Artykuł metodologiczny

Metody hodowli w celu określenia granicy wykrywalności i przeżywalności w pożywkach transportowych Campylobacter jejuni w próbkach kału ludzkiego

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60457

⸱

10 marca 2020

 ,  , 
1TECHLAB, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Chociaż posiewy kału dla Campylobacter są nieprecyzyjne, nadal są uważane za złoty standard identyfikacji. Opisano metody określania granicy wykrywalności i przeżycia C. jejuni w pożywkach transportowych w ludzkim stolcu i porównano je z nowym testem immunologicznym z większą dokładnością.

Streszczenie

Posiew z ludzkiego kału w celu zdiagnozowania choroby jelitowej opartej na Campylobacter trwa kilka dni, co jest wyzwaniem dla hartu ducha lekarza i pacjenta. Kultura jest również podatna na fałszywie ujemne wyniki spowodowane losową utratą żywotności podczas obchodzenia się z próbkami, przerostem innej flory kałowej i słabym wzrostem kilku chorobotwórczych gatunków Campylobacter na tradycyjnych podłożach. Problemy te mogą zakłócić decyzje kliniczne dotyczące leczenia pacjentów i ograniczyły zakres odpowiedzi na podstawowe pytania dotyczące wzrostu i zakażeń Campylobacter. Opisujemy procedurę, która szacuje dolną granicę liczby bakterii, które można wykryć za pomocą hodowli, oraz metodę ilościowego określania przeżywalności C. jejuni w pożywkach używanych do transportu tego delikatnego organizmu. Znając te informacje, możliwe staje się ustalenie klinicznie istotnych progów wykrywania dla testów diagnostycznych i zajęcie się niezbadanymi kwestiami, czy powszechna jest kolonizacja bezobjawowa, czy koinfekcja innymi patogenami jelitowymi jest powszechna, czy też obciążenie bakteryjne koreluje z objawami lub poważnymi następstwami. Badanie obejmowało również przetestowanie 1552 prospektywnie pobranych próbek kału pacjentów z biegunką, które początkowo zostały sklasyfikowane za pomocą konwencjonalnej hodowli, a następnie przetestowane za pomocą nowego testu immunoenzymatycznego. Próbki dodatnie i rozbieżne zostały następnie przebadane czterema metodami molekularnymi w celu przypisania statusu prawdziwie dodatniego lub prawdziwie ujemnego. 5 metod niehodowlanych wykazało całkowitą zgodność we wszystkich 48 pozytywnych i rozbieżnych próbkach, podczas gdy hodowla błędnie zidentyfikowała 14 (28%). Próbki, które zostały nieprawidłowo zidentyfikowane przez hodowlę, obejmowały 13 próbek fałszywie ujemnych i 1 fałszywie dodatnią. Ten podstawowy protokół może być stosowany w przypadku wielu Campylobacter spp. i pozwoli na określenie liczby bakterii Campylobacter, które wywołują objawy zapalenia żołądka i jelit u ludzi, oraz na aktualizację wskaźników występowania.

Wprowadzenie

Amerykańskie Centrum Kontroli Chorób (CDC) opublikowało niedawno, że program nadzoru Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) zgłosił 9 723 przypadki laboratoryjnie zdiagnozowanych infekcji Campylobacter w 2018 roku1. Stanowi to 12% wzrost liczby zgłoszeń przypadków Campylobacter w latach 2015−20171. Na całym świecie Campylobacter spp. należą do najczęstszych bakteryjnych infekcji jelitowych2. Niemniej jednak podejrzewa się, że liczba chorób jelitowych opartych na Campylobacter, które występują każdego roku, jest zaniżona3. To niedoszacowanie jest do przewidzenia, ponieważ większość pacjentów może wyzdrowieć tylko z umiarkowanym dyskomfortem i bez leczenia. Jednak w przypadku pacjentów z poważniejszymi objawami lub którzy są narażeni na większe ryzyko poważnej choroby, a następnie szukają pomocy medycznej, posiew kału jest najczęstszą metodą oceny, czy Campylobacter jest patogenem, który powoduje ich niepokój4.

Dla Campylobacter spp., posiew kału jest szczególnie kłopotliwy. Najczęstszymi organizmami chorobotwórczymi, C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis i C. lari, są mikroaerofilne5. Oznacza to, że bakterie będą umierać w losowym, nieznanym tempie po wystawieniu na działanie powietrza. Czas między pobraniem próbki a założeniem hodowli staje się zatem niekontrolowaną zmienną w zdolności do wykrywania żywotnych Campylobacter spp. przez hodowlę.

Dla bezpośredniej hodowli próbek kału, powolny wzrost Campylobacter jest również problemem. Kolonie Campylobacter są bardzo małe nawet po 48 godzinach inkubacji i mogą być łatwo pokryte przez konkurencyjne organizmy w macierzy kałowej. Płytki zawierające antybiotyki, na które oporna jest większość szczepów C. jejuni i C. coli, są szeroko stosowane, ponieważ antybiotyki hamują wzrost wielu (ale nie wszystkich) konkurencyjnych bakterii kałowych, co pozwala na lepszą wizualizację kolonii Campylobacter6. Jednak inne gatunki Campylobacter, takie jak C. lari i C. upsaliensis, są wrażliwe na niektóre z tych antybiotyków i albo rosną słabo, albo wcale. Przyczynia się to do zaniżania liczby zakażeń Campylobacter przez te wrażliwe na antybiotyki gatunki7.

Jest trzeci powód, dla którego hodowla Campylobacter może być niedokładna. Bakterie, gdy są zestresowane, mogą pozostać żywe, ale mogą stać się "niehodowlane"8. Z definicji oznacza to, że kultura nie wykryje bakterii obecnych w próbce. Nie wiadomo, jak często to się zdarza8.

Biorąc pod uwagę te potencjalne problemy z hodowlą, użyliśmy wielu metod porównawczych, aby błędne wyniki hodowli nie spowodowały, że pojedynczy test porównawczy okazał się niedokładny9. Zastosowane metody hodowli (np. płytki selektywne dla Campylobacter, pożywka transportowa, saszetki generujące gazy) zostały wybrane, ponieważ są one szeroko stosowane w laboratoriach klinicznych do hodowli próbek kału10.

Opisane tutaj protokoły hodowli zostały opracowane, ponieważ nie była znana najniższa liczba Campylobacter jejuni, którą można było wykryć przez hodowlę w ludzkim stolcu. Chociaż opublikowano szacunki dotyczące liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) obecnych w kale drobiu11, wyników tych nie można utożsamiać z ludzkim stolcem, ponieważ Campylobacter spp. są komensalami u kurcząt i nie powodują biegunki. Te podstawowe informacje są potrzebne do ustalenia liczby bakterii Campylobacter, które będą powodować objawy zapalenia żołądka i jelit u ludzi oraz do porównania zjadliwości między szczepami lub gatunkami.

Protokół

1. Wyliczanie Campylobacter w spreparowanych próbkach kału ludzkiego

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane przy użyciu sterylnych technik i materiałów na jednorazowym arkuszu ochronnym w zdezynfekowanym kapturze bezpieczeństwa z przepływem laminarnym.

UWAGA: Żywe Campylobacter są zakaźne i mogą powodować choroby, w tym biegunkę. Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne podczas pracy z bakteriami. Nie pipetować do ust. Zutylizuj wszystkie materiały, które miały kontakt z bakteriami, w odpowiednich pojemnikach na zagrożenia biologiczne.

  1. Wzrost hodowli bakterii
    1. Otrzymaj szczepy C. jejuni (ATCC-33560) lub C. coli (ATCC 33559) (tabela materiałów) w postaci wysuszonych lub zamrożonych kultur i ponownie uwodnić lub rozmrozić bakterie zgodnie z instrukcjami producenta. Umieść ponownie uwodnione bakterie na płytce agarowej specyficznej dla Campylobacter, aby rozpocząć hodowlę. Inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w słoiku beztlenowym zawierającym saszetkę wytwarzającą gazy w atmosferze mikrotlenowej.
    2. Następnego dnia przygotuj 100 ml bulionu wzrostu naparu mózgowo-sercowego (BHI) zawierającego 0,5% tryptykazy, 0,5% peptonu proteazy, 0,0125% pirogronianu sodu i 0,0125% wodorosiarczynu sodu.
    3. Wstępnie zredukuj bulion BHI, przykrywając luźno kolbę i umieszczając ją w słoiku beztlenowym z saszetką, która wytworzy środowisko mikroaerofilowe. Pozostawić bulion do wstępnego zredukowania przez noc w temperaturze 37 °C. Podobnie, należy wstępnie zredukować płytki specyficzne dla Campylobacter, które mają być używane do liczenia kolonii w krokach 1.1.10 i 1.2.2.
    4. Ponieważ Campylobacter są wrażliwe na powietrze, zbierz wszystkie materiały przed zaszczepieniem bulionu i nie marudź podczas obchodzenia się z kulturami. Gdy będzie gotowy do zaszczepienia, dodaj płodową surowicę bydlęcą (FBS) do wstępnie zredukowanego bulionu do 4% całkowitej objętości. Zachowaj 1 ml wstępnie zredukowanego bulionu, aby służył jako ślepa próba w pomiarach gęstości optycznej przy 600 nm (OD600).
    5. Usunąć 3 ml wstępnie zredukowanego bulionu zawierającego FBS i użyć bulionu do zeskrobania płytki startowej zawierającej kulturę Campylobacter. Delikatnie zeskrob płytkę za pomocą pętli zaszczepiającej, a następnie przenieś zawiesinę bakteryjną do sterylnej probówki.
    6. Zaszczepić 100 ml wstępnie zredukowanego bulionu około 3 ml zawiesiny bakteryjnej i inkubować z umiarkowanym wstrząsaniem przy 115 obr./min w temperaturze 37 °C w słoiku beztlenowym zawierającym saszetkę wytwarzającą gaz.
    7. Monitorować wzrost bakterii spektrofotometrycznie przez zmętnienie przy OD600. Użyj zarezerwowanego bulionu jako pustego miejsca. Jeśli słoik beztlenowy zostanie otwarty, wymień saszetkę wytwarzającą gaz.
    8. Przerwać inkubację bulionu po 48−72 h lub zanim wartość OD600 osiągnie ~0,4.
      UWAGA: Ten OD600 zwykle odpowiada 107 do 108 CFU/ml. Tabela 1 zawiera typowe wyniki.
    9. Aby ustalić liczbę bakterii w czystej kulturze podstawowej, należy wykonać osiem serii 10-krotnego rozcieńczania 100 μl bulionu w 900 μl buforu rozcieńczającego (tabela materiałów). Po usunięciu 100 μl bulionu do pierwszego rozcieńczenia, kolbę należy umieścić z powrotem w słoiku beztlenowym ze świeżą saszetką wytwarzającą gaz, aby oczekiwać na użycie w kałużu do napełniania.
    10. Użyć sterylnych kulek galwanicznych, aby rozprowadzić 100 μl 10-5 do 10-7 rozcieńczeń na zduplikowanych, wstępnie zredukowanych płytkach specyficznych dla Campylobacter z kroku 1.1.3. Oznaczyć płytki użytym rozcieńczeniem, umieścić je w drugim słoiku beztlenowym z saszetką wytwarzającą gaz i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48−72 h.
      UWAGA: Zobacz Rysunek 1 i Rysunek 2 dla schematu rozcieńczania i zdjęć kolonii.
    11. Po wzroście wybierz płytkę z 30-300 koloniami do policzenia. Wykorzystaj zliczenia, aby określić jtk/ml kultury bulionu za pomocą równania 1:

      CFU/ml w magazynie = Średnia # kolonii na wybranych (zduplikowanych) płytkach analitycznych ÷ (ml posiane x rozcieńczenie płytki) [Równanie 1]
  2. Przygotowanie i liczenie spreparowanych klinicznych próbek kału
    1. Natychmiast po przygotowaniu płytek do zliczania analitycznego w kroku 1.1.10 należy przygotować drugi zestaw rozcieńczeń bulionu podstawowego, przygotowując 10 seryjnych 2-krotnych rozcieńczeń z bulionu podstawowego i kału Campylobacter ujemnego pod względem kału (NFP). Na przykład, należy przygotować pierwsze rozcieńczenie, mieszając równe objętości bulionu i NFP (np. po 0,1 ml) i dokonać kolejnych rozcieńczeń, przenosząc wyznaczoną objętość mieszaniny bulionu i NFP do probówki o równej wyznaczonej objętości NFP. Dodaj płytkę kontrolną z bulionem niezawierającym Campylobacter dodanego do puli kałowej, aby pomóc zidentyfikować kolonie inne niż Campylobacter.
      1. Wykonać NPR z pozbawionych elementów pozwalających na identyfikację, próbek z nadzoru nad pacjentem z biegunką lub zdrowych stolców dawców, które zostały wcześniej przebadane i uznane za Campylobacter ujemne za pomocą metod takich jak test immunologiczny enzymu Campylobacter i 16S rRNA qPCR.
    2. Smuga T: 10 μl każdego rozcieńczenia Campylobacter/kału na zduplikowanych, wstępnie zredukowanych płytkach agarowych specyficznych dla Campylobacter. Umieścić płytki w słoiku beztlenowym z saszetką wytwarzającą gaz i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 ± 2 godziny.
    3. Zbadaj wizualnie prążkowane płytki pod kątem kolonii przypominających te z czystych kultur Campylobacter.
      UWAGA: Trzecia ćwiartka to zazwyczaj miejsce, w którym można je znaleźć. Zobacz Rysunek 1 i Rysunek 2 dla schematu rozcieńczania i obrazów wielkości, koloru i morfologii kolonii.
    4. Wybierz wiele kolonii podobnych do Campylobacter i barwienie metodą Grama. Używając mikroskopii z soczewką olejkową, zbadaj obszar z cienkimi smugami pod kątem małych bakterii w kształcie krzywych Gram-ujemnych, spiralnych lub cygarowych.
      UWAGA: Campylobacter są Gram-ujemne i wymagają podstawowej fuksyny jako barwnika przeciwstawnego (zamiast typowej safraniny), aby można je było dokładnie zobrazować. Klasyczne bakterie skrzydlate mewy mogą być widoczne, ale nie są wymagane. Zobacz Rysunek 2 dla reprezentatywnej mikrofotografii.
    5. Jeśli którakolwiek z zduplikowanych płytek w określonym rozcieńczeniu ma obecną 1 lub więcej kolonii Campylobacter, należy uznać, że rozcieńczenie ma dodatni wynik posiewu kału.
    6. Weźmy pod uwagę ostatnie rozcieńczenie, które zawiera widoczną kolonię Gram-ujemną podobną do Campylobacter, granicę wykrywania hodowli. Użyj równania 2, aby obliczyć jtk/ml dodatniego rozcieńczenia w spreparowanej klinicznej próbce kału:

      jtk/ml w próbce kału = Analityczny CFU/ml ÷ Rozcieńczenie ostatnią dodatnią kolonią [Równanie 2]

      UWAGA: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z typowymi wynikami.

2. Oznaczanie żywotności Campylobacter przechowywanego w pożywkach transportowych

  1. Zmieszać 1 ml kultury bulionowej Campylobacter (etap 1.1.8) z 1 ml NFP i przygotować 10 podwójnych seryjnych rozcieńczeń w NPR. Dalsze rozcieńczanie każdego rozcieńczenia w stosunku 1:4 w pożywce Cary'ego-Blaira, tak jak poddaje się się obróbce próbkę kliniczną przygotowaną w pożywce transportowej.
  2. Przechowywać 20 probówek do rozcieńczania i kontrolę ujemną w pożywce Cary'ego-Blaira w zamkniętych probówkach w temperaturze 2−8 °C przez 96 godzin i liczyć kolonie z każdego rozcieńczenia występującego w czasie zero i co 24 godziny. W celu zliczenia kolonii należy pobrać próbkę bulionu: probówki kałowe i ustawić kulturę kałową do liczenia kolonii w każdym rozcieńczeniu, w dwóch egzemplarzach.
  3. Każdego dnia roztaczać 10 μl porcji rozcieńczeń kału na agarze selektywnym dla Campylobacter i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin, jak opisano powyżej w krokach 1.1.9−1.2.7.
  4. Przeprowadzić jednoczesne analityczne liczenie płytek oryginalnego wywaru bakteryjnego (z kroku 1.1.8 lub świeżo wyhodowanego bulionu), jak opisano powyżej (kroki 1.1.9−1.1.11). Obliczyć jtk/ml pierwotnego materiału bakteryjnego (równanie 1), aby obliczyć stężenie bakterii w próbce kału pożywki transportowej i jej rozcieńczeniach (równanie 2).

3. Testy niehodowlane do weryfikacji wyników hodowli

  1. Użyj testu immunoenzymatycznego (EIA), który daje minimalne wyniki fałszywie dodatnie12 i wykonaj zgodnie z instrukcjami dołączonymi do opakowania, aby zweryfikować wyniki hodowli.
  2. Użyj testu molekularnego, który może wykryć gen 16S rRNA lub inny gen z szerokiego zakresu gatunków Campylobacter13. Upewnij się, że test molekularny reaguje z gatunkami takimi jak C. upsaliensis lub C. lari, które słabo rosną na standardowym agarze zawierającym antybiotyk 14. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi ekstrakcji DNA z próbek kału i wykonywania testu.
    UWAGA: Dwukierunkowe sekwencjonowanie DNA amplikonu 16S może być wykorzystane do potwierdzenia gatunku Campylobacter w próbce dodatniej. PCR specyficzny dla gatunku (patrz tabela 3 dla genów docelowych) może być również używany do identyfikacji gatunków obecnych w rozbieżnych lub dodatnich próbkach15.

Wyniki

Identyfikacja kolonii Campylobacter spp. wśród konkurencyjnej flory kałowej wymaga sprawnego wzroku i znacznego doświadczenia. Minimalna liczba kolonii, którą można wykryć metodą hodowlano, nie została zbadana, choć szacuje się, że próbki pobrane od pacjentów zawierają od 106 do 109 CFU/mL16,17. Jednakże próbek pacjentów nie można wykorzystać ilościowo, ponieważ nie istnieje niezależna metoda pozwalająca na ustalenie dokładnej liczby bakterii. Aby pokonać to ograniczenie, z jednego zapasu bakterii wykonuje się dwa jednoczesne pomiary. Jeden test służy do wizualnej detekcji kolonii Campylobacter z rozcieńczeń seryjnych zapasu bakterii w matrycy kałowej, co symuluje próbki kliniczne; drugi jest wykorzystywany analitycznie do ilościowego oznaczenia CFU/mL obecnych w hodowli zapasowej bakterii użytej do wzbogacania (Rysunek 2A).

Progi detekcji dla Campylobacter nie będą wartościami stałymi. Jest to oczekiwane, ponieważ każda macierz kałowa jest złożona i unikalna, a wzrost bakterii jest zmienny. Kluczowym parametrem warunkującym sukces jest zidentyfikowanie kolonii o rozmiarze punktowym spośród konkurującej flory kałowej. Reprezentatywna płytka posiewu kału z dodatkiem bakterii jest przedstawiona na Ryc. 2C oraz Ryc. 2D. Płytka kontrolna ujemna bez dodanego Campylobacter jest istotna, aby pomóc w identyfikacji innej flory kałowej. Barwienie metodą Grama wielu potencjalnych kolonii pozwala również wyćwiczyć wzrok w rozróżnianiu właściwych błyszczących kolonii oraz pośredniego różowego koloru bakterii Gram-ujemnych barwionych fuksyną i potwierdza morfologię bakterii w wybranych koloniach (Ryc. 2B). Przeprowadzono siedem niezależnych eksperymentów, wykorzystując 5 bulionów z C. jejuni i 2 buliony z C. coli, co dało progi, które nakładały się na siebie i mieściły się w zakresie 0,3−5 x 106 CFU/mL. Typowe dane przedstawiono w Tabeli 2. Granice detekcji wynosiły średnio 2 x 106 dla C. jejuni i 1,2 x 106 CFU/mL dla C. coli. Wskazuje to, że metoda hodowlana może prawdopodobnie wykryć ~1−2 x 106 C. jejuni lub C. coli na gram próbki kału na standardowym agarze specyficznym dla Campylobacter zawierającym antybiotyki, stosowanym w wielu laboratoriach klinicznych. Istnieje wiele specjalistycznych agarów z różnymi antybiotykami, które mogą dawać różne progi detekcji kolonii. Metody opisane w niniejszej pracy powinny zachęcić do prowadzenia bardziej ilościowych i porównawczych badań w celu poprawy dokładności hodowli i poszerzenia wszechstronności nowych pożywek. Na przykład na pierwszej płytce z rozcieńczeniem 10-5 policzono 152 kolonie, a na drugiej płytce 10-5 144 kolonie. Średnia z dwóch płytek wynosi 148 kolonii. Płytki zaszczepiono 0,1 mL (100 µL) rozcieńczenia 10-5, co zgodnie z Równaniem 1 odpowiada 148 x 106 (14,8 x 107) CFU/mL w czystym materiale szczepowym. Podczas przygotowywania rozcieńczeń kału, hodowlę dodano do ujemnej puli kału w stosunku 1:1. Zatem, zgodnie z Równaniem 2, pierwszy punkt (płytka „a”) na krzywej kałowej odpowiada wartości 14,8 x 107 podzielonej przez 2, co daje 7,4 x 107 CFU/mL. Probówka „a” służy do wykonania 9 dodatkowych rozcieńczeń. Na Ryc. 1 ostatnie rozcieńczenie z jedną widoczną kolonią Gram-ujemną o morfologii przypominającej Campylobacter znajduje się na płytce „g”. W tym przykładzie odpowiada to wartości 1,1 x 106 CFU/mL dla progu detekcji w hodowli kałowej.

Mimo że utrzymanie żywotności jest kluczowe dla dokładności hodowli, zachowanie żywotności Campylobacter spp. podczas przenoszenia i transportu próbek od pacjentów do klinik, a następnie do laboratoriów referencyjnych, jest problematyczne. Typowe przechowywanie polega na chłodzeniu próbek w zwykłych probówkach z zakrętkami, z dostępem powietrza i bez specjalnej atmosfery. Uważa się, że próbki w mediach transportowych (znane również jako próbki konserwowane) wykazują lepszą przeżywalność, jednak istnieje niewiele raportów dostarczających danych ilościowych18.

Opisane powyżej połączenie analitycznych i sztucznie przygotowanych metod próbkowania wykorzystano ponownie w celu oszacowania żywotności i czasu przeżycia C. jejuni w mediach transportowych. Do przygotowania dziesięciu powtórzonych rozcieńczeń próbki w macierzy kałowej (od 2-krotnego do 1024-krotnego) użyto bakteryjnego bulionu stokowego. Analiza ilościowa wykazała, że stężenie w początkowym bulionie wynosiło 4,8 x 107 CFU/mL. Na płytkach przygotowanych w dniu 0, C. jejuni wykryto (2 dni później) na płytce posianej rozcieńczeniem 32-krotnym, co odpowiadało 1,5 x 106 CFU/mL. Jednakże na płytkach przygotowanych po 24-godzinnym przechowywaniu próbki kału w medium Cary Blair w lodówce, widoczne kolonie wyrosły tylko dla rozcieńczenia 2-krotnego (odpowiadającego 2,4 x 107 CFU/mL). Do momentu zakończenia badania po 96 godzinach nie zaobserwowano dalszego spadku żywotności. Ta utrata żywotności odpowiada 16-krotnemu (94%) ubytkowi organizmów zdolnych do hodowli w czasie krótszym niż 24 godziny i wskazuje, że nawet przy chłodzeniu, w przypadku próbek kału w medium Cary Blair zawierających mniej niż 107 CFU/mL C. jejuni, patogen ten może nie zostać wykryty metodą hodowli.

W przeciwieństwie do wyników hodowli, test EIA wykrył obecność C. jejuni przy 256-krotnym rozcieńczeniu w punkcie początkowym oraz przez cały 4-dniowy okres testowania. Próg detekcji C. jejuni dla tego testu EIA z wykorzystaniem wzbogaconych próbek kału wynosi 8,4 x 104 CFU/mL. Próg ten jest niższy niż w przypadku hodowli kału i umożliwia bardziej czułe oraz stabilne wykrywanie C. jejuni.

Aby przetestować zdolność hodowli do wykrywania Campylobacter spp. w rzeczywistych warunkach klinicznych, 1552 kliniczne próbki kału poddano charakterystyce za pomocą 6 procedur: posiewu kału, nowego testu immunoenzymatycznego na Campylobacter spp. oraz 4 metod molekularnych. Wszystkie próbki zostały zebrane prospektywnie i wstępnie sklasyfikowane za pomocą konwencjonalnej hodowli w 3 laboratoriach w Stanach Zjednoczonych, a następnie zweryfikowane za pomocą EIA. Wszelkie próbki dodatnie w hodowli lub wykazujące rozbieżność między wynikami EIA a hodowlą zostały następnie przesiewowo przebadane za pomocą metod molekularnych12. Próbkom przypisano status prawdziwie dodatni lub prawdziwie ujemny na podstawie wyników 5 metod bez użycia hodowli. Pięć metod bez użycia hodowli wykazało pełną zgodność we wszystkich 48 próbkach dodatnich i rozbieżnych, podczas gdy hodowla błędnie zidentyfikowała 14 z nich (28%). Próbki błędnie zidentyfikowane za pomocą hodowli obejmowały 13 wyników fałszywie ujemnych i 1 wynik fałszywie dodatni.

Schemat procesu rozcieńczania kultury bakterii; ocena wzrostu bakterii na płytkach w ciągu 72 godzin.
Rycina 1: Schemat jednoczesnego przygotowania analitycznych i wzbogaconych próbek kału. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzrost kolonii bakteryjnych w szalkach Petriego; mikroskopia barwienia metodą Grama; eksperymentalne wyniki laboratoryjne.
Rycina 2: Identyfikacja kolonii C. jejuni z kultur czystych i kałowych. (A) Fotografia kolonii C. jejuni z czystej kultury bakteryjnej po 72 godzinach inkubacji. (B) Barwienie metodą Grama C. jejuni z czystej kultury bakteryjnej, imersja olejowa, powiększenie 400x. (C) Fotografia dodatniej kultury kałowej z dodatkiem C. jejuni po 48 h inkubacji. (D) Powiększenie obszaru zaznaczonego ramką na (C), powiększenie 10x. Białe strzałki wskazują punktowe kolonie C. jejuni ujemne w barwieniu Grama. Czarna grot strzałki wskazuje kolonię nieco większą, dodatnią w barwieniu Grama i niebędącą C. jejuni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

HodowleOD600 @ T0OD600 @ T końcowe1Końcowe CFU/ml
C. jejuni0.1460.3211,28 x 107
C. coli0.2450.5084,50 x 108

Tabela 1: Typowy wzrost i CFU/mL szczepów C. jejuni oraz C. coli.1 Hodowlę C. jejuni przerwano po 48 h inkubacji. Hodowlę C. coli przerwano po 54 h inkubacji.

Probówka do rozcieńczania wzbogaconej próbki kałuLiczba Campylobacterkolonie przypominająceLiczba kolonii bakterii Gram-ujemnych1Wynik posiewu dodatni?Obliczona wartość CFU/ml próbki wzbogaconej
C. jejuni (1,28 x 108 stężenie zapasu w CFU/ml)(2-krotny) aGęstynd2Tak6,40 x 107
(4-krotny) b20+ndTak3,20 x 107
(8-krotne) c4-10ndTak1,60 x 107
(16-krotne) dndTak8,00 x 106
(32-krotne) endTak4,00 x 106
(64-krotny) f1-31 z 2Tak2,00 x 106
(128-krotne) g2 z 3Tak1,00 x 106
3(256-krotny) h1 z 2Tak5,00 x 105
(512-krotne) i0 z 1nie2,50 x 105
(1024-krotne) j0ndnieNFP
C. coli (4,50 x 108 stężenie zapasu CFU/ml)(2-krotny) aGęstyndTak2,25 x 108
(4-krotny) bndTak1,13 x 108
(8-krotne) c50+ndTak5,63 x 107
(16-krotne) d30+ndTak2,81 x 107
(32-krotny) e10+ndTak1,41 x 107
(64-krotny) f3-8ndTak7,03 x 106
(128-krotne) gndTak3,52 x 106
3(256-krotne) h1-31 z 3Tak1,76 x 106
(512-krotny) i0 z 1nie8,79 x 105
(1024-krotne) j0ndnieNFP

Tabela 2: Typowa liczba kolonii na płytkach z posiewami wzbogaconych próbek kału.1 Kolonie gram-ujemne wśród kolonii podobnych do Campylobacter, 2nd = nie określono, 3 Dane pogrubione wskazują na ostatnie dodatnie rozcieńczenie.

GatunkiGen docelowy
C. jejunihipO
C. colicadF
C. upsaliensiscpn60
C. laricpn60
C. helveticuscpn60
C. fetuscpn60
C. hyointestinaliscpn60
C. concisuscpn60

Tabela 3: Geny przydatne do wykrywania poszczególnych gatunków Campylobacter metodą qPCR.

Dyskusja

Opisane tutaj metody hodowli opierają się na prostych, szeroko stosowanych technikach i materiałach dostępnych w większości laboratoriów10. Jest to połączenie próbek analitycznych i spreparowanych, które dostarczają nowych informacji na temat klinicznie istotnego progu wykrywania dla kultur kałowych. Dodatkowo, ocena wyników posiewów za pomocą 5 oddzielnych testów wzmacnia wnioski, że posiewy kału Campylobacter błędnie identyfikują znaczną część próbek pacjentów. Testy EIA i molekularne są przydatne jako kontrole, ponieważ każde z nich opiera się na innej zasadzie (interakcja antygenu z przeciwciałem a amplifikacja DNA) i, co ważne, nie opierają się na żywotności bakterii. Należy zauważyć, że test EIA zastosowany w tych badaniach jest dobrze zwalidowany i wykazano, że w pełni zgadza się z 4 testami molekularnymi12.

Hodowla Campylobacter spp. jest szczególnie kłopotliwa, z czułością zgłaszaną w zakresie 60−76%19,20, co widać po ~30% wskaźniku niepowodzeń w wykrywaniu prawdziwie dodatnich próbek tutaj. Personel może oczekiwać, że kontrolne EIA i testy molekularne często przyniosą pozytywne wyniki, gdy dane z hodowli są negatywne.

Najważniejszym krokiem w protokole jest identyfikacja punktowych kolonii wśród konkurującej flory kałowej. Nie jest niczym niezwykłym, że rozcieńczenia zbliżają się do progu wykrywalności, mają naprzemiennie zerowe i niezerowe oszacowania liczby kolonii (np. 2, 0, 1, 0, 0). Ważne jest, aby zdawać sobie sprawę, że progi hodowli będą zakresem stężeń, a nie konkretnym CFU/ml. Niemniej jednak oszacowanie kału ~1 x 106 jtk/ml jako dolna granica wykrywania kultur dobrze wypada w porównaniu z doniesieniami, że zakażeni ludzie wydalają od 106 do 109 Campylobacter na gram kału21. Zmiany w antybiotykach lub płytkach agarowych oraz zmiany nieuniknione w poszczególnych próbkach kału niewątpliwie zmienią wartości progowe. Protokół ten powinien umożliwić ulepszenia w pożywkach wzrostowych.

Ta pierwsza informacja na temat granicy wykrywalności hodowli umożliwia ustalenie klinicznie istotnych progów dla testów diagnostycznych i stanowi podstawę mikrobiologiczną, która jest potrzebna do rozwiązania niezbadanych problemów bezobjawowego nosicielstwa22,23 przez Campylobacter lub jeśli obciążenie bakteryjne koreluje z objawami lub poważnymi następstwami.

Oświadczenia

Autorzy są pracownikami firmy TECHLAB, Inc., która produkuje zestaw QUIK CHEK™ używany jako komparator w tym artykule.

Podziękowania

Te badania zostały sfinansowane przez TECHLAB, Inc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Beztlenowy słoik 3,5 lThermo Fisher HP0031A
AnaeroGRO Campylobacter Selektywny agarHardy DiagnosticsAG701
Napar z baktowirusa do mózguBD Biosciences237500
Pepton proteazy baktonowejTechnologies Corp211684
Podstawowy fuksinFisher ScientificB12544
BBL Trypticase PeptoneLife Technologies Corp211921
C. coli Typ szczepuATCC33559
C. jejuni Typ szczepuATCC33560
Saszetka systemu generowania gazu CampyGenThermo FisherCN0025A
Campylobacter QUIK CHEKTechLab, Inc.T5047 / T31025
Pożywka transportowa Cary-BlairFisher Scientific23-005-47
Wałek Coli Sterylne kulki galwaniczneMillipore Sigma71013
Bufor rozcieńczającySystemy beztlenoweAS-908
Surowica bydlęcapłodu Equitech-Bio, IncSFBM30
Wodorosiarczyn soduSigma-Aldrich243973
Pirogronian soduSigma-AldrichP2256
Kuwety spektrofotometryczneUSA Scientific9090-0460
Life

Bibliografia

  1. CDC. Annual Summaries of Foodborne Outbreaks. , Available from: https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html (2018).
  2. Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. Global Epidemiology of Campylobacter Infection. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 687-720 (2015).
  3. Pitkanen, T. a, H, M. L. Global Water Pathogen Project. Rose, J. B., Jimenez-Cisneros, B. , UNESCO (2017).
  4. Fitzgerald, C., et al. Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool. Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1209-1215 (2016).
  5. Kirkpatrick, B. D., Tribble, D. R. Update on human Campylobacter jejuni infections. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (1), 1-7 (2011).
  6. CDC. Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2013. Morbidity and Mortality Weekly Report. 63, 328-332 (2014).
  7. Jaime, A. L., et al. Campylobacter upsaliensis: Another Pathogen for Consideration in the United States. Clinical Infectious Diseases. 34 (11), 59-60 (2002).
  8. Bullman, S., O'Leary, J., Corcoran, D., Sleator, R., Lucey, B. Molecular-based detection of non-culturable and emerging campylobacteria in patients preseting with gastroenteritis. Epidemiology and Infection. 140, 684-688 (2012).
  9. Giltner, C. L., Saeki, S., Bobenchik, A. M., Humphries, R. M. Rapid Detection of Campylobacter Antigen by Enzyme Immunoassay Leads to Increased Positivity Rates. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 618-620 (2013).
  10. M'ikanatha, N. M., et al. Culturing stool specimens for Campylobacter spp., Pennsylvania, USA. Emerging Infectious Disease. 18, 484-487 (2012).
  11. Al Amri, A., Senok, A. C., Ismaeel, A. Y., Al-Mahmeed, A. E., Botta, G. A. Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools. Journal of Medical Microbiology. 56 (10), 1350-1355 (2007).
  12. Buss, J. E., et al. Campylobacter culture fails to correctly detect Campylobacter in 30% of positive patient stool specimens compared to non-cultural methods. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38, 1087-1093 (2019).
  13. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  14. Couturier, B. A., Hale, D. C., Couturier, M. R. Association of Campylobacter upsaliensis with Persistent Bloody Diarrhea. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3792-3794 (2012).
  15. Chaban, B., Musil, K. M., Himsworth, C. G., Hill, A. K. Development of cpn60-Based Real-Time Quantitative PCR Assays for the Detection of 14 Campylobacter Species and Application to Screening of Canine Fecal Samples. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3055-3061 (2009).
  16. Allos, B., Blaser, M. J. Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed. Mandell, G. L., Bennett, J. E., Dolin, R. , Churchill Livingstone. 2793-2802 (2009).
  17. Anderson, N. W., Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Comparison of the BD MAX Enteric Bacterial Panel to Routine Culture Methods for Detection of Campylobacter, Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157), Salmonella, and Shigella Isolates in Preserved Stool Specimens. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1222-1224 (2014).
  18. Wasfy, M., Oyofo, B., Elgindy, A., Churilla, A. Comparison of preservation media for storage of stool samples. Journal of Clinical Microbiology. 33 (8), 2176-2178 (1995).
  19. Bessède, E., Delcamp, A., Sifre, E., Buissonniere, A., Mégraud, F. New Methods for Detection of Campylobacters in Stool Samples in Comparison to Culture. Journal of Clinical Microbiology. 49 (3), 941-944 (2011).
  20. Bessède, E., et al. Evaluation of the Diagnostic Accuracy of Two Immunochromatographic Tests Detecting Campylobacter in Stools and Their Role in Campylobacter Infection Diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), (2018).
  21. Shane, A. L., et al. Infectious Diseases Society of America Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea. Clinical Infectious Diseases. 65 (12), 1963-1973 (2017).
  22. Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Astudillo, X., Fernández, H. Occurrence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter species isolated from healthy children attending municipal care centers in Southern Ecuador. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 59, 77-77 (2017).
  23. Lee, G., et al. Symptomatic and asymptomatic Campylobacter infections associated with reduced growth in Peruvian children. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (1), 2036(2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

hodowla Campylobactergranica wykrywalnościjednostki tworzące kolonierozcieńczenia seryjneinkubacja beztlenowabarwienie metodą Gramatest immunoenzymatycznypodłoże Cary-Blair
Metody hodowli w celu określenia granicy wykrywalności i przeżywalności w pożywkach transportowych Campylobacter jejuni w próbkach kału ludzkiego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.