Uchwycenie reakcji docelowych populacji komórek na uraz serca za pomocą trójwymiarowego obrazowania serca

Podsumowanie

Proliferacja kardiomiocytów po urazie jest dynamicznym procesem, który wymaga symfonii sygnałów zewnątrzkomórkowych z populacji komórek niebędących miocytami. Wykorzystując śledzenie linii, pasywną CLARITY i techniki trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej z pełnym mocowaniem, możemy analizować wpływ różnych typów komórek na naprawę i regenerację serca.

Streszczenie

Choroby układu krążenia przewyższają wszystkie inne przyczyny zgonów i są odpowiedzialne za oszałamiające 31% zgonów na całym świecie. Choroba ta objawia się uszkodzeniem serca, przede wszystkim w postaci ostrego zawału mięśnia sercowego. Przy niewielkiej odporności po urazie, niegdyś zdrowa tkanka serca zostanie zastąpiona włóknistą, niekurczliwą tkanką bliznowatą i często będzie to preludium do niewydolności serca. Aby zidentyfikować nowe opcje leczenia w medycynie regeneracyjnej, badania skupiły się na kręgowcach z wrodzonymi zdolnościami regeneracyjnymi. Jednym z takich organizmów modelowych jest mysz nowonarodzona, która reaguje na uraz serca solidną regeneracją mięśnia sercowego. W celu wywołania urazu u noworodka, który jest istotny klinicznie, opracowaliśmy operację zamknięcia lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD), odzwierciedlającej zawał mięśnia sercowego wywołany miażdżycą w ludzkim sercu. W połączeniu z technologią śledzenia zmian zarówno w populacjach kardiomiocytów, jak i nie-miocytów, model ten zapewnia nam platformę do identyfikacji mechanizmów, które kierują regeneracją serca. Uzyskanie wglądu w zmiany w populacjach komórek serca po urazie kiedyś w dużej mierze opierało się na metodach takich jak sekcja tkanek i badanie histologiczne, które ograniczają się do analizy dwuwymiarowej i często uszkadzają tkankę w tym procesie. Co więcej, metody te nie są w stanie śledzić zmian w liniach komórkowych, zamiast tego dostarczają jedynie migawki reakcji na uraz. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób zaawansowane technologicznie metody w modelach śledzenia linii, oczyszczaniu całego narządu i trójwymiarowej (3D) mikroskopii całościowej można wykorzystać do wyjaśnienia mechanizmów naprawy serca. Dzięki naszemu protokołowi operacji zawału mięśnia sercowego u noworodków myszy, oczyszczania tkanek i obrazowania 3D całych narządów, złożone szlaki, które indukują proliferację kardiomiocytów, mogą zostać odkryte, ujawniając nowe cele terapeutyczne dla regeneracji serca.

Wprowadzenie

Serce od dawna uważane jest za organ postmitotyczny, jednak ostatnie dowody pokazują, że odnowa kardiomiocytów zachodzi w sercu dorosłego człowieka w tempie około 1% rocznie¹. Jednak te niskie wskaźniki obrotu kardiomiocytów są niewystarczające, aby uzupełnić masywną utratę tkanki, która następuje po urazie. Serce, które doznało zawału mięśnia sercowego, straci około miliarda kardiomiocytów, co często służy jako preludium do niewydolności serca i nagłej śmierci sercowej^2,3. Biorąc pod uwagę, że na całym świecie niewydolność serca dotyka ponad 26 milionów osób, istnieje niezaspokojone zapotrzebowanie na terapie, które mogą odwrócić szkody wyrządzone przez choroby serca⁴.

Aby wypełnić tę lukę w lecznictwie, naukowcy rozpoczęli badania nad ewolucyjnie zachowanymi mechanizmami, które leżą u podstaw endogennej regeneracji po urazie. Jednym z modeli do badania regeneracji serca u ssaków jest mysz nowonarodzona. W ciągu tygodnia po urodzeniu u nowonarodzonych myszy występuje silna odpowiedź regeneracyjna po uszkodzeniu serca⁵. Wcześniej wykazaliśmy, że nowonarodzone myszy mogą regenerować swoje serce poprzez proliferację kardiomiocytów po resekcji wierzchołkowej⁵. Chociaż technika ta może wywołać regenerację serca u noworodków, operacja nie ma znaczenia klinicznego w przypadku urazów serca u ludzi. Aby naśladować uraz człowieka w modelu noworodka myszy, opracowaliśmy technikę wywoływania zawału mięśnia sercowego poprzez niedrożność tętnicy wieńcowej⁶. Technika ta wymaga chirurgicznego podwiązania lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD), która jest odpowiedzialna za dostarczanie 40%–50% krwi do mięśnia sercowego lewej komory^6,7. W ten sposób operacja powoduje zawał, który wpływa na znaczną część ściany lewej komory. To uszkodzenie mięśnia sercowego będzie stymulować proliferację kardiomiocytów i regenerację serca u noworodków⁵.

Operacja niedrożności tętnic wieńcowych zapewnia wysoce powtarzalną i bezpośrednio translacyjną metodę odkrywania wewnętrznych mechanizmów regeneracji serca. Chirurgia noworodków przebiega równolegle do miażdżycy tętnic wieńcowych w ludzkim sercu, gdzie nagromadzenie blaszki miażdżycowej w wewnętrznych ścianach tętnic może spowodować niedrożność, a następnie zawał mięśnia sercowego⁸. Ze względu na brak metod leczenia pacjentów z niewydolnością serca, niedrożność w LAD wiąże się ze śmiertelnością sięgającą do 26% w ciągu roku po urazie⁹, i w związku z tym została nazwana "twórcą wdów". Postęp w terapii wymaga modelu, który dokładnie odzwierciedla złożone fizjologiczne i patologiczne skutki uszkodzenia serca. Nasz protokół chirurgiczny leczenia uszkodzeń serca u noworodków myszy stanowi platformę, która pozwala naukowcom badać sygnały molekularne i komórkowe, które sygnalizują regenerację serca ssaków po urazie.

Ostatnie badania podkreślają dynamiczny związek między środowiskiem zewnątrzkomórkowym a proliferacją kardiomiocytów. Na przykład poporodowe okno regeneracyjne można wydłużyć, zmniejszając sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej serce¹⁰. Biomateriały z macierzy zewnątrzkomórkowej noworodków mogą również wspomagać regenerację serca w sercach dorosłych ssaków po urazie serca¹¹. Proliferacji kardiomiocytów towarzyszy również odpowiedź angiogenna^12,13; Wykazano, że tworzenie się tętnicy pobocznej unikalne dla regenerującego się serca noworodka myszy jest niezbędne do stymulowania regeneracji serca¹². Co więcej, nasze laboratorium wykazało, że sygnalizacja nerwowa reguluje proliferację kardiomiocytów i regenerację serca poprzez modulację poziomu czynnika wzrostu, a także reakcję zapalną po urazie¹⁴. Odkrycia te podkreślają potrzebę śledzenia populacji komórek niebędących miocytami w odpowiedzi na uszkodzenie serca. Aby osiągnąć ten cel, wykorzystaliśmy system rekombinacji Cre-lox w liniach myszy transgenicznych w celu włączenia konstytutywnej lub warunkowej ekspresji fluorescencyjnych białek reporterowych do śledzenia linii. Co więcej, możemy użyć zaawansowanych metod do określenia wzorca ekspansji klonalnej za pomocą linii myszy Rainbow, która opiera się na stochastycznej ekspresji zależnych, wielokolorowych reporterów fluorescencyjnych zależnych od Cre w celu określenia ekspansji klonalnej docelowych populacji komórek¹⁵. Wykorzystanie śledzenia linii z chirurgią niedrożności tętnic wieńcowych u noworodków jest potężnym narzędziem do analizowania skomplikowanych mechanizmów komórkowych regeneracji serca.

Śledzenie linii komórek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą trójwymiarowego (3D) obrazowania całego narządu jest trudne do osiągnięcia przy użyciu tradycyjnej techniki cięcia i rekonstrukcji - zwłaszcza gdy populacje komórek są delikatne, takie jak włókna nerwowe lub naczynia krwionośne. Podczas gdy bezpośrednie obrazowanie całego narządu za pomocą sekcji optycznej może uchwycić powierzchowne populacje komórek, struktury znajdujące się głęboko w tkance pozostają niedostępne. Aby obejść te bariery, opracowano techniki oczyszczania tkanek w celu zmniejszenia zmętnienia tkanek całego narządu. Ostatnio poczyniono znaczne postępy w zakresie metod opartych na przezroczystym morfologii sztywnego obrazowania zgodnego z polimerami lipidowymi i akrylamidem (CLARITY), które usuwają utrwaloną tkankę za pomocą ekstrakcji lipidów¹⁶. Podejmowane są również kroki w celu homogenizacji współczynnika załamania światła, a następnie zmniejszenia rozpraszania światła podczas obrazowania¹⁷. Jedną z takich metod jest aktywna CLARITY, która przyspiesza rozkład lipidów za pomocą elektroforezy do penetracji detergentu w całej tkance¹⁸. Chociaż skuteczna, ta metoda oczyszczania tkanek wymaga drogiego sprzętu i może powodować uszkodzenia tkanek, co sprawia, że podejście to jest niekompatybilne z delikatnymi populacjami komórek, takimi jak nerwy sercowe¹⁹. W związku z tym stosujemy pasywne podejście CLARITY, które opiera się na cieple, aby delikatnie ułatwić przenikanie detergentu, pomagając w ten sposób w zachowaniu skomplikowanych struktur komórkowych^20,21.

Pasywna PRZEJRZYSTOŚĆ jest zazwyczaj uważana za mniej efektywną niż aktywna PRZEJRZYSTOŚĆ¹⁸, ponieważ technice tej często towarzyszą dwie główne przeszkody: niemożność oczyszczenia całego narządu i długi czas potrzebny na usunięcie tkanek dorosłych. Nasze pasywne podejście CLARITY pokonuje obie te bariery dzięki przyspieszonemu procesowi oczyszczania, który jest w stanie w pełni oczyścić tkankę serca noworodków i dorosłych. Nasza pasywna technika oczyszczania tkanek CLARITY osiągnęła skuteczność, która pozwala na wizualizację różnych populacji komórek serca, w tym rzadkich populacji rozmieszczonych w całym sercu dorosłego człowieka. Kiedy oczyszczone serce jest obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, można naświetlić architekturę specyficznych dla komórek wzorców podczas rozwoju, choroby i regeneracji.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po użytkowaniu i opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi oraz zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Szkole Medycyny i Zdrowia Publicznego na Uniwersytecie Wisconsin-Madison. Wszystkie metody przeprowadzono na dzikich liniach myszy C57BL/6J (B6) i transgenicznych uzyskanych z Jackson Laboratories.

1. Niedrożność tętnicy wieńcowej (zawał mięśnia sercowego) wywołana przez podwiązanie lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) u 1-dniowych noworodków myszy⁶

1. Oddziel 1-dniowe młode nowonarodzone od matki, umieszczając je w czystej klatce wraz z częścią oryginalnego materiału gniazdowego.
2. Umieść połowę klatki na poduszce grzewczej ustawionej na średnie ciepło. Szczenięta powinny pozostać po nieogrzewanej stronie klatki, a dopiero po operacji umieszczać je na ogrzewanej stronie.
3. Stwórz sterylne pole operacyjne pod mikroskopem operacyjnym. Zbierz wysterylizowany sprzęt chirurgiczny (Tabela 1).
4. Znieczulenie szczeniaka przez hipotermię: owiń szczenię gazą, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu skóry z lodem i zakop je w lodzie na około 3-4 minuty. Okresowo sprawdzaj hipotermię myszy, wykonując szczypanie palca u nogi. Noworodki dobrze znoszą hipotermię, jednak długotrwałe narażenie na hipotermię może skutkować odmrożeniami, a następnie śmiertelnością.
5. Po znieczuleniu umieść mysz na obszarze operacyjnym w pozycji leżącej, zabezpieczając ręce i nogi taśmą. Wysterylizuj obszar chirurgiczny myszy roztworem antyseptycznym.
6. Zlokalizuj dolną część klatki piersiowej i wykonaj poprzeczne nacięcie w skórze małymi nożyczkami preparującymi. Aby poszerzyć pole widzenia chirurgicznego żeber, oddziel skórę od mięśnia, delikatnie unosząc skórę za pomocą kleszczy opatrunkowych i delikatnie dociśnij do mięśni międzyżebrowych małymi nożyczkami w pozycji zamkniętej.
7. Zlokalizuj czwartą przestrzeń międzyżebrową (Rysunek 1A) i wykonaj małe, powierzchowne nakłucie za pomocą ostrych kleszczy, uważając, aby nie przebić żadnych narządów wewnętrznych. Wykonaj rozwarstwienie, poszerzając obszar między mięśniami międzyżebrowymi za pomocą kleszczy opatrunkowych. Prawidłowe anatomiczne umiejscowienie nacięcia jest niezbędne do prawidłowego dostępu do serca.
8. Delikatnie wyprowadź serce z jamy klatki piersiowej, kładąc palec i wywierając coraz większy nacisk na lewą stronę brzucha, jednocześnie przytrzymując otwartą przestrzeń międzyżebrową kleszczami opatrunkowymi (Ryc. 1B). Gdy serce znajdzie się na zewnątrz klatki piersiowej, zdejmij kleszcze opatrunkowe, zmniejsz nacisk i pozwól sercu spocząć na mięśniach międzyżebrowych.
9. Zlokalizuj LAD jako obszar serca, który ma mniej nagromadzonej krwi i znajduje się we właściwej pozycji anatomicznej (Rysunek 1C). LAD można zobaczyć pod mikroskopem tylko wtedy, gdy dostęp do serca nastąpi w ciągu kilku minut od rozpoczęcia operacji.
10. Wykonaj podwiązanie LAD, zszywając LAD szwem 6-0 (Rysunek 1D). Zawiąż kwadratowy węzeł dwa razy, aby wywołać zawał mięśnia sercowego (Rysunek 1E). Głębokość szwu w mięśniu sercowym może być różna, jednak prawidłowe anatomiczne ułożenie podwiązania LAD ma kluczowe znaczenie dla odtwarzalności. Podczas podwiązywania LAD szew powinien być mocno naciągnięty, ale ostrożnie, aby nie przeciąć LAD. Blanszowanie na wierzchołku serca będzie widoczne natychmiast (Rysunek 1E)
11. Pozwól, aby serce wsunęło się z powrotem do jamy klatki piersiowej; proces ten można delikatnie ułatwić za pomocą kleszczy opatrunkowych. Zszyj żebra razem z węzłem chirurgicznym, a następnie węzłem kwadratowym, używając kleszczy, aby podnieść górny zestaw żeber, jednocześnie przechodząc szwem 6-0 przez górny i dolny zestaw żeber.
12. Usuń taśmę, która była używana do zabezpieczenia tylnych nóg szczeniaka.
13. Sklej skórę ze sobą, nakładając niewielką ilość kleju do skóry na górną część brzucha. Następnie chwyć skórę dolnej części brzucha cienkimi kleszczami i zakryj odsłoniętą część klatki piersiowej. Ogranicz ilość nadmiaru kleju, który pozostaje na szczeniętach, ponieważ może to zwiększyć prawdopodobieństwo odrzucenia i kanibalizmu przez matkę.
14. Natychmiast ułatw powrót do zdrowia po znieczuleniu, umieszczając szczeniaka na poduszce grzewczej ustawionej na średnie ciepło. Okresowo zmieniaj ułożenie noworodków, aby równomiernie ogrzać wszystkie części ciała.
15. Pozwól noworodkowi pozostać bezpośrednio na poduszce grzewczej przez 10–15 minut. Zazwyczaj ruch jest odzyskiwany w ciągu 5 minut od umieszczenia na ogniu.
16. Oczyść resztki krwi i kleju wacikiem nasączonym alkoholem.
17. Zakryj obce zapachy noworodków, pocierając całe ciało pościelą z oryginalnej klatki. Umieść szczeniaka w klatce po ogrzewanej stronie, podczas gdy wykonywane są inne operacje.
18. Gdy wszystkie operacje zostaną zakończone, a młode będą ciepłe i ruchliwe, przenieś miot wraz z oryginalnym materiałem gniazdowym do klatki matki.
19. Monitoruj myszy przez 30–60 minut po operacji i obserwuj, czy matka akceptuje młode poprzez zagnieżdżanie i/lub pielęgnację.
20. Sprawdź myszy rano po zabiegu. Jeśli matka jest zestresowana i nie zagnieździła szczeniąt, rozważ przybraną matkę dla szczeniąt.

2. Oczyszczanie serca myszy za pomocą umiejętności pasywnej CLARITY^21,22,23

1. Znieczulij mysz izofluranem. Uszczypnij palec u nogi, aby upewnić się, że mysz jest w pełni uspokojona.
2. Umieść mysz na czystym, chirurgicznym obszarze w pozycji leżącej, zabezpieczając ręce i nogi taśmą.
3. Utrzymać sedację izofluranem u myszy za pomocą stożka nosowego do momentu ekstrakcji serca.
4. Otwórz dolną część klatki piersiowej, przytrzymując futro tuż poniżej wyrostka mieczykowatego kleszczami tkankowymi i wykonaj nacięcie na całej szerokości klatki piersiowej za pomocą dużych nożyczek preparujących.
5. Przeciąć wzdłuż dystalnych części klatki piersiowej nożyczkami chirurgicznymi.
6. Odsłoń mięsień przepony, chwytając wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy tkankowych. Odłącz membranę za pomocą zakrzywionych kleszczy.
7. Utrzymując chwyt wyrostka mieczykowatego, pociągnij tkankę czaszkowo, aż bijące serce będzie dostępne.
8. Chwyć serce u podstawy zakrzywionymi kleszczami i wypreparuj serce z jamy klatki piersiowej, przecinając aortę i żyłę główną górną nożyczkami do irydektomii.
9. Gdy serce nadal bije, umieść je na szalce Petriego wypełnionej PBS, aby serce pompowało krew do środka, gdy nadal bije. Zawał mięśnia sercowego można potwierdzić poprzez sprawdzenie, czy szew jest umieszczony w odpowiedniej pozycji anatomicznej do podwiązania LAD.
10. Delikatnie ściśnij serce kleszczami, aby serce mogło wydalić resztki krwi.
11. Przenieś serce myszy do jednorazowej fiolki ze szklaną skorupką o pojemności 2,5 ml i 2 ml PBS. Zmyj resztki krwi, kilkakrotnie inkubując serce na wytrząsarce przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Zmieniaj rozwiązanie PBS za każdym razem, aż PBS pozostanie czysty.
12. Wyrzuć PBS i napełnij fiolkę 2 ml zimnego 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (Rysunek 2A).
13. Po inkubacji wyrzucić PFA i fiolkę z 2 ml PBS. Myj serce na shakerze przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz etap mycia dwukrotnie, za każdym razem opróżniając i napełniając fiolkę nowym PBS, aby całkowicie zmyć nadmiar PFA.
14. Wyrzucić PBS i napełnić fiolkę 2 ml 4% roztworu akrylamidu i 0,5% roztworu VA-044. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
15. Następnego dnia należy przeprowadzić polimeryzację, przenosząc fiolkę do bloku grzewczego ustawionego na 37 °C na 3 godziny.
16. Przenieść serce do nowej fiolki ze szklaną otoczką i powtórzyć krok 2.12 (cykl płukania PBS).
17. Odrzucić PBS i napełnić fiolkę 2 ml roztworu czyszczącego (Tabela 2). Inkubować w temperaturze 37 °C aż do oczyszczenia serca. Zmieniaj roztwór i uzupełniaj go świeżym roztworem czyszczącym co 2-3 dni. Proces oczyszczania może potrwać do kilku tygodni (Rysunek 2B-C).
    UWAGA: Serca P1 zwykle potrzebują około 3-5 dni, podczas gdy serca P21 mogą potrzebować prawie miesiąca, zanim inkubacja roztworu oczyszczającego zostanie zakończona.
18. Odrzucić PBS i napełnić fiolkę 2 ml PBS i powtórzyć krok 2.12 (cykl płukania PBS). Ponownie napełnić fiolkę świeżym PBS i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
19. Jeśli ma być wykonane barwienie immunologiczne, pomiń kroki 2.21–2.22 i przejdź do sekcji 3 dotyczącej barwienia immunologicznego. Jeśli polegasz wyłącznie na fluorescencji endogennej, wykonaj kroki 2.21–2.22 i pomiń sekcję 3.
20. Odrzucić PBS i zmienić roztwór na roztwór do dopasowania współczynnika załamania światła (RIMS) (Tabela 3). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
21. Po inkubacji, oczyszczona tkanka może być przechowywana w roztworze RIMS w temperaturze RT. Tkanka może wydawać się biała i nieprzezroczysta w środku, gdy po raz pierwszy przenosi się do RIMS; tkanka powinna stać się przezroczysta po inkubacji w RIMS w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni (Rysunek 2D).

3. Opcjonalnie: Barwienie immunohistochemiczne całego serca myszy

1. Wyjąć oczyszczone serce z roztworu RIMS i umieścić w czystej szklanej fiolce o pojemności 2,5 ml z 2 ml PBST (PBS z 0,1% Triton-X 100)
2. Umyj serce w PBST 3 razy na rotatorze orbitalnym z 30-minutową inkubacją w temperaturze pokojowej.
3. Zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał poprzez zanurzenie serca w 2 ml 20% buforu blokującego (rozcieńczonego w PBST) i inkubować z rotacją przez 3 godziny w temperaturze suchej masy. Przenieść do 4 °C w celu barwienia z rotacją przez noc.
   UWAGA: Bufor blokujący jest wytwarzany z normalnej surowicy pasującej do gatunku, w którym wyhodowano przeciwciało drugorzędowe.
4. Umyj serce w PBST 3 razy z rotacją przez 5 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.
5. Zanurz serce w przeciwciałie pierwszorzędowym (rozcieńczonym w 2% buforze blokującym z PBST) i zapobiegaj ekspozycji na światło, owijając szklaną fiolkę folią aluminiową. Inkubować z rotacją przez noc w temperaturze RT.
   UWAGA: Od tego momentu folia aluminiowa powinna być stale używana do ochrony wtórnika przed światłem otoczenia.
6. Inkubować przez dodatkowe 24 godziny z rotacją w temperaturze 4 °C.
7. Po barwieniu pierwotnym powtórz krok 3.2 (długi cykl płukania PBST), aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe z tkanki. Przedłużyć pranie o inkubację przez noc z rotacją przy suchej smołce.
8. Pracując w miejscu o ograniczonym oświetleniu, aby zapobiec wtórnej ekspozycji na światło przeciwciał, zanurzyć serce w przeciwciałie drugorzędowym (rozcieńczonym w 2% buforze blokującym z PBST) i inkubować z rotacją przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Przenieść do 4 °C w celu barwienia z rotacją przez noc.
9. Następnego dnia powtórz krok 3.2 (długi cykl płukania PBST), aby usunąć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe.
10. Zastąp roztwór 2% buforem blokującym (rozcieńczonym w PBST). Usunąć resztki niezwiązanego przeciwciała przez przemycie przez noc z rotacją w temperaturze pokojowej.
11. Następnego dnia sprawdź, czy nadmiar przeciwciał drugorzędowych został usunięty za pomocą mikroskopii konfokalnej. W razie potrzeby przedłuż mycie, codziennie wymieniając 2% roztwór buforowy blokujący. Kontynuuj, gdy nie ma prawie żadnej niespecyficznej wtórnej.
12. Przechowywać wybarwione immunologicznie serce w PBS w temperaturze 4 °C.
13. Bezpośrednio przed mikroskopią całego wierzchowania należy inkubować serce w roztworze RIMS przez noc w temperaturze 37 °C. Przedłużyć inkubację o dodatkowe 24 godziny, jeśli tkanka nadal nie jest w pełni oczyszczona.
14. Przechowuj w pełni oczyszczone i wybarwione immunologicznie serce w RIMS w temperaturze pokojowej.

4. Wizualizacja populacji nie-miocytów w 3D za pomocą jednofotonowej mikroskopii konfokalnej Obrazowanie oczyszczonego serca myszy

UWAGA: Jeśli serca myszy są zbierane embrionalnie, przejdź do sekcji 4.1. W przypadku serc myszy pobranych po urodzeniu, należy przejść do punktu 4.2.

1. Obrazowanie oczyszczonego embrionalnego serca myszy
   1. Napełnij szkiełko wgłębieniowe mikroskopu roztworem PBS.
   2. Ostrożnie podnieś oczyszczone serce za pomocą zakrzywionych kleszczy i umieść tkankę na szkiełku.
   3. Zamontuj szkiełko za pomocą szklanego szkiełka nakrywkowego. Tkankę można teraz obrazować pod mikroskopem konfokalnym.
2. Obrazowanie oczyszczonego serca myszy po urodzeniu
   1. Napełnić połowę komory szkiełka wgłębieniowego roztworem PBS. W celu stworzenia komory wystarczająco dużej, aby zmieściło się w niej serce dorosłej myszy, wydrukowana w 3D polipropylenowa prowadnica depresyjna została wykonana na zamówienie (Rysunek 4).
   2. Ostrożnie podnieś oczyszczone serce za pomocą zakrzywionych kleszczy i umieść tkankę w komorze. Wypełnij pozostałą objętość komory PBS.
   3. Napełnij komorę PBS tak, aby powierzchnia cieczy utworzyła kopułę nad górną częścią komory. Zamontuj prowadnicę pokrywy. Tkankę można teraz obrazować pod pionowym mikroskopem konfokalnym.

Wyniki

Często dwoma najtrudniejszymi etapami są wysunięcie serca z jamy klatki piersiowej oraz podwiązanie LAD. Aby rozwiązać problemy z tymi krokami, można wprowadzić korekty w rozmieszczeniu początkowego nakłucia między czwartymi mięśniami międzyżebrowymi; jeśli nakłucie i tępa dyssekcja znajdują się zbyt blisko mostka, serce może nie być w stanie opuścić jamy klatki piersiowej (Rysunek 1A).

Dodatkowo, aby ułatwić ten proces, może być konieczny zwiększ...

Dyskusja

Interakcje komórka-komórka między kardiomiocytami a populacjami nie-miocytami są czynnikiem decydującym o tym, czy serce ulegnie zwłóknieniu, czy naprawi się po urazie. Dokonano odkryć wykazujących, że różne typy komórek, w tym nerwy¹⁴, komórki nasierdzia²⁴, makrofagi otrzewnej²⁵, tętniczki^12,13 i komórki śródbłonka limfatycznego²⁶, odgrywają istotną rolę w pośrednicze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-tioglicerol
6-0 Szwy prolenowe	Ethicon	8889H	Szwy polipropylenowe
Akrylamid
Kwas
Zakrzywione kleszcze	Excelta	16-050-146	Półzakrzywione, ząbkowane, 4
cale opatrunkowe	Fisherbrand	13-812-39	Rozwarstwianie, 4,5 cala
szklana fiolka	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Fiolka z nakrętką
Histodenz	Sigma-Aldrich		Gradient gęstości średni
Irydektomia Nożyczki	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Krawędź tnąca
Duże nożyczki preparacyjne	Fisherbrand	08-951-20	Prosty, 6-calowy
uchwyt na igłę	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 cali
			fosforanowy
paraformaldehydu
Ostre kleszcze	Sigma-Adrich	Z168777	Cienka końcówka, prosta, 4,25 cala
Małe nożyczki preparacyjne	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Krawędź tnąca
Azydek
sodu Dodecyl sodu Siarczan (SDS)
Kleszczyki tkankowe	Excelta	16050133	Średnia tkanka, 1X2 zęby
VA-044	Wako Chemicals Rozpuszczalny		w wodzie inicjator azowy

borowybufor