Hodowla agregatów dojrzałych adipocytów błonowych (MAAC) to nowa metoda hodowli dojrzałych ludzkich adipocytów. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wyizolować adipocyty z ludzkiej tkanki tłuszczowej i jak skonfigurować MAAC.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla dojrzałych adipocytów ludzkich przy użyciu błonowych dojrzałych kultur zagregowanych adipocytów (MAAC)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozregulowanie białej tkanki tłuszczowej (WAT) odgrywa kluczową rolę w rozwoju insulinooporności i cukrzycy typu 2 (T2D). Aby opracować nowe metody leczenia cukrzycy typu 2, potrzebne są bardziej fizjologicznie istotne modele adipocytów in vitro. Badanie to opisuje nową technikę izolowania i hodowli dojrzałych ludzkich adipocytów. Metoda ta nosi nazwę MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture) i w porównaniu z innymi modelami adipocytów in vitro, MAAC posiada adipogenną sygnaturę genową, która jest najbardziej zbliżona do świeżo wyizolowanych dojrzałych adipocytów. Za pomocą MAAC adipocyty mogą być hodowane od pacjentów szczupłych i otyłych, różnych magazynów tłuszczowych, współhodowanych z różnymi typami komórek i, co ważne, mogą być trzymane w hodowli przez 2 tygodnie. Można również przeprowadzać eksperymenty funkcjonalne dotyczące MAAC, w tym wychwyt glukozy, lipogenezę i lipolizę. Co więcej, MAAC silnie reaguje na różnorodny agonizm farmakologiczny i może być stosowany do badania zmian fenotypowych adipocytów, w tym transróżnicowania białych adipocytów do brązowych komórek tłuszczowych.
Wprowadzenie
Światowy wzrost otyłości i chorób współistniejących związanych z otyłością wymaga opracowania nowych metod leczenia. Biała tkanka tłuszczowa (WAT) jest ważnym regulatorem metabolizmu całego organizmu, homeostazy energetycznej i odgrywa kluczową rolę w rozwoju insulinooporności i cukrzycy typu 2 (T2D)1,2. Podczas przewlekłego nadmiernego spożycia kalorii adipocyty powiększają się, aby poradzić sobie z nadwyżką energii. Jednak zdolność magazynowania lipidów adipocytów może zostać przekroczona, co skutkuje podniesieniem poziomu krążących kwasów tłuszczowych i zwiększonym magazynowaniem w obwodowych tkankach nietłuszczowych oraz prowadzi do lipotoksyczności3,4.
Brak modeli adipocytów in vitro o dużym znaczeniu translacyjnym jest kluczowym wyzwaniem w rozwoju nowych metod leczenia otyłości i cukrzycy typu 2. Model eksplantatu ex vivo, w którym hoduje się małe fragmenty tkanki tłuszczowej, wiąże się z szybkimi zmianami w ekspresji genów adipogennych napędzanymi przez niedotlenienie i stan zapalny5,6. Hodowle sufitowe (CC), w których dojrzałe adipocyty unoszą się na wodzie i przylegają do górnej części kolb wypełnionych pożywką, szybko różnicują się w komórki podobne do fibroblastów pozbawione lipidów7,8,9,10. Najczęściej stosowanym modelem są adipocyty różnicowane in vitro od zaangażowanych prekursorów. Zróżnicowane komórki różnią się jednak morfologicznie od dojrzałych adipocytów in vivo, ponieważ są znacznie mniejsze i nie mają jednolokowej kropelki lipidowej. Inne ograniczenia tego modelu obejmują niefizjologiczną potrzebę koktajlu chemicznego do napędzania różnicowania, a także zmienność skuteczności różnicowania, na którą może wpływać wiele czynników11,12,13,14.
Niedawno opracowaliśmy hodowlę zbiorczą dojrzałych adipocytów błonowych (MAAC), metodę długoterminowej hodowli świeżo wyizolowanych dojrzałych adipocytów, gdzie adipocyty są hodowane pod przepuszczalnymi błonami10. Bezstronna analiza danych sekwencjonowania RNA wykazała, że w porównaniu z eksplantatami tkanki tłuszczowej i adipocytami różnicowanymi in vitro, MAAC jest najbardziej podobny do świeżo wyizolowanych adipocytów. MAAC może być stosowany do hodowli dojrzałych adipocytów wyizolowanych zarówno z podskórnej, jak i trzewnej tkanki tłuszczowej, a także adipocytów zarówno od osób otyłych, jak i szczupłych. Metodologia ta pozwala na badanie długoterminowych zmian fenotypowych adipocytów i ułatwia kohodowlę adipocytów z innymi typami komórek. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji dojrzałych adipocytów z ludzkiej tkanki tłuszczowej oraz sposób konfiguracji systemu MAAC.
Protokół
Anonimowe próbki tkanki tłuszczowej zostały pobrane z okolic brzucha pacjentek poddawanych planowym operacjom w Szpitalu Uniwersyteckim Sahlgrenska w Göteborgu, Szwecja. Wszyscy uczestnicy badania otrzymali pisemne i ustne informacje przed wyrażeniem pisemnej świadomej zgody na wykorzystanie tkanki. Badania zostały zatwierdzone przez Regionalną Komisję ds. Oceny Etycznej w Göteborgu w Szwecji.
UWAGA: Przegląd metody znajduje się w Rysunek 1.
1. Przygotowanie, pożywek do hodowli tkankowych i płytek hodowlanych
- Przygotuj 5x bulion Krébbs Ringer (KR), rozpuszczając 35,1 g NaCl, 1,75 g KCl, 0,82 g KH2PO4 i 1,48 g MgSO4·7H2O w 900 ml wody. Dodać 1,84 g CaCl2·2H2O i dostosować objętość do 1 l, dodając wodę. Sterylny filtr przepuścić przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Z zapasu 5x KR przygotować 1 l buforu zawierającego 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM glukozy i 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (zwanej dalej buforem do przemywania ). Dostosować pH do 7,4.
- Przygotować 500 ml buforu kolagenazy zawierającego 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2, 2% BSA i 450 ml wody (zwanej dalej buforem wytrawiającym).
UWAGA: Kolagenazy nie należy dodawać do buforu trawiennego, dopóki tkanka tłuszczowa nie zostanie zważona w kroku 2.2. - Dostosuj pH pożywki 199 do 7,4.
- Sterylne przefiltrować zarówno, jak i pożywkę 199 przez kolbę filtracyjną 0,22 μm i ogrzać do 37 °C.
UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, pożywki do hodowli tkankowych można przygotować i dodać do płytek przed obróbką tkanki tłuszczowej. W przypadku formatu płytki 24-dołkowej (Rysunek 1A), użyj 0,5−1 ml / studzienkę zmodyfikowanej mieszanki składników odżywczych Eagle's Medium / Ham's F12 firmy Dulbecco (DMEM/F12), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny-streptomycyny (penn/strep) i 20 nM insuliny. W tym czasie do pożywek można również dodawać małe cząsteczki i inne stabilne środki farmakologiczne w pożądanym układzie. Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ).
2. Sekcja ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej
UWAGA: Pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego i używaj sterylnej techniki podczas całego procesu izolacji, a także wyłącznego korzystania z autoklawowanego i sterylnego sprzętu.
- Umieść ludzką tkankę tłuszczową na szalce Petriego o średnicy 15 cm i dodaj niewielką objętość pożywki 199, aby utrzymać jej nawilżenie podczas sekcji.
- Pracując z kawałkami tłuszczu wielkości mniej więcej piłki golfowej, chwyć pęsetą duże zwłókniałe naczynia krwionośne i delikatnie uwolnij adipocyty, zeskrobując tłuszcz grzbietem zamkniętych nożyczek. Wyrzuć duże kawałki tkanki zwłóknieniowej. Zważ przycięty tłuszcz.
3. Leczenie kolagenazą
- Dodać kolagenazę do buforu wytrawiającego (patrz krok 1.3) w stężeniu 1 mg/ml. Sterylny przefiltrować roztwór za pomocą sterylnego filtra 0,22 μm.
UWAGA: Zalecane są trzy ml buforu trawiennego na gram tłuszczu (tj. na 100 g tłuszczu przygotuj 300 ml buforu trawiennego z 300 mg kolagenazy typu 2).
UWAGA: Kolagenaza typu 2 jest niebezpieczna dla oczu, skóry i może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Podczas obchodzenia się z kolagenazą należy nosić rękawice, okulary ochronne i pracować w wentylowanym kapturze. - Przenieś około 10 g tkanki tłuszczowej na 15-centymetrową szalkę Petriego i ostrożnie zmiel tłuszcz za pomocą zakrzywionych nożyczek, aż stanie się gładką, jednorodną mieszanką i nie pozostaną żadne duże kawałki tłuszczu. Powtarzaj proces, aż cały tłuszcz zostanie przetworzony.
UWAGA: Każda runda powinna trwać około 2 minut, a kawałki tłuszczu powinny być na tyle małe, aby można je było pipetować za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości adipocytów. Jeśli kawałki są zbyt duże, czas trawienia będzie musiał się wydłużyć, co pogorszy elastyczność komórek. - Przenieś zmielony tłuszcz do stożkowych probówek o pojemności 50 ml za pomocą łyżki. Do każdej probówki dodać 10 ml tkanki mielonej i 30 ml buforu wytrawiającego. Zmniejsz do odpowiednich objętości, jeśli dostępnych jest mniej niż 10 ml tłuszczu mielonego.
- Trawić tkankę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem ze stałym mieszaniem przy 150 obr./min przez 30−45 min. Po 30 minutach sprawdzaj proces co 5 minut, aby uniknąć nadmiernego trawienia.
UWAGA: Trawienie jest całkowite, gdy roztwór tłuszczu jest jednorodny, bez dużych kawałków i ma morelowy kolor.
4. Filtracja zawiesiny komórek i oczyszczanie dojrzałych adipocytów
- Umieść lejek na sterylnej kolbie o pojemności 1 l i umieść sterylny filtr siatkowy 250 μm wewnątrz lejka. Wlej roztwór strawionego tłuszczu do filtra, aby usunąć niestrawioną tkankę.
- Gdy cała zawiesina adipocytów przejdzie przez filtr, delikatnie ściśnij filtr siatkowy, aby zwiększyć wydajność adipocytów. Wlej około 50-100 ml buforu do płukania do filtra, aby go przepłukać i ponownie wycisnąć filtr.
- Wlać wyizolowaną zawiesinę adipocytów z kolby do rozdzielacza i dodawać bufor do przemywania aż do prawie całkowitego napełnienia lejka. Delikatnie odwróć lejek kilka razy, aby wymieszać zawiesinę adipocytów z buforem.
- Pozostaw zawiesinę na 2-3 minuty, aż nastąpi wyraźne oddzielenie 2 warstw (Rysunek 1B), z górną żółtą warstwą zawierającą dojrzałe adipocyty i wolny lipid oraz dolną warstwą zawierającą bufor i frakcję naczyniową zrębu tłuszczowego (SVF).
- Otwórz dyszę na lejku rozdzielającym i powoli eluuj dolny roztwór do sterylnej kolby (komórki z SVF można granulować i zbierać po odwirowaniu w ilości 200 x g przez 7 minut). Utrzymuj górną warstwę z dojrzałymi adipocytami w lejku separacyjnym .
- Powtórz proces mycia w krokach 4.3−4.5 trzy razy, aby dokładnie umyć dojrzałe adipocyty i usunąć całą kolagenazę.
5. Pakowanie dojrzałych adipocytów
- Otwórz dyszę i zbierz oczyszczoną zawiesinę dojrzałych adipocytów do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
- Lekko upakować dojrzałe adipocyty, obracając probówki o masie 50 x g przez 3 minuty.
- Za pomocą igły 18 G i strzykawki usunąć pozostały bufor do przemywania znajdujący się poniżej zawiesiny adipocytów.
- Za pomocą pipety usunąć wolną warstwę lipidową (olej z małej części adipocytów, która pękła podczas procedury izolacji) unoszącą się na wierzchu dojrzałych adipocytów.
UWAGA: Aby zmniejszyć ryzyko, że adipocyty będą kapać z błon w kroku 6.5, ważne jest, aby warstwa lipidowa i cały bufor płuczący zostały usunięte, gdy dojrzałe adipocyty są wysiewane na błony. Z tego powodu zbierz adipocyty w 3 probówkach. Próbki, które są pobierane jako ostatnie, będą zawierały najwięcej przenoszonych lipidów i dlatego będą najniższej jakości. Jednak przy starannym pipetowaniu można użyć tych próbek.
6. Wysiewanie dojrzałych adipocytów
- Otwórz opakowanie zawierające przepuszczalne wkłady membranowe (tabela materiałów) i wyjmij element membrany. Odwróć go do góry nogami i umieść na sterylnej powierzchni tak, aby membrany były skierowane w stronę sufitu.
- Odpipetować 30 μl upakowanych dojrzałych adipocytów na każdą z błon (Rysunek 1C). Unikaj dotykania membrany końcówką. Użyj końcówek do pipet o szerokim otworze, aby wysiać komórki, lub użyj nożyczek, aby odciąć mały kawałek końcówki pipety, aby ją poszerzyć.
- Delikatnie odwróć probówki o pojemności 50 ml z upakowanymi adipocytami kilka razy podczas procesu wysiewu, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie adipocytów o różnych rozmiarach.
- Przenieść przygotowane płytki wielodołkowe zawierające pożywkę z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i zdjąć pokrywki. Podnieś błony obsiane adipocytami i chwyć je od dołu, aby można je było odwrócić w kroku 6.5.
- Jednym płynnym ruchem odwróć błony z adipocytami na górze, tak aby adipocyty z nasionami były teraz skierowane w dół (Rysunek 1D). Opuść płytkę z adipocytami do studzienek zawierających pożywkę (Rysunek 1E).
- Przykryj płytkę pokrywką i ostrożnie przenieś ją do inkubatora do hodowli tkankowych. Unikaj gwałtownego ruchu płytki, ponieważ adipocyty mogą początkowo łatwo się przemieścić.
UWAGA: Potrzeba kilku dni, aby komórki mocniej przylegały do błony.
7. Utrzymanie adipocytów i pobieranie do analizy
- Zmieniaj nośnik co najmniej co 7 dni. Wyjmij i dodaj nośnik przez otwór wycięty w każdej wkładce membrany. Aby usunąć pożywkę, użyj strzykawki i igły, różdżki zasysającej lub pipety z końcówką p200. Aby dodać pożywkę, użyj pipety i powoli pipetuj nowe media do studzienek wzdłuż ściany, aby uniknąć zakłócenia adipocytów.
UWAGA: Adipocyty hodowano przez 2 tygodnie z jedną zmianą pożywki po 7 dniach. Jednak różne pochodzenie tkanki tłuszczowej i pytania eksperymentalne mogą skorzystać na zwiększonych zmianach w mediach. - Aby zebrać RNA, usuń pożywkę zgodnie z opisem w kroku 7.1 i dodaj 500 μl buforu do lizy (tabela materiałów) bezpośrednio do studzienek w celu lizy komórek. Aby utrwalić komórki do obrazowania, dodaj formaldehyd bezpośrednio do studzienki w końcowym stężeniu 1%.
UWAGA: Ogniwa można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.
Wyniki
Dojrzałe adipocyty hodowane jako MAAC zachowują swoją funkcję oraz fenotyp i mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi adipocytów na różne zabiegi farmakologiczne. Po 1 tygodniu hodowli MAAC wyizolowane z tkanki tłuszczowej podskórnej zachowują charakterystyczną jednocząsteczkową kroplę lipidową występującą wyłącznie w dojrzałych adipocytach (Rysunek 2A). MAAC hodowano przez 1 tydzień, stosując agonistów PPARγ: rozoglitazon (Rosi) i pioglitazon (Pio) lub agonistę receptora glikokortykoidów (GR) deksametazon (Dex), aby określić, czy różne agoniści jądrowych receptorów hormonów (NHR) wywołują przewidywane zmiany w genach docelowych w MAAC. Rosi i Pio zwiększyły ekspresję genów responsywnych na PPARγ FABP4 oraz LPL odpowiednio 4- oraz 2-3-krotnie, podczas gdy deksametazon nie wywarł żadnego wpływu (Rysunek 2B). Podobnie deksametazon silnie stymulował ekspresję genów docelowych GR APOD oraz FKBP5 odpowiednio 13- i 55-krotnie, podczas gdy agoniści PPARγ nie wykazali istotnego wpływu. Wykazaliśmy wcześniej, że świeżo wyizolowane ludzkie dojrzałe białe adipocyty mogą ulegać transdyferencjacji w fenotyp podobny do brązowego w MAAC po zastosowaniu Rosi10. 7-dniowa terapia Rosi lub Pio silnie indukowała ekspresję genu specyficznego dla brązowej tkanki tłuszczowej UCP1 44-65-krotnie, a także zwiększyła ekspresję markera brązowej tkanki tłuszczowej PDK4 12-18-krotnie (Rysunek 2C).
Rysunek 1: Schemat wizualny układu MAAC. (A) Przygotowanie pożywki. (B) Izolacja i upakowanie dojrzałych adipocytów. (C) Wysiew dojrzałych adipocytów na membrany. (D) Odwrócenie membran przy zachowaniu przylegania adipocytów. (E) Zanurzenie membran w pożywce i wymiana pożywki. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Harms et al.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 2: MAAC zachowują wygląd jednocomórkowy przez tydzień i reagują na różnorodne agonizm farmakologiczne. (A) Reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym przy powiększeniu 4x i 10x MAAC po jednym tygodniu hodowli. Łatwo dostrzegalne są adipocyty o średniej średnicy 100 µm z dużymi, jednocomórkowymi kroplami lipidów. (B) Poziomy mRNA genów docelowych PPARγ oraz genów docelowych receptora glikokortykoidowego (GR) w MAAC po 7 dniach traktowania nośnikiem (Vehc), roziglitazonem (Rosi), pioglitazonem (Pio) lub deksametazonem (Dex). Rosi, Pio i Dex były stosowane w końcowym stężeniu 10 µM. (C) Poziomy mRNA genów wzbogaconych w tkance tłuszczowej brunatnej w MAAC po 7 dniach traktowania nośnikiem (Vehc), roziglitazonem (Rosi), pioglitazonem (Pio) lub deksametazonem (Dex). Rosi, Pio i Dex były stosowane w końcowym stężeniu 10 µM. Dla wszystkich danych dotyczących ekspresji genów, białko wiążące TATA (TBP) służyło jako wewnętrzna kontrola normalizacji. Statystyki obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Tukeya. (średnia ± SD, n = 3, *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Błonowa hodowla zagregowana dojrzałych adipocytów (MAAC) to nowa metoda długotrwałej hodowli świeżo wyizolowanych dojrzałych adipocytów. Podczas tworzenia MAAC istnieje kilka krytycznych kroków w protokole, które mają ogromny wpływ na wydajność, jakość i żywotność dojrzałych adipocytów. Należy włożyć dużo wysiłku w mielenie tłuszczu w kroku 3.2, ponieważ ten krok bezpośrednio wpływa na czas, w którym adipocyty są wystawione na działanie kolagenazy. Jeśli kawałki tłuszczu są zbyt duże, czas trawienia będzie musiał się wydłużyć, co negatywnie wpływa na żywotność komórek. I odwrotnie, jeśli tkanka jest zbyt drobno przetwarzana nożyczkami, może to również wpłynąć na żywotność. Aby pomyślnie wyhodować dojrzałe adipocyty jako MAAC, należy zwrócić szczególną uwagę na następujące kroki: W celu pomyślnego wysiewu adipocytów na błony ważne jest, aby wolny lipid i przeniesiony bufor płuczący zostały usunięte z dojrzałych adipocytów w krokach 5.3 i 5.4. Pozostały lipid lub bufor płuczący zmniejszy napięcie powierzchniowe adipocytów i zwiększy ryzyko kapania adipocytów z błon po ich odwróceniu. Kiedy adipocyty są wysiewane i znajdują się w pożywce, komórki pozostają w kontakcie z błoną głównie dzięki wyporności, dlatego zaleca się powolną i delikatną technikę podczas zmiany pożywki, aby nie stracić komórek. Usuń pożywkę z dna studzienek zgodnie z opisem w kroku 7.1 i dodaj pożywkę, powoli pipetując pożywkę po bokach ścianek. Wreszcie, sugestią oszczędzającą czas jest przygotowanie płytek z pożywką i zabiegami przed procesem izolacji adipocytów. Szczególnie w przypadku złożonych projektów eksperymentalnych wstępne przygotowanie płytek może zaoszczędzić dużo czasu i zapewnia, że adipocyty zostaną umieszczone w pożywce wraz z ich leczeniem, gdy tylko zostaną wyizolowane.
Jedną z zalet stosowania MAAC w porównaniu z różnicowaniem preadipocytów jest to, że stosowane podłoże MAAC jest bardzo proste i nie wymaga niefizjologicznego koktajlu hormonalnego. Tutaj mamy wyhodowany MAAC w pożywkach bogatych w glukozę (DMEM / F12), 10% FBS, 1% penn / paciorkowca i 20 nM insuliny. Co ważne, odkryliśmy, że insulina jest absolutnie niezbędna do indukcji UCP110 wywołanej rozyglitazonem/pioglitazonem. Insulina nie jest jednak niezbędna do utrzymania fenotypu adipogennego komórek. Tak więc, w zależności od pytania eksperymentalnego, insulina może być uwzględniona lub pominięta.
Opisana powyżej procedura została zoptymalizowana pod kątem izolacji i hodowli ludzkich adipocytów. Jednak adipocyty myszy i ewentualnie innych organizmów mogą być również hodowane jako MAAC. Jeśli adipocyty myszy mają być hodowane jako MAAC, należy pamiętać o dodatkowych kwestiach i środkach ostrożności. Odkryliśmy, że dojrzałe adipocyty myszy są znacznie bardziej kruche niż te pochodzące od ludzi. W rezultacie czas trawienia powinien zostać skrócony do absolutnego minimum, aby zwiększyć żywotność komórek. Odkryliśmy również, że adipocyty od młodych myszy (8-tygodniowych i młodszych) zapewniały najbardziej wiarygodne i powtarzalne wyniki. Wreszcie, mysie MAAC mogą być hodowane przez okres do jednego tygodnia, jednak biorąc pod uwagę, że ich adipogenny fenotyp wydaje się mniej stabilny niż u ludzi (którzy mogą być hodowani przez co najmniej dwa tygodnie), zalecamy hodowlę MAAC myszy przez minimalny wymagany czas, aby odpowiedzieć na pytania eksperymentalne.
Ponieważ model MAAC opiera się na wykorzystaniu przepuszczalnych błon, jedną z zalet tej techniki jest możliwość kohodowli dojrzałych adipocytów z innymi typami komórek. Wcześniej wykazaliśmy zdolność dojrzałych adipocytów i makrofagów do wzajemnych oddziaływań dzięki zastosowaniu MAAC10. Otwiera to możliwości dalszego badania związku między otyłością, insulinoopornością i reakcjami immunologicznymi 15,16,17. Przyszłe eksperymenty mogą obejmować inne typy komórek, takie jak hepatocyty, preadipocyty, komórki śródbłonka lub komórki trzustki, aby jeszcze bardziej zwiększyć złożoność i znaczenie translacyjne modelu MAAC oraz zbadać wzajemne oddziaływanie między wieloma typami komórek.
Mimo że wykazano, że MAAC jest lepszy w utrzymywaniu funkcjonalności i tożsamości adipocytów w porównaniu z innymi modelami adipocytów in vitro, ma również ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. W porównaniu do stosowania adipocytów zróżnicowanych od komórek prekursorowych, MAAC jest modelem bardziej pracochłonnym i czasochłonnym. Płytki z membranami są również droższe w porównaniu ze zwykłymi płytkami do hodowli komórkowych. Co ważne, dojrzałe adipocyty muszą być świeżo izolowane za każdym razem po wysiewie i nie mogą być namnażane ani zamrażane do postaci takich jak komórki prekursorowe. W związku z tym wymaga to dostępu do świeżych próbek białej tkanki tłuszczowej, ale także zwiększa poziom złożoności wynikający z różnic między dawcami.
Tutaj przedstawiliśmy szczegółowy protokół izolacji ludzkich dojrzałych adipocytów i zakładania MAAC. Wykazaliśmy, że adipocyty hodowane jako MAAC zachowują żywotność przez dwa tygodnie, ich adipogenna sygnatura genów jest zachowana i reagują na różnorodny agonizm farmakologiczny. Wykorzystanie MAAC pozwala na badanie wzajemnych oddziaływań między adipocytami a innymi typami komórek oraz ocenę długoterminowych zmian fenotypowych dojrzałych adipocytów w odpowiedzi na różne bodźce.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Xiao-Rong Peng i Stefanowi Hallenowi za dostarczenie zasobów i optymalizację izolacji adipocytów, Martinowi Uhrbomowi za pomoc techniczną oraz Danielowi Olaussonowi i Malin Lönn za koordynację i dostarczenie ludzkiej tkanki tłuszczowej.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nożyczki autoklawowane Łyżki | |||
| autoklawizowane | |||
| Pęseta | |||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Bufor RLT | QIAGEN | 79216 | Bufor do lizy |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Probówki stożkowe, 50 ml | |||
| D-(+)-Glukoza | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Kolba filtrująca 0,2 i mikro; m wielkość porów, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
| Kolba filtracyjna 0,2 &mikro; m wielkość porów, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
| HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
| Roztwór buforowy HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Insulina (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
| Filtr siatkowy (250 µ M) | Sintab AB | 6111-025043 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Igły, 18 g, 1,20 mm x 40 mm | Sterican | 613-2948 | |
| Pencillin-Streptomycyna (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
| Szalki Petriego, 150 mm x 21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym Quantstudio 7 Flex Zestawy | Applied Biosystems | ||
| RNeasy Mini QIAGEN | 74106 | ||
| Rozdzielacz | VWR | 527-0008 | Do przygotowania na dużą skalę |
| Lejek | separacyjnyVWR | 527-0005 | Do przygotowania na małą skalę |
| Inkubator z wytrząsaniem (37 ° C) | |||
| Strzykawki, 5 ml | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
| Inkubator do hodowli tkankowych (37 ° C, 5% CO2) | |||
| Transwells, 24-dołkowe (6,5 mm) | Costar | 3397 | Przepuszczalne wkładki membranowe |
| Odczynnik TRIzol | Invitrogen | 10296010 | Bufor do lizy |
| typu 2 Kolagenaza | Worthington | LS004177 |
Bibliografia
- Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Lotta, L. A., et al. Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance. Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).
- Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. Insulin resistance and impaired adipogenesis. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).
- Gesta, S., et al. Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression. Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).
- Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue. Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), e0122065(2015).
- Asada, S., et al. Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).
- Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues. International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).
- Harms, M. J., et al. Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding adipocyte differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040(2016).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).
- Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease. The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).
- Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. An Integrated View of Immunometabolism. Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).
Przedruki i uprawnienia
