Artykuł metodologiczny

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60478

⸱

15 listopada 2019

 , 
1AG Oncophysiology, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Streszczenie

Opisujemy modyfikację ustalonej metody określania dynamiki mikrotubul w żywych komórkach. Protokół opiera się na ekspresji genetycznie kodowanego markera dodatnich końców mikrotubul (EB3 znakowany białkiem fluorescencyjnym tdTomato) oraz szybkim obrazowaniu żywych komórek o wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Synchronizację cyklu komórkowego i zwiększenie gęstości mikrotubul uzyskuje się poprzez hamowanie separacji centrosomalnej w komórkach mitotycznych, a analizę wzrostu przeprowadza się za pomocą oprogramowania U-Track o otwartym kodzie źródłowym. Zastosowanie jasnego i przesuniętego ku czerwieni białka fluorescencyjnego, w połączeniu z niższą mocą lasera i skróconym czasem ekspozycji wymaganym do mikroskopii wirującego dysku, zmniejsza fototoksyczność i prawdopodobieństwo artefaktów wywołanych światłem. Pozwala to na obrazowanie większej liczby komórek w tym samym preparacie przy jednoczesnym utrzymaniu komórek w pożywce wzrostowej w standardowych warunkach hodowli. Ponieważ analiza jest wykonywana w sposób nadzorowany automatycznie, wyniki są statystycznie solidne i powtarzalne.

Wprowadzenie

Mikrotubule (MT) są wysoce dynamicznymi strukturami występującymi praktycznie we wszystkich komórkach eukariotycznych oraz u niektórych bakterii1. Wraz z aktyną i włóknami pośrednimi rzeźbią cytoszkielet2,3. Podział komórek4, transport molekuł5, bicie wici6, odczucie otaczającego środowiska przez pierwotną rzęskę7, słuch (kinocilium)8,9, embriogeneza10,11,12, inwazja i przerzuty13,14, a nawet tworzenie pamięci15,16,17,18, a wiele innych procesów opiera się głównie na MT. Udział MT we wszystkich tych wydarzeniach byłby niemożliwy bez ich niezwykłej zdolności do szybkiego przełączania się między wzrostem (polimeryzacją) a kurczeniem się (depolimeryzacją). Ta właściwość jest opisana jako niestabilność dynamiczna19. Dynamika MT ulega zmianie w wielu stanach patologicznych20,21,22. W związku z tym określenie charakteru tej właściwości może pomóc w zrozumieniu mechanizmów choroby, a następnie ich leczenia.

Opracowano długą listę metod analizy dynamiki MT, z których większość opiera się na technikach obrazowania23. Początkowo mikroskopy świetlne o szerokim polu widzenia były używane do obserwacji powstawania polimerów tubuliny in vitro24. Odkrycie białek wiążących końcówki (EB), które gromadzą się na plus-końcach MT oraz opracowanie metod fluorescencyjnego znakowania białek umożliwiło obserwację zachowania MT bezpośrednio w żywych komórkach za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych o szerokim polu i konfokalnych25,26,27. Jedno białko EB to białko wiążące koniec 3 (EB3)28; poprzez nadekspresję i śledzenie EB3 połączonego z białkiem fluorescencyjnym, można określić szybkość składania plus-end MT 29,30.

Konfokalna laserowa skaningowa mikroskopia fluorescencyjna (CLSM) jest często używana do śledzenia dynamiki MT. Jednak ta technika obrazowania stwarza wysokie ryzyko fototoksyczności i fotowybielania, dwóch niepożądanych procesów obrazowania żywych komórek i próbek przyciemnionych31. Aby uzyskać lepszy stosunek sygnału do szumu, moc lasera i czas naświetlania powinny być wystarczająco wysokie, a jednocześnie nie uszkadzać próbek, a to wymaga poświęcenia rozdzielczości w zamian za szybkość. Odpowiednią alternatywą dla CLSM jest mikroskopia z wirującym dyskiem32. Ta metoda obrazowania opiera się na użyciu dysku Nipkowa 33, który składa się z ruchomego dysku z układem otworków i działa równoważnie z wieloma mikroskopami CLS obrazującymi tę samą próbkę jednocześnie34. Dlatego światło z lasera oświetli jednocześnie kilka obszarów w próbce, ale zachowa konfokalny charakter. Dysk Nipkow pozwala więc na uzyskanie obrazów podobnych do CLSM, ale szybszych i przy mniejszym zużyciu mocy lasera. Dysk Nipkow został dodatkowo ulepszony przez Yokogawa Electric, która wprowadziła drugi dysk z układem mikrosoczewek, które indywidualnie kierują światło do odpowiedniego otworka, co jeszcze bardziej zmniejsza fototoksyczność i fotowybielanie35. W ten sposób laserowa mikroskopia skaningowa z wirującym dyskiem stała się metodą z wyboru do obrazowania żywych komórek i umożliwia uzyskanie obrazów o wysokim stosunku sygnału do szumu przy dużej prędkości31,36, co ma kluczowe znaczenie dla rozdzielczości sygnałów, takich jak te z szybko rosnących końców MT.

MT dynamika różni się tymczasowo. Na przykład mitotyczne MT są bardziej dynamiczne niż międzyfazowe37,38. Podobnie, różnice w szybkości wzrostu i kurczenia się zaobserwowano nawet w tej samej fazie cyklu komórkowego, np. mitosis39,40. W związku z tym, aby uniknąć gromadzenia fałszywych danych, pomiar dynamiki MT powinien być ograniczony do wąskiego okna czasowego podczas cyklu komórkowego. Na przykład, pomiar dynamiki MT w prometafazie można osiągnąć, traktując komórki dimetylenastronem (DME), analogiem monoastrolu, który hamuje kinezynę motoryczną Eg541 i zapobiega tworzeniu się dwubiegunowego wrzeciona mitotycznego42. Hamowanie komórek w prometafazie za pomocą inhibitora Eg5 DME i innych pochodnych monoastrolu nie wpływa na dynamikę MT43,44,45, co sprawia, że DME jest użytecznym narzędziem do badania dynamiki MT zarówno w stałych, jak i żywych komórkach44.

Tutaj łączymy metodę analizy dynamiki MT w komórkach prometafazowych opisaną przez Ertych et al.44 z obrazowaniem podwójnego wirującego dysku. Metoda ta umożliwia pomiar dynamiki MT w komórkach prometafazy pobranych z pojedynczej płaszczyzny ogniskowej z większą szybkością obrazowania, ale bez fotowybielania i minimalnej fototoksyczności. Ponadto, jako reporter fluorescencyjny, używamy tandemowego dimera białka fluorescencyjnego pomidora (tdTomato), które ma lepszą jasność i fotostabilność w porównaniu z białkiem zielonej fluorescencji (EGFP) i jest wzbudzane światłem o niższej energii46. Dlatego tdTomato wymaga mniejszej mocy lasera do wzbudzenia i jest mniej fototoksyczny. Ogólnie rzecz biorąc, jeszcze bardziej udoskonaliliśmy tę metodę, zmniejszając fototoksyczność oraz poprawiając rozdzielczość i przetwarzanie końcowe wymagane do analizy dynamiki MT. Dodatkowo tworzymy bazę do przyszłych modyfikacji metody poprzez łączenie jej z innymi technikami synchronizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wysiewanie komórek HeLa

  1. Przygotować 2 mL roztworu fibronektyny o stężeniu 5 μg/mL w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i dodać po 450 μL do każdego dołka szkiełka podstawowego z 4 komorami (#1.5). Inkubować szkiełko przez 15 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Przepłukać asynchronicznie rosnące komórki HeLa solą fizjologiczną z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) i inkubować z trypsyną-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) przez 5 min w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję enzymatyczną poprzez dodanie pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej o 10% inaktywowanego ciepłem płodowego surowicy cielęcej (FCS) w stosunku 3:1 (v:v) względem dodanej trypsyny-EDTA.
    UWAGA: Komórki HeLa były hodowane w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% inaktywowanego ciepłem FCS w temperaturze 37 °C i 5% CO2 oraz rutynowo pasażowane po osiągnięciu 80–90% konfluencji zgodnie z powyższym opisem.
  3. Określić stężenie komórek przy użyciu komory Neubauera. Wymieszać 50 μL alikwot zawiesiny komórkowej z błękitem trypanu w stosunku 1:1 (v:v), resuspendować i przenieść 10 μL zawiesiny do komory. Odliczyć tylko komórki niebarwiące się błękitem trypanu w obrębie czterech dużych kwadratów (szczegóły patrz Phelan et al.47). Obliczyć stężenie komórek na podstawie liczby odliczonych komórek, korzystając z następującego wzoru:
    figure-protocol-1
  4. Zwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 300 x g przez 2 min. Resuspendować w świeżej pożywce RPMI 1640, aby uzyskać stężenie 1 x 106 komórek/mL.
  5. Usunąć fibronektynę z komorowego szkiełka podstawowego, dwukrotnie przemyć dołki DPBS i wysiać po 50 000 komórek na dołek.
  6. Przenieść szkiełko podstawowe z komórkami z powrotem do inkubatora i hodować przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

2. Ekspresja pEB3-tdTomato w komórkach HeLa

  1. Przygotować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Do każdej probówki wprowadzić 2 μg pEB3-tdTomato48 i rozcieńczyć buforem do transfekcji (produkt syntetyczny w roztworze wodnym) do objętości końcowej 396 μL.
  2. Do pierwszej probówki dodać 4 μL odczynnika do transfekcji (nielipidowy, zawierający polietylenoiminę) i natychmiast wymieszać na wortexie przez dokładnie 10 s.
  3. Krótko wirować probówkę w mikrocentry fudze i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min.
  4. Wyjąć komórki HeLa z inkubatora. Do każdego dołka 4-komorowego szkiełka podstawowego dodać kroplami 100 μL mieszaniny do transfekcji, a następnie umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.
  5. Po 4 h inkubacji w 37 °C i 5% CO2 uzupełnić świeżą pożywką wzrostową i inkubować przez co najmniej 24 h w 37 °C i 5% CO2.
    UWAGA: Konieczna jest optymalizacja warunków transfekcji dla każdego typu komórek. Poziomy ekspresji muszą być na tyle niskie, aby umożliwić identyfikację pojedynczych końców rosnących MT. Alternatywnie, w eksperymentach można zastosować linię komórkową stabilnie eksponującą EB3-tdTomato; pozwoliłoby to zmniejszyć zmienność poziomów ekspresji EB3-tdTomato pomiędzy preparatami oraz między komórkami z tego samego preparatu49.

3. Synchronizacja i obrazowanie żywych komórek HeLa wykazujących ekspresję pEB3-tdTomato

  1. Przygotować 2,5 μM roztwór dimetylenastronu (DME) w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) bez czerwieni fenolowej, uzupełnionej o 10% FCS i 2 mM L-glutaminy lub alternatywne źródło glutaminy.
  2. Wymienić pożywkę wzrostową na szkiełku podstawowym z komorą na 500 μL pożywki wzrostowej zawierającej 2,5 μM DME i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  3. Po 3,5 h inkubacji z DME przenieść komórki pod mikroskop, zamocować szkiełko z komorą w komorze inkubacyjnej z ciemnymi panelami do obrazowania w 37 °C i 5% CO2 i inkubować dalej, aż całkowity czas inkubacji wyniesie 4 h.
    UWAGA: Utrzymanie stałej temperatury 37 °C bez wahań jest kluczowe dla eksperymentu.
  4. Przeprowadzić obrazowanie time-lapse przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw imersyjny 100x 1,49 N.A., konfokalny system z podwójnym dyskiem obrotowym oraz niezawodny system autofokusa do ciągłego utrzymywania płaszczyzny ostrości. Parametry obrazowania zdefiniować w następujący sposób.
    UWAGA: Stosujemy kamerę EM-CCD (Electron Multiplying Charge-Coupled Device).
    1. Do wzbudzenia EB3-tdTomato użyć linii lasera 561 nm z czasem ekspozycji 200 ms. Emitowane światło zbierać poprzez czteropasmowe lustro dichroiczne (405, 488, 561, 640 nm) i filtr emisyjny 600/52 nm.
      UWAGA: Moc lasera może być dostosowywana dla każdej obrazowanej komórki, aby zapobiec nasyceniu obrazu. We wszystkich przedstawionych tutaj filmach time-lapse moc lasera została ustawiona na 5,3 mW.
    2. Znaleźć komórkę w profazie i ustawić ostrość w płaszczyźnie Z odpowiadającej centrum monopolarnego wrzeciona mitotycznego. Pozyskiwać obrazy co 0,5 s przez łącznie 1 min, bez binningu i bez oświetlenia pomiędzy ekspozycjami.

4. Analiza dynamiki MT przy użyciu oprogramowania U-Track v2.2.0

  1. Do analizy dynamiki MT wymagane jest oprogramowanie do obliczeń numerycznych (np. MATLAB).
    UWAGA: Do przeprowadzenia analizy wystarczy podstawowa znajomość oprogramowania. Kompleksowe materiały pomocnicze i samouczki są dostępne na stronie internetowej producenta (https://uk.mathworks.com/products/­matlab/­getting-started.html).
  2. Pobrać (https://github.com/DanuserLab/u-track) i zainstalować otwartoźródłowe oprogramowanie U-Track v2.2.0 zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami zawartymi w pliku „Readme_u-track.pdf”50,51,52.
  3. Uruchomić oprogramowanie do analizy numerycznej i dodać folder U-Track v2.2.0 wraz z podfolderami do ścieżki wyszukiwania oprogramowania.
  4. Z okna poleceń wywołać „movieSelectorGUI”. Otworzy to okno dialogowe, z którego można zaimportować surowe pliki wygenerowane przez oprogramowanie do akwizycji obrazu w mikroskopie (Rysunek dodatkowy 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4).
    UWAGA: Oprogramowanie U-Track jest kompatybilne z innymi formatami danych obrazowych. Wykorzystuje ono Bio-Formats, który rozpoznaje różne formaty danych stosowane w naukach o życiu53.
  5. Rozmiar każdego obrazu jest odczytywany automatycznie z metadanych. Ręcznie wprowadzić aperturę numeryczną obiektywu (w tym przypadku 1,49) oraz odstęp czasu (0,5 s) zastosowany podczas obrazowania (Rysunek dodatkowy 1B). Dodatkowo można podać informacje o długości fali wzbudzenia, fluoroforze i czasie ekspozycji, ale nie są one kluczowe dla dalszej analizy.
  6. Po załadowaniu wszystkich obrazów zapisać wprowadzoną serię time-lapse jako listę filmów, wybierając opcję „Save As Movie List”. Po prawej stronie okna dialogowego wybrać opcję „U-Track” i nacisnąć „Continue” (Rysunek dodatkowy 1C).
    UWAGA: Wartości zostały zoptymalizowane dla komórek HeLa. W przypadku przejścia na inną linię komórkową wartości należy zdefiniować ponownie. Alternatywnie można skorzystać z ustawień zalecanych przez twórców oprogramowania. Szczegółowe wyjaśnienie każdego z parametrów oraz sposób ich definiowania można znaleźć w raporcie technicznym dostarczonym z poprzednią wersją oprogramowania, plusTipTracker50.
  7. Z okna pop-up wybrać „Microtubule Plus-Ends” i nacisnąć „Ok” (Rysunek dodatkowy 1C). Nowe okno dialogowe umożliwia określenie parametrów dla trzech etapów analizy (Rysunek dodatkowy 1D), którymi są detekcja, śledzenie oraz analiza ścieżek.
  8. W kroku 1 wybrać „Settings” i z menu rozwijanego wybrać „Comet Detection” jako metodę detekcji (Rysunek dodatkowy 2B).
    1. W nowym oknie dialogowym zdefiniować parametry filtra różnicy Gaussianów (DoG) oraz segmentacji watershed w następujący sposób (Rysunek dodatkowy 2C): Mask process to be used for the detection = None; Low-pass Gaussian standard deviation = 1 pixel; High-pass Gaussian standard deviation = 3 pixels; Minimum threshold = 3 standard deviations; Threshold step size = 0,25 standard deviations. Wybrać „Apply Settings to All Movies” i „Apply”.
  9. W kroku 2 parametry funkcji łączenia (linking), zamykania przerw (gap closing), scalania i rozdzielania (merging and splitting) oraz filtra Kalmana są definiowane w trzech etapach, odpowiednio zaznaczonych kolorem różowym, zielonym i niebieskim (Rysunek dodatkowy 3B). Dla tych etapów wybrać „Microtubule Plus-end Dynamics” i w opcji „Setting” zdefiniować wartości zgodnie z tym, co wskazano odpowiednio na Rysunku dodatkowym 3C–E.
    1. W przypadku problemów z wymiarowością wybrać „2” z menu rozwijanego. Ustawić Maximum Gap to Close = 5 frames; Minimum Length of Track Segments from First Step = 3 frames. Podobnie jak wcześniej, wybrać „Apply Settings to All Movies” i kliknąć „Apply”.
  10. W kroku 3 analizy wykryte ścieżki MT są klasyfikowane (Rysunek dodatkowy 4). Jako metodę analizy ścieżek wybrać „Microtubule Dynamics Classification” i zdefiniować parametry za pomocą przycisku „Setting”, jak wskazano na Rysunku dodatkowym 4B,C. Następnie zaznaczyć pole „Apply Settings to All Movies” i kliknąć „Apply”.
  11. Po zdefiniowaniu wszystkich parametrów w oknie „Control Panel–U-Track” (Rysunek dodatkowy 1D) zaznaczyć pola „Apply Check/Uncheck to All Movies” oraz „Run All Movies” i nacisnąć „Run”. Rozpocznie to analizę MT serii time-lapse.
  12. Po zakończeniu przetwarzania filmów wyświetli się komunikat „Your movie(s) have been processed successfully”. Nacisnąć „Ok”, a następnie „Save”.
  13. Można teraz bezpiecznie zamknąć oprogramowanie do analizy numerycznej. Wyniki przetwarzania filmów są przechowywane w strukturach podfolderów jako pliki m-files w folderze, w którym znajdują się pliki surowe.

5. Analiza statystyczna dynamiki mikrotubul

  1. Zaimportuj pliki m-files do preferowanego programu do analizy statystycznej.
    UWAGA: W naszym przypadku najpierw importujemy pliki do standardowego arkusza kalkulacyjnego, aby były czytelne. Pliki m-files zawierają informacje statystyczne (medianę, średnią i odchylenie standardowe) dotyczące różnych parametrów (np. prędkości wzrostu, dynamiki MT). Szczegółowa lista parametrów znajduje się w raporcie technicznym dostarczonym z poprzednią wersją oprogramowania plusTipTracker50,52. Wygenerowane pliki m-files można również zaimportować do innego oprogramowania do przetwarzania danych.
  2. Wybierz parametr "growth speed mean" i zaimportuj go do tabeli w celu przeprowadzenia analizy statystycznej i prezentacji danych. Informacje o innych parametrach (np. "dynamicity") wprowadź do nowej tabeli lub do nowej kolumny tej samej tabeli zgrupowanej i wykresu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 1A, plazmid pEB3-tdTomato wykazano w formie ekspresji przejściowej w asynchronicznie rosnących komórkach HeLa. Komórki zsynchronizowano 48 h po transfekcji w prometafazie poprzez traktowanie DME (Rysunek 1B). Krok ten zapewnił, że pomiary dynamiki MT zawsze przeprowadzano w tej samej fazie cyklu komórkowego. Filmy time-lapse zostały następnie przetworzone i przeanalizowane za pomocą oprogramowania U-Track v2.2.0, zg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy modyfikację metody ustanowionej po raz pierwszy przez Ertycha i wsp.44. Wraz z kilkoma innymi modyfikacjami łączymy tę technikę analizy dynamiki MT z obrazowaniem konfokalnym z podwójnym wirującym dyskiem. Zastosowanie podwójnego wirującego dysku poprawia rozdzielczość rosnących MT przy jednoczesnym zmniejszeniu fototoksyczności36. Jeszcze bardziej zmniejszamy fotowybielanie i uszkodzenia komórek wywołane światłem laserowym, przełączając się na repor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy członkom Centrum Mikroskopii Świetlnej, Instytutu Medycyny Eksperymentalnej Maxa-Plancka, za ich fachowe porady i wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DimetylenastronMerck324622
DMEM bez czerwieni fenolowejGibco31053-28
DPBSGibco14190-094
Płodowa surowica bydlęcaBiochromS0415
Fibronektyna Osocze bydlęceMerckF4759Sterylny proszek
GlutaMAXGibco35050-038Stabilny substytut glutaminy
jetPRIMEPolyplus114-15
EB3-TdTomatoAddgeneplazmid #50708
RPMI 1640Gibco61870-010
Trypan BlueMerckT8154-20ML
Roztwór trypsyny/EDTABiochromL21430,05%/0,02 % w/o wapń i magnez
szkiełkoIbidi804264-dołkowe z szkiełkiem nakrywkowym #1,5
Eclipse Ti Mikroskop odwróconyNikonNA
ObiektywNikonMRD01991CFI Apo TIRF 100xC Olej
ACAL Laser ExcahngerNikonSkrzynka laserowa. 405, 458, 488, 514, 561 i 647 nm
Moduł dysku obrotowegoAndorCSU-W
KameraAndoriXon Ultra 888
OkolabCiemna komora wyposażona w zasilanie CO2, regulację temperatury i nawilżacz
HeLa CellsDSMZACC-57
NIS Elements v4NikonMikroskop z wirującym dyskiem. Oprogramowanie do akwizycji
MATLABMathworksŚrodowisko obliczeniowe
Prism 8GraphPadOprogramowanie do analizy statystycznej i wyświetlania
Komora środowiskowa

Bibliografia

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8(2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4(2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343(2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153(2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39(2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Elektrisches teleskop. Germany patent. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. , EP92114750A (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3(1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138(2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

EB3 tdTomatoobrazowanie ywych kom reksynchronizacja cyklu kom rkowegooprogramowanie U Trackfluorescencyjny marker bia kowyobrazowanie time lapseredukcja fototoksyczno ci

Powiązane artykuły