Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA)

Podsumowanie

Opisujemy test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy przeprowadzony po inaktywacji termicznej plwociny. Inaktywacja termiczna sprawia, że próbki plwociny stają się niezakaźne i eliminuje potrzebę stosowania laboratoriów o poziomie 3 hermetyczności do testów molekularnych na gruźlicę.

Streszczenie

Gruźlica jest wywoływana przez Mycobacterium tuberculosis (Mtb), patogen sklasyfikowany przez Organizację Narodów Zjednoczonych (ONZ) jako niebezpieczna substancja biologiczna kategorii B. Ze względu na bezpieczeństwo pracowników, obchodzenie się ze wszystkimi próbkami, co do których istnieje podejrzenie, że są nosicielami Mtb, musi odbywać się w laboratorium o poziomie hermetyczności (CL) 3. Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA) jest ilościowym testem reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR), który określa ilościowo obciążenie prątkami Mtb przy użyciu starterów i podwójnie znakowanych sond dla 16S rRNA. Opisujemy zastosowanie inaktywacji cieplnej w celu uczynienia próbek gruźlicy niezakaźnymi, przy jednoczesnym zachowaniu RNA dla TB-MBLA. Porcję 1 ml próbki plwociny w szczelnie zamkniętych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml gotuje się przez 20 minut w temperaturze 80 °C, 85 °C lub 95 °C w celu dezaktywacji pałeczek Mtb. Hodowla próbek inaktywowanych w cieple i kontrolnych (żywych) przez 42 dni potwierdziła śmierć gruźlicy. Inaktywowaną próbkę następnie wzbogaca się 100 μl kontrolnego środka ekstrakcyjnego, a RNA ekstrahuje się zgodnie ze standardową procedurą izolacji RNA. Nie zaobserwowano wzrostu w kulturach próbek poddanych obróbce cieplnej. Wyizolowany RNA poddawany jest procesowi RT-qPCR w czasie rzeczywistym, który amplifikuje określony cel w genie Mtb 16S rRNA, uzyskując wyniki w postaci cykli kwantyfikacji (Cq). Krzywa standardowa służy do przeliczenia Cq na obciążenie bakteryjne lub szacowane jednostki tworzące kolonie na ml (eCFU/ml). Istnieje odwrotna zależność między Cq a obciążeniem bakteryjnym próbki. Ograniczenie polega na tym, że inaktywacja cieplna powoduje lizę niektórych komórek, wystawiając RNA na działanie RNaz, które powodują utratę <1 log₁₀eCFU/ml (tj. <10 CFU/ml). Dalsze badania pozwolą określić odsetek pacjentów o bardzo niskim obciążeniu, którzy powodują fałszywie ujemne wyniki z powodu inaktywacji cieplnej.

Wprowadzenie

Spowodowane przez Mycobacterium tuberculosis (Mtb), ponad 7 x 10⁶ nowych przypadków gruźlicy (TB) jest zgłaszanych na całym świecie, z czego ponad 1 x 10⁶ umiera rocznie1^,2. Aby odwrócić ten trend, Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) wprowadziła podejście oparte na trzech filarach, w tym opracowanie skutecznych narzędzi diagnostycznych i leczniczych³. Sklasyfikowana przez ONZ jako niebezpieczna substancja biologiczna B, praca z próbkami, co do których istnieje podejrzenie, że są dodatnie dla Mtb, wymaga poziomu hermetyczności (CL) wynoszącego 3. Laboratoria CL3 są drogie w budowie i utrzymaniu. W związku z tym większość krajów scentralizowała usługi w zakresie hodowli gruźlicy na poziomie regionalnym lub krajowym. Oznacza to, że mikroskopia cytologiczna jest najbardziej dostępnym narzędziem diagnostycznym w peryferyjnych placówkach opieki zdrowotnej.

Istnieje zgoda WHO na wdrożenie szybkich testów molekularnych, takich jak Xpert MTB/RIF w placówkach opieki zdrowotnej poziomu 4, głównie zlokalizowanych na poziomie dystryktu^4,5. Niektóre dzielnice są dość duże i mniej dostępne dla niektórych osób. Chociaż jest to korzystne, Xpert MTB/RIF działa poprzez wykrywanie DNA Mtb. DNA jest stabilną cząsteczką, która przetrwa długo po śmierci komórek, a zatem nie jest dobrym standardem do pomiaru żywotnych komórek krytycznych dla monitorowania odpowiedzi na leczenie^5,6. Testy oparte na RNA stanowią alternatywę dla dokładnego pomiaru żywotnych komórek^{7,8,9,10,11,12,13}. RNA występuje w różnych gatunkach o różnej stabilności: rybosomalnym RNA (rRNA), transferowym RNA (tRNA) i informacyjnym RNA (mRNA). Informacyjny RNA jest związany z ekspresją genów, a zatem jest najściślej związany z aktywnością i żywotnością komórki¹⁴. Ważne jest, aby pamiętać, że brak ekspresji genów nie jest równoznaczny ze śmiercią komórki, ponieważ wiadomo, że patogeny takie jak Mtb istnieją w stanie nieaktywnym (uśpionym), ale zdolnym do życia^15,16. Stabilne gatunki RNA, takie jak rRNA, są zatem lepszymi markerami zarówno aktywnych, jak i nieaktywnych stanów żywotnych komórek.

Używając Escherichia coli, Sheridan wykazał, że 16S rRNA proporcjonalnie wzrastało wraz ze wzrostem bakterii mierzonym liczbą jednostek tworzących kolonie (CFU)¹⁷. Nastąpił jednoczesny spadek liczby CFU i 16S rRNA, gdy bakterie E. coli były narażone na działanie antybiotyków. Spadek rRNA po śmierci komórki był wskaźnikiem, że może on być używany jako marker żywotności komórki^13,17. Opierając się na tej zasadzie, opracowano test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA) do celowania w rRNA M. tuberculosis 16S w celu pomiaru żywotnego obciążenia prątkami gruźlicy jako markera odpowiedzi na leczenie u pacjentów poddawanych terapii przeciwgruźliczej^11,18,19. Dalej rozwijaliśmy i optymalizowaliśmy TB-MBLA, aby uwzględnić kontrolę ekstrakcji komórkowej, która odzwierciedla lizę pałeczek M. tuberculosis i jest odporna w różnych warunkach środowiskowych²⁰. Procedura TB-MBLA wymaga, aby pierwsze etapy izolacji RNA z Mtb były przeprowadzane w laboratorium CL3 do momentu całkowitej lizy komórek Mtb, aby zapewnić bezpieczeństwo pracowników. Obejmuje to również przechowywanie próbek do retrospektywnej analizy wsadowej, które mają być utrzymywane w temperaturze -80 °C w tiocyjanianu guanidyny, substancji toksycznej poziomu 4. W tym celu użyliśmy ciepła do inaktywacji Mtb i uczynienia próbek bezpiecznymi do wykonywania TB-MBLA w laboratoriach mikroskopii rozmazowej.

Wykorzystanie ciepła w zastosowaniach laboratoryjnych i klinicznych istnieje od wieków^21,22. Jednak niektóre mikroorganizmy, takie jak Mtb, są trudne do zabicia, a krótsza ekspozycja na ciepło nie wystarcza, aby zabić wszystkie komórki^23,24. Badanie wykazało, że 20-minutowe ogrzewanie kultur gruźlicy w temperaturze 80 °C zabiło wszystkie pałeczki Mtb bez zniszczenia DNA potrzebnego do PCR²⁵. Następnie, szereg laboratoryjnych technik ekstrakcji DNA podgrzewa się obecnie do 95 °C. Zastosowaliśmy tę samą zasadę, aby pokazać, że próbki gruźlicy wrzące w temperaturze 80 °C, 85 °C lub 95 °C dezaktywują Mtb, zachowując jednocześnie wystarczającą ilość RNA, aby można było przeprowadzić TB-MBLA. Inaktywowaną kulturę lub plwocinę można przechowywać w szczelnie zamkniętych pojemnikach w temperaturze pokojowej lub przechowywać w lodówce przez 7 dni bez zmniejszania ilości mierzalnego rRNA.

TB-MBLA, obecnie używany jako test wyłącznie do celów badawczych (RUO), jest elastyczny i został zastosowany do różnych typów próbek, w tym plwociny, tkanki płucnej i płynu mózgowo-rdzeniowego. Nie został jeszcze zastosowany do płynu pęcherzykowego oskrzeli, krwi i innych rodzajów próbek. Używając plwociny jako próbki, wyniki oceny wieloośrodkowej w Afryce (dane niepublikowane) i poprzednie publikacje^{18,26 pokazują,} że czułość MBLA jest zgodna z płynną hodowlą w probówce wskaźnika wzrostu prątków (MGIT). Jednak TB-MBLA jest szybsza, daje wyniki w ciągu godzin, a nie dni lub tygodni hodowli, jest specyficzna, nie ma wpływu na mikroorganizmy inne niż gruźlica w próbce i daje ilościową miarę ciężkości choroby. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uznała niedawno TB-MBLA za kandydata do zastąpienia mikroskopii rozmazowej i hodowli w monitorowaniu leczenia gruźlicy².

W tym artykule szczegółowo opisujemy inaktywację ciepła i protokół TB-MBLA opublikowany w Sabiiti et al.²⁷. Ten szczegółowy protokół zapewni kompleksowe zasoby wizualne dla użytkowników TB-MBLA na całym świecie.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. kultura
   1. Pracując na czystym stole lub kabinie klasy 1, zbierz 1 ml porcji kultury Bacillus Calmette-Guérin (BCG) fazy wykładniczej do plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Szczelnie zamknij rurki.
      nuta: Do przetworzenia całej próbki o pojemności 5 ml potrzebnych jest pięć probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Szafa bezpieczeństwa biologicznego jest wymagana podczas pracy z każdą kulturą gruźlicy.
2. Próbka plwociny pacjenta
   1. Pracując w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i nosząc maskę nosową, ostrożnie otwórz kubek na próbkę, odpipetuj 1 ml porcji do plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i szczelnie zamknij probówki.
      nuta: Do pipetowania plwociny zalecana jest końcówka z szerokimi ustami. Za pomocą nożyczek odetnij cienką część ust końcówki o pojemności 1 ml, aby uzyskać szersze usta.

2. Inaktywacja ciepła

1. Przed przygotowaniem próbki należy ustawić łaźnię wodną na temperaturę 95 °C.
   nuta: Temperatura 95 °C zwiększa szansę na zmniejszenie aktywności RNazy, a tym samym zachowanie większej ilości RNA dla dalszej TB-MBLA.
2. Przenieść probówki z próbkami do stojaka zanurzonego w łaźni wodnej. Upewnij się, że trzy czwarte każdej probówki z próbką jest zanurzone w wodzie.
3. Gotować w temperaturze 95 °C przez 20 minut, a następnie przenieść probówki na stół do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut przed rozpoczęciem ekstrakcji RNA.
   nuta: Całkowitą inaktywację termiczną prątków M. tuberculosis i BCG zweryfikowano poprzez inkubację próbek inaktywowanych termicznie i próbek kontrolnych w temperaturze 37 °C przez 42 dni w celu sprawdzenia wzrostu. Pomiar gęstości optycznej przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀) wykonywano na początku badania, a następnie co tydzień przez 42-dniowy okres inkubacji.

3. Ekstrakcja RNA

UWAGA: Opisany tutaj proces ekstrakcji RNA dotyczy zestawu RNA wymienionego w Tabeli Materiałów. Można stosować inne odpowiednie zestawy do ekstrakcji RNA różnych producentów.

1. Dodawanie do kontroli ekstrakcji (EC)
   1. Przenieść 1 ml podwielokrotności próbek inaktywowanych termicznie do probówek o pojemności 1,5 ml. Wlej 100 μl EC do każdej próbki, zamknij probówkę i wymieszaj, odwracając probówkę do góry nogami 3x,
      nuta: EC jest dostarczany z zestawem TB-MBLA vital bacteria kit (tabela materiałów).
2. Sedymentacja komórek
   1. Za pomocą mikrowirówki stołowej odwirować probówki o stężeniu 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować supernatant, pozostawiając 50 μl osadu.
   2. Zawiesić osad w 950 μl buforu do lizy, pipetując w górę iw dół, a następnie przenieść całą zawiesinę do probówki z matrycą lizującą dostarczonej z zestawem do ekstrakcji RNA (tabela materiałów). Upewnij się, że probówki są szczelnie zamknięte i oznacz zarówno pokrywkę, jak i bok tuby.
3. W celu lizy komórek przenieść probówki z kroku 3.2.2 do homogenizatora. Homogenizować próbki przez 40 s przy 6 000 obr./min.
4. Oczyszczanie kwasów nukleinowych
   1. Odwirować lizat z kroku 3.3 przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Przygotuj świeże probówki o pojemności 1 ml i dodaj 300 μl chloroformu do każdej probówki.
   3. Za pomocą końcówki o pojemności 1 ml ostrożnie odpipetować supernatant bez dotykania matrycy lizy.
   4. Przenieść supernatant do probówek zawierających chloroform i wirować przez 5 s. Pozostaw probówkę do osiadania na 5 minut lub dłużej, aż trzy fazy (górna, środkowa i dolna) będą wyraźnie widoczne.
   5. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetować górną fazę i przenieść do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml.
   6. Do probówek w kroku 3.4.5 dodać 500 μl lodowatego 100% etanolu, zamknąć probówki i wymieszać, delikatnie odwracając do góry nogami 3x. Inkubować probówki w temperaturze -80 °C przez 15 minut lub -20 °C przez 30 minut i kontynuować ekstrakcję lub pozostawić w temperaturze -20 °C na noc, aby zakończyć ekstrakcję następnego dnia.
   7. Ustawić mikrowirówkę na 4 °C i pozostawić do schłodzenia do co najmniej 12 °C przed rozpoczęciem wirowania. Załaduj probówki do mikrowirówki i wiruj przez 20 minut przy 13 000 x g. Odrzuć supernatant, zastąp 70% lodowatym etanolem i odwiruj przez kolejne 10 minut przy 13 000 x g.
      nuta: 70% etanol powinien być wytwarzany z wody wolnej od nukleaz molekularnych.
   8. Odrzucić cały supernatant z kroku 3.4.7 i przenieść probówki do inkubatora ustawionego na 50 °C. Inkubować przez 20 minut w celu wysuszenia osadu RNA/DNA. Utrzymuj rurki częściowo otwarte, aby umożliwić odparowanie całego etanolu.
   9. Do suchego osadu dodać 100 μl wody wolnej od nukleaz i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wiruj przez 3 sekundy, aby wymieszać zawartość.
      nuta: Na tym etapie ekstrakt może być przechowywany 2-3 dni w lodówce lub dłużej w temperaturze -80 °C, aż do wykonania sekcji 3.5.
5. Usuwanie DNA
   UWAGA: Ten krok jest kluczowy, ponieważ obecność DNA w ekstrakcie unieważnia wynik MBLA. Ta sekcja jest oparta na zestawie do usuwania DNA (Tabela materiałów).
   1. Przygotować mieszaninę enzymu buforu DNazy I 10x i enzymu DNazy I dla liczby próbek (10 μl buforu i 1 μl DNazy na próbkę) plus 10% ekstra w celu pokrycia wszelkich strat spowodowanych pipetowaniem. Wymieszać przez wirowanie, a następnie pipetować 11 μl do każdej probówki zawierającej ekstrakt RNA.
   2. Mieszaj przez wirowanie przez 3 s, a następnie krótko wiruj (10 s przy 13 000 x g), aby usunąć wszelkie kropelki ze ścianek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w gorącym bloku lub inkubatorze. Dodać dodatkowy 1 μl enzymu DNazy I bezpośrednio do każdej probówki, dobrze wymieszać przez wirowanie i inkubować przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C.
   3. Rozmrozić odczynnik do inaktywacji DNazy 10 minut przed zakończeniem inkubacji DNazy. Wirować 20 s, aby zapewnić jednorodną, mleczną zawiesinę, a następnie dodać 10 μl odczynnika inaktywacji DNazy do każdego ekstraktu RNA z kroku 3.5.2.
   4. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wirować 3x podczas 5-minutowego etapu inkubacji.
   5. Odwirować mieszaninę przy 13 000 x g przez 2 minuty. Ostrożnie przenieść supernatant do 1,5 ml probówki wolnej od RNazy, nie dotykając żadnej z matryc inaktywacyjnej.
   6. Przechowuj ekstrakt RNA w lodówce, jeśli uruchamiany jest RT-qPCR tego samego dnia lub w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

4. Odwrotna transkryptaza qPCR

1. W przypadku nieznanych próbek należy rozcieńczyć wszystkie ekstrakty RNA, które mają być użyte, w stosunku 1:10 w wodzie wolnej od RNazy. Dobrze wymieszaj, wirując przez 5 s i krótko odwiruj, aby usunąć wszelkie kropelki lub pęcherzyki powietrza.
2. W przypadku próbek wzorcowych dla krzywej wzorcowej należy pobrać wzorce Mtb i EC RNA z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Wykonać siedmio- i sześciokrotne 10-krotne rozcieńczenia odpowiednio próbek wzorcowych Mtb i EC. Wymień końcówki przed przeniesieniem mieszaniny z jednej probówki do drugiej.
   nuta: Standardowe próbki są dostarczane z zestawem TB-MBLA.
3. Przygotowanie mieszanki wzorcowej
   UWAGA: Mieszanka główna (MM) to roztwór odczynników PCR wystarczający do amplifikacji wszystkich próbek, wzorców i wody w celu kontroli bez matrycy (NTC). Woda używana jako NTC powinna być tą samą wodą, która jest używana do ekstrakcji i przygotowania MM. Upewnij się, że wzorce, każda próbka RNA i jej rozcieńczenie dziesiętne są amplifikowane 2x dla reakcji odwrotnej transkryptazy dodatniej (RT+) i 1x dla reakcji odwrotnej transkryptazy ujemnej (RT-). Reakcja RT- jest kontrolą mającą na celu określenie skuteczności usuwania DNA (tab. 1).
   1. Przenieść 16 μl MM do każdej probówki reakcyjnej PCR.
   2. Dodać 4 μl ekstraktu RNA do każdej probówki reakcyjnej RT+ i RT-, a wodę do probówek reakcyjnych NTC.
   3. Załaduj probówki reakcyjne do maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i ustaw warunki PCR w następujący sposób: 50 °C przez 30 minut, 95 °C przez 15 minut, 40 razy cykle w 94 °C przez 45 s i 60 °C przez 1 minutę z akwizycją za pomocą fluoroforów, które absorbują się w kanałach zielonym i żółtym.
      nuta: Zielony kanał to fluorofor detekcji Mtb, a żółty to fluorofor detekcji kontroli ekstrakcji.
4. Interpretacja wyników
   UWAGA: Upewnij się, że zduplikowane reakcje tej samej próbki nie różnią się o więcej niż 1 odchylenie standardowe. Wartości Mtb i EC Cq wyższe niż 30 są uważane za ujemne. Więcej szczegółów interpretacji znajduje się w tabeli 2.
   1. Aby zinterpretować odpowiedź na leczenie, przelicz wartości Cq na obciążenie bakteryjne (eCFU/ml) za pomocą krzywej standardowej. Odczyt odpowiedzi na leczenie jako zmiany obciążenia bakteryjnego w okresie obserwacji leczenia.
      nuta: Spadek wiremii bakteryjnej po leczeniu oznacza pozytywną odpowiedź (tj. leki przeciwgruźlicze zabijają bakterie gruźlicy), podczas gdy brak zmiany lub wzrost obciążenia bakteryjnego oznacza odpowiedź negatywną, co może oznaczać oporność bakterii gruźlicy na leki przeciwgruźlicze lub niewłaściwe przestrzeganie przez pacjenta dawki terapeutycznej. Spadek obciążenia bakteryjnego mierzony za pomocą TB-MBLA koreluje ze wzrostem czasu do dodatniego wyniku hodowli MGIT (TTP).

5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa

1. Przenieść 2 ml podwielokrotności inaktywowanych termicznie kultur i kontroli do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml. Wirować przez 10 minut przy 20 000 x g.
2. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 700 μl buforu do wiązania komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu utrwalenia komórek.
3. Odwirować zawiesinę przez 30 minut przy 16 000 x g, aby uzyskać twardy osad. Odrzucić supernatant i zastąpić go 1% sacharozą w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Przechowywać granulki w sacharozie w temperaturze 4 °C do momentu przekroju do mikroskopii elektronowej.
4. Podział na sekcje i TEM
   UWAGA: Poniższy protokół został zaadaptowany z Griffiths et al.²⁸.
   1. Krioprotektoratuj osad komórkowy, zanurzając go w 2,1 M sacharozie w PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyj 3x lodowatą wodą.
   2. Schłodzić kriochronione granulki komórek w ciekłym azocie i zamontować je w kriomikrotomii. Za pomocą kriomikrotomu wytnij ultracienkie odcinki przy 90 nm.
   3. Odzyskaj wycięte sekcje za pomocą pętli z drutu wolframowego mieszaniny 1:1 2% metylocelulozy i 2,1 M sacharozy w PBS.
   4. Przenieść sekcje na sześciokątne miedziane wsporniki TEM (siatki) TEM z powłoką pioloform o oczkach 150 i przechowywać w temperaturze 4 °C lub przejść do kroku 5.4.5.
   5. Skontrastuj siatki z octanu uranylu i wysusz na powietrzu w warstwie octanu metylu. Umyj kratki lodowatą wodą, a następnie dwiema kroplami PBS przez 5 minut i susz przez 15-30 minut. Sprawdź sekcje w TEM zgodnie z wytycznymi producenta.
      nuta: Wszystkie etapy etykietowania zostały wykonane w temperaturze lodu (temperaturze cieczy), z wyjątkiem etapów prania, które zostały wykonane w temperaturze otoczenia.

Wyniki

Ciepło dezaktywuje wszystkie pałeczki M. tuberculosis
Gęstość optyczna (OD) kontrolnych (żywych komórek) wzrastała z czasem (0,04_OD–0,85_OD) i nie zaobserwowano żadnej zmiany OD w próbkach inaktywowanych termicznie, co oznaczało odpowiednio wzrost i brak wzrostu (Rysunek 1)²⁷. Podobnie, kontrolna plwocina kliniczna stała się dodatnia do 3 dnia w MGIT, podczas gdy inaktywowane termicznie próbki kliniczne nie były oznaczone jako pozytywne do końca inkubacji. Wzrost Mtb w MGIT został potwierdzony przez mikroskopię rozmazową Ziehl-Neelsen i antygen MPT64²⁹.

RNA w inaktywowanych próbkach jest stabilne w temperaturze 37 °C przez 4 dni
Próbki inaktywowane termicznie inkubowano w temperaturze 37 °C w celu określenia, czy RNA ulega degradacji po inaktywacji termicznej komórek. Nie stwierdzono różnicy między RNA zebranym w dniu (D) 0 bezpośrednio po inaktywacji cieplnej a RNA wyizolowanym w D1, 2, 3 i 4 w obu kulturach BCG (Rysunek 2A-C) i plwocinie TB dodatniej (Rysunek 2D).

Egzogenna RNaza zwiększa szybkość degradacji RNA we frakcjach inaktywowanych termicznie
Aby ustalić, dlaczego RNA nie ulega degradacji, enzym RNaza A został egzogennie dodany w stężeniu 1000 U / ml przed i/lub po inaktywacji cieplnej. Spowodowało to utratę RNA równoważną obciążeniu bakteryjnemu 1,5 ± 0,3 -, 1,8 ± 0,2 - i 1,3 ± 0,1 – log₁₀ eCFU/ml odpowiednio w temperaturze 80 °C, 85 °C i 95 °C w ciągu 4 dni inkubacji. Stwierdzono różnicę w degradacji RNA w próbkach, w których RNaza została dodana przed i/lub po inaktywacji cieplnej (Rysunek 3AC).

Wystarczająca ilość RNA jest zachowana dla TB-MBLA przy użyciu 16S rRNA jako markera referencyjnego
Wpływ inaktywacji cieplnej na rRNA mierzono w kulturach BCG i plwocinie od pacjentów z dodatnim wynikiem gruźlicy. Zmierzone obciążenie bakteryjne kontrolnej hodowli BCG, 5,3 ± 0,2 log₁₀ eCFU/ml, było o 0,2 ± 0,1 log₁₀ eCFU/ml wyższe niż połączone 5,1 ± 0,3 log₁₀ eCFU/ml kultury inaktywowanej termicznie (ANOVA p < 0,0001) w temperaturze 80 °C, 85 °C i 95 °C (Rysunek 4A)²⁷. Podobnie, obciążenie bakteryjne plwociny pacjenta kontrolnego, 7,1 log₁₀ eCFU/ml, było o 0,8 ± 0,1 log₁₀ eCFU/ml wyższe niż połączone 6,3 ± 0,41 log₁₀eCFU/ml w temperaturze 80 °C, 85 °C i 95 °C (Rysunek 4B)²⁷. Redukcja obciążenia bakteryjnego wyniosła <1log w dwóch badanych typach próbek.

Test wielokrotnych porównań Sidak wykazał istotną różnicę między obciążeniem bakteryjnym w temperaturze 95 °C a obciążeniem bakterii wynoszącym 80 °C i 85 °C (p = 0,001). Nie stwierdzono różnicy w próbkach gruźlicy we wszystkich temperaturach, p = 0,8.

Integralność ściany komórkowej nie jest niszczona przez ciepło w większości komórek Mtb
Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) zbadaliśmy, czy komórki uległy lizie przez inaktywację cieplną. Cienkie odcinki paraformaldehydowych osadów komórek zostały wykonane i osadzone w pożywce bogatej w elektrony przed badaniem przez TEM. Oględziny komórek w mniejszym i większym powiększeniu ujawniły nienaruszoną ścianę komórkową i widoczne wewnątrzkomórkowe ciała lipidowe. Komórki morfologicznie wydawały się wydłużone, ale nie zlizowane. Rysunek 5 ilustruje morfologię komórek prątków w różnych powiększeniach. Dwa górne panele odsłaniają wewnątrzkomórkowe ciała lipidowe i nieskrępowany sznur przypominający linę, co jest cechą morfologiczną typową dla gatunków prątków. Dwa dolne panele to większe powiększenie, które rozszerza widok ciał lipidowych i odsłania niektóre struktury mikrowewnątrzkomórkowe.

Obciążenie bakteryjne mierzone za pomocą TB-MBLA jest odwrotnie skorelowane z czasem hodowli MGIT do pozytywnego wyniku
U pacjentów, u których wystąpiła odpowiedź na leczenie, obciążenie bakteryjne spada średnio o 1 log₁₀ eCFU/ml na tydzień w trakcie leczenia. Szybko reagujący, szybciej ustępują, przekształcając się w ujemny (zerowe obciążenie bakteryjne) po 2 tygodniach leczenia. Spadek obciążenia bakteryjnego mierzony za pomocą TB-MBLA odpowiadał wzrostowi czasu do dodatniego wyniku hodowli MGIT (TTP). Rysunek 6 pokazuje odwrotną korelację między obciążeniem bakteryjnym a MGIT TTP. Różnica polega jednak na tym, że wyniki TB-MBLA są dostępne w ciągu 4 godzin, a czas oczekiwania na wynik jest niezależny od poziomu obciążenia bakteryjnego. Jest to przeciwieństwo 5-25 dni w przypadku testów posiewu MGIT. Zanieczyszczenie bakteriami innymi niż gruźlica dodatkowo pogarsza wyniki testów hodowlanych.

Rysunek 1: Weryfikacja inaktywacji BCG w temperaturze 80 °C (krzywa wzoru kropkowego), 85 °C (krzywa wzoru kropka-kreska) i 95 °C (krzywa wzoru kreski). Kontrolą (krzywa) była żywa (nieogrzewana) hodowla BCG zaszczepiona w tej samej pożywce wzrostowej. Wzrost w grupie kontrolnej został potwierdzony przez wzrost OD kultury w okresie inkubacji. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sabiiti et al.²⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Stabilność mierzalnego RNA w inaktywowanej termicznie próbce inkubowanej w temperaturze 37 °C przez 4 dni (D0–D4). (A), (B) i (C) pokazują kultury BCG inaktywowane odpowiednio w temperaturze 80 °C, 85 °C i 95 °C. (D) pokazuje plwocinę gruźlicy inaktywowaną w temperaturze 80 °C. Kontrolą jest niepoddana działaniu substancji (żywa) frakcja tej samej próbki. Słupki błędów = odchylenie standardowe. Trzy powtórzenia, dziewięć powtórzeń na przebieg. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wyższa degradacja RNA po egzogennym dodaniu enzymu RNazy. (A) Inaktywacja cieplna (HI) w temperaturze 80 °C, (B) HI w temperaturze 85 °C i (C) HI 95 °C. Słupki błędu = błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zachowanie wystarczającej ilości RNA do pomiaru obciążenia bakteryjnego TB-MBLA przy użyciu 16S rRNA jako markera. (A) Obciążenie bakteryjne oszacowane na podstawie kultur BCG in vitro. (B) Obciążenie bakteryjne oszacowane na podstawie plwociny dodatniej na gruźlicę. Słupki błędów = błąd standardowy średniej (n = 18 i 20 powtórzeń odpowiednio dla A i B). Ten rysunek został zmodyfikowany z Sabiiti et al.²⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Mikrofotografie elektronowe nienaruszonych pałeczek Mtb po inaktywacji w temperaturze 95 °C przez 20 minut. Za pomocą TEM obserwowano czystą, nienaruszoną ścianę komórkową i policzalne ciała lipidowe. U góry: obrazy grupy komórek w małym powiększeniu, ujawniające nieskrępowaną morfologię sznurowatych sznurów mykobakteryjnych i wewnątrzkomórkowe ciała lipidowe. Dół: duże powiększenie górnych paneli w celu rozszerzenia widoku ciał lipidowych i odsłonięcia niektórych struktur mikrowewnątrzkomórkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Krzywa odpowiedzi na leczenie pacjenta leczonego przeciwgruźliczą po 12 tygodniach wykazująca odwrotną korelację między TB-MBLA mierzonym obciążeniem bakteryjnym a MGIT TTP. Obciążenie bakteryjne (niebieska krzywa) spada, podczas gdy TTP wzrasta (czerwona krzywa), gdy pacjent reaguje na leczenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mistrz mix	Pozytywna reakcja RT	Negatywna reakcja RT
	Objętość na reakcję x liczba reakcji + 5	Objętość na reakcję x liczba reakcji + 5
Mieszanka ilościowa	10,0 μL	10,0 μL
Mieszanka podkładowa Mtb16S (F + R)	0,4 μl	0,4 μl
Sonda Mtb16S	0,2 μl	0,2 μl
Mieszanka gruntująca EC (F + R)	0,4 μl	0,4 μl
Sonda EC	0,2 μl	0,2 μl
Enzym RT	0,2 μl	-------
Woda wolna od RNaz	4,6 μL	4,8 μl
Całkowita objętość	16 μL	16 μL

Tabela 1: Przewodnik przygotowania mieszanki głównej dla TB-MBLA qPCR.

typ	Kanał MTB	Kanał EC	interpretacja
próbka	Plus	Plus	ważny
próbka	Plus	Minus	Nieokreślony
próbka	Minus	Plus	ważny
próbka	Minus	Minus	Nieprawidłowy
MTB + Kontrola	Plus	Minus	ważny
Kontrola ekstrakcji (EC)	Minus	Plus	ważny
Kontrola DNA	Minus	Minus	ważny
Kontrola ujemna (NTC)	Minus	Minus	ważny

Tabela 2: Przewodnik interpretacji wyników TB-MBLA.

Dyskusja

W artykule pokazano, że obróbka cieplna przez 20 minut w temperaturze 80 °C, 85 °C i 95 °C skutecznie dezaktywuje próbki gruźlicy, umożliwiając wykonanie TB-MBLA w placówce innej niż CL3 bez ryzyka zakażenia pracowników laboratoryjnych. Wyniki potwierdzają obserwacje poczynione w poprzednich badaniach, jednocześnie kontrastując z niektórymi na temat skuteczności inaktywacji cieplnej Mtb^25,30. Na przykład niektóre raporty wskazują, że ogrzewanie w temperaturze 80 °C nie jest skuteczne w przypadku próbek o dużym obciążeniu bakcyllami 25,31,32,33^. W naszym badaniu uniknięto efektu inokulum o dużej gęstości, zapewniając, że cała plwocina i czyste kultury zostały podgrzane w objętości 1 ml na 15 ml probówki wirówkowej, zapewniając odpowiednią przestrzeń do wystawienia każdej części próbki na wrzenie²⁷.

Zachowanie RNA po inaktywacji cieplnej umożliwia przeprowadzenie TB-MBLA. Odkrycie to zgadza się z dwoma badaniami, które wykazały zachowanie RNA po inaktywacji cieplnej^12,34. Wykazaliśmy, że RNA w próbkach inaktywowanych termicznie jest stabilne w temperaturze 37 °C przez 4 dni, co oznacza, że laboratoria mogą przeprowadzać testy grupowe, utrzymując inaktywowane próbki w temperaturze pokojowej przez tydzień. Dzięki zastosowaniu zestawów do ekstrakcji RNA, które wymagają chłodzenia lub zamrażania, możliwość utrzymania inaktywowanych próbek w temperaturze pokojowej eliminuje potrzebę wykonywania TB-MBLA w warunkach ograniczonych zasobów zarówno przez laboratoria łańcucha chłodniczego, jak i laboratoria kategorii 3.

Mniej niż 1log obciążenia bakteryjnego zostało utracone przy użyciu 16S rRNA jako markera. Chociaż istniała różnica między próbką żywą a inaktywowaną termicznie, ilość tracona w wyniku inaktywacji cieplnej jest zbyt mała, aby zagrozić dalszym wynikom. Wzrost temperatury nie zwiększył ilości traconego RNA, co oznacza, że obserwowana utrata jest niezależna od obróbki cieplnej. Obróbka cieplna w wysokich temperaturach najprawdopodobniej powoduje lizę komórek, narażając RNA na degradację przez RNazy. Rzeczywiście, egzogenne dodanie RNazy A do frakcji inaktywowanej ciepłem zwiększyło szybkość degradacji RNA. Gotowanie nie zmniejszyło aktywności RNazy, co oznacza, że jest to białko bardzo odporne.

Ważne jest, aby pamiętać, że średnia degradacja RNA wynosząca 1,5 log₁₀ eCFU/ml nie jest dużą stratą. W tym celu stawiamy hipotezę, że ogrzewanie powoduje lizę niewielkiej części pałeczek Mtb, narażając w ten sposób niewielką ilość RNA na działanie RNazy. Za pomocą TEM wykazaliśmy, że morfologia komórek Mtb i integralność ścian komórkowych prawie nie wpływa na ogrzewanie w temperaturze 95 °C. Oznacza to, że może wymagać różnych czynników fizjologicznych i wystarczającej podaży RNaz, takich jak w gospodarzu, aby znacząco zdegradować RNA^35,36. Ponadto, będąc rybosomem strukturalnym, 16S rRNA jest potencjalnie mniej podatny na RNazę ^37,38. Pojedyncza komórka Mtb zawiera ~ 700 rybosomów / 0,1^mm3 cytoplazmy³⁷, co oznacza, że na komórkę przypadają większe ilości rRNA. Zatem mniejsze ilości RNazy mogą mieć mniejszy wpływ³⁸. Istnienie dużej liczby rybosomów daje TB-MBLA przewagę pod względem czułości i zdolności do wykrywania pacjentów z gruźlicą o niskim obciążeniu.

Stwierdzono silną korelację między obciążeniem bakteryjnym mierzonym za pomocą TB-MBLA a TTP hodowli MGIT. Potwierdza to w pewnym stopniu obciążenie bakteryjne jako czynnik wpływający na dodatnie wyniki hodowli. Jednak zaletą TB-MBLA jest to, że bezpośrednio określa ilościowo obciążenie bakcyllacyjne obecne w próbce i nie wymaga proliferacji komórek Mtb przed wykryciem. Kontrastuje to z hodowlą, w której czas do uzyskania dodatniego wyniku zależy od poziomu obciążenia bakteryjnego i tempa proliferacji komórek Mtb. Przyszłe badania będą oceniać przebieg pracy TB-MBLA, w tym inaktywację termiczną, w rutynowych warunkach klinicznych. W badaniu zbadane zostaną również próbki z różnymi ładunkami bakteryjnymi, aby zrozumieć liczbę, która może zmienić się z dodatniej na ujemną (tj. te, w których po inaktywacji cieplnej jest mniej bakterii).

Protokół TB-MBLA do molekularnej kwantyfikacji obciążenia bakteryjnego jest pierwszym tego rodzaju protokołem w bakteriologii. Metoda bezpośrednio określa ilościowo obciążenie prątkami Mtb z plwociny pacjenta i nie wymaga do tego posiewu. To sprawia, że jest szybszy i zwiększa jego potencjał do informowania o decyzjach klinicznych dotyczących postępów pacjenta. Etap inaktywacji termicznej zmniejsza ryzyko infekcji i zwiększa możliwości zastosowania TB-MBLA w warunkach, w których nie ma laboratorium kategorii 3. Po inaktywacji termicznej próbki istnieją trzy etapy protokołu w celu uzyskania wyników TB-MBLA: ekstrakcja RNA, odwrotna transkryptaza (RT)-qPCR i analiza wyników qPCR.

Im wyższa skuteczność izolacji Mtb RNA od próbki pacjenta, tym wyższa jakość wyników. Ważne jest, aby pamiętać, że jakość próbki plwociny wpływa na ilość wyizolowanego RNA. Na przykład plwocina ślinowa jest uważana za niskiej jakości i wiąże się z niskim obciążeniem bakteryjnym. Oznacza to, że ważne jest przeszkolenie pacjenta w zakresie wysokiej jakości odkrztuszania plwociny. Aby ocenić skuteczność procesu ekstrakcji, przed ekstrakcją RNA do próbki wprowadza się kontrolę ekstrakcji (tj. znaną liczbę komórek innych niż Mtb). Odzyskanie kontroli ekstrakcji potwierdza skuteczność procesu ekstrakcji RNA. Proces izolacji RNA nie może być prawidłowy, jeśli nie została pobrana kontrola ekstrakcji. Biorąc pod uwagę fakt, że Mtb jest odpornym organizmem, liza mechaniczna jest kluczową częścią procesu. Homogenizacja próbki z dużą prędkością (600 obr./min) w obecności kulek (tj. matryca lizująca) skutecznie powoduje lizę komórek. W wyniku oczyszczenia lizatu uzyskuje się ekstrakt zawierający zarówno RNA, jak i DNA. Usunięcie DNA jest kluczowym ostatnim etapem ekstrakcji RNA. TB-MBLA ma na celu pomiar żywotnych pałeczek poprzez ilościowe określenie RNA. Tak więc niepowodzenie w usunięciu genomowego DNA oznacza, że wyniki będą miały sygnał z DNA, który nie jest dobrym markerem żywotności komórki⁶.

RT-qPCR to dupleksowa sonda z podwójnym oznaczeniem do kontroli Mtb i ekstrakcji. Składa się z trzech etapów: 30-minutowej odwrotnej transkrypcji przez odwrotną transkryptazę w temperaturze 50 °C, 15-minutowej denaturacji w temperaturze 95 °C i 40 cykli amplifikacji w temperaturze 94 °C i 60 °C. Akwizycja fluorescencji z sond następuje w temperaturze 60 °C (tj. w fazie wydłużania fragmentów). Należy zauważyć, że TB-MBLA został zoptymalizowany przy użyciu konkretnej maszyny qPCR, więc operatorzy korzystający z innych platform qPCR powinni zoptymalizować warunki dla swojego sprzętu. Skuteczność usuwania DNA jest kontrolowana poprzez przeprowadzenie pojedynczej reakcji na próbkę przy braku RT. Pozytywny wynik tej reakcji oznacza niepełne usunięcie DNA. Próbki o dużym obciążeniu, które zawierają duże ilości DNA, mogą wymagać podwójnej ilości enzymu DNazy do całkowitego usunięcia DNA. Na szczęście w próbkach o dużym obciążeniu prątkami obecność niewielkich ilości DNA jest mniej prawdopodobna, aby wpłynąć na wynik RNA. Rybosomalny RNA, cel TB-MBLA, naturalnie występuje w dwukrotnie większej ilości niż DNA³⁷. W PCR kontrola bez matrycy (NTC), która jest wodą używaną do rozpuszczania odczynników PCR, kontroluje zanieczyszczenie krzyżowe egzogennym DNA lub RNA. Pozytywny sygnał w NTC oznacza zanieczyszczenie krzyżowe, a wynik jest uważany za nieważny. Oznacza to, że wszystkie roztwory sporządzone przy użyciu tej wody muszą zostać wyrzucone, a nowe wykonane przy użyciu świeżej fiolki z wodą. Zaleca się przechowywanie wody PCR w oddzielnych podwielokrotnościach, aby uniknąć zanieczyszczenia całej wody. Kontrola pozytywna (Mtb RNA) służy do kontroli ogólnej skuteczności PCR.

Analiza wyników polega na przeliczeniu Cqs PCR na obciążenie bakteryjne (tj. szacowane jednostki tworzące kolonie na ml) przy użyciu krzywej wzorcowej. Ustawienie i optymalizacja krzywej standardowej ma kluczowe znaczenie na tym etapie. Zalecana jest standardowa sprawność krzywej 0,95–1. Standardowe krzywe dla MTb i kontroli ekstrakcji powinny być skonfigurowane i zoptymalizowane przed uruchomieniem pacjentów lub innych próbek testowych na maszynie. Standardowe próbki są dostarczane z zestawem TB-MBLA. Do PCR zaleca się dziesięciokrotne rozcieńczenie ekstraktu RNA. Oznacza to, że wynik obciążenia bakteryjnego należy pomnożyć przez współczynnik 10, aby uzyskać ostateczny wynik obciążenia bakteryjnego na ml. Należy zauważyć, że Cqs powyżej 30 są uważane za negatywne dla TB-MBLA. Aby można było wnioskować o odpowiedzi na leczenie, wymagane są co najmniej dwa prospektywne wyniki obciążenia bakteryjnego mierzone w różnych punktach czasowych. Zdecydowanie zaleca się, aby jeden z dwóch wyników był wyjściowy przed rozpoczęciem leczenia. Jeśli jednak zainicjowana przez pacjenta ocena obciążenia bakteryjnego następuje w połowie leczenia, musi nastąpić drugi pomiar obciążenia bakteryjnego w punkcie czasowym w celu oceny odpowiedzi na leczenie. TB-MBLA potrafi rozróżnić obciążenie bakteryjne w ciągu 3 dni po leczeniu, ale idealnym rozwiązaniem są dwa pomiary obciążenia bakteryjnego wykonane w odstępie 7 dni.

Chociaż protokół generuje pouczające wyniki ilościowe dotyczące odpowiedzi na leczenie, nadal jest w dużej mierze ręczny i wymaga znacznego czasu na ekstrakcję RNA. Technicy w zatłoczonych laboratoriach mogą nie mieć tego czasu. Trwają przygotowania do automatyzacji procesów ekstrakcji RNA i PCR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inaktywacja termiczna:
15 mL Probówki wirówkowe	Fisher-Scientific	10136120	50 ml mogą być używane, jeśli w grę wchodzą większe objętości próbek
15 ml stojak na rurki druciane	Fisher-Scientific	11749128	Można stosować inne marki o podobnej marce
Kąpiel wodna	Fisher-Scientific	15700619	Można stosować inne marki o podobnej marce
< silna ekstrakcja >RNA:
Chloroform	Sigma	372978-1L	Nie jest konieczne w innych markach zestawów do ekstrakcji RNA
Etanol, absolutny 99-100%	Sigma	51976-500ML-F	Dostępna większa objętość
Kontrola ekstrakcji	Grupa SOI St Andrews	VitalbacteriaEC	Dostarczany z Zestaw TB-MBLA Vitalbacteria
FASTRNA Pro niebieski Zestaw	MP Biomedicals	116025050	Dostarczany z probówkami z matrycą lizującą
Woda klasy molekularnej (bez RNaz)	Sigma	W4502-1L	Qiagen, Fisherscientific może również dostarczyć ten sam produkt
Homogenizator Precellys 24	VWR	432-3750	FastPrep MP Biomedicals może być również używany
Mikrowirówka z chłodzeniem, Fresco 21, Heraeus	Fisher-Scientific	15352117	Można stosować inne marki o podobnej pojemności
: Termomikser	Eppendorf	BLD-455-010C	Działa z probówkami 1-2 ml
TURBO bez DNA	Fisher-Scientific	AM1907M	Trwa dłużej, ale jest skuteczniejszy niż krótsze procedury usuwania DNA.
RT-qPCR:
Primery i sondy Taqman	grupa SOI St Andrews	VitalbacteriaPP	Dostarczany z zestawem TB-MBLA Vitalbacteria. Fluorofory sondy to FAM (zielony) dla Mtb i HEX (żółty) dla kontroli ekstrakcji (EC). Platformy qPCR firmy Applied Biosystems wykorzystują VIC zamiast HEX.
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit	Qiagen	204845	mieszanka PCR plus enzym RT
RotorGene Q 5plex maszyna	Qiagen	9001580	Można stosować inne maszyny qPCR: Vii7, Quantistudio, Steponelus itp.
Można stosować probówki i nakrętki paskowe, 0,1 ml	Qiagen	981103	Inne rozmiary probówek dostępne w zależności od wielkości wirnika. W przypadku innych platform PCR potrzebne są 96-dołkowe płytki PCR.
Inaktywacja termiczna Materiały do konserwacji próbek
1 M Tris-HCl pH 7,5	Sigma	93313	Dostarczany w postaci gotowej do użycia
2-merkaptoetanol	Sigma	63689	Wielu kompetentnych dostawców
Tiocyjanian guanidyny (GTC)	Marka Promega	V2791	Promega zalecana ze względu na jakość
Woda molekularna ( Bez RNazy)	Sigma	W4502-1L	Zapewnia, że roztwór GTC jest wolny od nukleaz
Materiały ogólne (używane, ale niespecyficzne dla TB-MBLA)
500 ml pojemniki plastikowe		734-5087	Marka Nalgene polecana
		odpady biologiczne	Wielu kompetentnych dostawców
Słoiki	na odpady chemiczne		Wielu kompetentnych dostawców
Rękawice jednorazowe, odporne na			Wielu kompetentnych dostawców
Zamrażarka (-20 ° C)			Wielu kompetentnych dostawców
Zamrażarka (-80 & C)			Wielu kompetentnych dostawców
Lodówka (0-8 & C)			Wielu kompetentnych dostawców
Dygestoria			Do bezpiecznego obchodzenia się z toksycznymi odczynnikami
Wagi			laboratoryjne Do dokładnego pomiaru odczynników
Cylindry miarowe, z tworzyw sztucznych			Aby zapewnić dokładny pomiar odczynników
Probówki			Powinny być odpowiednie do używanego
przyrządu do PCRPipety i pasujące sterylne końcówki do pipet z filtrem,			wolne od DNAzy i RNAzy, zakres: P1000, P200, P10, P2 zalecane
Płytki ładujące Qiagility			5-dołkowa główna płytka mieszająca, 16-dołkowa płytka odczynnikowa, 32-dołkowa płytka do próbek, 72-dołkowe i 96-dołkowe płytki reakcyjne
QIAgility Robot do pipetowania	Qiagen		Ważne dla pipetowania
o wysokiej przepustowościStojaki na mikroprobówki 1,5 ml i 2 ml oraz na probówki			Odporne na chemikalia i nadające się do sterylizacji w autoklawie zalecane
RNase Away (usuwa enzymy RNazy z przestrzeni roboczej)	Fisher Scientific	10666421	aby zapewnić, że usługi i urządzenia są wolne od enzymu RNazy
Okulary ochronne, odporne na chemikalia	Fisher Scientific		Można również dostać od Sigma. Chronić oczy przed toksycznymi odczynnikami.
Sterylne pipety Pasteura, 1,5-3 ml			Wielu kompetentnych dostawców
Sterylne mikroprobówki			1,5 ml odpowiednie do zamrażania w temperaturze -80 stopni; C zalecany
środek dezynfekujący gruźlicę, np. Tristel Fuse			Upewnij się, że jest świeżo przygotowany lub przygotowany w ciągu tygodnia
Zalecana marka Vortex			Genie 2
Transmisyjna mikroskopia elektronowa
Glualdehyd (8%)	Sigma	G7526-10ML	Część bufora utrwalającego komórki (bufor HEPES)
HEPES ( pH 7,4, 100 mM)	Sigma	H4034-25G	Część bufora do utrwalania komórek (bufor HEPES)
Leica FCS ultracryo	Leica		Cryomicrotome do cięcia tkanek
Agar metylocelulozowy	AGG6425	Żywica montażowa na zimno
Paraformaldehyd (4% w PBS)	Sigma	P6148-500G	Część bufora do utrwalania komórek (bufor HEPES)
Sacharoza	Sigma	84097-250G	Medium konserwujące i montażowe
Octan uranylu	Agar Scientific	AGR1260A	Uniwersalne barwienie do mikroskopii elektronowej