Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Projekt biokompatybilnego stentu tchawicy uwalniającego leki u myszy ze zwężeniem krtani i tchawicy

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60483

⸱

21 stycznia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, University of California, San Francisco, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Johns Hopkins School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Zwężenie krtani i tchawicy wynika z patologicznego osadzania się blizn, które krytycznie zwężają drogi oddechowe tchawicy i nie mają skutecznych terapii medycznych. Stosując stent PLLA-PCL (70% poli-L-laktydu i 30% polikaprolaktonu) jako miejscowy system dostarczania leków, można badać potencjalne terapie mające na celu zmniejszenie proliferacji blizn w tchawicy.

Streszczenie

Zwężenie krtani i tchawicy (LTS) to patologiczne zwężenie podgłośni i tchawicy prowadzące do niedrożności pozaklatkowej i znacznej duszności. LTS wynika z uszkodzenia błony śluzowej spowodowanego ciałem obcym w tchawicy, co prowadzi do uszkodzenia tkanek i miejscowej reakcji zapalnej, która przebiega nieprawidłowo, prowadząc do odkładania się patologicznej tkanki bliznowatej. Leczenie LTS jest chirurgiczne ze względu na brak skutecznych terapii medycznych. Celem tej metody jest skonstruowanie biokompatybilnego stentu, który można zminiaturyzować w celu umieszczenia u myszy z LTS. Wykazaliśmy, że konstrukt PLLA-PCL (70% poli-L-laktydu i 30% polikaprolaktonu) miał optymalną wytrzymałość biomechaniczną, był biokompatybilny, praktyczny dla stentu umieszczonego in vivo i zdolny do elucji leku. Metoda ta zapewnia system dostarczania leków do testowania różnych środków immunomodulujących w celu miejscowego hamowania stanu zapalnego i zmniejszania zwłóknienia dróg oddechowych. Produkcja stentów trwa 28-30 godzin i można je łatwo odtworzyć, co pozwala na eksperymenty z dużymi kohortami. W tym przypadku włączyliśmy lek rapamycynę do stentu, aby przetestować jego skuteczność w zmniejszaniu zwłóknienia i odkładania się kolagenu. Wyniki wykazały, że namioty PLLA-PCL wykazywały niezawodne uwalnianie rapamycyny, były stabilne mechanicznie w warunkach fizjologicznych i były biokompatybilne, wywołując niewielką reakcję zapalną w tchawicy. Co więcej, stenty PLLA-PCL uwalniające rapamycynę zmniejszyły powstawanie blizn w tchawicy in vivo.

Wprowadzenie

Zwężenie krtani i tchawicy (LTS) jest patologicznym zwężeniem tchawicy najczęściej spowodowanym jatrogennym urazem po intubacji. Połączenie kolonizacji bakteryjnej, reakcji ciała obcego na tracheostomię lub rurkę dotchawiczą oraz czynników specyficznych dla pacjenta prowadzi do nieprawidłowej odpowiedzi zapalnej. Ta nieadaptacyjna odpowiedź immunologiczna prowadzi do odkładania się kolagenu w tchawicy, co skutkuje zwężeniem światła tchawicy i późniejszym zwężeniem1,2. Ponieważ obecne leczenie tej choroby jest przede wszystkim chirurgiczne, badano opracowanie alternatywnego paradygmatu leczenia opartego na medycynie, ukierunkowanego na nieprawidłowe szlaki zapalne i profibrotyczne, które prowadzą do nadmiernego odkładania się kolagenu. Wykazano, że rapamycyna, która hamuje kompleks sygnałowy mTOR, ma działanie immunosupresyjne, a także silne działanie antyfibroblastowe. Jednakże, gdy rapamycyna jest podawana ogólnoustrojowo, częste działania niepożądane (np. hiperlipidemia, niedokrwistość, małopłytkowość) mogą być wymawiane3. Celem naszej metodologii jest opracowanie nośnika do miejscowego podawania leków, który można by stosować w drogach oddechowych, który zmniejszyłby te skutki ogólnoustrojowe. Nasze oceny koncentrują się na badaniu lokalnej odpowiedzi immunologicznej na konstrukt dostarczający lek, a także jego zdolności do hamowania funkcji fibroblastów i zmiany lokalnego mikrośrodowiska immunologicznego. Wyniki specyficzne dla choroby obejmują testy in vivo, które oceniają markery zwłóknienia.

Biodegradowalne stenty uwalniające leki były używane w zwierzęcych modelach chorób w wielu układach narządów, w tym w drogach oddechowych4. W leczeniu zwężenia dróg oddechowych lub zapadnięcia się, w poprzednich badaniach stosowano stenty silikonowe i niklowe powlekane lekiem5. Do tej konkretnej metody wybrano konstrukt PLLA-PCL ze względu na jego profil elucji leku i wytrzymałość mechaniczną w warunkach fizjologicznych przez okres 3 tygodni, co wykazano w poprzednich opublikowanych badaniach6. PLLA-PCL jest również biokompatybilnym i biodegradowalnym materiałem, który został już zatwierdzony przez FDA4. Biokompatybilne stenty uwalniające cisplatynę i MMC badano na dużych modelach zwierzęcych, takich jak króliki i psy. Jednak w tych modelach zwierzęcych stenty nie zostały umieszczone w zwierzęcym modelu choroby i zostały wszczepione przezszyjkowo. Badanie to zapewnia unikalną metodę oceny biokompatybilnego stentu uwalniającego leki, umieszczonego przezustnie w mysim modelu uszkodzenia dróg oddechowych i zwężenia krtani i tchawicy. Biokompatybilny stent, który wymywa lek immunomodulujący lokalnie i może być miniaturyzowany do badań w modelu mysim, jest cenny dla translacyjnych badań przedklinicznych. Wcześniejsze próby wykorzystania stentu z innymi konstruktami materiałowymi wygenerowały silne reakcje ciał obcych, pogarszając podstawowy stan zapalny, który wyróżnia LTS7. Metodologia ta, zgodnie z naszą wiedzą, jest pierwszą tego rodzaju badaniem immunomodulacyjnych i przeciwfibrotycznych skutków systemu dostarczania leków opartego na stentach w mysim modelu LTS. Sam model mysi oferuje kilka korzyści w badaniu wpływu leku immunomodulującego na tchawicę. Można badać genetycznie zmodyfikowane myszy i eksperymentalne kohorty zdrowych i chorych myszy, co może prowadzić do odtwarzalności eksperymentalnej i poprawić opłacalność. Co więcej, dostarczanie stentu przezustnie do tchawicy myszy naśladuje kliniczne dostarczanie takiego stentu u ludzi, co dodatkowo podkreśla translacyjną przewagę tej metody. Wreszcie, względna łatwość, z jaką można wyprodukować stent PLLA-PCL z lekiem, pozwala na modyfikacje w celu dostarczenia alternatywnych terapii lekowych mających na celu zmniejszenie tworzenia się blizn w tchawicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa (MO12M354).

1. Przygotowanie rapamycyny w PLLA-PCL

  1. Przygotować dwie szklane fiolki (z nakrętkami) roztworów polimerowych PLLA-PCL w proporcji 70:30 (lepkość własna 1,3−1,8 DL/G; Tabela materiałów) roztworów, z jedną fiolką zawierającą 1,0% rapamycyny, a drugą bez rapamycyny.
    1. Przygotować 1,0% roztwór polimeru zawierający rapamycynę, dodając 6 mg rapamycyny do 600 mg PLLA-PCL w proporcji 70:30 w szklanej fiolce.
    2. W przypadku roztworu polimeru bez rapamycyny (kontrola) do szklanej fiolki dodać tylko 600 mg PLLA-PCL w proporcji 70:30.
  2. Pod wyciągiem dodaj 6 ml dichlorometanu do każdej szklanej fiolki.
    UWAGA: Dichlorometan jest materiałem i należy używać wyłącznie szklanych pipet. Odpowiednie środki ostrożności obejmują osobistą ochronę oczu i rękawice.
  3. Dodać 120 μl glicerolu do każdej szklanej fiolki (dla 2% roztworu glicerolu).
    UWAGA: Dodatek glicerolu pozwala na zwiększenie elastyczności i zmniejszenie sztywności konstrukcji stentu.
  4. Ponownie zamknij szklane fiolki i pozwól 70:30 PLLA-PCL z rapamycyną i bez rapamycyny rozpuścić się i homogenizować przez 6−12 h.
    UWAGA: Szklane fiolki można również umieścić na obrotowej platformie wimakującej w celu szybszego rozpuszczenia.

2. Badanie elucji rapamycyny

  1. Odpipetować 1 ml roztworu PLLA-PCL o proporcji 70:30 zawierającego 1% rapamycyny do szklanej szalki Petriego.
    UWAGA: Ta objętość roztworu PLLA-PCL w proporcji 70:30 zawierającego 1% rapamycyny będzie zawierać 120 μg rapamycyny i reprezentuje całkowitą ilość rapamycyny w każdym konstrukcie. Można stosować alternatywne objętości i stężenia.
  2. Odczekać, aby PLLA-PCL w proporcji 70:30 z 1% rapamycyną stwardniał w płaski krążek na szklanej szalce Petriego.
  3. Po stwardnieniu umieścić krążek w 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) i inkubować w komorze o temperaturze 37 °C.
  4. Zbierać i wymieniać PBS (2 ml) co 24 godziny i używać zebranych PBS do analizy zawartości rapamycyny metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
  5. Użyj automatycznego podajnika próbek i kolumny HPLC C18 o wymiarach 4,6 cm x 250 mm, aby przepuścić próbki przez wtryskiwacz automatycznego podajnika próbek wraz z seryjnymi rozcieńczeniami rapamycyny w celu utworzenia skalibrowanej krzywej wzorcowej. Uruchom każdą próbkę w trzech egzemplarzach.
    UWAGA: Seryjne rozcieńczenia rapamycyny, które mają być badane, obejmują 10%, 1%, 0,1% i 0,01%.
  6. Użyć ruchomej fazy wody klasy HPLC i acetonitrylu o objętości 10/90 i natężeniu przepływu 2,0 ml/min. Ustawić absorbancję podczas HPLC dla rapamycyny na 280 nm.
    UWAGA: Rysunek 1 pokazuje elucję rapamycyny w okresie 14 dni.

3. Tworzenie mysich stentów do dróg oddechowych PLLA-PCL uwalniających rapamycynę

UWAGA: Wykonaj kroki 3.2−3.9 używając sterylnych materiałów i sterylnej techniki, aby uniknąć zanieczyszczenia, które mogłoby wpłynąć na aplikacje in vivo i in vitro.

  1. Przygotować roztwory PLLA-PCL zawierające rapamycynę zgodnie z opisem w punkcie 1.
  2. Za pomocą szklanej pipety Pasteura z gumowym balonem nanieść 1 ml roztworu PLLA-PCL zawierającego 1% rapamycyny na kaniulę żylną 22 g angiocewnika na bazie fluorowanego etylenu propylenu (tabela materiałów). Trzymaj angiocewnik w jednej ręce i użyj szklanej pipety, aby wrzucić roztwór PLLA-PCL na angiocewnik. Powoli obracaj angiocewnik, aby zapewnić jednorodne pokrycie angiocewnika roztworem PLLA-PCL.
    UWAGA: Na początku roztwór PLLA-PCL będzie rzadki, ale w miarę jak dichlorometan odparowuje podczas aplikacji na angiocewnik, roztwór stanie się bardziej lepki, aby uformować się na angiocewniku. Korzystne jest ciągłe obracanie angiocewnika podczas aplikacji. Ten krok należy wykonywać powoli i skrupulatnie, aby zapewnić stałą grubość stentu.
  3. Oprzyj uformowany angiocewnik tak, aby końcówka angiocewnika była skierowana w dół, a rękojeść opierała się o krawędź szklanej szalki Petriego w celu wysuszenia.
  4. Pozostaw stenty do wyschnięcia na 24 godziny w okapie próżniowym w temperaturze pokojowej (Rysunek 2A).
  5. Usuń konstrukcję stentu z leżącego pod spodem angiocewnika, delikatnie przekręcając cewnik znajdujący się pod spodem i wysuwając go z uformowanego stentu (Rysunek 2B).
  6. Sprawdź stent obwodowo pod kątem wad, które mogły powstać podczas procesu odlewania. Jeśli występuje wada w stencie gipsowym, należy go wyrzucić.
  7. Przytnij każdy koniec odlewanego stentu cienkimi prostymi nożyczkami, tak aby krawędzie były osiowe.
  8. Za pomocą cienkich prostych nożyczek wytnij 3 mm osiowe segmenty odlewanego stentu do użycia w mysim modelu LTS ( Rysunek 2C).
    UWAGA: Z jednego odlewanego angiocewnika można wykonać około 8 stentów, przy czym każdy stent 3 mm zawiera 120 μg rapamycyny.
  9. Załadować stent 3 mm do nowego cewnika żylnego 22 do użycia w mysim modelu LTS (Rysunek 1).

4. Indukcja zwężenia krtani i tchawicy u myszy

  1. Przed przeprowadzeniem badań in vivo na myszach należy uzyskać zgodę Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania.
  2. Znieczulić 9-tygodniowego samca C57BL/6, podając dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (80-100 mg/kg) i ksylazyny (5-10 mg/kg).
    UWAGA: Inne szczepy myszy można zastąpić, ale zaleca się, aby waga myszy mieściła się w przedziale 20-27 g.
  3. Losowo podziel myszy na grupę eksperymentalną (uraz chemomechaniczny z umieszczeniem 1% stentu PLLA-PCL zawierającego rapamycynę) i dwie grupy kontrolne: 1) uraz chemomechaniczny z umieszczeniem stentu PLLA-PCL, 2) uraz chemomechaniczny bez umieszczenia stentu.
  4. Umieść mysz na platformie operacyjnej w pozycji leżącej. Użyj małej pętli nici przymocowanej do górnej części platformy, aby przedłużyć kręgosłup szyjny, owijając go wokół centralnych siekaczy.
  5. Przymocuj ręce i nogi myszy do stołu za pomocą 2-calowych kawałków taśmy. Uszczypnij łapę myszy, aby upewnić się, że została odpowiednio znieczulona.
  6. Następnie przygotowuje się miejsce operacji. Pokrywającą ją sierść należy usunąć i oczyścić skórę (naprzemiennie peeling jodem lub chlorheksydyną z alkoholem lub rozcieńczonym środkiem do dezynfekcji skóry) trzy razy. Obszar ten należy udrapować i nosić sterylne rękawice. Wysterylizowane narzędzia należy kłaść na sterylnej powierzchni, gdy nie są używane.
  7. Wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej o długości 1,5 cm na szyi myszy za pomocą cienkich zakrzywionych nożyczek do tęczówki. Podziel leżącą na wierzchu grasicę i zlateralizuj dwa powstałe płaty, aby uwidocznić tchawicę. Podziel leżące na wierzchu mięśnie mostkowo-gnykowe i mostkowo-tarczycowe (pasek) na górnym przyczepie obustronnie.
    UWAGA: Po tym całym kompleksie krtaniowo-tchawiczym należy całkowicie odsłonić.
  8. Przepuścić angiocewnik 22 G przezustnie przez krtań do tchawicy. Użyj małych kleszczy, aby wywrzeć nacisk na przednią krtań myszy, aby pomóc w prawidłowym umieszczeniu cewnika naczyniochłonnego. Uwidocznij biały angiocewnik przez tchawicę, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie (bez przełyku).
    UWAGA: Tchawica myszy jest niezwykle cienka, a biały angiocewnik będzie uwidoczniony przez półprzezroczystą tchawicę.
  9. Przełóż szczotkę drucianą pokrytą bleomycyną przez wprowadzony angiocewnik.
  10. Powoli wycofaj angiocewnik, tak aby w tchawicy pozostała tylko szczotka druciana.
  11. Zastosuj przeciwnacisk za pomocą drobnych kleszczyków do tchawicy, aby mechanicznie zakłócić światło tchawicy za pomocą szczotki drucianej.
  12. Ponownie włóż angiocewnik do tchawicy przez szczotkę drucianą.
  13. Wyjmij szczotkę drucianą i ponownie nałóż bleomycynę.
  14. Powtórz kroki 4.8−4.12 w sumie 5x. Nałóż bleomycynę na pędzel między każdą aplikacją.
    UWAGA: Walidację i opis tego modelu można znaleźć w Hillel et al.8.
  15. Usuń angiocewnik z tchawicy myszy.
    UWAGA: Jeśli nie ma potrzeby umieszczania stentu, nacięcie można zamknąć klejem tkankowym.

5. Przezustne umieszczanie stentu PLLA-PCL u myszy

  1. Załaduj jeden stent odlewany 3 mm na pusty angiocewnik 22 G (Rysunek 3A).
    UWAGA: Stent powinien spoczywać 5 mm od końcówki cewnika naczyniogrobowego.
  2. Narysuj cienką czarną pionową linię na stencie odlewanym 3 mm.
    UWAGA: Linia ta pozwala na lepszą wizualizację stentu w tchawicy.
  3. Przezustnie zaintubować mysz za pomocą angiocewnika, który został wstępnie załadowany stentem.
  4. Wizualizacja stentu na angiocewniku w tchawicy przez nacięcie przezszyjkowe (Rysunek 3B).
    UWAGA: Tchawica jest bardzo cienka, co pozwala na uwidocznienie czarnego barwnika na stencie przez tchawicę. Użyj tego, aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie tchawicy.
  5. Przytrzymaj stent na miejscu, chwytając tchawicę przez nacięcie przezszyjkowe cienkimi kleszkami.
  6. Usunąć angiocewnik przezustnie, utrzymując uchwyt stentu za pomocą cienkich kleszczyków.
    UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby nie przykładać zbyt dużej siły do stentu, aby nie zmiażdżyć światła podczas usuwania angiocewnika. Jednak wymagana jest wystarczająca siła, aby stent nie został usunięty za pomocą angiocewnika. Sialendoskop 0,8 mm może być użyty do wizualizacji lokalizacji i umiejscowienia stentu w tchawicy.
  7. Zamknij nacięcie przezszyjkowe klejem tkankowym.
  8. Pozwól każdej myszy powrócić do pierwotnego poziomu aktywności przed umieszczeniem jej z powrotem w klatce.

6. Przygotowanie histologiczne próbek

  1. Znieczulenie myszy za pomocą wziewnego środka znieczulającego i poświęcenie myszy ze zwichnięciem szyjki macicy zgodnie z protokołem zwierzęcym po 7, 14 lub 21 dniach.
    UWAGA: W zależności od przewlekłości badania można zastosować różne przedziały czasowe (np. 28, 30 dni itp.).
  2. Umieść mysz na platformie chirurgicznej zgodnie z opisem w krokach 4.4 i 4.5.
  3. Ponownie otwórz nacięcie szyi myszy za pomocą cienkich zakrzywionych nożyczek do tęczówki.
  4. Odsłonić tchawicę zgodnie z krokiem 4.6.
  5. Podziel dystalną tchawicę poniżej poziomu stentu za pomocą cienkich zakrzywionych nożyczek do tęczówki.
  6. Podziel proksymalną tchawicę poniżej krtani i powyżej stentu za pomocą drobno zakrzywionych nożyczek do tęczówki.
    UWAGA: Ważne jest, aby najpierw podzielić dystalną tchawicę, aby zapobiec cofaniu się tchawicy do klatki piersiowej.
  7. Oddziel podzieloną tchawicę od przełyku z tyłu i usuń tchawicę od myszy.
    UWAGA: Stenty będą nadal zatrzymywane w tchawicy myszy.
  8. Usunąć stent z tchawicy i utrwalić w 10% formalinie przez 24 godziny.
  9. Zanurz próbki tchawicy myszy utrwalone w formalinie w parafinie z dystalnym końcem zorientowanym wyżej, tak aby w następnym kroku można było wykonać osiowe nacięcia tchawicy.
  10. Wytnij 5 μm odcinki tchawicy myszy zatopionej w parafinie za pomocą mikrotomu.
    UWAGA: Próbki należy ciąć osiowo, zaczynając od dystalnej tchawicy.
  11. Uzyskać reprezentatywny przekrój o wielkości 5 μm co 250 μm wzdłuż długości próbki.
  12. Kompletna plama H&E na każdej reprezentatywnej sekcji.
    1. Odparafinować szkiełka, umieszczając je w ksylenie 2x na szkiełko na 3 min.
    2. Umieść szkiełka w 100% etanolu na 2 minuty, 95% etanolu na 2 minuty i 70% etanolu na 2 minuty w celu ponownego nawodnienia.
    3. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty.
    4. Barwić szkiełka w hematoksylinie przez 3−5 min.
    5. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.
    6. Umieść szkiełka w 1% kwaśnym alkoholu na 1 minutę.
    7. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 1 minutę.
    8. Płukać w 0,2% wodzie amoniakalnej przez 30 s.
    9. Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Zanurz 10x w 95% etanolu.
    10. Barwienie eozyny poprzez umieszczenie szkiełka we floksynie eozyny na 30 s.
    11. Odwodnić szkiełka, umieszczając je w 95% etanolu na 5 minut, a następnie w etanolu absolutnym 2x na 5 minut.
    12. Umieść w ksylenie 2x na 5 min.
    13. Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu.
  13. Zmierz grubość blaszki właściwej zgodnie z opisem w Hillel et al.8.

7. Biokompatybilność stentów in vivo

  1. Przygotować skrawki tkanek jak w krokach 6.1−6.4. Nie należy usuwać stentu z tych odcinków tchawicy w celu uwidocznienia zmian w stanie zapalnym w stosunku do lokalizacji stentu w świetle tchawicy.
    1. Aby określić ostrą odpowiedź ciała obcego na stent, obserwuj aktywność makrofagów i limfocytów T za pomocą markerów CD3 i F4/80.
      UWAGA: Inne markery mogą być również używane do określenia ostrej reakcji zapalnej na stent.
    2. Uzyskać 5 μm wyciętych odcinków tchawicy zatopionej w parafinie na dostępnych na rynku szkiełkach hydrofilowych plus (tabela materiałów). Umieść dwie sekcje na każdym slajdzie.
      UWAGA: Te odcinki powinny pochodzić z obszaru tchawicy, w którym umieszczono stent PLLA-PCL.
  2. Umieść szkiełka w ksylenie 2x na 5 minut każda.
  3. Umieść szkiełka w 100% etanolu 2x na 3 minuty każde.
  4. Umieść szkiełka w 95% etanolu na 1 minutę.
  5. Umieścić szkiełka w stojaku do barwienia histologicznego tak, aby były zanurzone w buforze do pobierania antygenu (tabela materiałów), a następnie umieścić w parowarze do warzyw z wrzącą wodą na 20 minut.
  6. Wyjmij stojaki do barwienia z naczynia do gotowania na parze i wyrzuć bufor do odzyskiwania antygenu.
  7. Zastąp bufor 1 ml PBS.
  8. Umieść szkiełka w mokrym pudełku do barwienia na 1 minutę.
  9. Wyrzuć PBS i inkubuj szkiełka ze zmodyfikowanym podłożem orła (DMEM) firmy Dulbecco z 10% FBS przez 30 minut.
  10. Odrzuć DMEM i dodaj mieszaninę dwóch pierwszorzędowych przeciwciał wyhodowanych u różnych gatunków. Przykryć szkiełka folią parafinową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w ciemnym pomieszczeniu.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano królicze anty-CD3 i szczurze anty-F4/80 (Tabela Materiałów).
  11. Myj szkiełka w PBS 3x przez 5 minut.
  12. Inkubować szkiełka z przeciwciałami drugorzędowymi specyficznymi dla pierwszorzędowych gatunków przeciwciał (tabela materiałów) rozcieńczonymi w DMEM z 10% FBS przez 0,5-1 h w temperaturze pokojowej w ciemności.
  13. Myj szkiełka w PBS 3x przez 5 minut w ciemności.
  14. Zamontuj szkiełka na szkiełkach nakrywkowych z kroplą podłoża montażowego z 4'6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). Przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze 20 °C lub 4 °C.
  15. Obserwuj zabarwione szkiełka na laserowym mikroskopie konfokalnym i sfotografuj.
  16. Określ ilościowo całkowitą liczbę komórek barwionych DAPI i przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania w celu porównania z nieuszkodzoną tchawicą.

8. Ilościowa analiza ekspresji genów tchawicy myszy

  1. Zbierz tchawicę myszy zgodnie z opisem w krokach 6.1−6.7 i usuń stent.
    UWAGA: Zebrane tchawice myszy można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez okres do 2 lat.
  2. Wysuszyć tkankę tchawicy pobraną w kroku 8.1 za pomocą drobnych nożyczek i dalej homogenizować za pomocą homogenizatora perełkowego z kulkami ceramicznymi o średnicy 1,4 mm (tabela materiałów) jako część dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji RNA opartego na kolumnie (tabela materiałów).
    UWAGA: Ustawienia homogenizatora młynka perełkowego = jeden cykl 40 s przy 6 m/s.
  3. Wyekstrahuj RNA z lizatu tchawicy za pomocą kolumnowego zestawu do ekstrakcji i oczyszczania (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Określić ilościowo RNA z każdej próbki za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
    UWAGA: Czystość RNA ocenia się przy użyciu stosunku 260/230 nm przy odczycie próbki czystego RNA 2,0.
  5. Stwórz komplementarne DNA z wyekstrahowanego RNA za pomocą odwrotnej transkryptazy (tabela materiałów) i termocyklera z następującymi ustawieniami: 5 min w temperaturze 25 °C (gruntowanie), 46 °C przez 30 min (odwrotna transkrypcja), a następnie 95 °C przez 1 min (inaktywacja odwrotnej transkryptazy).
  6. Rozcieńczyć komplementarne próbki DNA wodą wolną od RNaz do stężenia 10-25 ng / ml do stosowania w ilościowym PCR w czasie rzeczywistym.
  7. Wymieszać 1 μl komplementarnego DNA (10−25 ng / ml) z 10 μl mastermixu PCR (tabela materiałów), 8 μl ddH2O i 0,5 μl starterów 10 μM do przodu i do tyłu dla interesującego genu w jednym dołku 96-dołkowej płytki PCR (tabela materiałów).
    UWAGA: Całkowita objętość w każdej studzience powinna wynosić 20 μl. Każda studzienka na płytce 96-dołkowej powinna zawierać tylko jedną próbkę i jeden gen będący przedmiotem zainteresowania.
  8. Powtórz kroki 8.1–8.7 dla wszystkich genów będących przedmiotem zainteresowania i uruchom każdą próbkę dla każdego genu w trzech egzemplarzach.
    UWAGA: Specyficzne dla genu startery do przodu i do tyłu (tabela materiałów) dla kolagenu 1, kolagenu 3 i genu referencyjnego β-aktyny są powszechnie stosowane do badania markerów zwłóknienia.
  9. Umieścić 96-dołkową płytkę na ilościowej maszynie do PCR w czasie rzeczywistym i zainicjować następujący protokół: denaturacja w temperaturze 95 °C przez 15 s i wyżarzanie oraz rozciąganie w temperaturze 60 °C przez 60 s przez 40 cykli.
  10. Znormalizować wartość progową cyklu (CT) dla wykrywania produktu genu dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI) do wartości CT dla genu odniesienia β-aktyny dla wszystkich próbek, aby uzyskać ΔCT dla każdego GOI. Następnie porównaj wartości ΔCT dla każdego rządu Indonezji dla próbek poddanych działaniu środka i niepoddanych działaniu środka, aby wygenerować ΔΔCT.
    UWAGA: Próg cyklu to punkt na krzywej amplifikacji, w którym obecna jest z góry określona ilość produktu genu (ΔRn). Wartość ΔRn dla każdej reakcji powinna być określona dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania i powinna przypadać na liniową część krzywej amplifikacji.
    UWAGA: ΔCT = CT (GOI) – CT (gen referencyjny); ΔΔCT = ΔCT (poddane obróbce) – ΔCT (niepoddane obróbce).
  11. Obliczyć względną zmianę ekspresji genów między próbkami poddanymi działaniu substancji i niepoddanymi działaniu substancji jako wyrażenie zmiany krotności, obliczając 2ΔΔCT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Biodegradowalny stento-konstrukt PLLA-PCL załadowany rapamycyną, wykorzystany w niniejszym badaniu, był zdolny do uwalniania rapamycyny w sposób stały i przewidywalny w warunkach fizjologicznych (Rysunek 1). Rysunek 2 przedstawia stent PLLA-PCL odlewany wokół cewnika angiograficznego 2 G do zastosowania w mysim modelu LTS. Aby ustalić, czy efekty uwalniania rapamycyny w tchawicy są skuteczne w łagodzeniu włóknienia, zmierzone zmiany w ekspresji genów związanych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najbardziej krytycznymi etapami pomyślnego skonstruowania i użycia stentu uwalniającego lek in vivo są: 1) określenie optymalnego stosunku PLLA-PCL dla pożądanej szybkości elucji leku, 2) określenie odpowiedniego stężenia leku do elucji, 3) formowanie stentów wokół angiocewnika do stosowania in vivo oraz 4) transustne dostarczenie stentu myszom po indukcji LTS bez powodowania śmiertelnej niedrożności dróg oddechowych.

Chociaż istnieje kilka metod dostarczania leków za pomocą stentów w zwierzęc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

National Institute on Deafness and Other Communication Disorders of the National Institutes of Health pod numerami nagród 1K23DC014082 i 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Badanie to było również wspierane finansowo przez Towarzystwo Trilogiczne i American College of Surgeons (Alexander Hillel), Fundację Amerykańskiego Towarzystwa Medycznego w Chicago, Illinois (Madhavi Duvvuri) oraz grant szkoleniowy T32 NIDCD (Kevin Motz).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Do stentu
22Jelco4050
DichlorometanSigma Aldrich270997-100ML
GlicerolFisher Scientific56-81-5Dostępne również u innych dostawców.
PDLGASigma Aldrich739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30)Evonik Industries AG65053
RapamycinLC LaboratoriesR-5000
2. Chirurgia zwierząt
szczotka drucianaMill-Rose Company320101
3. Do barwienia immunohistochemicznego
Antigen retrival bufferAbcamab93678Dostępne również u innych dostawców; potrzebne kwaśne pH
DAPICell Signaling8961S
DMEMThermoFisher Scientific11965-092Dostępne również u innych dostawców.
FBS (Surowica bydlęca płodu)MilliporeSigmaF4135-500ML
Przeciwciało przeciw królikowi-488 Kozie przeciwciałoTechnologia Lifa11008
Przeciwciało przeciw szczurom-633 Kozie TechnologiaLifa21094
Szkiełko hydrofilowe plusBSB7028
PBSThermoFisher Scientific100-10023Dostępne również u innych dostawców.
Królicze przeciwciało anty-CD3Abcamab5690
Szczurze przeciwciało antyF4/80Biolengend123101
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 MetaZeiss
4. Do ilościowego PCR
0,5 mm kulek szklanychOMNI International19-645
Homoginizator młyna perełkowegoOMNI International
Startery do przodu / do tyłu specyficzne dla genówZasoby genomiczne Core Facility
Spektrofotometr Nanodrop 2000Thermo Scientific
Power SYBR Green MastermixLife Technologies4367659
RNeasy mini zestawQiagen80404
System StepOnePlus Real Time PCRLife Technologies
cewnika o rozmiarze

Bibliografia

  1. Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
  2. Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
  3. Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
  4. Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14(2017).
  5. Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
  6. Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
  7. Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
  8. Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
  9. Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
  10. Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
  11. Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10(2015).
  12. Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

stent uwalniający lekpolimer PLLA-PCLuwalnianie rapamycynyintubacja przezustnamodel uszkodzenia tchawicybadanie biokompatybilnościanaliza cytometrycznabarwienie immunohistochemicznemysi model dróg oddechowych
Projekt biokompatybilnego stentu tchawicy uwalniającego leki u myszy ze zwężeniem krtani i tchawicy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.