skrzynki kontrolnej z prędkością 5 m/s, czasem przebywania 250 ms i głębokością urazu 1 mm, aby wywołać łagodne obrażenia myszy.
  11. Wywołaj obrażenia, naciskając przycisk "uderzenie" na skrzynce sterowniczej. Wymaz wszelkie krwawienia, które wystąpią, za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.
  12. Wyjmij mysz z ramy stereotaktycznej i zamknij nacięcie za pomocą jedwabnych szwów chirurgicznych. Nie używaj metalowych klipsów do zamykania pola operacyjnego, ponieważ mysz zostanie poddana działaniu pola magnetycznego do rezonansu magnetycznego.
  13. Stosować miejscowo antybiotyki (bacytracyna, neomycyna) na miejsce operowane, aby zapobiec infekcjom. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej i uważnie ją monitoruj podczas fazy odzyskiwania.
  14. Ketoprofen (2,5 mg/kg, IP) należy podawać codziennie przez 3 dni po zabiegu, chyba że podanie ketoprofenu jest sprzeczne z celami badania.

3. Podanie donosowe

  1. W 1 dniu po indukcji CCI należy podać zolazepam (50 mg/kg) i ksylazynę (20 mg/kg) koktajl znieczulający poprzez wstrzyknięcie dożylne. Upewnij się, że mysz jest głęboko znieczulona z powodu braku reakcji na uszczypnięcie palca.
  2. Przygotuj mysz do donosowego podawania MSCs za pomocą leczenia hialuronidazą.
    1. Chwyć kark myszy i mocno obróć się na plecy, jednocześnie unieruchamiając czaszkę. Umieść końcówkę pipety zawierającej hialuronidazę w sterylnym PBS (4 U/μL) w pobliżu nozdrza myszy pod kątem 45°.
    2. Podać 3 μl zawiesiny hialuronidazy do każdego nozdrza. Trzymaj mysz unieruchomioną i skierowaną do góry na czystej podkładce przez 5 minut. Powtórz zabieg hialuronidazy 4x (łącznie 100 U zawiesiny hialuronidazy).
  3. Po leczeniu hialuronidazą należy trzymać leczoną mysz na czystej podkładce skierowanej do góry przez 30 minut.
  4. Aby dostarczyć MSC do mózgu, przytrzymaj mocno mysz, jak opisano w kroku 3.2.1. Podawać 3 μl/nozdrze zawiesiny MSC w odstępie 3 s. Przytrzymaj mysz w tej samej pozycji przez 30 sekund, aż krople próbki całkowicie znikną.
    nuta: Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas podawania.
  5. Powtórzyć podawanie w odstępie 2 minut do 3x,
    nuta: Całkowita liczba komórek, które mają zostać dostarczone, wynosi 150 000, tak że 18 μl zawiesiny komórek można dostarczyć w dawce 3 μl na każde nozdrze, po 3 razy każda.
  6. Umieść mysz z powrotem w klatce i uważnie ją monitoruj, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.

4. Rezonans magnetyczny in vivo

UWAGA: Barwienie histologiczne tkanki mózgowej było wcześniej używane do potwierdzania udanego dostarczania komórek macierzystych po podaniu donosowym. Metoda ta może być jednak stosowana jedynie jako punkt końcowy badania, a nie w ujęciu podłużnym. Wykorzystanie sond MRI do znakowania terapeutycznych komórek macierzystych pozwoli na podłużne, nieinwazyjne śledzenie komórek in vivo za pomocą MRI. Co ważne, protokół ten skutecznie zmniejsza liczbę wymaganych zwierząt. W tym protokole skanowanie MRI wykonano w 1, 7 i 14 dniu po dostarczeniu MSC.

  1. Aby przygotować mysz do badania MRI, znieczulij mysz izofluranem (5% izofluranu w 1 l/minO2 do indukcji, 1,5%-2% izofluranu do konserwacji). Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że mysz osiągnie wymagany poziom znieczulenia.
  2. Umieść mysz na uchwycie obrazu i zabezpiecz jej pozycję za pomocą stuknięć lub innej odpowiedniej metody. Przesuń uchwyt na środek cewki MRI (magnes 7 T/40 cm) i podłącz złącze monitorowania.
  3. Aby uzyskać skany zależne od T2* przy użyciu sekwencji spin-echo, ustaw czas powtarzania (TR) na 1500 ms, a czas echa (TE) na 2,8 ms.
  4. Użyj pola widzenia (FOV) 16 mm x 16 mm, matrycy akwizycji 128 x 128 (MTX) i grubości warstwy 0,75 x 0,8 mm2 z czterema średnimi sygnałami i kątem obrotu 90° (FA).
  5. Po zakończeniu skanowania wycofaj uchwyt myszy ze środka cewki MRI. Umieść mysz z powrotem w klatce i uważnie ją monitoruj, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia.
  6. Do śledzenia i ilościowego oznaczania oznaczonych MSC na obrazach ważonych T2* należy użyć oprogramowania ITK-SNAP (wersja 3.8.0)7.
    1. Przenieś surowe dane ze skanów MRI z komputera urządzenia do rezonansu magnetycznego do komputera używanego do analizy w formacie DICOM (digital imaging and communications in medicine).
    2. Uruchom oprogramowanie ITK-SNAP i załaduj obrazy MRI, klikając przycisk Plik. Następnie kliknij Otwórz główny obraz w menu. Naciśnij przycisk Otwórz obraz w oknie wyświetlacza, a następnie zlokalizuj i otwórz obrazy MRI za pomocą przycisku Przeglądaj.
      nuta: Wizualizacja oznaczonych komórek na obrazach MRI będzie wyglądać jak obszary hipointensywne. Jeśli konieczne jest dostosowanie kontrastu obrazu, wybierz Narzędzia | Kontrast obrazu.
    3. Utwórz segmentacje obszarów hipointensywnych i zmian chorobowych lub innych części mózgu, wybierając opcję Aktywna etykieta w sekcji etykiet segmentacji. Używaj różnych kolorów etykiet dla różnych segmentów (jeśli potrzebna jest segmentacja więcej niż jednej części).
    4. Użyj narzędzia Wielokąt na głównym pasku narzędzi, aby obrysować hipointensywne obszary reprezentujące MSC oznaczone SPIO. Wybierz opcję Akceptuj, znajdującą się poniżej obrazu MRI. Segmentowane obszary będą wyświetlane w tym samym kolorze, co aktywna etykieta przypisana do tego konkretnego segmentu. Powtórz ten krok segmentacji dla wszystkich wycinków MRI.
    5. Opracuj mapę 3D segmentowanych obszarów, aby przedstawić rozkład MSC w całym mózgu, wybierając narzędzie Skalpel u dołu paska narzędzi 3D, znajdującego się w sekcji Etykiety segmentacji u dołu przybornika ITK-SNAP. Następnie naciśnij przycisk Akceptuj u dołu utworzonej mapy 3D.
    6. Aby przeprowadzić analizę ilościową (średnia objętość i intensywność) segmentowanych obszarów hipointensywnych reprezentujących oznaczone komórki, naciśnij przycisk Segmentacja w górnym panelu i wybierz Objętość i statystyki.

5. Fiksacja mózgu myszy i kriosekcja

  1. Aby naprawić mózg myszy, wykonaj perfuzję przezsercową z 4% paraformaldehydem (PFA) po ostatnim skanowaniu MRI, jak opisano wcześniej8.
    1. Odetnij głowę i wyciągnij mózg8. Utrwalić mózg 4% PFA przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 4 °C.
    2. Odwodnić mózg, zanurzając go w 30% roztworze sacharozy w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno roztworu.
  2. Zanurzyć mózg w roztworze o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrozić w temperaturze -20 °C. Mózg za pomocą mikrotomu kriostatu należy podzielić na plastry o grubości 14 μm i zamontować na szkiełkach. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

6. Barwienie błękitu pruskiego

UWAGA: Barwienie błękitem pruskim jest powszechnie używane do wykrywania zawartości żelaza w komórkach znakowanych SPIO. W tym przypadku barwienie błękitem pruskim służy do potwierdzenia, że hipointensywne sygnały na obrazach MRI odpowiadają MSC znakowane SPIO, a nie artefaktom. Barwienie błękitem pruskim jest jedną z najbardziej czułych metod histochemicznych stosowanych do wykrywania żelaza w tkankach i może być stosowane do identyfikacji nawet pojedynczej granulki żelaza w komórkach.

  1. Myj szkiełka sekcji mózgu wodą destylowaną przez 5 minut.
  2. Barwienie błękitu pruskiego należy wykonać, zanurzając szkiełka na 30 minut w roztworze barwiącym, który zawiera równe części kwasu solnego (10%) i żelazocyjanku potasu (10%) przygotowanych bezpośrednio przed użyciem.
  3. Umyć 3x wodą destylowaną, po 5 min każde. Przeciwbarwić sekcje szybkim jądrowo kolorem czerwonym przez 5 minut. Opłucz szkiełka 2x wodą destylowaną.
  4. Sekcje należy stopniowo odwadniać, zanurzając szkiełka w 95% i 100% alkoholu na 2 minuty każda. Dodaj szkiełko nakrywkowe z żywicznym podłożem montażowym.
  5. Użyj mikroskopu świetlnego, aby wykryć wybarwione komórki w sekcjach mózgu.
    nuta: Żelazo w oznaczonych komórkach pojawi się jako osady w kolorze niebieskim.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwadzieścia cztery godziny po podaniu donosowym, MSC znakowane SPIO zostały wykryte jako silne obszary hipointensywne przyśrodkowe do uszkodzenia kory mózgowej na obrazach T2*-ważonych (Rysunek 2B), wskazując na ukierunkowaną migrację SPIO do miejsca urazu. Migracja ta pozostała widoczna do 14 dni po porodzie, ponieważ stwierdzono, że sygnały hipointensywne były widoczne bez znaczącego zmniejszenia w tym okresie czasu (Rysunek 2B). Ranne zwierzęta leczone PBS nie wykazywały obszarów hipointensywnych, co wskazuje, że obserwowane obszary hipointensywne odpowiadają MSC znakowanym SPIO, a nie sygnalizują artefakty (Rysunek 2A) Biodystrybucja znakowanych MSC, które zaobserwowano in vivo za pomocą MRI, została zobrazowana za pomocą rekonstrukcji 3D (Rysunek 2C, D). Migracja MSCs do uszkodzonej kory została potwierdzona histologicznie przez pruskie barwienie błękitem i wykrywanie kanału FITC SPIO znakowanego FITC w znakowanych MSCs (Figura 3A, B).

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny schemat blokowy protokołu i potwierdzenia in vitro wychwytu SPIO przez MSC. (A) MSCs inkubowano z SPIO przez 24 godziny w celu znakowania. Następnie znakowane MSC zostały dostarczone do mysiego modelu TBI drogą donosową (IN). Wykonano rezonans magnetyczny w różnych punktach czasowych w celu śledzenia znakowanych MSC. Potwierdzenie wystarczającego znakowania MSC przez SPIO uzyskano za pomocą (B) mikroskopii fluorescencyjnej i (C) mikroskopii konfokalnej przy użyciu kanału FITC, ponieważ nanocząstki SPIO zostały oznaczone FITC. (D) Osad komórek oznakowanych MSCs wydawał się ciemny z powodu obciążenia żelazem. FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; SPIO = superparamagnetyczne cząstki tlenku żelaza; MSCs = mezenchymalne komórki macierzyste; MRI = obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego; IN = donosowo; TBI = urazowe uszkodzenie mózgu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Ryc. 2: Rezonans magnetyczny w czasie rzeczywistym umożliwia wykrywanie i śledzenie migracji MSC znakowanej SPIO w kierunku miejsc urazów w mózgach myszy z TBI. (A) Myszy poddano TBI, a następnie poddano leczeniu PBS lub MSC znakowanymi SPIO, podawanymi drogą donosową 24 godziny po urazie. Przekroje koronalne obrazów zależnych od T2 * wykazały oznaczone MSC jako hipointensywny obszar (grot strzałki) na krawędzi miejsca urazu (obszar konturowy) po 1, 7 i 14 dniach od porodu. Myszy leczone PBS nie wykazują obszaru hipointensywnego. (B) Proces segmentacji obszaru miejsca urazu (zielony) i oznaczonych MSC (czerwony) na podstawie koronalnych obrazów T2*-MRI. (C) Rekonstrukcja 3D mózgu myszy w oparciu o obrazy T2*ważone ilustrujące biodystrybucję MSCs znakowanych SPIO w mózgu 14 dni po porodzie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Analiza histologiczna potwierdza obecność MSC znakowanych SPIO w mózgach leczonych zwierząt. Barwienie błękitem pruskim odcinków mózgu myszy (A) leczonej PBS (kontrola) i (C) myszy leczonej MSC znakowanych SPIO. Komórki SPIO-dodatnie wykryto u myszy leczonej MSC (komórki pudełkowe, niebieskie), podczas gdy mysz kontrolna nie wykazała żadnych dodatnich komórek w miejscu uszkodzenia kory mózgowej po 14 dniach od porodu, potwierdzając obserwacje MRI. Analizę mikroskopii fluorescencyjnej kory mózgowej myszy kontrolnej (B) leczonej PBS i (D) myszy leczonej MSC znakowanych SPIO przeprowadzono 14 dni po porodzie. Analiza ujawniła obecność komórek SPIO-dodatnich oznaczonych FITC (komórki pudełkowe, zielone) w uszkodzonej korze u myszy leczonej MSC, ale nie zaobserwowano żadnych sygnałów FITC w korze myszy leczonej PBS. Podziałka = 50 μm, chyba że zaznaczono inaczej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół przedstawia ogólne procedury znakowania MSC SPIO i śledzenia MRI MSCs znakowanych SPIO po podaniu donosowym. Protokół daje możliwość badania migracji i biodystrybucji MSCs po dostarczeniu in vivo w mózgu, przy użyciu metody nieinwazyjnej.

MSCs są atrakcyjnymi kandydatami do terapii opartych na komórkach macierzystych zaburzeń i urazów OUN ze względu na ich zdolność do wydzielania czynników troficznych, które 1) uruchamiają procesy neuroregeneracyjne i 2) zapewniają neuroprotekcję, dzięki ich działaniu przeciwzapalnemu w obszarze urazu 9,10,11,12 . Chociaż długoterminowe śledzenie MRI i wykrywanie MSC znakowanych SPIO może być ograniczone ze względu na rozcieńczenie międzykomórkowego SPIO z podziałem komórkowym, znakowane komórki mogą być wykrywane przez okres do kilku tygodni po przeszczepie w mózgach modeli zwierzęcych13.

Opisano tu również protokół znakowania MSCs z nanocząstkami SPIO pokrytymi dekstranem bez środków transfekcyjnych. Inne protokoły zostały wykorzystane w literaturze 14,15,16. Jednak we wszystkich przypadkach protokoły te powinny być dostosowane do typu komórki, wielkości SPIO, czasu inkubacji i stężenia SPI. Wykazano, że MSCs mają upośledzony potencjał różnicowania chondrogennego, ale nie różnicowanie adipogenne po znakowaniu SPIO17. Dlatego zdecydowanie zaleca się wykonanie testów różnicowania przed dostarczeniem komórek macierzystych w celu oceny wpływu SPIO na siłę różnicowania komórek macierzystych. W poprzednim badaniu wykazano, że znakowanie MSC tym samym typem SPIO i stężeniem zastosowanym w tym badaniu nie wpłynęło na siłę różnicowania osteogennego lub adipogennegoMSCs 6.

Donosowa droga terapeutycznego dostarczania komórek macierzystych w przypadku zaburzeń i urazów mózgu jest obiecującym podejściem do klinicznego zastosowania komórek macierzystych. Jednak wewnętrzne i molekularne mechanizmy, które dyktują zachowanie komórek macierzystych w jamie nosowej, pozostają niejasne. Chociaż droga donosowa jest szeroko badana pod kątem dostarczania małych cząsteczek, rozmiar i zachowanie biodystrybucji łodygi terapeutycznej różnią się od małych cząsteczek. Obecny protokół pokazuje, że MSC mają tendencję do migracji w kierunku miejsca urazu po porodzie donosowym.

W tym przypadku obrazy ważone T2* zostały wykorzystane do śledzenia MSC oznaczonych SPIO. W innych raportach wykorzystano obrazowanie echa gradientowego. Jednak artefakty podatności są często obserwowane w obrazowaniu echa gradientowego z powodu międzykomórkowego SPIO. W obecnym protokole lokalizacja obszarów hipointensywnych reprezentujących MSC znakowane SPIO na obrazach T2 * była taka sama, jak lokalizacja SPIO w sekcjach mózgu, wykryta w badaniu histologicznym (Figura 3). Wskazuje to na odpowiednią czułość obrazowania echa spinowego zależnego od T2* dla śledzenia MSC w mózgu znakowanego SPIO.

Podsumowując, opisany protokół jest korzystny dla badań in vivo nad śledzeniem komórek macierzystych urazów i zaburzeń mózgu. Śledzenie podłużne komórek macierzystych in vivo tradycyjnie odbywa się poprzez składanie zwierząt w ofierze w wielu punktach czasowych. Obecny protokół zapewnia nieinwazyjne i skuteczne podejście do dostarczania i śledzenia MSC, co stanowi potencjalną procedurę terapii opartej na komórkach macierzystych w przypadku urazów i zaburzeń mózgu w warunkach klinicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Granty Ministerstwa Nauki i Technologii na Tajwanie (MOST 104-2923-B-038-004 -MY2, MOST 107-2314-B-038-063 i MOST 107-2314-B-038-042) oraz Uniwersytet Medyczny w Tajpej (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 i DP2-108-21121-01-N-05-01).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały do hodowli komórkowych (tworzywa sztuczne)ThermoFisher ScientificVary Wymiennez dowolnego źródła
Jednorazowe ostrze do mikrotomówVWR95057-832
D-MEM/F-12 (1x) z GlutaMAXGIBCO10565-018
Podłoże do zatapiania zamrożonych próbek tkanek (O. C. T.)Sakura Finetek4583
Płodowa surowica bydlęca (FBS)GIBCO12662-029
Fluorescencyjny mikroskop dzikiego polaOlympus OlympusBX43
ForceptFine Science Tools11293-00Chirurgia
gentamycyna (10 mg / ml)GIBCO15710-064
Maszynka do strzyżenia włosówPet ClubPC-400
Urządzenie do urazów głowyPrecyzyjne systemy i oprzyrządowanieModel TBI-0310
Hialuronidaza z jąder bydlęcychMilliporeSigmaH3506
ITK-SNAP SoftwarePenn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) na Uniwersytecie Pensylwanii oraz Naukowy Instytut Obliczeń i Obrazowania (SCI) na Uniwersytecie UtahITK-SNAP 3.8.0
Ketamina ( Ketavet)Pfizer778-551
MyszyNarodowe Centrum Zwierząt Laboratoryjnych, TajwanC57BL6Szczep myszy typu dzikiego wykorzystany w badaniu
MicrodrillNakanishiNE50Połącz z zadziorami do generowania okna kostnego
MikrotomLeicaRM2265
Mysz (C57BL/6) Mezenchymalne komórki macierzysteGIBCOS1502-100
Skaner MRIBruker Biospec
Bufor fosforanowy Saline (PBS)Corning Cellgro/ThermoFisher21-031-CV
Powidon-jod 7,5%Purdue produkt L.P.Peeling chirurgiczny
Pruska niebieska plamaAbcamab150674
NożyczkiFine Science Tools14084-08Chirurgia
Rama stereotaktycznaKopf InstrumentsModel 900
Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza (SPIO)BioPALMolday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51znakowanie komórek macierzystych do śledzenia in vivo za pomocą MRI
Monofilament do szwówEthiconG697szwów
WisewindWymienny z dowolnym źródłem
TrypLEGIBCO12604-013
Ksylazyna (Rompun)BayerQN05 cm92
Zegar

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelled, G., et al. Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon. Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).
  2. Shahror, R. A., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. Journal of Neurotrauma. , (2019).
  3. Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).
  4. Karussis, D., et al. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).
  5. Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease. Cell Transplant. 23, Suppl 1 123-139 (2014).
  6. Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  7. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  8. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  9. Li, Y., Chopp, M. Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury. Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).
  10. Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275, Pt 3 411-426 (2016).
  11. Ohtaki, H., et al. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).
  12. Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).
  13. Hoehn, M., et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).
  14. Reddy, A. M., et al. In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI. Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).
  15. Roeder, E., et al. Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study. PLoS ONE. 9 (5), e98451(2014).
  16. Schafer, R., et al. Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability. Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).
  17. Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis. NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie rezonansem magnetycznymznakowanie kom rekmikroskopia fluorescencyjnakontrolowany uraz kory m zguobrazowanie T2barwienie b kitem pruskim

Powiązane artykuły