Artykuł metodologiczny

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60455

⸱

12 grudnia 2019

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

W tym artykule

Podsumowanie

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Streszczenie

Sygnalizacja Notch reguluje utrzymanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych poprzez interakcje komórka-komórka. Składowe sygnalizacji Notch wykazują ekspresję dynamiczną. Efektor sygnalizacji Notch Hes1 i ligand Notch Delta-like1 (Dll1) ulegają ekspresji w sposób oscylacyjny w nerwowych komórkach macierzystych/progenitorowych. Ponieważ okres oscylacyjnej ekspresji tych genów jest bardzo krótki (2 h), trudno jest monitorować ich cykliczną ekspresję. Aby zbadać tak szybkie zmiany w ekspresji genów lub dynamice białek, potrzebne są reportery o szybkiej reakcji. Ze względu na szybką kinetykę dojrzewania i wysoką czułość, lucyferazy reporterowej bioluminescencji nadaje się do monitorowania szybkich zmian ekspresji genów w żywych komórkach. Użyliśmy zdestabilizowanego reportera lucyferazy do monitorowania aktywności promotora i reportera połączonego z lucyferazą do wizualizacji dynamiki białek w rozdzielczości pojedynczej komórki. Te reportery bioluminescencyjne wykazują szybki obrót i generują bardzo słabe sygnały; Dlatego opracowaliśmy bardzo czuły system obrazowania bioluminescencyjnego do wykrywania takich słabych sygnałów. Metody te umożliwiają nam monitorowanie różnych dynamik ekspresji genów w żywych komórkach i tkankach, które są ważnymi informacjami pomagającymi zrozumieć rzeczywiste stany komórkowe.

Wprowadzenie

Mózg ssaków składa się z dużej liczby różnych typów neuronów i komórek glejowych. Wszystkie komórki są generowane z nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych (NPC), które najpierw namnażają się, aby zwiększyć swoją liczbę, następnie zaczynają różnicować się w neurony, a na końcu dają początek komórkom glejowym1,2,3,4,5. Gdy komórki zróżnicują się w neurony, nie mogą się namnażać ani zwiększać swojej liczby, dlatego ważne jest utrzymanie NPC do późniejszych etapów. Sygnalizacja Notch poprzez interakcje komórka-komórka odgrywa ważną rolę w utrzymaniu NPCs6,7. Ligandy Notch oddziałują z białkiem błonowym, Notch, na powierzchni sąsiednich komórek i aktywują białko Notch. Po aktywacji następuje proteoliza białka Notch, uwalniając w ten sposób wewnątrzkomórkową domenę Notch (NICD) z błony komórkowej do jądra8,9,10. W jądrze NICD wiąże się z regionami promotorowymi Hes1 i Hes5 (Hes1/5) i aktywuje ekspresję tych genów. Hes1/5 hamują ekspresję genów pronerwowych Ascl1 i Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Ponieważ geny proneuronalne indukują różnicowanie neuronów, Hes1/5 odgrywają istotną rolę w utrzymaniu NPC. Ponadto, ponieważ geny proneuronalne mogą aktywować ekspresję liganda Notch podobnego do Delta1 (Dll1), Hes1/5 również hamują ekspresję Dll1. Dlatego ekspresja Dll1 prowadzi do tego, że sąsiednie komórki są ujemne dla Dll1 poprzez sygnalizację Notch. W ten sposób komórki powstrzymują sąsiednie komórki przed podążaniem tym samym losem, zjawiskiem znanym jako hamowanie boczne8. W rozwijającym się mózgu hamowanie boczne odgrywa rolę w generowaniu różnych typów komórek.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki ujawnia dynamiczne wyrażenia komponentów sygnalizacji Notch w NPCs15,16,17. Sygnalizacja Notch aktywuje ekspresję Hes1, ale białko Hes1 wiąże się z własnym promotorem i hamuje własną ekspresję. Ponadto Hes1 jest wyjątkowo niestabilnym białkiem, które jest degradowane przez szlak ubikwityna-proteasom; W związku z tym represja wobec własnego promotora jest krótkotrwała, a następnie transkrypcja zaczyna się od nowa. W ten sposób ekspresja Hes1 oscyluje zarówno na poziomie transkrypcji, jak i translacji w cyklu 2 godzin18. Z kolei oscylacyjna ekspresja Hes1 indukuje oscylacyjną ekspresję dalszych genów docelowych, takich jak Ascl1, Neurog2 i Dll1, poprzez okresową represję15,16,17,19. Podczas gdy geny proneuronalne mogą indukować różnicowanie neuronów, ich oscylacyjna ekspresja nie jest wystarczająca do różnicowania neuronów; raczej ich trwała ekspresja jest niezbędna do różnicowania neuronów. Oscylacyjna ekspresja genów proneuronalnych jest ważna dla utrzymania NPC, a nie dla indukowania różnicowania neuronów14,15,16. Ekspresja Dll1 oscyluje zarówno na poziomie transkrypcji, jak i translacji podczas różnych morfogenezy, takich jak neurogeneza i somitogeneza. Dynamiczna ekspresja Dll1 jest ważna dla prawidłowej morfogenezy, a stała ekspresja Dll1 indukuje defekty w neurogenezie i somitogenezie17. Odkrycia te pokazują ważną funkcję, jaką dynamika ekspresji genów i kinetyka białek odgrywają w regulacji różnych zdarzeń rozwojowych (tj. Różna dynamika ekspresji wytwarza różne wyniki w zachowaniach komórkowych).

Aby przeanalizować dynamikę sygnalizacji Notch, analiza statyczna tkanek i komórek jest niewystarczająca, ponieważ ciągle się zmieniają. Obrazowanie pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym jest potężnym narzędziem do ujawniania dynamiki ekspresji genów. Dynamiczna ekspresja cząsteczek sygnałowych Notch ulega szybkim reakcjom cyklicznym w okresie 2-3 godzin. Ta szybka okresowa ekspresja stwarza dwa trudne problemy dla monitorowania w czasie rzeczywistym: (1) ekspresja cząsteczek jest tłumiona do niskich poziomów, oraz (2) szybki obrót wymaga szybko reagujących reporterów. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy wcześniej metodę obrazowania bioluminescencji w czasie rzeczywistym20. Ponieważ reporter bioluminescencyjny ma wyższą czułość i krótszy czas dojrzewania niż reportery fluorescencyjne, strategia ta umożliwia nam monitorowanie szybkiej dynamiki w żywych komórkach. Korzystając z wizualizacji w czasie rzeczywistym, odkryliśmy, że więcej genów wykazuje dynamiczną ekspresję, niż wcześniej sądziliśmy. Ponadto wzrosła liczba doniesień pokazujących ekspresję i dynamikę białek w żywych komórkach oraz znaczenie tej dynamiki w różnych zdarzeniach biologicznych, co sugeruje fundamentalną rolę dynamiki w ekspresji genów21,22.

W tym raporcie opisujemy sposób wizualizacji ekspresji liganda Notch Dll1 u NPC zarówno w kulturach dysocjacyjnych, jak i w kulturach warstw korowych. Aby monitorować dynamikę transkrypcji Dll1 na poziomie pojedynczej komórki, wygenerowaliśmy zdysocjowane kultury NPC pochodzących z embrionalnego kresomózgowia transgenicznych myszy przenoszących reporter pDll1-Ub-Fluc, zdestabilizowany reporter lucyferazy napędzany przez promotor Dll1. Aby monitorować dynamikę białka Dll1 in vivo, wprowadziliśmy reporter fuzyjny Dll1-Fluc do NPC w korze mózgowej i zobrazowaliśmy ekspresję reportera w NPC w kulturach warstw korowych. Obrazowanie w czasie rzeczywistym umożliwiło nam uchwycenie różnych cech ekspresji genów i dynamiki białek w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Instytucie Nauk Przyrodniczych i Medycznych Uniwersytetu w Kioto.

1. Reporterzy bioluminescencji

UWAGA: Reporter lucyferazy jest odpowiedni do pomiaru szybkiej dynamiki aktywności promotora poprzez fuzję sygnału degradacji. Co więcej, reporter fuzji lucyferazy umożliwia monitorowanie dynamiki białek w pojedynczej komórce. Oba typy reporterów są dostępne dla hodowli jednowarstwowej (kultura dysocjacyjna) i hodowli tkankowej (hodowla plasterkowa).

  1. Reporter do monitorowania aktywności promotora Dll117
    UWAGA: Aby monitorować szybkie zmiany w ekspresji genów, niezbędny jest szybko reagujący i niestabilny reporter. Lucyferazy świetlików (Fluc) wykazują szybkie dojrzewanie w porównaniu z reporterami fluoresceiny. Ponieważ reporter lucyferazy skonfundowanej ubikwityną (Ub-Fluc) wykazuje szybką degradację i szybki obrót, bardzo przydatne jest monitorowanie dynamicznej ekspresji genów w żywych komórkach20.
    1. Użyj sterowanego przez promotor Dll1 zdestabilizowanego reportera lucyferazy, wszechobecnej lucyferazy (pDll1-Ub-Fluc, Rysunek 1Górny panel), aby monitorować szybkie zmiany w ekspresji Dll1 na poziomie transkrypcji17.
    2. Wygeneruj transgeniczną linię myszy przenoszącą pDll1-Ub-Fluc w celu uzyskania stabilnej ekspresji tego reportera.
  2. Reporter do monitorowania dynamiki białka Dll117.
    1. W przypadku generacji myszy knock-in, wstaw cDNA lucyferazy do końców 3' regionu kodującego Dll1, tak aby białko fuzyjne Dll1-lucyferazy uległo ekspresji (reporter Dll1-Fluc, Rysunek 1A, dolny panel)17.
    2. Monitoruj dynamikę ekspresji Dll1 na poziomie białka, mierząc aktywność lucyferazy.
    3. W celu monitorowania dynamiki białka Dll1 na poziomie tkankowym, należy wprowadzić reporter Dll1-Fluc do NPC w embrionalnym kresomózgowiu za pomocą elektroporacji in utero.

2. System obrazowania bioluminescencyjnego

  1. Zbuduj bioluminescencyjny system obrazowania na żywo za pomocą odwróconego mikroskopu zainstalowanego z bardzo czułą, chłodzoną wodą kamerą CCD. W celu zmniejszenia hałasu i uzyskania wysokiej czułości należy schłodzić kamerę schłodzoną wodą dostarczaną przez cyrkulator wodny o zoptymalizowanej temperaturze -90 °C.
  2. W przypadku obrazowania żywych komórek/tkanek zainstaluj system inkubacji, kontrolując temperaturę i zmieszany gaz, na stoliku mikroskopowym.
  3. Do obrazowania ekspresji zdestabilizowanego reportera lucyferazy należy użyć soczewki obiektywowej o wysokim kącie numerycznym (NA: 1.30) 40-krotnej immersji olejowej. Odległość robocza tej soczewki wynosi 0,2 mm, jest ona dostępna nie tylko do jednowarstwowej hodowli komórkowej, ale także do hodowli warstwowej.
  4. W celu podwójnego monitorowania ekspresji reporterowej lucyferazy i fluoresceiny, zainstaluj urządzenie oświetlające LED na ścieżce światła mikroskopu.
  5. Kontroluj obrazowanie poklatkowe za pomocą oprogramowania powiązanego z mikroskopem (np. programu do akwizycji wielowymiarowej oprogramowania MetaMorph).
  6. Przygotuj cały system w ciemnym pomieszczeniu, ponieważ sygnał zdestabilizowanego reportera lucyferazy jest bardzo słaby i aby uniknąć zewnętrznego światła, zapobiegaj akwizycji.

3. Kultury dysocjacji komórek macierzystych/progenitorowych (NPC)

  1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, naczyń i odczynników do hodowli dysocjacji NPC
    1. Przygotować pożywkę N2/B27 do hodowli nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych o końcowym stężeniu 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylocysteiny, 10 ng/ml bFGF i 50 U/ml penicyliny/streptomycyny w pożywce DMEM/F12.
    2. Przygotować roztwór papainy do dysocjacji zawierający 7 U/ml papainy, 0,006% DNazy i 1 mM N-acetylocysteiny w pożywce EBSS.
    3. Przygotuj 100 mM roztworu sodu lucyferyny do obrazowania luminescencyjnego. Rozcieńczyć 100 mM roztworu lucyferyny w pożywce N2/B27 do końcowego stężenia 1 mM.
      UWAGA: Lucyferyna sama w sobie wykazuje autofluoresceinę. W przypadku podwójnego obrazowania lucyferazy-fluorescencji, zwłaszcza EGFP, obniżenie stężenia lucyferyny do 0,5 mM jest lepsze.
    4. Naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (średnica szkła 27 mm) należy pokryć 40 μg/ml roztworu poli-L-lizyny (PLL) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyj płytki 3x PBS i pozostaw do wyschnięcia.
  2. Preparacja zarodków i dysocjacja NPC
    1. Po eutanazji ciężarnej transgenicznej myszy pDll1-Ub-luc (12,5 dzień embrionalny (E12,5)) przez uduszenie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy, przeciąć brzuch i usunąć macicę.
      UWAGA: Badacze muszą przestrzegać przepisów i wytycznych komitetu ds. badań na zwierzętach w swojej instytucji. Jeśli stosowane są leki znieczulające lub przeciwbólowe, należy je stosować prawidłowo.
    2. Przenieś macicę na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 25 ml lodowatego PBS. Wyjmij zarodki z macicy w lodowatym PBS, używając mikronożyczek i cienkich kleszczy.
    3. Odetnij głowę każdego zarodka za pomocą nożyczek i przenieś ją na 10-centymetrowe szalki Petriego zawierające lodowaty DMEM/F12. Usuń naskórek i chrząstkę otaczające mózg i przenieś mózg na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą lodowate 3 ml pożywki N2/B27.
    4. Odetnij prawą i lewą kresomózgowie od międzymózgowia (Ryc. 1Ba-f, C,D). Usuń opony pokrywające powierzchnię kresomózgowia za pomocą cienkich kleszczy (Rysunek 1Bi). Używając ponownie cienkich kleszczy, wyjmij grzbietowo-boczną część kory mózgowia z kresomózgowia (Rysunek 1Bg,h,j-l E).
    5. Przenieś tkanki do nowych probówek o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety P1000 i usuń wszelkie dodatkowe podłoże za pomocą pipety P200. Dodaj 0,1 ml roztworu papainy na tkankę mózgową (parę kory). Po 15 minutach inkubacji w temperaturze 24 °C delikatnie odpipetować próbki 10 razy pipetą P1000. Ponownie inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 24 °C.
    6. Delikatnie odpipetować próbki 10 razy za pomocą pipety P1000. Odwirowywać próbki przez 3 minuty przy 400 x g i temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant.
    7. Dodać 1 ml pożywki DMEM/F12 do osadu. Delikatnie odpipetować 10 razy pipetą P1000. Odwirowywać próbki przez 3 minuty przy 400 x g i w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Powtórz to jeszcze co najmniej 2 razy.
    8. Do osadu dodać 0,5 ml pożywki N2/B27 zawierającej 1 mM lucyferyny i dobrze wymieszać. Zasiej komórki (1 x 10,6 komórek) do naczynia ze szklanym dnem pokrytym PLL. Hodować komórki w inkubatorze CO2 przez 1 godzinę. Gdy komórki przylgną do naczynia, dodaj 2 ml pożywki N2/B27 zawierającej 1 mM lucyferyny.
  3. Wizualizacja ekspresji reportera lucyferazy w kulturze dysocjacji NPC
    1. Uruchom system obrazowania luminescencji na żywo przed wykonaniem sekcji. W przypadku hodowli NPC należy ustawić temperaturę inkubatora stopniowego na 37 °C i ustawić ustawienie mieszaniny gazów 20% O2, 5% CO2 .
    2. Nałóż olejek immersyjny na soczewkę obiektywu. Umieścić naczynie na próbkę na stoliku mikroskopu. Wyświetl pole ręcznie i wybierz najlepszą pozycję oraz punkt skupienia interesujących komórek. Kliknij na żywo, aby uzyskać obraz testowy.
    3. Uruchom akwizycję poklatkową za pomocą akwizycji dwuwymiarowych (luminescencja i jasne pole) przez 24 godziny za pomocą programu Multi-Dimensional Acquisition. Wybierz program Multi-Dimensional Acquisition i ustaw ustawienie akwizycji w następujący sposób (krok 3.3.6).
    4. Do akwizycji obrazu luminescencyjnego należy użyć następujących ustawień aparatu: niska szybkość przesyłania (50 kHz), binning 2 x 2/4 x 4, czas naświetlania 10 min/5 min. Do akwizycji obrazu w jasnym polu należy użyć następujących ustawień: pośrednia szybkość przesyłania (1 MHz), binning 1 x 1 i czas ekspozycji 100 ms.

4. Elektroporacja in utero

UWAGA: To jest wykonywane w celu wprowadzenia reportera Dll1-Fluc do nerwowych komórek progenitorowych.

  1. Przygotowanie narzędzi i odczynników do elektroporacji
    1. Przygotować mikronaczynia włosowate do wstrzyknięcia DNA do komory kresomózgowia zarodkowego. Rozciągnij kapilarę trawy pod wpływem ciepła, a następnie odetnij i wypoleruj jej końcówkę za pomocą maszyny do polerowania.
    2. Przygotuj mieszaninę DNA z barwnikiem (np. błękitem trypanowym). Stężenie każdego DNA wynosi 1 μg/μl w PBS i dodać barwnik do końcowego stężenia 10%.
      UWAGA: Użyj mieszaniny DNA do wizualizacji dynamiki białka Dll1 w następujący sposób: Dll1-Fluc (reporter białka Dll1, Rysunek 2E górna) i pEF-EGFP (wektor ekspresji EGFP sterowany promotorem EF, Rysunek 2E poniżej), monitorując lokalizację i morfologię transfekowanych komórek.
    3. Przygotuj dwa rodzaje środków znieczulających: 3,88 mg/ml pentobarbitalu i 0,12% ksylazyny, w sterylnym 1x PBS.
    4. Podczas operacji należy używać sterylnych narzędzi i rękawic chirurgicznych.
  2. Elektroporacja in utero
    1. Znieczulenie myszy ICR (E12,5) w ciąży poprzez dootrzewnowe podanie środków znieczulających 500 μl 3,88 mg/ml pentobarbitalu i 500 μl 0,12% ksylazyny.
      UWAGA: Badacze muszą przestrzegać przepisów dotyczących eksperymentów na zwierzętach. Jeśli ktoś musi użyć środków znieczulających lub przeciwbólowych, należy je stosować prawidłowo.
    2. Zepnij włosy i zdezynfekuj skórę peelingiem chirurgicznym.
    3. Sprawdź, czy nie ma reakcji na szczypanie palców. Gdy nie zaobserwuje się odruchu pedałowania, wykonaj 2-3 cm nacięcie przez brzuch wzdłuż linii środkowej. Umieść gazy wokół wypreparowanej części i zwilż gazy ciepłym PBS, aby nie wysuszyć nacięcia. Delikatnie wyjmij prawy róg macicy za pomocą kleszczy w kształcie pierścienia i policz liczbę zarodków.
    4. Delikatnie wstrzyknąć 1-2 μl zmieszanego DNA do komory kresomózgowia zarodków za pomocą mikrokapilary.
      UWAGA: Gdy wstrzyknięcie się powiedzie, można zobaczyć niebieski kolor barwnika na powierzchni macicy.
    5. Zwilż macicę i elektrodę przed podaniem impulsów napięcia, a następnie delikatnie przytrzymaj głowę zarodka. Ustaw dodatnio naładowaną elektrodę po stronie półkuli, w którą wstrzyknięto DNA. Upewnij się, że stan impulsu elektroporacji wynosi 30-50 V przez 50 ms, interwał impulsów wynosi 1 s (50 ms ładowania i 950 ms bez ładowania). Podać 5 impulsów do jednego zarodka i sprawdzić, czy z ujemnie naładowanej elektrody generowane są pęcherzyki.
      UWAGA: Upewnij się, że kierunek elektrody: DNA jest wbudowane w komórki po stronie elektrody dodatniej. Podczas tej procedury nie należy zmieniać położenia elektrody.
    6. Powtórzyć kroki 4.2.3-4.2.4 dla innych zarodków i przywrócić róg macicy do jamy brzusznej. Tę samą procedurę należy przeprowadzić z zarodkami w lewym rogu macicy.
    7. Po założeniu z powrotem lewej strony zszyć nacięcie szwem jedwabnym (4-0) za pomocą igły (17 mm). Przed całkowitym zamknięciem nacięcia należy wprowadzić ciepły PBS do jamy brzusznej
      UWAGA: Odstęp między szwami wynosi około 2 mm.
    8. Po zakończeniu operacji umieść mysz na poduszce grzewczej, aby uzyskać rekonwalescencję po znieczuleniu. Umieść mysz indywidualnie.
      UWAGA: Badacze muszą postępować zgodnie z lokalnymi przepisami instytucjonalnymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach. Jeśli ktoś musi użyć leków przeciwbólowych, należy je stosować prawidłowo.

5. Przygotowanie kultur warstwowych rozwijającej się kory mózgowej i wizualizacja ekspresji reportera lucyferazy w wycinkach korowych

  1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i odczynników do warstwowych kultur kory mózgowej
    1. Przygotować wzbogaconą pożywkę do hodowli wycinków korowych zawierających 5% płodowej surowicy bydlęcej i 5% surowicy końskiej w pożywce N2/B27.
    2. Pęcherzyk 100% gazu O2 przez media DMEM/F12 do preparacji i robienia plastrów korowych.
      UWAGA: Aby bezpiecznie korzystać z tlenu gazowego, przechowuj butlę O2 w szafie butli i monitoruj stężenie tlenu w powietrzu za pomocą miernika stężenia tlenu.
    3. Rozcieńczyć 100 mM roztworu sodu lucyferyny we wzbogaconej pożywce do końcowego stężenia 1 mM.
      UWAGA: Lucyferyna sama w sobie wykazuje autofluoresceinę. W przypadku podwójnego obrazowania lucyferazy-fluorescencji, zwłaszcza EGFP, niższe stężenie lucyferyny (0,5 mM) jest lepsze.
    4. Ustawić inkubator wielogazowy na 37 °C przy 40%O2 i 5% CO2 .
  2. Rozwarstwienie zarodków i badanie ekspresji fluorescencyjnego reportera
    1. Po eutanazji ciężarnej myszy, do której wprowadza się osoby zgłaszające (E13.5) za pomocą elektroporacji in utero (krok 4.2), należy przeciąć jamę brzuszną i usunąć macicę.
      UWAGA: Badacze muszą przestrzegać przepisów dotyczących eksperymentów na zwierzętach. Jeśli używasz środków znieczulających lub przeciwbólowych, używaj ich prawidłowo.
    2. Przenieść macicę na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą PBS. Wyjmij zarodki z macicy w PBS za pomocą mikronożyczek i cienkich kleszczy. Odciąć głowę każdego zarodka i przenieść na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą pożywkę DMEM/F12 z pęcherzykami 100% gazuO2. Usuń naskórek i chrząstki otaczające mózg w pożywce DMEM/F12.
    3. Umieść mózg na pokrywie szalki Petriego za pomocą kleszczy w kształcie pierścienia i umieść pokrywkę na stoliku mikroskopu stereoskopowego z fluorescencją. Sprawdź obszar kory mózgowej wykazujący ekspresję białka fluorescencyjnego pod wpływem światła wzbudzenia (Rysunek 2A, B).
    4. Przenieś mózg na deskę do krojenia z gumy silikonowej wypełnioną 30 ml pożywki DMEM/F12 z bąbelkami 100% gazuO2. Usuń opony mózgowe pokrywające powierzchnię kresomózgowia za pomocą drobnych kleszczy.
    5. Przetnij granicę między przyśrodkową i boczną częścią kresomózgowia grzbietowego i rozdziel na dwie półkule za pomocą mikronoża chirurgicznego lub cienkich kleszczy. Za pomocą mikronoża chirurgicznego przetnij korę jak paski i uformuj plastry kory mózgowej (Rysunek 2C,D). Odpipetować plastry pożywką za pomocą pipety i przenieść je na wzbogacone podłoże w naczyniu o średnicy 35 mm.
    6. Ułóż plastry na wkładkach hodowlanych w naczyniach ze szklanym dnem ze wzbogaconą pożywką. Popraw kierunek plastrów za pomocą cienkich kleszczy. Ustaw powierzchnię cięcia plastrów do powierzchni wkładki kulturowej. Usuń dodatkowy nośnik za pomocą pipety. Inkubować plastry w inkubatorze wielogazowym ustawionym na 40%O2 i 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    7. Dodać 300 μl wzbogaconej pożywki zawierającej 1 mM lucyferyny na zewnątrz wkładki hodowlanej w naczyniu ze szklanym dnem.
  3. Wizualizacja ekspresji reporterowej lucyferazy w kulturach plasterków
    1. Uruchom system obrazowania luminescencji na żywo przed rozpoczęciem sekcji. Stosować następujące warunki kultur warstw korowych: 40% O2 , 5 % CO2 i 37 °C.
    2. Umieść olejek immersyjny na soczewce obiektywu 40x. Umieść naczynie na próbkę na etapie mikroskopu. Uzyskaj obraz testowy świetlówki i ustaw pozycję i płaszczyznę ostrości w obszarze zainteresowania pod oświetleniem światła wzbudzenia.
    3. Przeprowadź akwizycję poklatkową za pomocą akwizycji 3-wymiarowej (luminescencja, fluorescencja i jasne pole) przez 24 godziny (Rysunek 2F-H). Do akwizycji obrazu luminescencyjnego należy użyć następujących ustawień aparatu: niska szybkość przesyłania (50 kHz), binning 2x2/4x4, czas naświetlania 10 min/5 min. Do akwizycji obrazu fluorescencji i jasnego pola użyj następujących ustawień: pośrednia szybkość przesyłania (1 MHz), binning 1x1 i czas naświetlania 100 ms.

6. Przetwarzanie i analiza obrazu

  1. Połącz każdy obraz i utwórz obrazy stosu. Kliknij polecenie Importuj sekwencję obrazów w menu Plik (punkt menu Plik | Import | Sekwencja obrazów) i wybierz folder, w którym zapisywane są pozyskane obrazy. Umieść kilka słów zawartych w nazwie pliku w kolumnie Nazwa plikuzawiera.
  2. Aby usunąć szum promieniowania kosmicznego na obrazach bioluminescencyjnych, należy zastosować wtyczkę SpikeNoise Filter programu ImageJ/Fiji. Otwórz obrazy stosu i kliknij Filtr SpikeNoise.
  3. Zastosuj wtyczkę Savitzky Golay Temporal Filter, aby uzyskać wyraźną dynamikę ekspresji reportera. Otwórz obrazy stosu i kliknij Filtr czasowy Savitzky'ego Golaya.
  4. Aby zmierzyć intensywność wyrażenia reportera, należy zastosować wtyczkę Z Axis Profile Plus do każdej pojedynczej komórki. Zaznacz komórki i ustaw ROI, obszar zainteresowania i kliknij Z Axis Profile Plus.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ekspresja genów Hes1/7 wykazuje 2-godzinny cykl oscylacji w różnych liniach komórkowych oraz podczas somitogenezy. Co więcej, okres oscylacji jest bardzo krótki, a zarówno ich mRNA, jak i białka są niezwykle niestabilne, z okresem półtrwania wynoszącym około 20 min. W przypadku zastosowania reportera o wolnej odpowiedzi nie jesteśmy w stanie śledzić tak szybkiej dynamiki, a przy użyciu stabilnego reportera następuje jego stopniowa akumulacja, podczas gdy ekspresja genu oscyluje. Zatem reporter musi ulegać szybki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Składniki sygnalizacji Notch wykazują ekspresje oscylacyjne w synchronizacji podczas somitogenezy, ale niezsynchronizowane podczas neurogenezy, co prowadzi do trudności w uchwyceniu dynamiki ekspresji przez analizę statyczną w tym drugim przypadku. W związku z tym wymagane jest monitorowanie w czasie rzeczywistym, aby ujawnić dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, takich jak Hes1 i Dll1. Ponieważ okresy ekspresji oscylacji Hes1 i Dll1 są niezwykle krótkie, około 2-3 god...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Yumiko Iwamoto za wsparcie w produkcji filmu. Jesteśmy również wdzięczni Akihiro Isomurze za dyskusję i wsparcie w zakresie analizy obrazu, Hitoshi Miyachi za wsparcie techniczne dla generacji transgenicznych zwierząt, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu (Olympus Medical Science) i Ouin Kunitaki (Andor Japan) za wsparcie techniczne i dyskusje na temat systemu obrazowania bioluminescencyjnego. Prace te były wspierane przez Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. i MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Fundację Takeda (R.K. i H.S.) oraz Platformę na rzecz Dynamicznych Podejść do Żywego Systemu z Ministerstwa Edukacji. Kultura, Sport, Nauka i Technologia, Japonia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System obrazowania bioluminescencyjnego
Cyrkulator wody lodowej (chiller)JulaboModel: F12-ED
Chłodzona kamera CCDAndor TechnologyModel: iKon-M 934
System inkubatoraTOKAI HITModel: INU-ONICS
Mikroskop odwróconyOlympusModel: IX81
Mikroskop odwróconyOlympusModel: IX83
Urządzenie oświetleniowe LEDCoolLEDModel: pE1
MetaMorph URZĄDZENIA MOLEKULARNEModel: 40000
Kontroler gazu mieszającegoTokkenModel: TK-MIGM OLO2
Soczewka obiektywowaOlympusModel: UPLFLN 40X O
Preparaty do sekcji
Mikroskop preparacyjnyNikonModel: SMZ-2B
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyLeicaModel: MZ16FA
Cienkie kleszczeDUMONTINOX No.5
nożyczki, Mikro nożyczki
kleszcze
Kleszcze
10 cm plastikowa szalka PetriegoGreiner664160-013
35 mm plastikowa szalka PetriegoGreiner627160
PBSNacalai Tesque14249-24
DMEM/F12invitrogen11039-021
Odczynniki do NPC kultura dysocjacji
B27 suplementinvitrogen12587-010
bFGFinvitrogen13256-029Roztwór podstawowy: 1 μ g / ml w 0,1% BSA / PBS
D-lucyferynaNacalai Tesque01493-85Roztwór podstawowy: 100 mM w 0,9% soli fizjologicznej
DNaseWorthington Biochemical CorporationLK003172Roztwór podstawowy: 1000 U / ml w EBSS
EBSSWorthington Biochemical CorporationLK003188
Naczynie ze szklanym dnemIWAKI3910-035
Suplement N2 (100x)invitrogen17502-048
N-acetylo-cysteinaSigmaA-9165-25G
PapainWorthington Biochemical CorporationLK003178Roztwór podstawowy: 7U / ml w EBSS
Penicylina / StreptmycynaNacalai Tesque09367-34
Poli-L-lizynaSigmaP-628140 mg / ml w DW
Preparaty do elektroporacji in utero
strzykawka 50 mlTERUMO181228T
ElektrodaNeppagene7 mm
ElektroporatorNeppageneCUY21 EDIT
Kleszcze
GazyKawamoto co.7161
MikrokapilaWykonana we własnym
zakresie PBSNacalai Tesque14249-24
PentbarbitalKyoritsuseiyakuSomnopentyl
Kleszcze
Nożyczki, Mikronożyczki Igła
do szyciaAkiyama MEDICAL MFG. COF17-40B2
KsylazynaBayerSeractal
Preparaty do hodowli Slice
10 cm plastikowa szalka PetriegoGreiner664160-013
35-mm plastikowa szalka PetriegoGreiner627160
Wkładka hodowlanaMilliporePICM01250
DMEM/F12invitrogen11039-021
Surowica bydlęcapłodu Sigma172012-500ML
Kleszcze drobneDUMONTINOX No.5
Kleszcze Serum
dla koniGibco16050-122
Mikronóż chirurgicznyAlcon19 Gauge V-Lance
Inkubator wielogazowyPanasonicNośniki MCO-5MUV-PJ
N2/B27Wykonane we własnym zakresieref. Kultura dysocjacji NPC
PBSNacalai Tesque14249-24
Kleszcze
Nożyczki, Mikronożyczki
Deska do krojenia z gumy silikonowejWyprodukowano we własnym zakresie
pierścieniowew kształcie pierścieniaw kształcie pierścienia

Bibliografia

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704(2014).
  31. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neurony macierzysteelektroporacja in uteroreporter lucyferazydynamika bia ekmonitorowanie ekspresji gen wobrazowanie ywych kom rekhodowla skrawk w koryrozdzielczo pojedynczej kom rki

Powiązane artykuły