Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60486

⸱

7 listopada 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Pediatrics and Communicable Diseases, University of Michigan Medical School, 3Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 4Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Michigan Medical School, 5Undergraduate Research Opportunity Program, University of Michigan, 6Department of Surgery, Ann Arbor Veterans Affairs Healthcare System

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Streszczenie

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w regulacji homeostazy tkanek, prowadzeniu rozmów z komórkami i regulowaniu wielu aspektów funkcji komórkowych. ECM odgrywa szczególnie ważną rolę w funkcjonowaniu tkanki tłuszczowej w otyłości, a zmiany w odkładaniu i składzie tkanki tłuszczowej ECM są związane z chorobami metabolicznymi u myszy i ludzi. Wykonalne modele in vitro, które pozwalają na analizę ról ECM i komórek w przyczynianiu się do globalnego fenotypu tkankowego, są nieliczne. Opisujemy nowatorski model 3D in vitro ludzkiej hodowli adipocytów ECM, który pozwala na badanie specyficznych ról ECM i adipocytów w regulacji fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej. Ludzka tkanka tłuszczowa jest decelularyzacja w celu wyizolowania ECM, który jest następnie ponownie zasiedlany preadipocytami, które są następnie różnicowane w ECM w dojrzałe adipocyty. Metoda ta tworzy konstrukty ECM-adipocytów, które są aktywne metabolicznie i zachowują cechy tkanek i pacjentów, z których pochodzą. Wykorzystaliśmy ten system do zademonstrowania specyficznego dla choroby przesłuchu ECM-adipocytów w ludzkiej tkance tłuszczowej. Ten model hodowli dostarcza narzędzia do analizy ról ECM i adipocytów w przyczynianiu się do globalnego fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej i pozwala na badanie roli ECM w regulacji homeostazy tkanki tłuszczowej.

Wprowadzenie

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) nie tylko stanowi mechaniczne rusztowanie dla tkanek, ale także prowadzi skomplikowane rozmowy z komórkami, które w niej przebywają, regulując różnorodne procesy niezbędne do homeostazy tkanek, w tym proliferację komórek, różnicowanie, sygnalizację i metabolizm1. Podczas gdy zdrowy ECM odgrywa istotną rolę w utrzymaniu prawidłowego funkcjonowania tkanek, dysfunkcyjny ECM jest związany z wieloma chorobami2.

Tkanka tłuszczowa odgrywa ważną rolę w patogenezie choroby metabolicznej. Otyłość wiąże się z nadmiernym przerostem adipocytów i niedotlenieniem komórek, defektami metabolizmu komórkowego adipocytów i retikulum endoplazmatycznego tkanki tłuszczowej oraz stresem oksydacyjnym i stanem zapalnym. Chociaż są słabo poznane, te złożone procesy współdziałają w celu osłabienia zdolności buforowania składników odżywczych w tkance tłuszczowej, prowadząc do przelania składników odżywczych z tkanki tłuszczowej, toksyczności w wielu tkankach i ogólnoustrojowej choroby metabolicznej3,4,5. Sekwencja zdarzeń i specyficzne mechanizmy, które leżą u podstaw niewydolności tkanki tłuszczowej, są słabo poznane, ale zmiany w ECM tkanki tłuszczowej są w to zaangażowane. Skład ECM jest zmieniony w tkance tłuszczowej w otyłości ludzkiej i mysjej, ze zwiększonym odkładaniem się białka ECM wraz z jakościowymi różnicami biochemicznymi i strukturalnymi w ECM tkanki tłuszczowej związanymi z chorobami metabolicznymi człowieka, w tym cukrzycą typu 2 i hiperlipidemią6,7,8,9,10,Rozdział 11.

Pomimo tych obserwacji, rola ECM tkanki tłuszczowej w pośredniczeniu w dysfunkcji tkanki tłuszczowej nie jest dobrze zdefiniowana. Wynika to częściowo z braku wykonalnych modeli eksperymentalnych, które pozwalają na analizę specyficznych ról ECM i adipocytów w regulacji ostatecznej funkcji tkanki tłuszczowej. Posiewy ECM-adipocytów lepiej symulują środowisko in vivo natywnej tkanki tłuszczowej pod co najmniej dwoma względami. Po pierwsze, hodowla ECM zapewnia środowisko molekularne podobne do natywnej tkanki tłuszczowej, w tym natywne kolageny, elastyny i inne białka macierzy nieobecne w standardowej hodowli 2D. Po drugie, wykazano, że hodowla na plastiku 2D zmienia metabolizm adipocytów poprzez efekty mechaniczne spowodowane zmniejszoną elastycznością podłoża z tworzywa sztucznego12, które kultura ECM eliminuje.

Metody inżynierii rusztowań biologicznych poprzez izolację ECM z decelularyzowanych tkanek tłuszczowych i innych tkanek były badane w kontekście medycyny regeneracyjnej i rekonstrukcyjnej oraz inżynierii tkankowej13,14,15,16,17,18. Wcześniej opublikowaliśmy metodologię, w której dostosowaliśmy te metody do opracowania modelu 3D in vitro ludzkiej hodowli adipocytów ECM, przy użyciu ECM i komórek macierzystych adipocytów (preadipocytów) pochodzących z ludzkich trzewnych tkanek tłuszczowych11. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy te metody. Procedura decelularyzacji ludzkiej tkanki tłuszczowej to czterodniowy proces, który obejmuje zabiegi mechaniczne i enzymatyczne w celu usunięcia komórek i lipidów, pozostawiając rusztowanie biologiczne, które zachowuje cechy tkanki, z której pochodzi. Bezkomórkowy ECM wspomaga adipogenne różnicowanie ludzkich preadipocytów, a po rozpuszczeniu z adipocytami zachowuje mikroarchitekturę oraz biochemiczne i specyficzne dla choroby cechy nienaruszonej tkanki tłuszczowej oraz angażuje się w funkcje metaboliczne charakterystyczne dla natywnej tkanki tłuszczowej. Macierz ta może być badana samodzielnie lub ponownie zasiewana komórkami, co pozwala na badanie interakcji i przesłuchów między komórkowymi i zewnątrzkomórkowymi składnikami tkanki tłuszczowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Tkanki tłuszczowe pobierane są od pacjentów poddawanych planowej operacji bariatrycznej za zgodą instytucjonalnej komisji bioetycznej.

1. Izolacja preadipocytów i przygotowanie odczynników do hodowli

  1. Przygotować 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Przefiltrować w celu sterylizacji i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować kolagenazę typu II: 2 mg/mL w 2% BSA w 1x PBS. Przygotować bezpośrednio przed użyciem.
  3. Przygotować roztwór do lizy czerwonych krwinek (RBC): 1,5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM EDTA dwusodowego w wodzie dejonizowanej (DI/H2O). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować 1x roztwór do lizy RBC z 10x roztworu zapasu w DI/H2O bezpośrednio przed użyciem.
  4. Przygotować pożywkę wzrostową: 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% roztworu antybiotykowo-antymykotycznego (ABAM) w pożywce DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12). Przefiltrować w celu sterylizacji i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować roztwór do mrożenia preadypocytów: 10% dimetylosulfoksydy, 15% FBS w pożywce DMEM/F12. Przefiltrować w celu sterylizacji i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. Przygotować pożywkę do różnicowania: 10 mg/L transferryny, 33 µM biotyny, 0,5 µM roztworu insuliny ludzkiej, 17 µM hemi-soli wapniowej kwasu D-pantotenowego, 100 nM deksametazonu, 2 nM soli sodowej 3,3',5-trijodotyroniny (T3), 1 µM ciglitizonu, 540 µM 3-izobutylo-1-metylksantyny (IBMX), 1% ABAM w DMEM/F12. Przefiltrować w celu sterylizacji i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie odczynników ECM

  1. Przygotować bufor mrożący: 10 mM Tris base, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% fenylometylosulfonilonu (PMSF) w DI/H2O. Mieszać roztwór do rozpuszczenia EDTA. Dostosować pH do 8,0 za pomocą HCl lub NaOH. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
  2. Przygotować roztwór enzymatyczny nr 1: 1% ABAM w 0,25% trypsyny-EDTA. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
  3. Przygotować bufor płuczący: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 1% ABAM, 1% PMSF w sterylnej wodzie DI/H2O. Mieszać do rozpuszczenia soli. Dostosować pH do 8,0 za pomocą HCl lub NaOH. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
  4. Przygotować roztwór enzymatyczny nr 2: 55 mM Na2HPO4, 17 mM KH2PO4, 4,9 mM MgSO4∙7H2O, 1% ABAM, 1% PMSF w DI/H2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy. Mieszać do rozpuszczenia soli. Bezpośrednio przed użyciem dodać 80 U/mL lipazy z trzustki świńskiej, typ VI-S; 160 U/mL doksyrybonukleazy I z trzustki bydlęcej, typ II-S; oraz 100 µg/mL rybonukleazy A z trzustki bydlęcej, typ III-A.
  5. Przygotować roztwór do ekstrakcji polarnym rozpuszczalnikiem: 1% ABAM, 1% PMSF w izopropanolu.
    OSTRZEŻENIE: Izopropanol jest łatwopalny; przechowywać w szafce na substancje łatwopalne w temperaturze 25 °C i utylizować jako odpady łatwopalne.
  6. Przygotować 70% etanol, 1% ABAM, 1% PMSF w DI/H2O. Dodać ABAM i PMSF bezpośrednio przed użyciem.
    OSTRZEŻENIE: Etanol jest łatwopalny; przechowywać w szafce na substancje łatwopalne w temperaturze 25 °C i utylizować jako odpady łatwopalne.
  7. Przygotować roztwór do przechowywania: 1% ABAM, 1% PMSF w 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.

3. Przygotowanie odczynników do fenotypowania metabolicznego

  1. Pobór glukozy
    1. Przygotować pożywkę do głodzenia w surowicy: DMEM/F12, 1% ABAM. Przesączyć przez filtr sterylizujący i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Bezpośrednio przed użyciem przygotować 200 nM roztwór ludzkiej insuliny w 1x PBS.
    3. Przygotować w 1x PBS: 200 nM ludzkiej insuliny, 0,1 mM 2-deoksy-D-glukozy oraz 1 µCi/dołek deoksy-D-glukozy, 2-[1,2-3H(N)]-. Przygotować bezpośrednio przed użyciem.
  2. Lipoliza
    1. Przygotować izoproterenol rozcieńczony w PBS: roztwór stokowy 3 mM. Przed analizą rozcieńczyć do stężenia roboczego 3 µM.
  3. Barwienie Oil Red-O
    1. Przygotować 4% formalinę w DI/H2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować roboczy roztwór Oil Red-O. Rozcieńczyć roztwór Oil Red-O (ORO) wodą DI/H2O w stosunku 3:2 (ORO:DI/H2O). Przygotować bezpośrednio przed użyciem. Przefiltrować przez papier filtracyjny (Tabela materiałów).

4. Pozyskiwanie tkanki tłuszczowej

UWAGA: Tkanka tłuszczowa trzewna (VAT) jest pobierana przez chirurga z sieci większej na początku operacji i transportowana z powrotem do laboratorium w lodzie w celu natychmiastowego przetworzenia. Podczas pracy ze wszystkimi tkankami ludzkimi i żrącymi odczynnikami należy stosować środki ostrożności uniwersalnej, w tym wykonywać wszystkie czynności w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używać kompletnej odzieży ochronnej laboratoryjnej oraz nie nakładać nasadek na igły.

  1. Do probówki stożkowej o pojemności 50 mL dodać 5-10 g nienaruszonej VAT do 15-25 mL roztworu buforu do zamrażania, aby zanurzyć próbkę tkanki. Próbki przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia decelularyzacji, maksymalnie przez 1 miesiąc.
  2. Do izolacji preadipocytów, zgodnie z opisem w sekcji 5, należy użyć oddzielnej, świeżej próbki VAT.

5. Izolacja preadipocytów

  1. Umieść 2 g nienaruszonej tkanki tłuszczowej (VAT) w 20 mL roztworu kolagenazy typu II w probówce stożkowej o pojemności 50 mL. Następnie dokładnie rozdrobnij tkankę, wprowadzając sterylne nożyczki do probówki stożkowej i rozcinając tkankę wewnątrz probówki. Po całkowitym rozdrobnieniu do postaci drobnej zawiesiny, inkubuj tkankę w roztworze kolagenazy na wytrząsarku orbitalnej przy 130 rpm i 37 °C przez 60 min.
  2. Przefiltruj otrzymany produkt trawienia przez nylonową siatkę o oczkach 100 µm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL, przelewając zawiesinę z jednej probówki przez kawałek siatki złożonej na górze nowej probówki. Na tym etapie produkt trawienia powinien być żółto-pomarańczową cieczą o umiarkowanej lepkości, z niewielką ilością pozostałych pasm niestrawionej tkanki włóknistej. Siatka powinna zatrzymać większe kawałki niestrawionej tkanki, które należy odrzucić.
  3. Odwiruj próbkę przy 270 x g przez 10 min. Usuń supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 2 mL 1x RBC Lysing Solution za pomocą pipety.
    1. Inkubuj przez 1 min przy 25 °C, a następnie dodaj 10 mL 15% FBS-DMEM/F12. Odwiruj przy 270 x g przez 10 min.
  4. Usuń supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 10 mL 15% FBS-DMEM/F12 za pomocą pipety. Przenieś zawiesinę komórkową do szalki Petriego o średnicy 100 mm za pomocą pipety i inkubuj przy 37 °C i 5% CO2, aż komórki osiągną 80-100% konfluencji, zazwyczaj przez 2-6 dni. Wymieniaj medium co 2-3 dni.
  5. Odklej i przemyj komórki.
    1. Usuń medium za pomocą pipety i nanieś 4 mL 0,25% trypsyny-EDTA na przylegające komórki. Inkubuj przy 37 °C przez 10 min, okresowo delikatnie potrząsając płytką, aby odkleić komórki.
    2. Dodaj 20 mL 15% FBS-DMEM/F12 i resuspenduj odklejone komórki w tym medium za pomocą pipety. Następnie przenieś je do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL i odwiruj przy 270 x g przez 10 min.
    3. Usuń supernatant i go odrzuć. Przemyj osad komórkowy raz w 1x PBS, a następnie resuspenduj osad komórkowy w 20 mL świeżego 15% FBS-DMEM/F12 za pomocą pipety. Przenieś zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej T-150.
  6. Hoduj komórki przy 37 °C i 5% CO2. Rozdzielaj i powiększ populację komórek co 2-3 dni, gdy osiągną 80-100% konfluencji, nakładając 7 mL 0,25% trypsyny-EDTA, powiększając hodowlę z jednej kolby do 8 kolb.
    UWAGA: Zazwyczaj wymaga to 3-4 pasażowań, co pozwala na odpowiednią ekspansję i zachowanie potencjału adipogennego oraz specyficznych dla pacjenta i depozytu fenotypów metabolicznych komórek. Pasażowanie preadipocytów powyżej 4-5 pasaży prowadzi do utraty potencjału adipogennego.
  7. Odklej komórki w 8 kolbach, stosując 7 mL 0,25% trypsyny-EDTA na kolbę, zgodnie z opisem powyżej, i inkubuj przy 37 °C przez 10 min.
  8. Dodaj 8 mL 15% FBS-DMEM/F12 na kolbę i resuspenduj odklejone komórki za pomocą pipety. Przenieś całą zawiesinę komórkową, dzieląc ją równomiernie do trzech probówek stożkowych o pojemności 50 mL, i odwiruj przy 270 x g przez 10 min.
  9. Resuspenduj otrzymane osady komórkowe w 5 mL 15% FBS-DMEM/F12 w probówce stożkowej o pojemności 15 mL i policz komórki, używając licznika komórek i błękitu Trypanu.
  10. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 270 x g przez 10 min. Następnie resuspenduj osad komórkowy w Preadipocyte Freezing Solution do końcowego stężenia komórek 1 x 106/mL i rozdziel zawiesinę po 1 mL na każdą probówkę kriogeniczną 1,5 mL.
  11. Przechowuj komórki w probówkach kriogenicznych przez 1 dzień w -80 °C. Następnie przenieś probówki do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania przez 3-6 miesięcy.
  12. W momencie użycia rozmroź jedną probówkę kriogeniczną w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 3-5 min. Resuspenduj komórki w 20 mL 15% FBS-DMEM/F12 i odwiruj przy 270 x g przez 10 min.
  13. Resuspenduj osad komórkowy w 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, przenieś za pomocą pipety do jednej kolby T-150, a następnie hoduj do 80% konfluencji przez 2-3 dni przy 37 °C i 5% CO2.
  14. Odklej komórki, stosując 7 mL 0,25% trypsyny-EDTA na kolbę, jak opisano powyżej w kroku 5.6. Resuspenduj w stężeniu 3 milionów komórek na mL (tj. 6 x 104 komórek na 20 µL) w 15% FBS-DMEM/F12 i wykorzystaj zgodnie z poniższym opisem (sekcja 7, krok 7.4).

6. Przygotowanie ECM z tkanki tłuszczowej

  1. Dzień 1: Zamrażanie-rozmrażanie i trawienie enzymatyczne nr 1
    1. Próbki VAT wcześniej zamrożone (krok 4.2), przechowywane w roztworze buforu do zamrażania w stożkowych probówkach 50 mL, poddać procesowi zamrażania i rozmrażania, przenosząc je z -80 °C do 37 °C w podgrzanej kąpieli wodnej; inkubować przez 20 min, delikatnie i okresowo mieszając ręcznie. Po rozmrożeniu przenieść z powrotem do -80 °C i inkubować przez 20 min. Powtórzyć cykl zamrażania i rozmrażania 3x, kończąc rozmrożeniem próbek w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Za pomocą sterylnej pęsety przenieść próbki VAT do nowych stożkowych probówek 50 mL zawierających 15-25 mL roztworu enzymatycznego nr 1, upewniając się, że próbki VAT są całkowicie zanurzone. Następnie inkubować przez noc na wytrząsarce orbitalnej (130 rpm, 37 °C).
  2. Dzień 2: Trawienie enzymatyczne nr 2
    1. Przemyć próbki 3x za pomocą 15-25 mL roztworu buforu płuczącego na wytrząsarce orbitalnej (130 rpm, 37 °C, 20 min na każde płukanie). Po każdym płukaniu odlać roztwór buforu płuczącego.
    2. Przenieść próbki do nowych stożkowych probówek 50 mL zawierających 15-25 mL roztworu enzymatycznego nr 2 i inkubować na wytrząsarce orbitalnej (130 rpm, 37 °C, przez noc).
  3. Dzień 3: Delipidacja
    1. Przemyć próbki 3x za pomocą 15-25 mL roztworu buforu płuczącego na wytrząsarce orbitalnej (130 rpm, 37 °C, 20 min na każde płukanie). Po każdym płukaniu odlać roztwór buforu płuczącego.
    2. Przenieść próbki do nowych stożkowych probówek 50 mL zawierających 15-25 mL roztworu ekstrakcyjnego z rozpuszczalnika polarnego i inkubować na wytrząsarce orbitalnej (130 rpm, 25 °C, przez noc). Po tym etapie większość lipidów powinna zostać usunięta, a próbki powinny mieć kolor biały lub być półprzezroczyste.
      OSTRZEŻENIE: Roztwór ekstrakcyjny z rozpuszczalnika polarnego jest łatwopalny i powinien być przechowywany oraz używany w temperaturze 25 °C.
  4. Dzień 4: Płukanie i przechowywanie
    1. Przenieść próbki do nowych stożkowych probówek 50 mL zawierających 15-25 mL roztworu buforu płuczącego. Przemyć próbki 3x na wytrząsarce orbitalnej (130 rpm, 37 °C, 20 min na każde płukanie).
    2. Przemyć próbki 3x za pomocą 15-25 mL 70% etanolu na wytrząsarce orbitalnej (130 rpm, 37 °C, 20 min na każde płukanie), odlewając 70% roztwór etanolu po każdym płukaniu.
    3. Przemyć próbki raz za pomocą roztworu do przechowywania na wytrząsarce orbitalnej (130 rpm, 37 °C, 20 min).
    4. Za pomocą sterylnej pęsety przenieść próbki do nowych stożkowych probówek 50 mL zawierających 15-25 mL roztworu do przechowywania. Upewnić się, że użyto wystarczającej ilości roztworu do przechowywania, aby próbki były całkowicie zanurzone. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.

7. Przygotowanie adipocytów-ECM

  1. Przenieś przechowywane fragmenty ECM do poszczególnych studzienek płytki 24-dołkowej za pomocą sterylnej pęsety. Umieść tyle fragmentów ECM w studzienkach, ile jest wymaganych do zaplanowanych dalszych analiz (np. poboru glukozy lub lipolizy, patrz poniżej), uwzględniając próbki powtórne lub potrójne. Przemyj 500 µL 70% etanolu 3x na wytrząsarce orbitalnej (130 rpm, 37 °C, 20 min każdego płukania).
  2. Rehydratuj ECM, płucząc 3x w sterylnym 1x PBS na wytrząsarce orbitalnej (130 rpm, 37 °C, 20 min każdego płukania).
  3. Za pomocą sterylnych nożyczek potnij i odważ fragmenty ECM o masie 100 mg. Używając sterylnej pęsety, umieść jeden fragment 100 mg w każdej studzience płytki 24-dołkowej. Inkubuj w 25 °C przez 15 min, aby umożliwić usunięcie nadmiaru PBS z fragmentów. Ostrożnie usuń nadmiar PBS za pomocą pipety.
  4. Zasiej każdy fragment ECM 100 mg za pomocą 20 µL zawiesiny komórek preadipocytów (3 miliony komórek na mL, 6 x 104 komórek na 20 µL, w 15% FBS-DMEM/F12, z kroku 5.10). Nanieś komórki bezpośrednio do ECM, umieszczając końcówkę pipety w ECM i delikatnie wypuszczając zawiesinę komórkową do centrum macierzy, dbając o to, aby zawiesina nie przelewała się i nie osadzała na dnie studzienki.
    1. Jeśli zawiesina komórkowa przelewa się z ECM w miejscu umieszczenia końcówki pipety, wyjmij końcówkę z tego miejsca i wsuń ją w inne miejsce w ECM. Inkubuj zasiane ECM przez 40 min w 37 °C.
      UWAGA: Do ekstrakcji RNA na potrzeby qrtPCR zasiej każdy fragment ECM 500 mg za pomocą 3 x 105 komórek w 100 µL (3 miliony komórek na mL, t.j. 3 x 105 komórek na 100 µL, w 15% FBS-DMEM/F12).
  5. Wypełnij każdą studzienkę płytki 24-dołkowej 500 µL pożywki wzrostowej, aby przykryć zasiane fragmenty ECM. Hoduj w 37 °C i 5% CO2 przez 72 h.
  6. Po 72 h ostrożnie odessaj 15% FBS-DMEM/F12, lekko przechylając płytkę, aby pożywka zebrała się poniżej fragmentu, i umieszczając końcówkę pipety tuż obok fragmentu ECM, nie naruszając go. Po odessaniu dodaj 500 µL pożywki różnicującej, wymieniając pożywkę co 2-3 dni przy użyciu podobnej techniki, przez całkowity okres hodowli wynoszący 14 dni.
    1. Sprawdź różnicowanie za pomocą mikroskopii świetlnej: komórki będą gromadzić lipidy, zmienią kolor na brązowo-żółty i przyjmą bardziej sferyczny kształt.
      UWAGA: Zasiane macierze mogą być wykorzystane do testów metabolicznych (np. testu poboru glukozy, testu lipolizy, ORO), histologii lub immunohistochemii (IHC) bądź standardowego obrazowania tkanek. W przypadku barwienia ORO i obrazowania utrwalonych tkanek, zamroź próbki ECM-adipocytów w ciekłym azocie.

8. Fenotypowanie metaboliczne

  1. Skaningowa mikroskopia elektronowa
    1. Utrwalić próbki w 2,5% glutaraldehydzie w buforze fosforanowym Sorensena w temperaturze 25 °C przez 12 h. Przeprowadzić potrwalanie w 1% tetroksydzie osmu w buforze fosforanowym Sorensena w temperaturze 4 °C przez 1 h.
    2. Odwodnić próbki szeregowo w etanolu. Przemyć heksametylodisilazanem i wysuszyć na powietrzu. Następnie zamocować na podstawce do skaningowej mikroskopii elektronowej za pomocą grafitu koloidalnego. Wysuszyć i napylić złotem.
    3. Wykonać obrazy za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego.
  2. Barwienie Oil Red-O
    1. Tkanka żywa: roztwór Oil Red-O
      1. Ostrożnie odessać pożywkę z dołków za pomocą pipety. Następnie przemyć próbki raz 500 µL 1x PBS na dołek.
      2. Utrwalić próbki 200 µL 4% formaliny w sterylnej dejonizowanej H2O w temperaturze 25 °C przez 15 min. Odessać formalinę pipetą, przemyć próbki dwa razy 1x PBS (po 500 µL na każde przemycie).
      3. Dodać 200 µL 60% izopropanolu do próbek w temperaturze 25 °C na 5 min. Odessać 60% izopropanol za pomocą pipety.
      4. Zabarwić próbki roboczym roztworem Oil Red-O w temperaturze 25 °C przez 5 min. Odessać Oil Red-O pipetą, a następnie przemyć próbki 3x 1x PBS (po 500 µL na każde przemycie). Następnie wykonać obrazy za pomocą mikroskopu optycznego.
    2. Tkanka utrwalona: zestaw do barwienia Oil Red-O
      1. Szybko zamrozić próbki ECM-adipocytów w związku do optymalnego cięcia (OCT) i wykonać skrawki (5 µm) na kriotomie.
      2. Umieścić preparat w 85% glikolu propylenowego w DI/H2O na 2 min. Umieścić preparat w barwniku ORO w temperaturze 60 °C przez 6 min. Umieścić preparat w 85% glikolu propylenowego w DI/H2O na 1 min. Przepłukać preparat dwukrotnie DI/H2O.
      3. Umieścić preparat w zmodyfikowanej hematoksylinie Mayera z zestawu do barwienia Oil Red-O na 1 min. Przepłukać preparat dwukrotnie wodą z kranu. Przepłukać preparat dwukrotnie DI/H2O.
      4. Przykryć szkiełko osłonowe za pomocą wodnego medium montażowego i wykonać obrazy pod mikroskopem.
    3. Ekstrakcja RNA z ECM do qrtPCR
      UWAGA: Aby zmaksymalizować wydajność RNA, należy użyć fragmentów ECM o masie 500 mg zasianych 3 x 105 preadipocytów w 100 µL i różnicować zgodnie z powyższym w płytkach 6-dołkowych w 3 mL pożywki do różnicowania na dołek.
      1. Po zróżnicowaniu przenieść każdą pojedynczą próbkę ECM-adipocytów do probówki stożkowej 50 mL na lodzie za pomocą sterylnej pęsety.
      2. Przemyć pusty dołek 500 µL buforu RLT. Dodać bufor RLT do probówki stożkowej 50 mL z odpowiadającą próbką ECM-adipocytów.
      3. Za pomocą sterylnych nożyczek drobno posiekać każdą próbkę ECM-adipocytów w probówce stożkowej 50 mL, trzymając probówkę na lodzie i wkładając nożyczki do probówki, aby posiekać tkankę.
      4. Całkowicie zamrozić i rozmrozić probówki stożkowe od -80 °C do 37 °C 3x.
      5. Wirować probówki stożkowe przy 500 x g i 4 °C przez 10 min.
      6. Ostrożnie usunąć nadsącz pipetą i wykorzystać do ekstrakcji RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA z tkanki włóknistej (Fibrous Tissue RNA extraction Kit) (Tabela materiałów).
  3. Test pobierania glukozy
    1. Zróżnicować 6 x 104 preadipocytów w fragmentach ECM o masie 100 mg w 0,5 mL pożywki do różnicowania w płytkach 24-dołkowych, jak opisano powyżej (sekcja 5).
    2. Po 14 dniach różnicowania usunąć pożywkę i przemyć ECM-adipocyty raz 1x PBS. Dodać 0,5 mL/dołek pożywki do głodzenia surowiczego (Serum Starvation Medium) i hodować w 37 °C i 5% CO2 przez 12 h.
    3. Usunąć pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie 1x PBS. Dodać 0,5 mL/dołek 2% BSA w PBS i hodować w 37 °C i 5% CO2 przez 2 h.
    4. Przemyć komórki raz 1x PBS, dodać 0,5 mL/dołek 1x PBS z lub bez 200 nM insuliny i inkubować w 37 °C przez 40 min.
    5. Odessać 1x PBS, dodać 0,5 mL/dołek 1X PBS z 0,1 mM 2-deoksy-D-glukozą, 2 µCi/mL deoksy-D-glukozy, 2- [1,2-3H(N)], z lub bez 200 nM insuliny i inkubować w 37 °C i 5% CO2 przez 40 min. Stosować standardowe środki ostrożności przy obchodzeniu się i utylizacji wszystkich odczynników i odpadów radioaktywnych, zgodnie z lokalnymi przepisami instytucjonalnymi.
    6. Usunąć pożywkę pipetą i przemyć komórki 3x 1x PBS. Dodać 420 µL 1% roztworu SDS w DI/H2O i zlizować komórki poprzez energiczne pipetowanie. Inkubować w 25 °C przez 10 min.
    7. Pobrać 5 µL z każdego dołka do testu białka BradFORda. Przenieść 400 µL pozostałego lizatu komórkowego do 2 mL cieczy scyntylacyjnej w fiolce scyntylacyjnej. Zmierzyć aktywność 3H-2DG na liczniku scyntylacyjnym. Analizować dane jako liczbę zliczeń na minutę znormalizowaną do ilości białka, mg/mL.
  4. Test lipolizy
    1. Zróżnicować 6 x 104 preadipocytów w fragmentach ECM o masie 100 mg w 0,5 mL ludzkiej pożywki do różnicowania w płytkach 24-dołkowych, jak opisano powyżej (sekcja 5).
    2. Po 14 dniach różnicowania usunąć pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie ciepłym 1x PBS. Dodać 0,5 mL pożywki do głodzenia surowiczego (bez insuliny) z lub bez 3 µM izoproterenolu i hodować adipocyty w 37 °C i 5% CO2 przez 72 h.
    3. Zebrać nadsącz z hodowli, który można przechowywać w -80 °C do czasu wykonania testu. Zebrać ECM do probótek do mikrowirowania w celu oznaczania ilości DNA do normalizacji danych.
    4. Napipetować 2 µL każdego nadsączu do mikropłytki 96-dołkowej. Zarezerwować dołki na próbki ślepe (destylowana H2O) i standardowy roztwór glicerolu dostarczony w zestawie do oznaczania triglicerydów (Triglyceride Determination Kit).
    5. Dodać 270 µL odczynnika do wolnego glicerolu z zestawu Triglyceride Determination Kit do każdego dołka, wymieszać pipetą. Inkubować płytkę w 37 °C przez 5 min.
    6. Zmierzyć absorbancję przy 540 nm na spektrofotometrze do mikropłytek.
    7. Obliczyć stężenie glicerolu i znormalizować za pomocą DNA z ECM:

Równanie stężenia glicerolu; wzór na absorbancję na schemacie spektrofotometrycznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) tkanki tłuszczowej, wysiew preadipocytów oraz różnicowanie in vitro w dojrzałe adipocyty prowadzą do wyraźnych sekwencyjnych zmian morfologicznych w tkance, co umożliwia wizualną ocenę postępów w trakcie całego protokołu (Rycina 1). Preadipocyty wykorzystywane do wysiewu na ECM są izolowane poprzez trawienie kolagenazą z oddzielnych próbek VAT (Rycina 2). Skaningowa mikroskopia elek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Model hodowli ECM-adipocytów stanowi cenne narzędzie do analizy indywidualnych ról ECM i komórek w dyktowaniu ostatecznego fenotypu tkanki. Protokół izolacji ECM jest dość powtarzalny, ale można zaobserwować zmienność w procesie decelularyzacji. Etap delipidacji w dniu 3 jest krytycznym punktem protokołu. Po zakończeniu ekstrakcji przez noc delipidacja matrycy powinna być udowodniona przez żółknięcie roztworu rozpuszczalnika polarnego, podczas gdy matryca powinna przejść z żółto-pomarańczowego koloru charakterystycznego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa i Retha Geiss za pomoc w koordynacji nauki. SEM został przeprowadzony przez University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Projekt ten był wspierany przez granty NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant z Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veterans Administration VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Skaningowa mikroskopia elektronowa wykonana przez University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Rysunek 4 tego manuskryptu został pierwotnie opublikowany w Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; 1 marca; 102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, i został przedrukowany za zgodą Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Aby uzyskać zgodę na ponowne wykorzystanie tych materiałów, odwiedź stronę http://global.oup.com/academic/rights.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTAGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAKat#25200056
1,5 ml probówka kriowialnaFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#02-682-557
10% neutralna buforowana formalinaVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#89370-094
100 µ m nylonowy filtr siatkowyCorning Inc., Corning, NY, USACat#352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#D8375
2 nM 3,3',5-triiodo-L-tyronina sól sodowa (T3)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T6397
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowychVWR International LLC., Radnor, PA, USANr kat.#10861-700
3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USAKat#I5879
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowychVWR International LLC., Radnor, PA, USAKat#10861-666
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (ABAM)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAKot#15240062
BiotynaSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USAKot#B4639
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#A8806
Bufor RLTQiagen, Hilden, NiemcyCat#79216
CiglitizoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#C3974
Deoksy-D-glukoza, 2-[1,2-3H (N)]-PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USACat#NET328A250UC
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej, typ II-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USANr kat.#D4513
DeksametazonSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USANr kat.#D4902
DimetylosulfotlenekFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone#BP231Łatwopalny,
disodowy EDTA FisherScientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USAKot#BP118
Kwas D-pantotenowy sól półwapniowaSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USAKot#21210
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle: Mieszanina składników odżywczych F-12 (DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#11320033
EthanolDecon Labs, Inc., Król Prus, PA, USACat#DSP-MD.43Łatwopalne
szkiełka do liczenia komórek EVE, NanoEnTekVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Surowica bydlęca płodu (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, Stany ZjednoczoneKot#10437028
Aldehyd glutarowySigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USAKot#G5882
heksametyldisalizanSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USAKot#440191Łatwopalny,
roztwór insuliny ludzkiejSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USAKat#I9278
IzopropanolFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany ZjednoczoneCat#A415Łatwopalny
izoproterenolSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USAKat#I5627Łatwopalny
KClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S25484
KH2PO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#P5655
Lipaza z trzustki świni, typ VI-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#L0382
MgSO4*7H2OSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#230391
Na2HPO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S5136
NaClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S3014
NaHCO3Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany ZjednoczoneCat#S233
NH4ClFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany ZjednoczoneCat#A661
Optymalne cięcie Związek temperatury (OCT)Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, Wielka BrytaniaCat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#O1391
Oil Red-O Stain KitAmerican Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USACat#KTORO-G
Tetroxide osmuSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#201030
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#93482Roztwór
soli fizjologicznej buforowany fosforanem kaustycznym (PBS)Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany ZjednoczoneKat#SH3025601
Rybonukleaza A z trzustki bydlęcej, typ III-ASigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#R5125
RNAEasy Tkanka włóknista MiniKitQiagen, Hilden, NiemcyCat#74704
Płyn scyntylacyjnyFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SX18
Licznik
Nożyczki, kleszcze, sterylny
bufor fosforanowy SorensenaThomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJCAS #: 10049-21-5
Kolba hodowlana T-150VWR International LLC., Radnor, PA, Stany ZjednoczoneCat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#4369016
Wytrząsarka
Homogenizator tkankowy, homogenizator mikroprobówek BeadBugBenchmark ScientificCat#D1030
TransferynaSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T3309
Zestaw do oznaczania trójglicerydówSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#TR0100
Niebieska plama trypanowa, 0,4%VWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Kolagenaza typu IIGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#17101015
Bibuła filtracyjna Whatman Reeve Angel, klasa 201, 150mmSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#WHA5201150
scyntylacyjnyorbitalna z kontrolowaną temperaturą

Bibliografia

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4(2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165(2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla kom rkowamacierz pozakom rkowa tkanki t uszczowejr nicowanie preadipocyt wdecelularyzacja tkankifenotypowanie metabolicznetest pobierania glukozytest funkcji lipolitycznejskaningowa mikroskopia elektronowabarwienie Oil Red O
Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.