Artykuł metodologiczny

Analiza złożonych cząsteczek i ich reakcji na powierzchniach za pomocą spektrometrii mas desorpcji/jonizacji indukowanej klastrami

DOI:

10.3791/60487

⸱

1 marca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa), Justus Liebig University Giessen, 2Bruker Daltonik GmbH

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutralne klastry SO2 o niskiej energii kinetycznej (< 0,8 eV/składnik) są używane do desorpcji złożonych cząsteczek powierzchniowych, takich jak peptydy lub lipidy, do dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas przy użyciu spektrometru masowego z pułapką jonową. Nie jest wymagane specjalne przygotowanie próbki i możliwa jest obserwacja reakcji w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desorpcja/Jonizacja indukowana przez neutralne klastry SO2 (DINeC) jest stosowana jako bardzo miękka i wydajna technika desorpcji/jonizacji dla spektrometrii mas (MS) złożonych cząsteczek i ich reakcji na powierzchniach. DINeC opiera się na wiązce klastrów SO2 uderzających w powierzchnię próbki przy niskiej energii klastra. Podczas uderzenia w powierzchnię klastra niektóre cząsteczki powierzchniowe są desorbowane i jonizowane poprzez rozpuszczenie w klastrze uderzającym; W wyniku tego mechanizmu desorpcji za pośrednictwem rozpuszczania, niska energia klastra jest wystarczająca, a proces desorpcji jest wyjątkowo miękki. Analizie można poddawać zarówno adsorbaty powierzchniowe, jak i cząsteczki, z których składa się powierzchnia. Uzyskuje się przejrzyste i wolne od fragmentacji widma ze złożonych cząsteczek, takich jak peptydy i białka. DINeC nie wymaga specjalnego przygotowania próbki, w szczególności nie trzeba stosować matrycy. Metoda dostarcza informacji ilościowych na temat składu próbek; Można wykryć cząsteczki o pokryciu powierzchni wynoszącym zaledwie 0,1% monowarstwy. Reakcje powierzchniowe, takie jak wymiana H/D lub rozkład termiczny, można obserwować w czasie rzeczywistym i można wywnioskować kinetykę reakcji. Wykorzystując dyszę pulsacyjną do generowania wiązki klastrowej, DINeC można skutecznie połączyć ze spektrometrią mas pułapki jonowej. Bezmatrycowy i miękki charakter procesu DINeC w połączeniu z możliwościami pułapki jonowej MSn pozwala na bardzo szczegółową i jednoznaczną analizę składu chemicznego złożonych próbek organicznych i adsorbatów organicznych na powierzchniach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki analizy wrażliwej na powierzchnię często opierają się na próbkach cząstek, takich jak elektrony o niskiej energii, atomy lub jony, które silnie oddziałują z próbkami stałymi. W konsekwencji wykazują wysoką czułość powierzchni, a szczegółowe informacje na temat struktury powierzchni można uzyskać1. Informacje chemiczne są jednak często ograniczone. Na przykład rentgenowska spektroskopia fotoelektronów może dostarczyć ilościowych informacji o składzie atomowym i średnim środowisku chemicznym danego gatunku (np. atomy węgla w cząsteczce organicznej zaadsorbowane na powierzchni2). Jednak bardziej szczegółowe informacje na temat złożonych, zaadsorbowanych powierzchniowo cząsteczek, takie jak ich szczegółowa struktura lub miejsca wiązania, są trudne do uzyskania za pomocą standardowych technik analizy powierzchni. Z drugiej strony, zapotrzebowanie na takie informacje rośnie wraz z rosnącym zainteresowaniem funkcjonalizacją powierzchni za pomocą cząsteczek organicznych. Rozszerzające się pola syntezy na powierzchni3 lub funkcjonalizacja powierzchni przez przyłączanie biomolekuł4,5 to dwa wybitne przykłady. We wszystkich tych dziedzinach badane są podstawowe pytania dotyczące interakcji substrat-adsorbat i adsorbat-adsorbat, aby lepiej zrozumieć te systemy. Do tych badań pożądane jest uzyskanie jak największej ilości informacji na temat zaadsorbowanych cząsteczek.

Częściowo, spektrometria mas jonów wtórnych (SIMS) może dostarczyć takich informacji. Po pierwsze, SIMS jest bardzo wrażliwy powierzchniowo. Po drugie, ponieważ rozpylone adsorbaty i ich fragmenty są wykrywane za pomocą MS, uzyskuje się informacje znacznie wykraczające poza skład atomowy. W zależności od charakteru substancji chemicznej zaadsorbowanej na powierzchni, można ją zidentyfikować na podstawie masy cząsteczkowej i wzoru fragmentów obserwowanego w widmie masowym6. Fragmenty indukowane przez jony pierwotne rzeczywiście mogą pomóc w identyfikacji analizowanego materiału. Z drugiej strony, jeśli modyfikacja próbki wywołana jonami pierwotnymi (fragmentacja, reakcje indukowane jonami, mieszanie) jest zbyt silna, większość informacji o pierwotnym stanie próbki zostaje utracona. W związku z tym podjęto znaczne wysiłki w celu zmniejszenia fragmentacji w SIMS (np. wykorzystując naładowane klastry molekularne jako jony pierwotne7,8,9). Jednak fragmentacja nadal dominuje w widmach SIMS dużych makrocząsteczek i próbek biologicznych10, ograniczając zastosowanie SIMS w różnych dziedzinach.

Jako alternatywę, pokazaliśmy, że desorpcja/jonizacja indukowana przez neutralne klastry (DINeC) jest miękką i bezmatrycową metodą jonizacji, która została z powodzeniem zastosowana do analizy spektrometrycznej mas złożonych cząsteczek11,12,13,14,15,16,17. DINeC opiera się na wiązce molekularnych klastrów, które składają się z 103 do 104 4 cząsteczek SO2 (Rysunek 1). Kiedy klastry oddziałują na próbkę, oddziałują na różne sposoby z cząsteczkami na powierzchni i na powierzchni: najpierw część energii kinetycznej klastra jest redystrybuowana i aktywuje desorpcję. Równie ważne jest to, że cząsteczka desorpcyjna rozpuszcza się w klastrze podczas uderzenia w powierzchnię klastra11,18,19 (Rysunek 1 i Rysunek 2). Innymi słowy, w oparciu o wysoki moment dipolowy SO2 klastry bardzo efektywnie służą jako matryca przejściowa dla analitów polarnych. W rezultacie desorpcja cząsteczek analitu zachodzi przy energiach klastra tak niskich, jak 1 eV/cząsteczkę i niższych. Miękka natura procesu desorpcji jest dodatkowo wspierana przez szybkie chłodzenie systemu, gdy klaster SO2 rozpada się podczas i po uderzeniu powierzchniowym11,19. W wyniku tych różnych aspektów, indukowana klastrem desorpcja złożonych cząsteczek, takich jak peptydy, białka, lipidy i barwniki, przebiega bez żadnej fragmentacji cząsteczek desorpcyjnych11,15; typowe widma masowe pokazują dominujący pik przy wartości m/z nienaruszonej cząsteczki ([M+H]+ lub [M-H]-, Rysunek 3). W zależności od liczby i charakteru grup funkcyjnych w cząsteczce obserwuje się wiele naładowanych kationów w postaci [M + n·H]n+11,15,18. W przypadku biomolekuł jonizacja zazwyczaj odbywa się poprzez wychwyt lub abstrakcję protonu odpowiednio w zasadowej lub kwasowej grupie funkcyjnej11. Jeśli w próbce obecne są cząsteczki wody, cząsteczki SO2 z klastra mogą reagować z tymi cząsteczkami wody, tworząc kwas siarkawy18. Ten ostatni może działać jako wydajne źródło protonów, co dodatkowo wspomaga proces jonizacji w przypadku jonizacji poprzez wychwyt protonów (tryb jonów dodatnich)13,18.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja desorpcji/jonizacji indukowanej klastrem i konfiguracji eksperymentalnej. Desorpcję/jonizację indukowaną klastrem przeprowadza się w naczyniu o wysokiej próżni. Wiązka klastrów SO2 (żółte kropki) jest wytwarzana w wyniku naddźwiękowego rozprężania mieszaniny gazów SO2/He z dyszy pulsacyjnej. Podczas uderzenia w powierzchnię klastra cząsteczki powierzchniowe są desorbowane i jonizowane. Jony molekularne (czerwone/pomarańczowe kropki) są przenoszone przez spolaryzowaną siatkę, wlot z podwójnym lejkiem jonowym i oktopolarne prowadnice jonów do pułapki jonowej w celu spektrometrii mas. Typowe widma mas wykazują dominujące piki przy wartościach m/z nienaruszonych cząsteczek, tutaj: M1 (pomarańczowy) i M2 (czerwony) w trybie jonów dodatnich. Wysadzenie: Podczas uderzenia w powierzchnię klastra zdesorbowane cząsteczki rozpuszczają się w uderzającym klastrze lub jednym z jego fragmentów. Dalsze rozdrabnianie i parowanie cząsteczek SO2 prowadzi następnie do gołego, nienaruszonego jonu molekularnego, wykrytego w spektrometrze mas. Zobacz też Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Migawki symulacji dynamiki molekularnej ilustrujące desorpcję wywołaną przez klaster poprzez rozpuszczanie. (A) KlasterSO2 (300 cząsteczek) zbliża się do powierzchni z prędkością 1250 m/s prostopadle do powierzchni, na której adsorbowany jest dipeptyd (kwas asparaginowy-arginina, ASP-ARG). (B) Podczas zderzenia z powierzchnią gromady, gromada rozpada się. Zaadsorbowany dipeptyd oddziałuje z otaczającymi cząsteczkamiSO2, prowadząc do jego rozpuszczenia w jednym z fragmentów klastra. (C) Odłamki klustera są odpychane od powierzchni. Oznaczony fragment (niebieskie kółko) przenosi dipeptyd, który ulega desorpcji w tym fragmencie. Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru referencyjnego 19. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-introduction-3
Rycina 3: Reprezentatywne widmo masowe i model molekularny angiotensyny II. (A) Widma masowe (górny panel: tryb jonów dodatnich, dolny panel: tryb jonów ujemnych) otrzymane po desorpcji/jonizacji wywołanej klastrem z próbki angiotensyny II. Próbkę przygotowano przez odlewanie kroplowe odpowiedniego roztworu na płytce krzemowej (pokrytej jej naturalnym tlenkiem). Główne piki są przypisane do nienaruszonej biomolekuły, [M+H]+ i [M-H]-; Nie obserwuje się żadnych wzorców fragmentacji. Dimery ([2M+H]+, strzałka) dodatkowo wskazują na miękką naturę procesu desorpcji. Sygnał jonów dodatnich jest bardziej intensywny ze względu na wpływ klastrów SO218. (B) Model wypełniania przestrzeni i sekwencja aminokwasowa angiotensyny II. Białe kulki wskazują atomy wodoru; : węgiel; niebieski: azot; czerwony: tlen. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

DINeC może być zastosowany do każdego rodzaju próbki stałej, która jest kompatybilna z warunkami wysokiej próżni. Nie jest wymagane specjalne przygotowanie próbki, w szczególności nie trzeba nakładać matrycy przed pomiarami DINeC-MS, w przeciwieństwie do spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) i technik pokrewnych20,21. Umożliwia to pomiary w czasie rzeczywistym zmian chemicznych próbki w różnych warunkach eksperymentalnych, takich jak ciśnienie tła form reaktywnych w komorze próżniowej22 lub temperatura próbki. Wykazano, że granica wykrywalności DINeC-MS mieści się w zakresie femtomolów11. Po zastosowaniu do analizy biomolekuł zaadsorbowanych na powierzchniach stałych w reżimie submonowarstwowym, wykryto pokrycie powierzchni zaledwie 0,1% monowarstwy23. W tym reżimie pokrycia intensywność sygnału zależy liniowo od pokrycia powierzchni, a DINeC-MS może być używany do ilościowej analizy składu powierzchni23. W przypadku próbek mieszanych możliwa jest ilościowa ocena składu próbki17,24, ponieważ nie obserwuje się większego wpływu środowiska chemicznego na prawdopodobieństwo jonizacji (np. w przypadku mieszanych próbek lipidów/peptydów17). Jest to wyraźny kontrast z SIMS, dla którego prawdopodobieństwo jonizacji danego gatunku jest zazwyczaj silnie uzależnione od obecności różnych składników chemicznych (tzw. "efekt matrycy"25,26).

Oprócz analizy powierzchni, skład chemiczny w obszarze podpowierzchniowym może być badany za pomocą profilowania głębokościowego17. Przy obecnej konfiguracji typowe szybkości desorpcji biomolekuł indukowanej klastrem wynoszą rzędu 10-3 nm/s. Wysoką rozdzielczość głębokości w zakresie od 1 do 2 nm zaobserwowano dla mieszanych próbek lipidów/peptydów17.

Kolejnym obszarem zastosowania jest połączenie DINeC-MS z chromatografią cienkowarstwową (TLC). Konwencjonalne płytki TLC mogą być analizowane bezpośrednio za pomocą DINeC-MS. Widma masowe zależne od położenia można uzyskać z płytek TLC, a zatem chromatogramy specyficzne dla masy można uzyskać z płytek TLC27. Nie jest konieczna reelucja oddzielonych analitów, inaczej niż w przypadku TLC w połączeniu z ESI28,29. Do kombinacji DINeC-MS + TLC nie jest również potrzebna matryca, w przeciwieństwie do sprzężenia TLC z MALDI28,29.

Desorpcja jonizacji elektrorozpylaniem (DESI) jest również metodą miękkiej desorpcji/jonizacji dla aplikacji MS30,31. Najbardziej rzucającymi się w oczy różnicami między DINeC a DESI są: ilościowy charakter DINeC23, jego kompatybilność z warunkami ultrawysokiej próżni (UHV), w szczególności możliwość badania próbek przygotowanych i przeniesionych w warunkach UHV bez przerywania próżni23, a także możliwość efektywnej desorpcji cząsteczek niepolarnych19.

Zasadniczo, DINeC jako źródło desorpcji/jonizacji może być sprzęgnięte z dowolnym typem spektrometru masowego. Jednak połączenie ze spektrometrią mas pułapki jonowej ma dwie główne zalety: po pierwsze, szerokość impulsu i częstotliwość powtarzania typowej impulsowej wiązki klastrowej bardzo dobrze odpowiadają nieciągłemu czasowi akumulacji, a także szybkości widmowej pułapki jonowej15,32. Po drugie, miękka natura procesu DINeC prowadzi do desorpcji nienaruszonych cząsteczek. W połączeniu z możliwościami spektrometrii mas z pułapką jonową pozwala to na najbardziej wszechstronną analizę badanych próbek15.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany w dowolnym momencie.

1. Przygotowanie substratów

  1. W przypadku próbek standardowych podłoża z płytek krzemowych (grubość ok. 0,5 do 1 mm) należy pociąć na kawałki o wymiarach 1 x 1 cm2.
  2. Podłoża Si należy oczyścić w kąpieli ultradźwiękowej z etanolu i acetonu przez 15 minut każdy.
  3. Wysuszyć podłoża w strumieniu suchego azotu gazowego.

2. Przygotowanie próbek

  1. Przygotowanie próbki wzorcowej
    1. W przypadku próbek wzorcowych należy przygotować roztwór zawierający cząsteczki analitu zgodnie z kwestią naukową, którą należy się zająć. Stężenie analitu powinno wynosić co najmniej 1 x 10-10 mol/l.
    2. Odlać kroplowo od 5 do 30 μl roztworu próbki na podłoże. W zależności od prężności par rozpuszczalnika, pozostawić próbkę do wyschnięcia w warunkach otoczenia lub w eksykatorze, aż cały rozpuszczalnik zostanie odparowany i utworzy się suchy film. W zależności od ilości nałożonej substancji, grubość folii może wynosić od kilku dziesięciu μm (możliwa kontrola wzrokowa) oraz reżimu od monowarstwy do podwarstwy (a więc niewykrywalna gołym okiem).
    3. Zamontuj próbki na uchwycie próbki (np. za pomocą taśmy klejącej lub zacisków dokręconych, w zależności od wymaganych próbek i warunków próżni).
    4. Jeśli to możliwe, należy dodatkowo zamontować próbkę referencyjną, taką jak folia angiotensyny II o grubości mikrometra, na uchwycie próbki.
  2. Alternatywne przygotowanie próbki
    1. W razie potrzeby należy zastosować alternatywne schematy przygotowania próbek, takie jak osadzanie wiązką jonów metodą elektrorozpylania (ES-IBD) w próżni lub powlekanie zanurzeniowe w odpowiednim roztworze.
    2. Zamontuj próbki, które mają być przygotowane i przeniesione w próżni, na uchwycie na próbkę DINeC przed etapami przygotowania.
    3. Upewnij się, że próbki powlekane zanurzeniowo są suche po ostatnim etapie przygotowania.
    4. Rozważ najprostszy schemat przygotowania. Na przykład, aby zbadać tusz do zakreślacza, wystarczy narysować kropkę na powierzchni podłoża
      5. .

3. Transfer próbek do spektrometru masowego DINeC

  1. Przenoszenie próbek z warunków otoczenia do próżniowej komory DINeC
    1. Odpowietrzyć system blokady obciążenia.
    2. Otwórz blokadę obciążenia i zamontuj uchwyt na próbkę.
    3. Zamknąć blokadę obciążenia i przepompować ją w dół do ciśnienia poniżej 2 x 10-5 mbar.
    4. Otworzyć zawór do komory DINeC i przenieść uchwyt próbki wraz z prętem transferowym do głównego manipulatora. Przymocuj uchwyt próbki do manipulatora.
    5. Cofnąć pręt przesyłowy i zamknąć zawór między blokadą obciążenia a komorą DINeC.
       

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniżej przedstawiono dwa przykłady zastosowania DINeC-MS w czasie rzeczywistym. Rysunek 4 pokazuje zmianę widma masowego uzyskanego z angiotensyny II, gdy próbka jest podgrzewana do temperatury ok. 140 °C. Po osiągnięciu końcowej temperatury (Rysunek 4B, Rysunek 4E), widmo jest charakteryzowane przez dodatkowy pik wskazujący na utratę jednostki H2O (m/z = 1029). Podczas utrzymywania próbki w tej temperaturze obserwuje się dalszy rozkład cząsteczek angiotensyny II ( Rysunek 4C), w tym utratę jednej z końcowych jednostek aminokwasowych, kwasu asparaginowego (pik przy m / z = 932, Rysunek 4D). Ilościowa analiza danych pozwala ocenić podstawową kinetykę reakcji (Rysunek 4E). W szczególności, Rysunek 4E pokazuje, że byt o m/z = 1029 jest pośrednikiem, który dalej rozkłada się na mniejsze fragmenty, gdy intensywność najpierw rośnie, a następnie maleje. Równoczesne stałe szybkości są zatem tego samego rzędu wielkości.

Jako drugi przykład, badanie wymiany wodoru/deuteru w angiotensyny II22 jest zilustrowane w Rysunek 5. Po wystawieniu próbki angiotensyny na działanieD2Ow komorze DINeC (pD2O = 10-4 mbar), wzór izotopowy angiotensyny II ulega poszerzeniu i przesunięciu w kierunku wyższych wartości m/z wskazujących na wymianę H przez atomy D. Proces ten przebiega szybko przez pierwsze 60 s, ale znacznie zwalnia w dalszym przebiegu eksperymentu: Wzór izotopowy w Rysunek 5B obejmuje szeroki zakres m/z (ok. 15 m/z jednostek). Gdy zdefiniujemy stopień deuteracji d jako liczbę wymienianych atomów H w cząsteczce, z widma można wydobyć wartości d między d = 0 do d = 13. W Rysunek 5C, wzór izotopowy jest ponownie zmniejszony pod względem szerokości. Obserwację tę można przypisać znacznie zmniejszonej intensywności szczytów, które są związane z najniższymi stopniami deuteracji. W Rysunek 5D, widmo jest pokazane dla jeszcze dłuższych czasów reakcji. Pokryty zakres m/z pozostaje prawie taki sam, ale środek masy widma nadal powoli przesuwa się w kierunku rosnących wartości m/z. W przypadku długich czasów ekspozycji część cząsteczek osiąga najwyższy stopień deuteracji, dmax = 17. Odpowiada maksymalnej liczbie wymiennych atomów H, podanej przez liczbę atomów H związanych z grupami funkcyjnymi, takimi jak kwasy karboksylowe lub grupy aminowe.

Już z czasowej ewolucji widm można wywnioskować, że wymiana H/D odbywa się przy różnych stałych szybkości. Dla ilościowego opisu tej obserwacji, średni stopień deuteracji d̅ jest wykreślony w Rysunek 5E jako funkcja czasu. Analiza wyników doświadczalnych (symboli) ujawnia trzy różne reżimy: szybki wzrost d̅ działającego dla t < 50 s, tryb pośredni dla 50 s < t < 200 s oraz powolny, ale prawie ciągły wzrost dla t > 200 s. Wyniki eksperymentalne przeprowadzono za pomocą symulacji Monte Carlo; Dla wymiany H/D przyjęto kinetykę reakcji pseudo-pierwszego rzędu ze stałymi reakcji ki w grupach funkcyjnych badanych cząsteczek22. Dobrą zgodność między symulacjami a wynikami eksperymentalnymi we wszystkich trzech reżimach uzyskano tylko wtedy, gdy zastosowano co najmniej trzy różne stałe szybkości ki dla wymiany H/D w cząsteczkach angiotensyny II. W Rysunek 5F,G, pokazana jest kinetyka wyprowadzona z dopasowania eksperymentalnych wzorców izotopowych przez sumę wzorców izotopów dla różnych stopni deuteracji (Rysunek 5A do Rysunek 5D). Wyraźnie można zaobserwować dobrą zgodność między danymi eksperymentalnymi a symulacjami, a także bardzo różne kursy wymiany dla niskich i wysokich stopni deuteracji. W porównaniu z różnymi oligopeptydami, takimi jak heksaglicyna, szybkie kursy wymiany przypisano wyraźnym grupom funkcyjnym, podczas gdy wolne kursy wymiany były związane z grupami amidowymi szkieletu peptydu 22.

Podczas gdy te dwa pierwsze przykłady zostały zmierzone próbkami angiotensyny II o grubości mikrometra, Rysunek 6 pokazuje wyniki uzyskane z submonowarstwowego pokrycia angiotensyny II próbkami złota przygotowanymi za pomocą osadzania wiązką jonów metodą elektrorozpylania (ES-IBD)23. Liniową zależność natężenia sygnału od ilości substancji obserwuje się na przestrzeni 3 rzędów wielkości, przy czym najmniejsza wykryta ilość substancji odpowiada 0,1% monowarstwy cząsteczek angiotensyny II na powierzchni złota. Eksperymenty wymiany H/D, jak pokazano na Rysunek 5, przeprowadzono również z angiotensyną II na złocie w reżimie submonolayer23.

figure-results-1
Rysunek 4: Obserwacja degradacji termicznej angiotensyny II w czasie rzeczywistym. (A-C) Widma masowe uzyskane po desorpcji/jonizacji wywołanej klastrem z próbki angiotensyny II. (A) Świeża próbka w temperaturze pokojowej (RT). (B) Próbka podgrzana do temperatury ok. 140 °C. Oprócz piku w m/z = 1047, który jest związany z nienaruszoną cząsteczką [M+H]+, pojawiają się piki w m/z = 932, 1012 i 1029 (oznaczone strzałkami). (C) Te ostatnie piki zwiększają się, a główny pik maleje z czasem, gdy próbka jest utrzymywana w podwyższonej temperaturze. (D) Wzór strukturalny angiotensyny II ze wskazaniem fragmentu (brązowe nawiasy), który prowadzi do pojawienia się piku przy m/z = 932 przez utratę jednej jednostki aminokwasowej (kwasu asparaginowego). (E) Zależność czasowa temperatury próbki i intensywności głównych pików wskazanych na wykresach (A) do (C). Linie ciągłe są prowadnicami dla oka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 5: Obserwacja wymiany H/D w czasie rzeczywistym w angiotensyny II. (A-D) Kationowe widma masowe angiotensyny II otrzymane za pomocą DINeC-MS. Ze względu na wymianę H/D, wzór izotopów rozszerza się i przesuwa w kierunku wyższych wartości m/z w (B) do (D) w porównaniu z wzorcem izotopowym gatunków niedeuterowanych pokazanym w (A). Czerwone linie to dane, przerywane linie cyjanowe to dopasowania do danych uwzględniające różne stopnie deuteracji. (E) Średni stopień deuteracji d̅ w funkcji czasu, wydedukowany z doświadczeń (otwarte kropki). Ponadto pokazano d̅ jako funkcję czasu wydedukowaną za pomocą symulacji Monte Carlo. Krzywa przerywana: symulacje uwzględniające jedną stałą szybkości (k1); Czerwona krzywa: Uwzględnianie trzech stałych szybkości (K1, K2, K3). (F,G) Względne natężenia sygnału wybranych stopni deuteracji angiotensyny II (symbole + linie ciągłe) w funkcji czasu wraz z odpowiadającymi im wynikami symulacji Monte Carlo (linie przerywane). Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru referencyjnego 22. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 6: Zastosowanie DINeC-MS do angiotensyny II na złocie w reżimie submonowarstwowym. (A) Schematyczne przedstawienie kombinacji ES-IBD do osadzania i DINeC-MS do spektrometrii mas izolowanych cząsteczek angiotensyny II w reżimie submonowarstwowym. (B) Zależność intensywności sygnału od ilości substancji zdeponowanej na próbce, uzyskanej z dwóch niezależnych zestawów danych (symbole wypełnione i otwarte). Wstawki: Widma masowe DINeC uzyskane z próbek, na których osadzono pewną ilość substancji zgodnie ze wskazaniami. Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru referencyjnego 23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W wielu przeprowadzonych do tej pory badaniach wykazano wysoką czułość DINeC-MS na różne substancje. Rzeczywiście, pozwala to na pomiary analitów do ilości substancji w reżimie femtomolowym11. Ze względu na tę wysoką czułość, przygotowanie próbki, w szczególności czyszczenie podłoża, musi być wykonywane przy użyciu chemikaliów o wysokiej czystości, aby uniknąć zanieczyszczenia widm masowych DINeC. Podobnie jak w przypadku wielu technik analizy, właściwy pomiar tła z podłoża zerowego pomaga oddzielić piki od analitu i piki, które mają swoje źródło w przygotowaniu substratu/próbki.

Chociaż wykazaliśmy, że na prawdopodobieństwo jonizacji danej cząsteczki analitu nie ma silnego wpływu obecność koadsorbatów lub współskładników w próbkach mieszanych17,24, prawdopodobieństwo jonizacji może się różnić w zależności od substancji13. Dlatego tym ważniejsza jest praca w czystych warunkach, ponieważ zanieczyszczenia, w zależności od prawdopodobieństwa ich jonizacji, mogą przyczyniać się do sygnału znacznie silniej niż analit. Wstępnie uformowane jony (np. jak w przypadku wielu cząsteczek barwnika) lub cząsteczki z grupami funkcyjnymi, które wykazują wyraźną tendencję do wychwytu protonów lub deprotonacji (tj. zasady lub kwasy), zwykle wykazują wysokie prawdopodobieństwo jonizacji w DINeC-MS. Jeśli taka grupa funkcyjna nie jest obecna w analicie, prawdopodobieństwo jonizacji może być niskie. Próbki mogą być następnie poddane obróbce środkami jonizującymi, takimi jak kwas trifluorowy (np. przez wystawienie próbki na działanie prężności pary czynnika jonizującego).

Reprezentatywne wyniki omówione na rys. 4 i rys. 5 pokazują możliwość zastosowania DINeC-MS do badań reakcji chemicznych w czasie rzeczywistym za pomocą spektrometrii mas. Rysunek 6 ilustruje czułość podmonowarstwową metody. Jeśli te dwie właściwości zostaną połączone, reakcje chemiczne na powierzchniach i ich produktach mogą być śledzone w czasie rzeczywistym23. Może to być szczególnie interesujące dla tak zwanej "syntezy powierzchniowej", która prowadzi do składania struktur makromolekularnych na powierzchniach 3,33,34,35,36. W obecnym układzie obserwacja takich reakcji powierzchniowych jest możliwa na powierzchniach o niższej reaktywności, takich jak złoto23 i inne metale szlachetne; Eksperymenty są trudniejsze do przeprowadzenia na wysoce reaktywnych powierzchniach, takich jak powierzchnie krzemowe37, ponieważ ciśnienie podstawowe w komorze desorpcyjnej mieści się w zakresie 10-7 mbar. Obecne działania mają na celu rozwiązanie tego ograniczenia i budowana jest aparatura DINeC kompatybilna z UHV. W przypadku powierzchni reaktywnych oddziaływanie międzySO2 a powierzchnią podłoża musi zostać zbadane przed pomiarami adsorbatów powierzchniowych i reakcji powierzchniowych.

Ponieważ wiązka klastrowa jest neutralna, nie można jej ustawić. Wielkość wiązki na próbce jest zatem określona przez geometrię ustawienia i kryzy używanego odpieniacza; Typowe wartości średnicy wiązki na próbce wynoszą od jednego do kilku milimetrów. W rezultacie obrazowanie poprzez skanowanie próbki jest możliwe tylko przy bardzo niskiej rozdzielczości. Z drugiej strony, ze względu na wysokie prawdopodobieństwo jonizacji13, DINeC efektywnie wykorzystuje zdesorbowane cząsteczki. Tak więc połączenie DINeC-MS i detektora obrazowania jonowego38 wydaje się być bardzo atrakcyjne.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Międzynarodowego Centrum Helmholtza dla FAIR (HICforFAIR) oraz Helmholtz Graduate School for Hadron and Ion Research (P.S.). Autorzy dziękują prof. Rauschenbachowi (Uniwersytet Oksfordzki) i jego zespołowi za owocną współpracę przy połączonych eksperymentach ES-IBD/DINeC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aceton rotisolv HPLCRoth7328.2HPLC Gradient Grade
Taśma
Etanol rotisolv HPLCRothp076.1HPLC Gradient
Grade HelPraxair4800086706Czystość 99,9999%
AzotPraxair40728408Czystość 99,5 - 100%
wafle krzemoweActive Business Company GmbHG60007
Dwutlenek siarkiAir LiquideP1734S10R0A001Czystość 99,98%
Woda rotisolv LC-MSRothHN43.1Ultra LC-MS
miedziana

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vickerman, J. C., Gilmore, I. Surface Analysis: The Principal Techniques. , 2nd ed, John Wiley & Sons. New York. (2009).
  2. Reutzel, M., Münster, N., Lipponer, M. A., Länger, C., Höfer, U., Koert, U., Dürr, M. Chemoselective Reactivity of Bifunctional Cyclooctynes on Si(001). Journal of Physical Chemistry C. 120, 26284-26289 (2016).
  3. Grill, L., Dyer, M., Lafferentz, L., Persson, M., Peters, M., Hecht, S. Nano-architectures by covalent assembly of molecular building blocks. Nature Nanotechnol. 2, 687-691 (2007).
  4. Stutzmann, M., Garrido, J. A., Eickhoff, M., Brandt, M. S. Direct biofunctionalization of semiconductors: A survey. Physica Status Solidi A. 203, 3424-3437 (2006).
  5. Adler-Abramovich, L., Gazit, E. The physical properties of supramolecular peptide assemblies: from building block association to technological applications. Chemical Society Reviews. 43, 6881-6893 (2014).
  6. Vickerman, J. C., Briggs, D. TOF-SIMS: Materials Analysis by Mass Spectrometry, 2nd ed. , IM Publications. Chichester, UK. (2013).
  7. Winograd, N. The magic of cluster SIMS. Analytical Chemistry. 77, 142-149 (2005).
  8. Ichiki, K., Ninomiya, S., Nakata, Y., Honda, Y., Seki, T., Aoki, T., Matsuo, J. High Sputtering Yields of Organic Compounds by Large Gas Cluster Ions. Applied Surface Science. 255, 1148-1150 (2008).
  9. Mochiji, K., Hashinokuchi, M., Moritani, K., Toyoda, N. Matrix-free Detection of Intact Ions from Proteins in Argon-Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23, 648-652 (2009).
  10. Yokoyama, Y., Aoyagi, S., Fujii, M., Matsuo, J., Fletcher, J. S., Lockyer, N. P., Vickerman, J. C., Passarelli, M. K., Havelund, R., Seah, M. P. Peptide Fragmentation and Surface Structural Analysis by Means of ToF-SIMS Using Large Cluster Ion Sources. Analytical Chemistry. 88, 3592-3597 (2016).
  11. Gebhardt, C. R., Tomsic, A., Schröder, H., Durr, M., Kompa, K. L. Matrix-Free Formation of Gas-Phase Biomolecular Ions by Soft Cluster-Induced Desorption. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 4162-4165 (2009).
  12. Baur, M., Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Durr, M. Soft Clusterinduced Desorption and Ionization of Biomolecules - Influence of Surface Load and Morphology on Desorption Efficiency. Applied Physics Letters. 99, 234103(2011).
  13. Lee, B. J., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Quantification of the Ionization Probability During Desorption/Ionization of Oligopeptides Induced by Neutral Cluster Impact. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 27, 1090-1094 (2013).
  14. Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Schroder, H., Kompa, K. L., Durr, M. Observation of Ionic Desorption Channels in Cluster-induced Desorption of Alkali Halides - Influence of Surface Electronic Properties and Surface Configuration. Chemical Physics Letters. 556, 77-81 (2013).
  15. Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact as a Soft and Efficient Ionization Source for Ion Trap Mass Spectrometry of Biomolecules. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28, 290-296 (2014).
  16. Kley, C. S., Dette, C., Rinke, G., Patrick, C. E., Cechal, J., Jung, S. J., Baur, M., Durr, M., Rauschenbach, S., Giustino, F., Stepanow, S., Kern, K. Atomic-Scale Observation of Multiconformational Binding and Energy Level Alignment of Ruthenium-Based Photosensitizers on TiO2 Anatase. Nano Letters. 14, 563-569 (2014).
  17. Portz, A., Aoyagi, S., Durr, M. Soft depth-profiling of mixed peptide/lipid samples by means of cluster induced desorption/ionization mass spectrometry - high depth resolution and low matrix effect. Biointerphases. 13, 03B405(2018).
  18. Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Frank, A. J., Neuderth, P., Eickhoff, M., Durr, M. Influence of the Cluster Constituents' Reactivity on the Desorption/Ionization Process Induced by Neutral SO2 Clusters. Journal of Chemical Physics. 146, 134705(2017).
  19. Schneider, P., Durr, M. Cluster-induced desorption investigated by means of molecular dynamics simulations - Microsolvation in clusters of polar and non-polar constituents. Journal of Chemical Physics. 150, 214301(2019).
  20. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10 000 Daltons. Analytical Chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
  21. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90, 240-265 (2018).
  22. Portz, A., Gebhardt, C. R., Durr, M. Real-Time Investigation of the H/D Exchange Kinetics of Porphyrins and Oligopeptides by Means of Neutral Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Journal of Physical Chemistry B. 121, 11031-11036 (2017).
  23. Portz, A., Baur, M., Rinke, G., Abb, S., Rauschenbach, S., Kern, K., Dürr, M. Chemical Analysis of Complex Surface-Adsorbed Molecules and Their Reactions by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90, 3328(2018).
  24. Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Mass Spectrometry of Oligopeptides in the Presence of Large Amounts of Alkali Halides Using Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact. Biointerphases. 11, 02A316(2016).
  25. Shard, A. G., Spencer, S. J., Smith, S. A., Havelund, R., Gilmore, I. S. International Journal of Mass Spectrometry. 377, 599-609 (2015).
  26. Nakano, S., Yamagishi, T., Aoyagi, S., Portz, A., Durr, M., Iwai, H., Kawashima, T. Evaluation of Matrix Effects on TOF-SIMS Data of Leu-enkephalin and DOPC Mixed Samples. Biointerphases. 13, 03B403(2018).
  27. Heep, J., Tuchecker, P. H. K., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. ACS Omega. 4, 22426-22430 (2019).
  28. Morlock, G., Schwack, W. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 29, 1157-1171 (2010).
  29. Cheng, S. C., Huang, M. Z., Shiea, J. Thin layer chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218, 2700-2711 (2011).
  30. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306, 471(2004).
  31. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science. 311, 1566(2006).
  32. Dürr, M., Gebhardt, C. Ion generation in mass spectrometers by cluster bombardment. US Patent. , 926322 B2 (2019).
  33. Lindner, R., Kuhnle, A. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. ChemPhysChem. 16, 1582-1592 (2015).
  34. Dong, L., Liu, P. N., Lin, N. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. Accounts of Chemical Research. 48, 2765-2774 (2015).
  35. Björk, J. Reaction mechanisms for on-surface synthesis of covalent nanostructures. Journal of Physics: Condensed Matter. 28, 083002(2016).
  36. Rauschenbach, S., Rinke, G., Gutzler, R., Abb, S., Albarghash, A., Le, D., Rahman, T. S., Durr, M., Harnau, L., Kern, K. Two-Dimensional Folding of Polypeptides into Molecular Nanostructures at Surfaces. ACS Nano. 11, 2420-2427 (2017).
  37. Dürr, M., Höfer, U. Dissociative adsorption of molecular hydrogen on silicon surfaces. Surface Science Reports. 61, 465-526 (2006).
  38. Zhang, J., Franzreb, K., Aksyonov, S. A., Williams, P. Mass Spectra and Yields of Intact Charged Biomolecules Ejected by Massive Cluster Impact for Bioimaging in a Time-of-Flight Secondary Ion Microscope. Analytical Chemistry. 87, 10779-10784 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

SO2 ClustersSurface AnalysisPeptide DetectionProtein AnalysisIon TrapPulsed NozzleSurface ReactionsSample Preparation

Powiązane artykuły