Artykuł metodologiczny

Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60469

⸱

31 stycznia 2020

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza szczegółowych kroków eksperymentalnych w celu ustanowienia trójwymiarowej hodowli in vitro organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego raka pęcherza moczowego. Opisano metody hodowli, w tym pasażowanie, inżynierię genetyczną i ortotopowe przeszczepianie organoidów nowotworowych.

Streszczenie

Rozwój zaawansowanych modeli nowotworów był od dawna wspierany, ponieważ obecne modele nowotworów wykazały ograniczenia, takie jak brak trójwymiarowej (3D) architektury guza i niskie znaczenie dla ludzkiego raka. Naukowcy opracowali niedawno trójwymiarowy model raka in vitro, określany jako organoidy nowotworowe, który może naśladować cechy rodzimego guza w naczyniu hodowlanym. Tutaj szczegółowo opisano procedury eksperymentalne dotyczące tworzenia organoidów guza pęcherza moczowego z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego guza pęcherza moczowego, w tym hodowla, pasaż i utrzymanie powstałych organoidów guza 3D in vitro. Ponadto opisano protokoły manipulowania ustalonymi liniami organoidów guza pęcherza moczowego na potrzeby inżynierii genetycznej przy użyciu transdukcji za pośrednictwem lentiwirusa, w tym zoptymalizowane warunki skutecznego wprowadzania nowych elementów genetycznych do organoidów nowotworowych. Na koniec przedstawiono procedurę ortotopowego przeszczepu organoidów guza pęcherza moczowego do ściany pęcherza myszy w celu dalszej analizy. Metody opisane w tym artykule mogą ułatwić stworzenie modelu in vitro raka pęcherza moczowego w celu opracowania lepszych opcji terapeutycznych.

Wprowadzenie

Rak pęcherza moczowego jest najbardziej rozpowszechnionym nowotworem dróg moczowych, z około 165 000 pacjentów umierających rocznie1. Wśród różnych typów raka pęcherza moczowego, inwazyjny rak urotelialny mięśni wykazuje agresywny fenotyp, a jego 5-letni wskaźnik przeżycia jest niższy niż 50%2. Nowatorskie opcje terapeutyczne dla inwazyjnych nowotworów urotelialnych nie zostały rozszerzone w ciągu ostatnich kilku dekad1.

Linie komórkowe raka były szeroko wykorzystywane do badań przesiewowych leków3. Chociaż zaobserwowano korzystne wyniki w przypadku wielu kandydatów na leki w liniach komórek rakowych, słabe wyniki są zgłaszane w badaniach klinicznych4. W związku ze zwiększoną adaptacją do dwuwymiarowych (2D) środowisk hodowli in vitro, coraz trudniej jest odtworzyć natywne nowotwory w liniach komórkowych. Zwierzęce modele raka lub ksenoprzeszczepy nowotworowe pochodzące od pacjentów mogą być wykorzystane do rozwiązania problemów związanych z ograniczeniami obserwowanymi w liniach komórkowych raka pęcherza moczowego. Jednak modele raka zwierzęcego są czasochłonne i zasobochłonne. W związku z tym od lat poszukiwano ulepszonych modeli chorób i opracowano nowatorski system modelowy, organoidy, w celu przezwyciężenia niedociągnięć istniejących modeli5.

Organoid to wielokomórkowy konstrukt 3D, który może podsumować in vitro fizjologiczne cechy odpowiadającego mu narządu in vivo. Organoidy normalne i nowotworowe mogą pochodzić odpowiednio z pluripotencjalnych lub dorosłych komórek macierzystych oraz pierwotnych komórek nowotworowych5,6. W ciągu ostatnich kilku lat organoidy nowotworowe zostały utworzone z dużej liczby różnych tkanek nowotworowych7, w tym colon8,9, bladder10, pancreas11,12, prostata13, wątroba14 i piersi15 tkanki nowotworowe. Takie organoidy nowotworowe naśladują swoje pierwotne guzy fenotypowo i genetycznie. Ze względu na ich podobieństwo do tkanek nowotworowych in vivo i ich liczne praktyczne zastosowania, naukowcy przyjęli je jako nowe modele chorób w badaniach patogenezy nowotworów.

Tutaj przedstawione są procedury tworzenia organoidów nowotworowych z indukowanego przez rakotwór mysiego inwazyjnego guza urotelialnego16. N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoamina (BBN) jest stosowana jako czynnik rakotwórczy do indukowania inwazyjnego raka urotelialnego u myszy17, a organoidy nowotworowe, które wykazują patologiczne cechy inwazyjnych guzów pęcherza moczowego inwazyjnych dla mięśni myszy, są tworzone z indukowanego przez BBN mysiego raka pęcherza moczowego16. Metoda genetycznej manipulacji organoidami guza została zilustrowana za pomocą transdukcji za pośrednictwem lentiwirusa w celu opracowania modelowego systemu do badania molekularnych podstaw rozwoju raka pęcherza moczowego. Ponadto opisano metodę ortotopowego przeszczepiania organoidów do pęcherza moczowego w celu zbadania roli rodzimego środowiska pęcherza moczowego w raku pęcherza moczowego.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w POSTECH (numer IACUC: POSTECH-2019-0055).

1. Hodowla in vitro organoidów guza pęcherza moczowego

  1. Ustalenie organoidów guza pęcherza moczowego z guza pęcherza moczowego myszy (Rysunek 1A).
    UWAGA: Procedura generowania guzów pęcherza moczowego myszy wywołanych przez BBN jest opisana w Shin et al.17.
    1. Dostarczaj 0,1% wody zawierającej BBN w ciemnej butelce myszom ad libitum przez 6 miesięcy. Zmieniaj wodę zawierającą BBN 2 razy w tygodniu.
      UWAGA: Wykorzystano samca myszy C57BL/6 o masie ciała około 25 g w wieku 8–10 tygodni. Woda zawierająca BBN może być podawana maksymalnie pięciu myszom w jednej klatce.
    2. Po 6 miesiącach poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenku węgla i wyizoluj cały guz pęcherza moczowego. Przenieś go na szalkę Petriego o średnicy 90 mm.
    3. Usuń nienowotworowe części i martwicze obszary za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych i umyj fragmenty guza pęcherza moczowego 2-3 razy zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS). Zbierz fragmenty i przenieś je na nową szalkę Petriego o średnicy 90 mm.
    4. Dodać 1 ml zmodyfikowanej minimalnej pożywki niezbędnej (DMEM) firmy Dulbecco z 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES).
    5. Zmiel tkankę nowotworową na jak najmniejsze kawałki (0,5–1 mm3) za pomocą wysterylizowanej żyletki.
    6. Dodaj 9 ml DMEM z 10 mM HEPES, 250 μg/ml kolagenazy typu I, 250 μg/ml kolagenazy typu II i 250 μg/ml termolizyny. Inkubować zmieloną tkankę nowotworową przez 1,5–2 godziny na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ), aby zdysocjować fragmenty do zawiesiny komórki. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Jeśli wielkość guza pobranego od myszy jest większa niż 1 cm3, potraktuj go 2x większą ilością termolizyny lub wydłuż czas inkubacji.
    7. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
    8. Zawiesić osad za pomocą 5 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować probówkę przez 3–5 minut w temperaturze pokojowej (RT), aż do całkowitej lizy czerwonych krwinek.
      UWAGA: Jeśli nie obserwuje się czerwonych krwinek, pomiń proces lizy.
    9. Dodać 20 ml DMEM do probówki. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
    10. Ponownie zawiesić osad za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i 10 μM dichlorowodorku Y-27632 (Y-27632), aby zdysocjować osad na pojedyncze komórki. Inkubować probówkę przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Obserwuj guz pod mikroskopem, aby potwierdzić całkowitą dysocjację na pojedyncze komórki. Jeśli fragmenty komórek utrzymują się, należy dalej pipetować zawiesinę.
    11. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 10 ml DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko o pojemności 100 μm na nowej probówce o pojemności 50 ml, aby usunąć niestrawione zanieczyszczenia.
    12. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
    13. Pokryj studzienkę na 24-dołkowej płytce, używając 150 μl lodowatej matrycy membrany podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (tabela materiałów) i umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 30 minut w celu zestalenia matrycy błony podstawnej.
      UWAGA: Rozmrozić i utrzymać matrycę membrany podstawnej w temperaturze 4 °C, aby zapobiec zestaleniu się przed użyciem.
    14. Zawiesić osad za pomocą 1 ml DMEM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Przenieś 3-4 x 104 komórek nowotworowych do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml na lodzie.
    15. Odwirować mikroprobówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ostrożnie odrzucić supernatant.
    16. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl wstępnie podgrzanego podłoża organoidowego (Tabela 1) i 10 μM Y-27632 i przenieść je do powleczonej studzienki. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    17. Dodatkowe komórki nowotworowe pęcherza moczowego można zaopatrzyć w 1 ml DMEM zawierającego 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) w 1,5 ml kriowialiów. Umieścić je w kriowialnym pojemniku do zamrażania i przenieść pojemnik do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Po przechowywaniu w zamrażarce przez noc przenieś kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
    18. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, używając 500 μl wstępnie podgrzanego podłoża organoidowego (Rysunek 1B).
  2. Organoidy guza pęcherza moczowego subkultury.
    UWAGA: Zaleca się przejście organoidów guza pęcherza moczowego, gdy osiągną średnicę 100–150 μm.
    1. Dodać 500 μl kolagenazy/dypazy do podłoża organoidowego na 24-dołkowej płytce z organoidami nowotworowymi. Pipetować w górę i w dół matrycy błony podstawnej i pożywki. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Zbadaj organoidy wyizolowane z macierzy błony podstawnej pod mikroskopem. Jeśli organoidy nie zostaną odłączone od matrycy błony podstawnej, należy wydłużyć czas inkubacji lub odpipetować więcej razy.
    2. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM, odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
    3. Zawiesić osad za pomocą 1 ml podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA i 10 μM Y-27632. Inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Energicznie pipetuj komórki w górę iw dół i zneutralizuj trypsynę za pomocą 5 ml DMEM z 10% FBS.
    4. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
    5. Zawiesić osad za pomocą 1 ml podgrzanego podłoża organoidowego i policzyć liczbę pojedynczych komórek nowotworowych.
    6. Powtórz kroki 1.1.14−1.1.18.

2. Manipulacja genetyczna organoidów guza pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem lentiwirusa (Rysunek 2A)

  1. Wytwarzają cząsteczki lentiwirusowe wykazujące ekspresję GFP.
    1. W dniu 0 umieść komórki HEK 293T w gęstości 5-6 x 106 komórek na 10 cm płytki do hodowli komórkowej w pożywce do hodowli linii komórkowej (tj. DMEM z 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny).
    2. W dniu 1 należy przygotować roztwór do transfekcji DNA zawierający plazmid transferowy zawierający GFP (8 μg), plazmid wypełniający lentiwirusa (10 μg pCMVR 8,74 i 3 μg pMD2.G) oraz 1 ml zredukowanej pożywki surowicy (tabela materiałów).
    3. Dodać 3 μl odczynnika do transfekcji (tabela materiałów) na 1 μg całkowitego plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta i delikatnie wymieszać pipetując. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej i dodać 9 ml DMEM z 10% FBS.
    4. Odessać pożywkę hodowlaną na płytce do hodowli komórkowej z komórkami HEK 293T. Ostrożnie przenieść 10 ml roztworu do transfekcji DNA na komórki HEK 293T i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
    5. W dniu 3 obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym (wzbudzenie przy 488 nm i emisja przy 512 nm), aby określić wydajność transfekcji. Prawie 90%-100% komórek w całej populacji komórek powinno wykazywać ekspresję GFP.
    6. Zebrać supernatant (zawierający wirusa) i przefiltrować supernatant za pomocą filtra polieterosulfonowego (PES) o wielkości 0,45 μm.
      UWAGA: Użyj filtra o niskim poziomie wiązania białek, takiego jak filtr PES.
    7. W celu zagęszczenia wirusa należy odwirować supernatant wirusa w temperaturze 98,768 x g w ultrawirówce przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym (tabela materiałów) i ostrożnie wyrzucić supernatant.
    8. Zawiesić osad w 2,5 ml zimnego podłoża organoidowego.
    9. W przypadku długotrwałego przechowywania należy podatkować 250 μl pożywki lentiwirusowej do fiolek kriogenicznych i zamrozić je za pomocą ciekłego azotu. Zamrożone zapasy wirusów należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
  2. Wykonaj transdukcję organoidów guza pęcherza moczowego za pośrednictwem lentiwirusa.
    1. W dniu 2 należy podzielić organoidy nowotworowe zgodnie z powyższym opisem (krok 1.2) 12 godzin przed transdukcją, w której pośredniczy lentiwirus.
    2. W dniu 3 należy szybko rozmrozić podwielokrotność (etap 2.1.9) zawierającą wirusa w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i dodać 250 μl pożywki organoidowej z 10 μM Y-27632 i 8 μg/ml bromku heksadimetryny.
    3. Zastąp pożywkę organoidową na płytce 24-dołkowej organoidami nowotworowymi przez 500 μl pożywki zawierającej wirusa i inkubuj przez 12–16 godzin w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    4. W 4 dniu zmień pożywkę na 500 μl świeżej pożywki organoidowej.
      UWAGA: Po 12–16 godzinach inkubacji należy zmienić pożywkę, ponieważ pożywka zawierająca lentiwirusa i bromek heksadimetryny jest cytotoksyczna.
    5. W 6 dniu monitoruj sygnał GFP z organoidów nowotworowych 3 dni po transdukcji pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 2B).
    6. W dniu 10 pasaż i zapas organoidów 7 dni po transdukcji, jak opisano w kroku 1.2, w celu utrzymania genetycznie zmodyfikowanych linii organoidów nowotworowych.

3. Ortotopowa transplantacja organoidu pęcherza moczowego (Rysunek 3A)

  1. Przygotuj organoidy guza pęcherza moczowego do przeszczepu ortotopowego.
    1. Przed przeszczepem należy hodować organoidy guza pęcherza moczowego przez 5-7 dni, jak opisano powyżej (krok 1.2).
    2. Dodać 500 μl kolagenazy/dypazy do podłoża organoidowego w 24-dołkowej płytce z organoidami nowotworowymi. Pipetować w górę i w dół matrycy błony podstawnej i podłoża. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml.
    3. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM, odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
    4. Zawiesić osad w 1 ml DMEM i przenieść roztwór na szalkę Petriego o średnicy 90 mm.
    5. Pod mikroskopem zbierz 10-100 organoidów nowotworowych za pomocą mikropipety p200 i zbierz je do mikroprobówki na lodzie.
    6. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ostrożnie wyrzucić supernatant.
    7. Utrzymuj osad komórkowy na lodzie, aż myszy będą gotowe do operacji.
  2. Przeszczep ściany pęcherza podśluzówkowego
    UWAGA: Ta procedura jest modyfikowana w stosunku do protokołu opublikowanego przez Fu et al18.
    1. Przygotuj 8 do 10 tygodniowego samca nagiej myszy (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) co najmniej 1 tydzień przed eksperymentem, aby umożliwić jej aklimatyzację w nowym środowisku. Enrofloksacynę (5 mg/kg) wstrzyknąć podskórnie 24 godziny przed zabiegiem.
    2. Oczyść powierzchnię ławki wodą z mydłem. Autoklawuj narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem chirurgicznym i wykonaj operację przy użyciu sterylnych narzędzi.
    3. Strzykawkę insulinową 29 G, końcówki pipet i matrycę błony podstawnej należy przechowywać na lodzie. Ketoprofen (5 mg/kg) należy podawać podskórnie przed podaniem znieczulenia.
    4. Znieczulić mysz 4% izofluranem w komorze indukcyjnej. Po uzyskaniu znieczulenia ogólnego połóż mysz w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj znieczulenie, wdychając maskę 2% odparowanego izofluranu.
      UWAGA: Jeśli czas znieczulenia przekracza 30 minut, nałóż maść do oczu na oba oczy za pomocą bawełnianego wacika, aby uniknąć wysuszenia rogówki.
    5. Nałóż powidon-jod sterylną gazą i przetrzyj ją 70% etanolem. Powtórz 3x za każdym razem z nową gazą lub wacikiem.
    6. Zakryj odbyt i pole operacyjne za pomocą jednorazowych, sterylnych obłożeni chirurgicznych.
    7. Używając mikroskopu preparacyjnego do powiększenia, wykonaj małe poprzeczne nacięcie (mniejsze niż 1,5 cm) w skórze i ścianie mięśniowej dolnej linii środkowej brzucha za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych. Odsłoń pęcherz z jamy brzusznej i podeprzyj go wacikami nasączonymi solą fizjologiczną.
      UWAGA: Jeśli pęcherz jest wypełniony moczem, delikatnie dociśnij pęcherz, aby go lekko rozprężyć.
    8. Zawiesić osady organoidów (krok 3.1.7) w 80 μl podłoża organoidowego zawierającego 50% matrycy błony podstawnej o wysokim stężeniu (tabela materiałów).
    9. Wstrzyknąć zawiesinę organoidową do przedniej części kopuły pęcherza moczowego za pomocą strzykawki insulinowej 29 G pod mikroskopem preparacyjnym
      10. .
    10. Zamknij wewnętrzną warstwę ściany brzucha antybakteryjnym szwem wchłanialnym, a następnie zamknij zewnętrzną warstwę nylonowym szwem 4-0. Zdezynfekować miejsce operacyjne jodonem powidonu i 70% etanolem.
    11. Pozwól myszy dojść do siebie pod promiennikiem podczerwieni przez 10–15 minut. Monitoruj mysz, aż odzyska przytomność i ruchliwość.
    12. Dzień po zabiegu należy sprawdzić ogólny stan myszy i nieszczelność zespolenia. Ketoprofen (5 mg/kg) należy podawać raz na dobę przez 3 dni po operacji i leczyć enrofloksacynę (5 mg/kg) raz na dobę przez 10 dni po operacji.
    13. Po zagojeniu się miejsca nacięcia (10-14 dni po zabiegu) należy zdjąć szwy. Monitoruj wzrost guza pęcherza myszy przez 2-3 tygodnie po wstrzyknięciu organoidu guza
      14. .
    14. Jeśli zaobserwuje się wzrost guza pęcherza moczowego, poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenku węgla i zbierz cały guz pęcherza moczowego. Umyj go za pomocą zimnego DPBS (Rysunek 3B)16.
    15. Aby przeanalizować histologię guza pęcherza moczowego, wybarwić zatopiony w parafinie odcinek tkanki za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H i E) (Rysunek 3B)16.

Wyniki

Kultura in vitro organoidów guza pęcherza moczowego myszy
Liczba komórek nowotworowych wydzielonych z guza o objętości ok. 1 cm3 indukowanego BBN wynosi co najmniej 4 x 105 komórek. Podczas początkowego wysiewu komórek w macierzy błony podstawnej mogą być widoczne komórki niezwyrodniałe oraz szczątki komórkowe. Szczątki te były stopniowo usuwane poprzez dalsze pasażowanie. Rysunek 1B przedstawia obrazy hodowanych organoidów w różnych punktach czasowych. Jeśli komórki nowotworowe nie tworzą organoidów, może to oznaczać, że komórki obumarły podczas etapu dysocjacji. W takim przypadku należy skorygować procedury dysocjacji, w tym czas inkubacji z enzymem, aby zwiększyć żywotność komórek.

Ekspresja GFP w organoidach guza pęcherza moczowego przy użyciu manipulacji genetycznej za pomocą lentiwirusa
Organoidy guza pęcherza moczowego wykazały silne sygnały GFP po udanej infekcji lentiwirusowej (Rycina 2B). Po zagęszczeniu, łącznie 250 µL pożywki zawierającej wirusa wystarczyło do zainfekowania 3 x 104 pojedynczych komórek nowotworowych na macierzy błony podstawnej, przy zachowaniu wydajności infekcji na poziomie 90%–10%. Sygnały GFP można było wykryć w organoidach guza pęcherza moczowego 3 dni po transdukcji lentiwirusowej. Jeśli sygnały fluorescencji są słabe, wydajność infekcji wirusowej może być niska. Może to wynikać z licznych czynników, takich jak niski miano wirusa, w związku z czym procedury należy odpowiednio dostosować.

Ortotopowy przeszczep organoidów guza pęcherza moczowego
Allograft guza pęcherza moczowego otrzymany z organoidów guza pęcherza moczowego indukowanych BBN przedstawiono na Rysunku 3B16. Allografty guza pęcherza moczowego pobrano 3 tygodnie po przeszczepieniu ortotopowym. Histologię przeszczepionego guza pęcherza moczowego przeanalizowano przy użyciu barwienia H&E. Ortotopowe przeszczepy organoidów guza mogą rosnąć jako guzy pęcherza moczowego przez 2–3 tygodnie.

Schemat procesu hodowli komórek nowotworu pęcherza moczowego; inkubacja krok po kroku, filtrowanie, wzrost komórek nowotworowych.
Rycina 1: Hodowla in vitro organoidów guza pęcherza moczowego myszy. (A) Schematycznego przedstawienia procesu tworzenia organoidów guza pęcherza moczowego myszy. (BReprezentatywne obrazy hodowli organoidów guza pęcherza moczowego w różnych punktach czasowych. Organoidy guza pęcherza moczowego myszy zostały ustanowione i hodowane przez 9 dni. Pasek skali = 100 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

transfekcja HEK 293T, ultrawirowanie wirusów; wzrost organoidów guza pęcherza moczowego, obrazy GFP w świetle przechodzącym.
Rysunek 2: Ekspresja GFP w organoidach guza pęcherza moczowego z wykorzystaniem lentiwirusowej manipulacji genetycznej. (A) Schemat transfekcji lentiwirusowej i transdukcji organoidów guza pęcherza moczowego. (B) Reprezentatywne obrazy organoidów guza pęcherza moczowego wykazujących ekspresję GFP. Paski skali = 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu tworzenia organoidów guza pęcherza moczowego, konfiguracja transplantacji, mikroskopia wyników implantu organoidu.
Rysunek 3: Ortotopowy przeszczep organoidów guza pęcherza moczowego. (A) Schematyczny rysunek ortotopowej transplantacji organoidów guza pęcherza moczowego do myszy nago. (B) Reprezentatywne obrazy pęcherzy moczowych oraz przekrojów barwionych H&E u myszy z ortotopowo przeszczepionymi organoidami guza pęcherza moczowego. Powiększone widoki obszarów zaznaczonych ramkami na środkowych panelach przedstawiono na panelach lewych. Pasek skali = 500 µmRysunek ten został powielony z Rysunku 1–Rysunku uzupełniającego 1, Kim et al.16, opublikowane na podstawie międzynarodowej publicznej licencji Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Pożywka do organoidów guza pęcherza moczowego myszy
Advanced DMEM/F-12 (pożywka podstawowa)10 mM HEPES (pH 7,4)
10 mM nikotynamidu0,5x suplement bezsurowiczy
2 mM didepeptyd L-alanilo-L-glutaminy1% penicylina/streptomycyna
1 mM N-acetyl-L-cysteina50 ng/mL mysiego czynnika wzrostu naskórka
1 µM A 83-01

Tabela 1: Skład pożywki do organoidów guza pęcherza moczowego.

Dyskusja

Protokół ten opisuje procedury eksperymentalne mające na celu hodowlę i utrzymanie organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z rakotwórczych guzów pęcherza moczowego.

W tym protokole istnieje kilka kroków eksperymentalnych, w których procedury mogą wymagać rozwiązania problemów. Po pierwsze, liczba komórek nowotworowych, które są początkowo wysiewane, jest czynnikiem krytycznym, ponieważ niska liczba komórek nowotworowych w hodowli (<2 x 104 komórek) najczęściej prowadzi do śmierci komórek z powodu braku interakcji między komórkami nowotworowymi. W przeciwieństwie do tego, rozpoczęcie od zbyt wielu komórek (>5 x 104 komórek) podczas wysiewu prowadzi do przepełnienia organoidów, co powoduje trudności podczas pracy z kulturami o słabym wzroście każdego organoidu. Zdecydowanie zaleca się, aby na początku założyć wiele płytek z różną liczbą komórek, aby zoptymalizować warunki eksperymentalne. Identyfikacja właściwej liczby początkowych komórek nowotworowych ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia najwyższej żywotności komórek i ustanowienia skutecznych organoidów guza pęcherza moczowego. Ponadto, w długotrwałej hodowli trwającej ponad 2 tygodnie bez pasażowania, większość organoidów nowotworowych przestaje rosnąć, potencjalnie z powodu niewystarczającego zaopatrzenia w składniki odżywcze w środku organoidów i wyczerpania czynnika wzrostu w macierzy błony podstawnej. Dlatego subkulturacja organoidów w odpowiednim czasie jest krytycznym krokiem w utrzymaniu hodowli organoidów nowotworowych.

Po drugie, produkcja cząstek lentiwirusa o wysokim mianie ma kluczowe znaczenie dla skutecznej manipulacji genetycznej organoidami nowotworowymi. Aby rozwiązać problemy związane z mianem wirusa, zdecydowanie zaleca się, aby miano wirusa było określane za każdym razem przed transdukcją wirusa, ponieważ konstrukty lentiwirusowe mają tendencję do wytwarzania cząstek wirusa z różną wydajnością. Jeśli organoidy nowotworowe wykazują niską żywotność po infekcji wirusowej, jest prawdopodobne, że miana wirusów są potencjalnie zbyt wysokie. W takim przypadku zdecydowanie zaleca się użycie mniejszej ilości wirusa. Po trzecie, podczas ortotopowego przeszczepu organoidów guza pęcherza moczowego indukowanych przez BBN kluczowe znaczenie ma utrzymanie integralności ściany pęcherza moczowego. W przypadku, gdy wstrzyknięcie dociera do światła pęcherza moczowego poprzez penetrację warstwy ściany pęcherza, eksperyment należy przerwać i odrzucić. Jeśli to możliwe, zaleca się monitorowanie wzrostu guza pęcherza moczowego za pomocą systemu obrazowania ultrasonograficznego.

Jednym z ograniczeń obecnych technik jest brak mikrośrodowiska lub zrębu guza w tych organoidach. Aby przezwyciężyć ten problem, zdecydowanie zaleca się, aby ortotopowe przeszczepianie organoidów nowotworowych wykorzystywało system in vivo do naśladowania natywnego mikrośrodowiska guza. W przyszłości konieczne będzie opracowanie 3D systemów organoidowych in vitro, które składają się z organoidów nowotworowych z innymi składnikami zrębu guza.

Jedną z głównych implikacji naszej techniki jest to, że w ortotopowym przeszczepie organoidów nowotworowych tylko 10 organoidów guza pęcherza moczowego może indukować wzrost guza w pęcherzu moczowym. W porównaniu z konwencjonalnymi eksperymentami przeszczepu guza, które wymagają pojedynczych komórek nowotworowych pęcherza moczowego 5 x 105-1 x 106 , nasze metody są znacznie bardziej wydajne i solidne. Inną istotną różnicą jest to, że organoidami można manipulować w różnorodny sposób przy użyciu różnych wektorów lentiwirusowych, takich jak konstrukty lentiwirusowe zawierające RNA o krótkiej spince do włosów, system CRISPR-Cas9 lub geny będące przedmiotem zainteresowania. Byłyby to potężne narzędzia, które można by dodać do obecnej technologii organoidów. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawione tutaj podejścia eksperymentalne mogą ułatwić ustanowienie modeli nowotworów in vitro, które mogą poprawić nasze zrozumienie patogenezy raka pęcherza moczowego, zamiast wykorzystywać linie komórkowe raka pęcherza moczowego 2D.

Metoda ta pozwoliła na ustalenie organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego guza pęcherza moczowego. Artykuł zawiera opis procedur eksperymentalnych za pośrednictwem lentiwirusa, za pomocą których modyfikacje genetyczne są wprowadzane i stabilnie utrzymywane w organoidach guza pęcherza moczowego. Ponadto uwzględniono procedurę ortotopowego przeszczepu organoidów nowotworowych. W połączeniu z obecnymi modelami nowotworów in vivo, technika ta będzie użytecznym narzędziem do badania molekularnych podstaw nowotworzenia pęcherza moczowego.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Badawczej Korei dla K.S: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Creative Economy Leading Technology Development Programme (SF317001A), POSCO (2018Y060) oraz BK21 Plus Research Fellowship.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 &mikro; m filtr strzykawkowy (membrana PES)MilliporeSLHP033RS
10 cmEppendorf0030-702-115
90 mm szalka PetriegoSPL10090
100 µ m sitko komórkoweCorning352360
15 ml rurka stożkowaSPL50015
płytka 24-dołkowaCorning3526
29 G 1/2 strzykawkainsulinowa SHINAB299473538
mlNorm-jectN7. A03
Rurka stożkowa 50 mlSPL50050
A8301Tocris2939stężenie magazynowe: 25 mM
etanol absolutnyDaejung4023-2304
Szew wchłanialnyHenry Schein039010
Advanced DMEM/F-12Thermo12634028
Chlorek amonu i potasu (ACK) liza buforThermoA1049201
B-27Gibco17504-044stężenie magazynowe: 50X
BBN(N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoamina)Tokyo Chemical IndustryB0938
Niebieski nylon 5/0-13mmAILEENB521
C57BL MyszThe Jackson Laboratory000664
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mysz)Charles River194
Kolagenaza typu IThermo17100017stężenie magazynowe: 20 mg/ml
kolagenazy typu IIThermo1710001520 mg/ml
kolagenazy/dypazySigma102696380011 mg/ml
CyrovialCorning430488
DMEM (zmodyfikowane minimum niezbędne podłoża Dulbecco)Gibco11965-118
DMSO (dimetylosulfotlenek)SigmaD8418
DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco)WelgeneLB 001-02
Enrofloksacyna (Baytril)Bayer HealthcareDIN: 02169428
FBS (płodowa surowica bydlęca)MilliporeES009B-KC
GlutamaxGibco35050061100X
HEK 293TATCCCRL-11268
KWAS HEPES(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy)WelgeneBB001-01
IsofluraneHana Pharm Co., Ltd.
Ketoprofen (Anafen)MerialDIN: 02150999
Matrigel Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR)
Zredukowany czynnik wzrostu
(GFR)		Corning354230zastosowanie do hodowli organoidów na płytce
Matrigel o wysokim stężeniu (HC)Corning354248do przeszczepu organoidów
1,5 ml mikroprobówkaAxygenMCT-150-C
Odczynnik do transfekcji LT1Mirus BioMIR 2300
mysi EGF (naskórkowy czynnik wzrostu)Peprotech315-09stężenie magazynowe: 100 i mikro; g / ml
N-acetylo-L-cysteinaSigmaA9165stężenie magazynowe: 200 mM
nikotynamiduSigmaN0636: 1M
Opti-MEMGibco31985070
pCMV.R 8.74Addgene22036Opakowanie plazmidu
Penicylina / streptomycynaGibco15140122100X
pMD2.GAddgene12259Plazmid kopertowy
Polybrene (bromek heksadyny etyny)SigmaH9286stężenie zapasów: 2 i mikro; g / mL
pSiCoRAddgene11579Plazmid lentiwirusowy
Żyletka
Bufor solnyJW Pharmaceutical
SW41Ti wahliwy wirnik kubełkowyBeckman Coulter
Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticusMillipore58656-2500KUCNstężenie zapasów: 250 KU/ml
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco25200072
Probówka do ultrawirówkiBeckman Coulter331372
Y-27632 dichlorowodorekAbmoleM1817stężenie fabryczne: 10 mM
Płytka hodowlana 3 Stężenie magazynowe: Stężenie magazynowe: stężenie

Bibliografia

  1. Sanli, O., et al. Bladder cancer. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17022(2017).
  2. Stenzl, A., et al. Treatment of muscle-invasive and metastatic bladder cancer: update of the EAU guidelines. European Urology. 59 (6), 1009-1018 (2011).
  3. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603(2012).
  4. Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 179(2011).
  5. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407(2018).
  6. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246(2016).
  7. Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  10. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-517 (2018).
  11. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364(2015).
  13. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  14. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer–derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424(2017).
  15. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  16. Kim, S., et al. Epigenetic regulation of mammalian Hedgehog signaling to the stroma determines the molecular subtype of bladder cancer. eLife. 8, 43024(2019).
  17. Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469(2014).
  18. Fu, C. L., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse bladder wall injection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (53), e2523(2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla organoidówtransdukcja lentiwirusowaizolacja komórek nowotworowychprzygotowanie pożywki do organoidówmacierz błony podstawnejtrawienie kolagenaząneutralizacja trypsynyliczenie komór i hemocytometrem
Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.